تقييم إطلاق LC3-II عبر الحويصلات خارج الخلية فيما يتعلق بتراكم الحويصلات الإيجابية LC3 داخل الخلايا

Shun-ichi Ito; Yoshinori Tanaka

doi:10.3791/67385

مقالة منهجية

تقييم إطلاق LC3-II عبر الحويصلات خارج الخلية فيما يتعلق بتراكم الحويصلات الإيجابية LC3 داخل الخلايا

DOI:

10.3791/67385

⸱

أكتوبر 18, 2024

Shun-ichi Ito¹ , Yoshinori Tanaka¹

¹Biochemistry Unit, Faculty of Veterinary Medicine, Okayama University of Science

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا ، نقدم منهجية التقييم الموجز لمستويات علامات البلعمة الذاتية LC3-II في الحويصلات خارج الخلية (EVs) عن طريق النشاف المناعي. يشير تحليل مستويات LC3-II في المركبات الكهربائية ، وتكوين الجسيم الذاتي ، وتكوين الأوميجاسوم إلى الدور الجديد ل STX6 في إطلاق المركبات الكهربائية الإيجابية LC3-II عند تثبيط اندماج البلعمة الذاتية والليزوسوم.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمثل الالتهام الذاتي (الكلي) مسارا أساسيا للتدهور الخلوي. في هذه العملية ، تبتلع الحويصلات ذات الغشاء المزدوج المعروفة باسم الجسيمات الذاتية محتويات السيتوبلازم ، ثم تندمج لاحقا مع الجسيمات الحالة للتحلل. بالإضافة إلى الدور الكنسي ، تعدل الجينات المرتبطة بالالتهام الذاتي أيضا مسارا إفرازيا يتضمن إطلاق الجزيئات الالتهابية وعوامل إصلاح الأنسجة والحويصلات خارج الخلية (EVs). والجدير بالذكر أن عملية نشر البروتينات المرضية بين الخلايا ، خاصة في الأمراض التنكسية العصبية التي تصيب الدماغ والحبل الشوكي ، تؤكد أهمية فهم هذه الظاهرة. تشير الأبحاث الحديثة إلى أن البروتين المرتبط بالحمض النووي 43 كيلو دالتون (TDP-43) ، وهو لاعب رئيسي في التصلب الجانبي الضموري والتنكس الفصيصي الجبهي الصدغي ، يتم إطلاقه بطريقة تعتمد على الالتهام الذاتي عبر المركبات الكهربائية المخصبة بالبروتينات المرتبطة بالأنابيب الدقيقة لعلامة الجسيم الذاتي 1A / 1B السلسلة الخفيفة 3B-II (LC3-II) ، خاصة عند تثبيط اندماج البلعمة الذاتية والجسيم المحلل.

لتوضيح الآلية الكامنة وراء تكوين وإطلاق المركبات الكهربائية الإيجابية LC3-II ، من الضروري إنشاء طريقة يمكن الوصول إليها وقابلة للتكرار لتقييم كل من الحويصلات الإيجابية LC3-II داخل الخلايا وخارجها. تقدم هذه الدراسة بروتوكولا مفصلا لتقييم مستويات LC3-II عن طريق النشاف المناعي في الأجزاء الخلوية والأجزاء الكهربائية التي تم الحصول عليها من خلال الطرد المركزي التفاضلي. يعمل Bafilomycin A1 (Baf) ، وهو مثبط لاندماج البلعمة الذاتية والليزوزوم ، كتحكم إيجابي لتعزيز مستويات الحويصلات الإيجابية LC3-II داخل الخلايا وخارجها. يستخدم جين قابلية الورم 101 (TSG101) كعلامة للأجسام متعددة الحويصلات. بتطبيق هذا البروتوكول ، ثبت أن الضربة القاضية بوساطة siRNA لسينتاكين-6 (STX6) ، وهو عامل خطر وراثي لمرض كروتزفيلد جاكوب المتقطع ، يزيد من مستويات LC3-II في جزء EV من الخلايا المعالجة ب Baf بينما لا يظهر أي تأثير كبير على مستويات TSG101. تشير هذه النتائج إلى أن STX6 قد ينظم سلبا إطلاق LC3-II خارج الخلية عبر المركبات الكهربائية ، خاصة في ظل الظروف التي يضعف فيها اندماج البلعمة الذاتية والليزوزوم. إلى جانب الأساليب المعمول بها لتقييم الالتهام الذاتي ، يوفر هذا البروتوكول رؤى قيمة حول دور جزيئات معينة في تكوين وإطلاق المركبات الكهربائية الإيجابية LC3-II.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بروتين ربط الحمض النووي 43 (TDP-43) هو بروتين نووي نووي غير متجانس معبر عنه على نطاق واسع يشارك في تنظيم تضفير exon ، ونسخ الجينات ، واستقرار mRNA ، وكلها حيوية لبقاء الخلية¹^،². في الحالات التنكسية العصبية مثل التصلب الجانبي الضموري (ALS) والتنكس الفصي الجبهي الصدغي (FTLD) ، يتراكم البروتين النووي TDP-43 بشكل غير طبيعي في السيتوبلازم. ينتج عن هذا التحول فقدان وظيفة TDP-43 في النواة واكتساب سام للوظيفة في السيتوبلازم. يبدأ التراكم المرضي ل TDP-43 في مناطق معينة من الدماغ والحبل الشوكي ، وينتشر عبر هذه المناطق بطريقة تشبه البريون ، وهي عملية مرتبطة ارتباطا وثيقا بتطور المرض³. ومع ذلك ، فإن الآلية الدقيقة التي ينتشر بها مرض TDP-43 عبر الدماغ والحبل الشوكي لا تزال غير معروفة.

يتم إفراز TDP-43 من خلال حويصلات خارج الخلية (EVs) ، ويتم الكشف عن مستويات مرتفعة من TDP-43 في البلازما والسائل النخاعي (CSF) لمرضى ALS و FTLD-TDP⁴^،⁵^،⁶. يحفز السائل الدماغي النخاعي من المرضى الذين تم تشخيص إصابتهم بمرض التصلب الجانبي الضموري و FTLD الخطأ في تحديد الموقع داخل الخلايا وتجميع TDP-43 الداخلي في خلايا الورم الدبقي البشري⁷. وبالتالي ، فإن TDP-43 الذي يتم إطلاقه خارج الخلية عبر المركبات الكهربائية قد يتوسط في انتشار أمراض TDP-43 من خلية إلى خلية.

الالتهام الذاتي هو آلية تحلل خلوي محفوظة جيدا تتضمن إحاطة المواد غير المرغوب فيها داخل حويصلات الغشاء المزدوج ، والمعروفة باسم البلعمة الذاتية ، والتي تتميز ب LC3. تندمج هذه الجسيمات الذاتية مع البروتين الغشائي المرتبط بالليزوزومات 1 (LAMP1) الإيجابية لتكوين الجسيمات التحللية الذاتية (LC3 ⁺ / LAMP1 ⁺) ، مما يؤدي إلى تدهور محتوياتها⁸. تشير التحليلات النسيجية إلى أن الجسيمات الذاتية التي تبتلع الشوائب تتراكم في الخلايا العصبية لمرضى التصلب الجانبي الضموري^{المتقطع 9}. ترتبط بعض الجينات المسببة لمرض التصلب الجانبي الضموري العائلي و FTLD-TDP بتنظيم الالتهام الذاتي¹⁰^،¹¹^،¹². تشير هذه النتائج إلى أن الالتهام الذاتي يتم قمعه في مرضى ALS و FTLD-TDP.

أشارت الدراسة السابقة إلى أن TDP-43 يفرز عبر المركبات الكهربائية الإيجابية لعلامة البلعم الذاتي LC3-II عندما يتم تثبيط اندماج البلعمة الذاتية والليزوسوم¹³. قد يتسبب عدم تنظيم مسار الالتهام الذاتي والليزوزوم ليس فقط في تراكم TDP-43 داخل الخلايا ولكن أيضا في إطلاق TDP-43 خارج الخلية عبر EVs¹⁴. ومع ذلك ، لا يزال من غير المعروف كيف يتم إطلاق المركبات الكهربائية الإيجابية LC3-II ومدى أهمية ذلك في انتشار أمراض TDP-43.

تصنف المركبات الكهربائية إلى مركبات كهربائية كبيرة (قطرها من 100 إلى 1000 نانومتر) ، والتي يتم إنتاجها من تبرعم سطح الخلية ، والمركبات الكهربائية الصغيرة (قطرها من 50 إلى 150 نانومتر) ، والتي يتم إنتاجها من تبرعم الأغشية الداخلية باتجاه الجزء الداخلي من الجسيم الداخلي (المعروف باسم الإكسوسومات) وجهاز جولجي. لجمع المركبات الكهربائية الكبيرة والصغيرة بشكل منفصل ، نقوم بإجراء الطرد المركزي المتسلسل وجمع الكريات عن طريق الطرد المركزي عند 20,000 × جم و 110,000 × جم ، على التوالي. يتم إعداد جزء P1 EV (20,000 × جم كريات) لجمع المركبات الكهربائية الكبيرة ، ويتم إعداد جزء P2 EV (110,000 × جم من الكريات) لجمع المركبات الكهربائية الصغيرة¹⁵. منهجية تقييم مستويات LC3-II في المركبات الكهربائية الكبيرة والصغيرة المشتقة من الطرد المركزي المتسلسل عن طريق النشاف المناعي مستقرة وقابلة للتكرار¹⁶. بالإضافة إلى تحليل مستويات LC3-II في المركبات الكهربائية ، فإن تحليل تكوين الأوميجاسوم الذاتي وتكوين الأوميجاسوم يعزز فهم كيف يؤدي عدم تنظيم الالتهام الذاتي إلى إطلاق المركبات الكهربائية الإيجابية LC3-II. هنا ، توضح الدراسة الحالية الدور القمعي لبناء الجملة 6 (STX6) ، وهو بروتين SNARE ، الذي يعزز حركة حويصلات النقل لاستهداف^{الأغشية 17} ، في إطلاق LC3-II EVs الإيجابية عند تثبيط اندماج البلعمة الذاتية والليزوزوم.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. تحضير جزء الخلية و P1 و P2 EV من الوسط المزروع لخلايا HeLa

تحضير الجزء P1 و P2 EV من الوسط المزروع لخلايا HeLa
1. اليوم 1
  1. عد الخلايا باستخدام عداد الخلايا والبذور 1 × 10⁶ خلايا على صفيحة 6 سم تحتوي على وسط مزرعة يتكون من DMEM High Glucose و 10٪ FBS و 1٪ بنسلين / ستربتومايسين. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ والرطوبة المتحكم فيها لمدة 24 ساعة.
2. اليوم 2 (اختياري)
  1. تحضير محلول siRNA 20 ميكرومتر.
  2. امزج 100 ميكرولتر من وسط المصل المختزل و 3 ميكرولتر من siRNA في أنبوب منخفض الاحتباس لتحضير المحلول A.
  3. امزج 100 ميكرولتر من وسط المصل المختزل و 5 ميكرولتر من كاشف التعدي في أنبوب منخفض الاحتباس لتحضير المحلول B.
  4. اخلطي المحلول أ والمحلول ب ، ثم احتضان الخليط في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 5 دقائق.
  5. أضف خليط المحاليل A و B إلى الوسط المستخدم لزراعة خلايا HeLa. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ والرطوبة المتحكم فيها لمدة 24 ساعة.
3. اليوم 3
  1. اغسل الخلايا باستخدام PBS وعرضها إلى 500 ميكرولتر من 0.25٪ تريبسين و 1 ملي مولار محلول EDTA عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ والرطوبة الخاضعة للرقابة لمدة 5 دقائق.
  2. أضف 2.5 مل من وسط الاستزراع إلى الخلايا، واستخدم ماصة نقل باستور مع طرف ماصة سعة 200 ميكرولتر متصل لإعداد معلق أحادي الخلية.
  3. عد الخلايا باستخدام عداد الخلايا ، وقم بزرع 1 × 10⁶ خلايا على صفيحة 10 سم. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ والرطوبة المتحكم فيها لمدة 24 ساعة.
    ملاحظة: من الضروري تحضير ما لا يقل عن 1 × 10⁶ خلايا لجمع المركبات الكهربائية من وسط الاستزراع المطلوب لتحليل النشاف المناعي.
4. يوم 4
  1. تحضير وسط الاستزراع (انظر الخطوة 1.1.1.1) الذي يحتوي إما على مركبة (DMSO) أو 100 نانومتر بافيلومايسين A1 (BAF).
  2. قم بتعريض الخلايا للوسط الذي يحتوي على مركبة أو 100 نانومتر Baf واحتضانها عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ والرطوبة الخاضعة للرقابة لمدة 24 ساعة.
5. اليوم 5
  1. اجمع كل وسط الاستزراع من اللوحة مقاس 10 سم ، وانقله إلى أنبوب سعة 15 مل ، وقم بطرده عند 3,000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية لإزالة بقايا الخلية.
    ملاحظة: سيتم استخدام الخلايا المتبقية في اللوحة مقاس 10 سم في القسم 1.2.1.
  2. لعزل جزء P1 EV ، قم بنقل المادة الطافية بعد الطرد المركزي عند 3,000 × جم إلى أنبوب الطرد المركزي ، ثم قم بجهاز الطرد المركزي عند 20,000 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 1 ساعة.
  3. لعزل جزء P2 EV ، قم بنقل المادة الطافية بعد الطرد المركزي عند 20,000 × جم إلى أنبوب طرد مركزي فائق ، ثم قم بجهاز الطرد المركزي عند 110,000 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 1 ساعة.
  4. بعد مسح الرطوبة الزائدة داخل الأنبوب بمنديل مختبري ، أعد تعليق الكريات المتبقية في أنبوب الطرد المركزي في 50 ميكرولتر من 2x عينة عازلة [2.5٪ SDS ، 125 ملي مولار Tris-HCl (درجة الحموضة 6.8) ، 30٪ جلسرين ، 10٪ 2-ميركابتو إيثانول ، 0.4٪ بروموفينول أزرق] لتحضير جزء P1 EV.
  5. قم بإزالة المادة الطافية عن طريق الصب ، وامسح الرطوبة الزائدة داخل الأنبوب بمسح مختبري ، ثم أعد تعليق الكريات المتبقية في أنبوب الطرد المركزي الفائق في 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت للعينة 2x لتحضير جزء P2 EV.
  6. احتضان كسور P1 و P2 EV عند 100 درجة مئوية على كتلة حرارية لمدة 10 دقائق.
    ملاحظة: لا تهز الأنابيب بعد الطرد المركزي عند 20,000 × جم و 110,000 × جم لتجنب التخلص من الكريات المتبقية عن طريق الخطأ. بعد إمالة الأنبوب لنقل المادة الطافية ، حافظ على موضع الأنبوب لمنع الحبيبات من الانغماس في المادة الطافية المتبقية مرة أخرى.
تحضير جزء الخلية من خلايا HeLa المستنبتة
1. اليوم 5
  1. بعد نقل وسط الاستزراع من اللوحة مقاس 10 سم إلى أنبوب سعة 15 مل ، اغسل الخلايا في طبق 10 سم باستخدام PBS وعرضها إلى 2 مل من 0.25٪ تريبسين و 1 ملي مولار محلول EDTA عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ والرطوبة الخاضعة للرقابة لمدة 5 دقائق.
  2. أضف 8 مل من وسط النمو إلى الخلايا، ثم استخدم ماصة نقل باستور بطرف ماصة سعة 200 ميكرولتر لسحب الخلايا وإعداد معلق أحادي الخلية.
  3. انقل معلق الخلية إلى أنبوب سعة 15 مل وقم بطرده عند 1,000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  4. قم بإزالة المادة الطافية بواسطة شفاط ، وأضف PBS إلى حبيبات الخلية ، ثم جهاز الطرد المركزي عند 1,000 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  5. قم بإزالة PBS باستخدام شفاط وصوتنة حبيبات الخلية في 1 مل من المخزن المؤقت A68 [10 ملي مولار Tris-HCl المخزن المؤقت ، الرقم الهيدروجيني 7.5 ، 0.8 م كلوريد الصوديوم ، 1 ملي مولار إيثيلين جلايكول مكرر (β-أمينوإيثيل الأثير) -N ، N ، N ، N ، N-tetraacetic acid (EGTA)] يحتوي على 1٪ sarkosyl.
  6. قم بقياس تركيز البروتين في محللة الخلية باستخدام مجموعة فحص بروتين BCA.
  7. امزج 300 ميكرولتر من محللة الخلية مع 100 ميكرولتر من 4x عينة عازلة واحتضان الخليط عند 100 درجة مئوية على كتلة حرارية لمدة 10 دقائق لتحضير جزء الخلية.

2. تحليل النشاف المناعي

افصل كميات مكافئة من البروتينات في العينات بواسطة SDS-PAGE¹⁸.
انقل البروتينات المنفصلة إلى أغشية ثنائي فلوريد البولي فينيلدين (PVDF).
بعد النقل ، قم بسد الأغشية بعامل الحجب لمدة 20 دقيقة.
احتضان الغشاء المسدود طوال الليل مع الجسم المضاد الأولي المشار إليه في مخزن Tris المؤقت الذي يحتوي على 10٪ (v / v) مصل ربلة الساق في RT.
اغسل الغشاء باستخدام مخزن ثلاثي المؤقت لمدة 5 ثوان ثم احتضنه بجسم مضاد ثانوي مترافق بالبيوتين في RT لمدة ساعتين.
اغسل الغشاء باستخدام عازلة تريس لمدة 5 ثوان ثم احتضنه باستخدام محلول Tris المؤقت الذي يحتوي على محلول A بنسبة 0.4٪ (حجم / حجم) والمحلول B من المجموعة في RT لمدة 1 ساعة.
اغسل الغشاء باستخدام PBS ، ثم احتضنه باستخدام PBS يحتوي على 0.04٪ (وزن / حجم) ديامينوبنزيدين ، 0.8٪ (وزن / حجم) NiCl₂ · 6H₂O ، و 0.3٪ (v / v) H₂O₂ للكشف اللوني عن النطاقات.
ملاحظة: للكشف عن الإشارات ، طريقة التلألؤ الكيميائي مقبولة أيضا.
رقمنة صورة الغشاء بواسطة ماسح ضوئي وإخضاعه لتحليل قياس الكثافة باستخدام فيجي.
1. افتح الصورة الرقمية باستخدام فيجي ، وقم بتحويل صورة RGB الملونة إلى صورة 8 بت بالنقر فوق صورة | النوع | 8 بت.
2. انقر فوق أداة المستطيل واضبط حجم المستطيل عن طريق سحبه لإحاطة النطاقات. حدد النطاق المراد تحليله بالنقر فوق تحليل | المواد الهلامية | حدد الممر الأول.
3. ضع المستطيل على النطاقات الثانية واللاحقة ، وحدد النطاقات للتحليل بالنقر فوق تحليل | المواد الهلامية | حدد Next Lane.
4. بعد التعرف على النطاق النهائي ، قم بقياس قياس الكثافة عبر المستطيل بالنقر فوق تحليل | المواد الهلامية | مؤامرة الممرات.
5. أحيط منطقة إشارة النطاق بخط مستقيم ، وانقر فوق أداة العصا ، وانقر في المنطقة لحساب شدة إشارة النطاق.

3. تحليل عدد الجسيمات الذاتية والجسيمات التحللية الذاتية

اليوم 1
1. احسب عدد خلايا HeLa باستخدام عداد الخلايا ، وبذرة 1 × 10⁵ خلايا HeLa تعبر عن LAMP1-GFP و mCherry-LC3 على طبق 3.5 سم. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ والرطوبة المتحكم فيها لمدة 24 ساعة.
اليوم 2 (اختياري)
1. قم بتنفيذ الخطوات الموضحة في القسم 1.1.2 في أطباق مقاس 3.5 سم.
اليوم 3
1. تخلص من وسط الثقافة من الأطباق مقاس 3.5 سم.
2. اغسل الخلايا باستخدام PBS ، وعرضها ل 400 ميكرولتر من محلول 0.25٪ تريبسين و 1 ملي مولار EDTA ، واحتضانها عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO₂ والرطوبة الخاضعة للرقابة لمدة 5 دقائق.
3. أضف 1.6 مل من وسط النمو إلى الخلايا ، وقم بماصتها بماصة نقل باستور لتحضير معلق أحادي الخلية.
4. احسب عدد الخلايا باستخدام عداد الخلايا ، وقم بالبذور 1 × 10⁴ خلايا على غطاء مكون من 8 غرف. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ والرطوبة المتحكم فيها لمدة 24 ساعة.
  ملاحظة: يتم تحضير بئرين من الغطاء الحجري للتحكم وخلايا الضربة القاضية STX6 ، على التوالي ، بعد علاج DMSO أو Baf كما هو موضح في القسم 3.4.2.
يوم 4
1. تحضير وسط النمو بدون فينول أحمر (DMEM بدون فينول ريد ، 10٪ FBS ، 1٪ بنسلين / ستربتومايسين) ، يحتوي على مركبة (DMSO) أو 100 نانومتر Baf مذاب في DMSO.
2. استبدل وسط الاستزراع بالوسط الخالي من الفينول الأحمر ، والذي يحتوي إما على مركبة أو 100 نانومتر Baf ، واحتضانه لمدة 4 ساعات.
  ملاحظة: لتقييم تأثير Baf على أعداد البلعمة الذاتية والجسيمات الذاتية ، قم بإعداد الخلايا المعالجة بالمركبات كضوابط.
3. تلطخ النوى ب 0.33 ميكروغرام / مل Hoechst 33342 لمدة 30 دقيقة قبل المراقبة.
4. قم بإجراء تصوير الخلايا الحية باستخدام عدسة موضوعية 60x على مجهر ليزر متحد البؤر والتقط عشرة إطارات مختلفة.
  1. افتح صورة RGB المدمجة في فيجي ، وقسمها إلى مكونات الصورة الحمراء والخضراء والزرقاء ذات الصلة بالنقر فوق صورة | اللون | تقسيم القنوات.
  2. قم بتعيين حد ثابت للإشارتين الحمراء والخضراء في كل صورة بالنقر فوق صورة | ضبط | عتبة لكل تجربة.
  3. احسب عدد المناطق الإيجابية للإشارات الحمراء أو الخضراء بالنقر فوق تحليل | تحليل الجسيمات. حدد المربع تلخيص ، ثم انقر فوق موافق. سجل القيم من العد لتحديد الحويصلات المرتبطة بالبلعمة الذاتية والليزوسوم.
  4. لتراكب الصورة الخضراء على الصورة الحمراء، اضبط وضع النقل على AND بالنقر فوق تحرير | عنصر التحكم في اللصق. انسخ الصورة الخضراء ثم الصقها على الصورة الحمراء لدمجها ، مع تمييز المناطق الإيجابية لكل من الإشارات الحمراء والخضراء.
  5. لتحديد أرقام التحلل الذاتي ، احسب عدد المناطق الموجبة لكل من الإشارات الحمراء والخضراء بالنقر فوق تحليل | تحليل الجسيمات. حدد المربع تلخيص ، وانقر فوق موافق، وسجل القيم في قسم العد لتحديد الحويصلات المرتبطة بجسيمات ذاتية والجسيمات الحالة
5. اقسم العدد الإجمالي للجسيمات الذاتية والبلعمة الذاتية على العدد الإجمالي للخلايا لحساب عدد الجسيمات الذاتية والبلعمة الذاتية لكل خلية.
  ملاحظة: عد ما لا يقل عن 35 خلية في كل تجربة من التجارب الثلاث المستقلة.

4. تحليل تكوين الأوميجاسوم

اليوم 1
1. احسب عدد خلايا HeLa باستخدام عداد الخلايا ، وقم بزرع 1 × 10⁵ خلايا على طبق 3.5 سم. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ والرطوبة المتحكم فيها لمدة 24 ساعة.
اليوم 2 (اختياري)
1. قم بتنفيذ الخطوات الموضحة في القسم 1.1.2.
اليوم 3
1. قم بإعداد معلق أحادي الخلية كما هو موضح في الخطوات 3.3.1-3.3.2.
2. عد الخلايا باستخدام عداد الخلايا ، وبذر 1 × 10⁵ خلايا على طبق 3.5 سم. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ والرطوبة المتحكم فيها لمدة 24 ساعة.
يوم 4
1. امزج 1 ميكروغرام من pEGFP-C1-hAtg13 ، و 3 ميكرولتر من كاشف تعداء الحمض النووي ، و 100 ميكرولتر من وسط المصل المخفض في أنبوب احتجاز منخفض. احتضن الخليط لمدة 20 دقيقة ، ثم أضفه إلى الوسط المستنبت.
2. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ والرطوبة المتحكم فيها لمدة 24 ساعة.
اليوم 5
1. قم بتربسين الخلايا كما هو موضح في الخطوات 3.3.1-3.3.2.
2. أضف 2.5 مل من وسط النمو إلى الخلايا. قم بعرض الخليط باستخدام ماصة نقل باستور لتحضير معلق أحادي الخلية.
3. عد الخلايا باستخدام عداد الخلايا ، وقم بزرع 1 × 10⁴ خلايا على غطاء من 8 غرف. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ والرطوبة المتحكم فيها لمدة 24 ساعة.
يوم 6
1. اتبع الخطوات 3.4.1-3.4.4 لإجراء تصوير الخلايا الحية للخلايا من الخطوة 4.5.3 باستخدام مجهر ليزر متحد البؤر. التقط عشرة إطارات مختلفة من الصور.
  1. اتبع الخطوات 3.4.4.1-3.4.4.3 لتقسيم الصور المدمجة RGB إلى مكونات الصورة الحمراء والخضراء والزرقاء ذات الصلة، وتعيين حد ثابت للإشارات الخضراء في كل صورة، وتحديد شدة إشارة GFP. سجل القيم من قسم المساحة الإجمالية لتحديد شدة إشارة GFP-ATG13.
  2. اقسم إجمالي شدة الإشارة على عدد الخلايا التي تم فحصها لحساب شدة الإشارة لكل خلية.
    ملاحظة: عد ما لا يقل عن 34 خلية في كل تجربة من التجارب الثلاث المستقلة.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

كما هو موضح في الدراسات السابقة ، زاد علاج Baf من مستويات TSG101 (P1: P < 0.01 ، P2: P = 0.012 ، كما هو محدد بواسطة ANOVA ثنائي الاتجاه في EZR¹⁹) و LC3-II (P1: P < 0.01 ، P2: P < 0.01 ، كما هو محدد بواسطة ANOVA ثنائي الاتجاه في EZR¹⁹) في الجزء الغني بالمركبات الكهربائية. والجدير بالذكر أن علاج Baf زاد أيضا من مستويات STX6 (P1: P < 0.01 ، P2: P < 0.01 ، كما هو محدد بواسطة ANOVA ثنائي الاتجاه في EZR¹⁹) في جزء EV (الشكل 1 أ) ، مما يشير إلى أن STX6 قد يكون أحد مكونات المركبات الكهربائية. لم يلاحظ تكاثر المستضد النووي الخلوي (PCNA) في جزء EV. كشف النشاف المناعي ل STX6 في جزء الخلية أن مستويات STX6 انخفضت بمقدار النصف مع ضربة قاضية siRNA (الشكل 1 ب). لم تؤثر ضربة قاضية STX6 على مستويات TSG101 في الخلية وكسور EV في كل من الظروف المعالجة بالمركبة و Baf (الشكل 1 ج). ومع ذلك ، أدت ضربة قاضية STX6 إلى زيادة مستويات LC3-II في جزء الخلية في ظل الحالة المعالجة بالمركبة ، ولكن ليس في ظل الحالة المعالجة ب Baf. أدت ضربة قاضية STX6 أيضا إلى زيادة مستويات LC3-II في جزء EV في ظل حالة Baf المعالجة (الشكل 1D). تشير هذه النتائج إلى أن الطرق المستخدمة للكشف عن LC3-II في المركبات الكهربائية عن طريق النشاف المناعي حساسة بما فيه الكفاية ، حتى لو لم تكن كفاءة الضربة القاضية كبيرة. بالإضافة إلى ذلك ، تشير هذه النتائج إلى أن ضربة قاضية STX6 تزيد من أعداد البلعمة الذاتية داخل الخلايا وتعزز إطلاق الحويصلات المرتبطة بالجسيمات الذاتية خارج الخلية تحت علاج Baf.

لمزيد من التحقيق فيما إذا كانت ضربة قاضية STX6 تؤثر على أعداد البلعمة الذاتية داخل الخلايا والجسيمات الذاتية ، تم تصور الجسيمات الذاتية والليزوزومات باستخدام علامة البلعمة الذاتية mCherry-LC3 وعلامة الجسيمات الحالة LAMP1-GFP. كشف تصوير الخلايا الحية متحد البؤر عن حويصلات إيجابية GFP و mCherry في خلايا HeLa التي تعبر عن LAMP1-GFP و mCherry-LC3 (الشكل 2 أ). تم تحديد الجسيمات الذاتية على أنها حويصلات إيجابية ل GFP و mCherry ، بينما تم تحديد الجسيمات الذاتية على أنها حويصلات سلبية GFP وإيجابية mCherry. زادت ضربة قاضية STX6 من عدد الجسيمات الذاتية والجسيمات الذاتية في ظل الحالة المعالجة بالمركبة (الشكل 2 ب ، ج). ومع ذلك ، لم تؤثر ضربة قاضية STX6 على أرقام البلعمة الذاتية والجسيمات الذاتية في ظل حالة Baf المعالجة (الشكل 2 ب ، ج).

لتحديد ما إذا كانت الزيادة في أعداد البلعمة الذاتية داخل الخلايا بسبب ضربة قاضية STX6 ناتجة عن تكوين البلعمة الذاتية المعزز ، تم فحص تكوين الأوميجاسوم ، وهي عملية مطلوبة لتكوين البلعمة الذاتية ، باستخدام شدة إشارة علامة الأوميجاسوم GFP-ATG13. قدم تصوير الخلايا الحية متحد البؤر صورة مجمعة ل GFP-ATG13 ، مما يشير إلى تكوين الأوميغا (الشكل 3 أ). أدت ضربة قاضية STX6 إلى تقليل شدة إشارة GFP-ATG13 (P = 0.023 ، كما هو محدد بواسطة ANOVA ثنائي الاتجاه في EZR¹⁹). في حين أن ضربة قاضية STX6 لم تؤثر بشكل كبير على شدة إشارة GFP-ATG13 في ظل الظروف المعالجة بالمركبة ، إلا أنها قللت بشكل كبير من الإشارة في ظل الظروف المعالجة ب Baf (الشكل 3 ب). بشكل جماعي ، تشير هذه النتائج إلى أن ضربة قاضية STX6 تزيد من إطلاق الحويصلات الإيجابية LC3-II المرتبطة بتراكم الحويصلات المرتبطة بالبلعمة الذاتية.

figure-results-1
الشكل 1: نتائج النشاف المناعي للخلية ، P1 ، و P2 الكسور من خلايا HeLa المنقولة إما بالتحكم أو STX6 siRNA تحت معالجة السيارة أو Baf. تمت معالجة خلايا HeLa بالمركبة (DMSO) أو 100 نانومتر Baf لمدة 24 ساعة بعد التعدي باستخدام التحكم أو STX6 siRNA. تم عزل كسور الخلية P1 (20,000 × جم بيليه) و P2 (110,000 × جم بيليه). (أ) صور النشاف المناعي التمثيلية لكل جزء تظهر STX6 و TSG101 و LC3 و PCNA. (ب-د) تم إجراء تحليل قياس الكثافة ل (B) STX6 و (C) TSG101 و (D) LC3-II من صور اللطخة المناعية. تم تطبيع شدة الإشارة إلى الخلايا الضابطة أو الخلايا المنقولة STX6 siRNA المعالجة بالمركبة أو Baf. تمثل الرسوم البيانية الشريطية القيم المتوسطة ± SEM (N = 3). * يشير إلى P < 0.05 من خلال اختبار t ثنائي الذيل غير المقترن في Excel. الاختصارات: STX6 = بناء الجملة 6 ؛ باف = بافيلومايسين A1 ؛ DMSO = ثنائي ميثيل سلفوكسيد. TSG101 = جين قابلية الورم 101 ؛ LC3 = البروتينات المرتبطة بالأنابيب الدقيقة 1A / 1B سلسلة خفيفة 3B ؛ PCNA = مستضد نووي خلوي متكاثر. S.E.M. = الخطأ المعياري للمتوسط. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: تحليل الصورة متحد البؤر لخلايا HeLa التي تعبر عن Lamp1-GFP و mCherry-LC3 المنقولة بالتحكم أو STX6 siRNA في ظل حالة المعالجة بالمركبة و Baf. (أ) تم نقل الصور متحدة البؤر لخلايا HeLa التي تعبر بثبات عن LAMP1-GFP و mCherry-LC3 باستخدام التحكم أو STX6 siRNA لمدة 48 ساعة ، متبوعا بالتعرض ل DMSO أو 400 نانومتر Baf لمدة 4 ساعات. شريط المقياس = 20 ميكرومتر. (B ، C) تم إجراء كوب الجسيمات الذاتية (B) البلعمة الذاتية (LAMP1-GFP السلبي والنقاط الموجبة mCherry-LC3) و (C) التحلل الذاتي (LAMP1-GFP و mCherry-LC3 النقاط الموجبة المزدوجة) باستخدام برنامج فيجي. يتم تقديم البيانات الموجودة في الرسوم البيانية الشريطية كقيم متوسطة ± SEM (N = 3). * يشير إلى P < 0.05 ، بناء على اختبار t ثنائي الذيل غير المقترن في Excel. الاختصارات: Lamp1 = بروتين الغشاء المرتبط بالليزوزومال 1 ؛ LC3 = البروتينات المرتبطة بالأنابيب الدقيقة 1A / 1B سلسلة خفيفة 3B ؛ STX6 = بناء الجملة 6 ؛ باف = بافيلومايسين A1 ؛ GFP = بروتين الفلورسنت الأخضر. S.E.M. = الخطأ المعياري للمتوسط. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3: التصوير متحد البؤر لخلايا HeLa التي تعبر عن GFP-ATG13 ، المنقولة إما بالتحكم أو STX6 siRNA ، وتخضع لمعالجة السيارة أو Baf. (أ) تم نقل خلايا HeLa باستخدام التحكم أو STX6 siRNA ، متبوعة بتعداء pEGFP-C1-hAtg13 ، ومعالجتها باستخدام DMSO أو 400 نانومتر Baf لمدة 4 ساعات. شريط المقياس = 20 ميكرومتر. (ب) تم تحديد شدة الإشارة النسبية عن طريق تطبيع الإشارة في كل حالة إلى تلك الخاصة بالخلايا المنقولة siRNA الضابطة المعالجة ب Baf. يظهر الرسم البياني الشريطي البيانات كوسيلة ± SEM (N = 3). * يشير إلى P < 0.05 بواسطة اختبار t ثنائي الذيل غير المقترن في Excel. الاختصارات: hAtg13 = الجين البشري المرتبط بالالتهام الذاتي 13 ؛ STX6 = بناء الجملة 6 ؛ باف = بافيلومايسين A1 ؛ DMSO = ثنائي ميثيل سلفوكسيد. S.E.M. = الخطأ المعياري للمتوسط. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل التكميلي S1: تحليل اللطخة المناعية للخلية ، P1 ، و P2 الكسور من خلايا HeLa المنقولة باستخدام التحكم siRNA ومعالجتها ب Baf. تم نقل خلايا HeLa مع التحكم siRNA وتعرضت ل 100 نانومتر Baf لمدة 24 ساعة. ثم تم تحضير الكسور: الخلية ، P1 (20,000 × جم بيليه) ، و P2 (110,000 × جم بيليه). صور اللطخة المناعية التمثيلية ل ULK1 و PCNA ، تظهر مستوياتها في كل جزء للمقارنة. الاختصارات: Baf = bafilomycin A1 ؛ ULK1 = unc-51 مثل الالتهام الذاتي الذي ينشط كيناز 1 ؛ PCNA = مستضد نووي خلوي متكاثر. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

كشفت دراسة النشاف المناعي عن مستويات LC3-II و TSG101 في الجزء الخلوي ، وجزء P1 EV الغني بالمثبط الدقيق ، وجزء P2 EV الغني بالإكسوزوم. تم استخدام تصوير الخلايا الحية لفحص الجسيمات الذاتية ، والسومات المحللة الذاتية ، والأوميغا ، مما يوفر نظرة ثاقبة حول ما إذا كانت ضربة قاضية STX6 تؤثر على الالتهام الذاتي. تشير هذه النتائج المجمعة إلى أن ضربة قاضية STX6 تؤثر على إطلاق المركبات الكهربائية الإيجابية LC3-II ، والتي يحتمل أن تكون مرتبطة بخلل تنظيم مسار الالتهام الذاتي. تتمثل الميزة الرئيسية لهذه الطريقة في قدرتها على التمييز بين المركبات الكهربائية الكبيرة والصغيرة التي تنشأ من مصادر مختلفة. قد يوضح تحليل قياس التدفق الخلوي باستخدام علامات محددة للحويصلات الدقيقة أو الإكسوسومات أو جهاز جولجي بشكل أكبر كيف تؤثر ضربة قاضية STX6 على إطلاق الحويصلات الموجبة LC3-II.

ومع ذلك ، فإن أحد قيود دراسة النشاف المناعي هو أنه لا يزال من غير الواضح ما إذا كانت الزيادة الملحوظة في مستويات LC3-II في جزء EV بعد ضربة قاضية STX6 تحت علاج Baf ترجع إلى زيادة عدد الحويصلات الإيجابية LC3-II التي يتم إطلاقها أو زيادة في مستويات LC3-II لكل EV. للتمييز بين هذه الاحتمالات ، قد يساعد عد الحويصلات باستخدام تحليل تتبع الجسيمات النانوية أو تحليل قياس التدفق الخلوي في تحديد ما إذا كان عدد الحويصلات الموجبة LC3-II قد زاد أو إذا كانت مستويات LC3-II لكل حويصلة مرتفعة.

تتمثل الخطوة الحاسمة في البروتوكول في تجزئة الوسط المزروع لتحضير جزء EV. لوحظت المركبات الكهربائية على شكل كريات صغيرة في أنبوب الطرد المركزي. لتحضير جزء EV مماثل, من المهم نقل المادة الطافية أو التخلص منها بعناية بعد الطرد المركزي لتجنب تخفيف تركيز البروتين في كريات EV. لفحص التلوث من جزء الخلية إلى جزء EV ، تمت مقارنة مستويات البروتين السيتوبلازمي ، والالتهام الذاتي الشبيه ب unc-51 الذي ينشط كيناز 1 (ULK1) ، والبروتين النووي ، PCNA بين الكسور في هذه الدراسة (الشكل التكميلي S1). يعكس تركيز البروتين في جزء الخلية بشكل عام أعداد الخلايا ، لكن تركيز البروتين الخلوي يتأثر بمراحل دورة الخلية²⁰ أو الاضطرابات في البروتين²¹. الالتهام الذاتي أمر بالغ الأهمية للحفاظ على البروتين²². قد يؤدي عدم تنظيم الالتهام الذاتي عن طريق ضربة قاضية STX6 أو علاج Baf إلى تغيير تركيز البروتين بغض النظر عن عدد الخلية.

يتم تحقيق ضربة قاضية STX6 من خلال تعداء الحمض النووي الريبي ، ويتم الإفراط في التعبير عن GFP-ATG13 عن طريق تعداء الحمض النووي. تتأثر كفاءة التعدي بنوع الخلية وكثافتها وأعدادها. قد تؤثر المحاذاة الفعالة لتسلسلات siRNA أيضا على كفاءة الضربة القاضية. تكون التعديلات ضرورية عندما تكون كفاءة التعدي منخفضة.

تشير النتائج الحالية إلى أن ضربة قاضية STX6 زادت من مستويات علامة البلعم الذاتي LC3-II في جزء EV في ظل ظروف معالجة Baf ولكنها لم تؤثر على مستويات TSG101. يشير هذا إلى أن STX6 يثبط إطلاق الحويصلات المشتقة من الجسيمات الذاتية ، ولكن ليس من MVBs ، عندما يتم تثبيط اندماج البلعمة الذاتية والليزوزوم.

زادت ضربة قاضية STX6 أيضا من مستويات LC3-II الخلوية في ظل ظروف النمو ، مما يشير إلى أن STX6 ينظم الالتهام الذاتي. في الواقع ، زادت ضربة قاضية STX6 من عدد الجسيمات الذاتية والجسيمات المحللة الذاتية ، في حين أنها لم تعزز تكوين الأوميجاسوم. نضوج الجسيمات الذاتية يسبب إصلاح الجسيمات الحالة الذاتية²³. من الممكن أن يتوسط STX6 في عملية نضج الجسيمات الذاتية ، وقد يؤدي فقدانه للوظيفة إلى زيادة عدد الجسيمات الذاتية غير الناضجة ، مما يؤدي إلى خلل في اندماج الجسيمات الحالة الذاتية بسبب قمع إصلاح الجسيمات الحالة الذاتية.

زاد علاج BAF من مستويات STX6 في جزء EV ، حتى عندما تم تقليل تنظيم تعبيره. أشارت الدراسات السابقة إلى أن الحويصلات المرتبطة بالبلعمة الذاتية يتم إطلاقها على شكل مركبات كهربائية عندما يتم تثبيط وظيفة الليزوزومات¹³^،¹⁴. من المعروف أن STX6 يتوجب إلى الحويصلات المرتبطة بالبلعمة الذاتية ، مثل الفجوات الشبيهة بالجسيمات الذاتية المحتوية على المجموعة أ (GAS)²⁴. لذلك ، قد يتم توطين STX6 في الحويصلات المرتبطة بالبلعمة الذاتية والتي يتم إطلاقها على شكل مركبات كهربائية عند تثبيط اندماج البلعمة الذاتية والليزوزوم.

يرتبط انتشار أمراض TDP-43 ارتباطا وثيقا بتطور مرض التصلب الجانبي الضموري و FTLD-TDP³. على الرغم من أنه لا يزال من غير الواضح كيف ينتشر مرض TDP-43 عبر الدماغ والحبل الشوكي ، إلا أن مسار EV قد يتوسط انتشاره. أشارت الدراسات السابقة إلى أن عدم تنظيم مسار الالتهام الذاتي والجسيم الحاللي يؤدي إلى إطلاق LC3-II EVs الإيجابية التي تحتوي على TDP-43¹³. تقترح الدراسة الحالية دورا ل STX6 في تنظيم إطلاق EV عند تثبيط اندماج البلعمة الذاتية والليزوزوم. يجب أن تكون منهجية تقييم مستويات LC3-II في الخلايا وكسور EV عن طريق النشاف المناعي مفيدة في الدراسات المستقبلية.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم تضارب في المصالح مع محتويات هذه المقالة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل بتمويل ل Y.T. من الجمعية اليابانية لتعزيز العلوم KAKENHI [رقم المنحة 23K06837] (طوكيو ، اليابان) ومؤسسة تاكيدا للعلوم (أوساكا ، اليابان). يقدر المؤلفون الدكتور ديفيد سي روبينشتاين (معهد كامبريدج للأبحاث الطبية ، كامبريدج ، المملكة المتحدة) لتزويده بخلايا HeLa.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
0.25٪ Trypsin EDTA	Fujifilm Wako	201-16945
10 سم طبق	ثيرمو فيشر العلمي	150464
15 مل أنبوب	ثيرمو فيشر العلمي	339650
200 & L طرف الماصة	Nippon Genetics	FG-301	ماصة
2-Mercaptoethanol	Nacalai Tesque	21417-52	مادة لمحلول عازلة عينة
3،3'-Diaminobenzidine رباعي هيدروكلوريد	Nacalai Tesque	11009-41	مادة لمحلول DAB
3.5 سم طبق & nbsp;	ثيرمو فيشر ساينتيف	150460
طبق 6 سم	TR4001		TrueLine
TR4001 (حمامات حرارية جافة)	EYELA	273860
شفاط	SANSYO	SAP-102	محلول استنشاق
Avanti JXN-30	Beckman Coulter	B34193
Bafilomycin A1	Adipogen	BVT-0252
الأجسام المضادة IgG المترافق بالبيوتين	المختبرات	BA-1000	2nd الجسم المضاد للنخاف
للحصان المضاد للماوس IgG	مختبرات ناقلات الأجسام المضادة للخيول	BA-2000	الجسم المضاد الثاني للنشاف المناعي
حجب واحد	Nacalai Tesque	03953-95	مادة للنشاف المناعي
Bromophenol Blue	Nacalai Tesque	05808-61	مادة لمحلول عازلة عينة
مصل	العجل cytiva	SH30073.03
CanoScan LiDE 220	Canon	CSLIDE220	Scanner
جهاز طرد مركزي 5702 R	eppendolf	5703000039
عد الشرائح غرفة مزدوجة	Bio-Rad	1450015J	عد الخلايا
رقمي سونيفير 450	برانسون
ثنائي ميثيل سلفوكسيد	ناكالاي تاسك	09659-14	مركبة
DMEM عالية الجلوكوز	Nacalai Tesque	08458-45	متوسط ثقافة
DMEM بدون فينول أحمر	Nacalai Tesque	08489-45	استزراع متوسط
EGTA	Dojindo	348-01311	مادة لحل A68
Excel	Microsoft	الإصدار 16.16.27	التحليل المنطقي
EZR	المرجع رقم 24	الإصدار 1.68	التحليل الsatistical
FBS	Sigma	173012	الثقافة
المتوسطة فيجي	المعاهد الوطنية للصحة		أداة تحليل الصور
Glycerol	Nacalai Tesque	09886-05	مادة لحل المخزن المؤقت عينة
Hoehst33342	Dojindo ؛	H342
بيروكسيد الهيدروجين	فوجي فيلم واكو	080-0186	مادة لحل DAB
Kimwipe S-200	NIPPON PAPER	CRECIA 62011	مسح تنظيف
أنبوب احتفاظ منخفض	Nippon Genetics	FG-MCT015CLB	siRNA و DNA transfection
LSM780 مجهر ليزر متحد البؤر	Carl Zeiss
ماوس أحادي النسيلة مضاد ل LC3 الأجسام المضادة	MBL	M186-3	الجسم المضاد الأول للنشاف المناعي
النيكل (II) كلوريد سداسي الهيدرات	فوجي فيلم واكو	149-01041	مادة لمحلول DAB
N-Lauroylsarcosine ملح الصوديوم	Nacalai Tesque	20117-12
Optima XE-90 أجهزة الطرد المركزي	الفائقة Beckman Coulter	A94471
Opti-MEM I مصل منخفض متوسط	ثيرمو فيشر Scientific	31985-070	siRNA و DNA transfection
pEGFP-C1-hAtg13	Addgene	22875
Penicillin / Streptomycin	Nacalai Tesque	26253-84	ثقافة متوسطة
بيرس BCA مجموعات فحص البروتين	Thermo Fisher Scientific	23225
الأرنب متعدد النسيلة المضاد للأجسام المضادة PCNA	BioAcademia	70-080	1st الجسم المضاد ل المناعي
نشاف الأرنب متعدد النسيلة المضاد لتركيب 6 بروتين الأجسام	المضادةTech	10841-1-AP	الجسم المضاد الأول للنشاف
المناعي للأرانب متعدد النسيلة المضاد TSG101 بروتين الأجسام المضادةTech		28283-1-AP	الجسم المضاد الأول للنشاف
المناعي الأرنب متعدد النسيلة المضاد للأجسام المضادة ULK1	بروتينTech	20986-1-AP	الجسم المضاد الأول للنشاف المناعي
ثنائي فلوريد البولي فينيلدين غشاء	Milliore	IPVH00010	مادة للنشاف المناعي
للفريق الأساسي لتطوير	R	الإصدار 4.4.1	التحليل الsatistical
RNAiMAX	Thermo Fisher Scientific	13778	كاشف التعداء
siRNA STX6	Thermo Fisher Scientific	HSS115604	siRNA لتعداء
كلوريد الصوديوم	Nacalai Tesque	31320-05	مادة للمخزن المؤقت Tris ومحلول A68
كبريتات دوديسيل الصوديوم	فوجيفيلم	واكو 192-13981	مادة لمحلول عازلة عينة
SPARK Microplate Reader	TECAN
Stealth RNAi دوبلكس للتحكم السلبي ، Med GC	Thermo Fisher Scientific	12935300	siRNA transfection
Sucrose	Fujifilm Wako	193-00025	مادة لحل A68
عداد الخلايا الآلي TC20 مع طابعة حرارية	Bio-Rad	1450109J1	عد الخلايا
Thermobath	طوكيو ريكاكاي	MG-3100	حضانة
TransIT-293	Mirus Bio	MIR 2700	كاشف تعداء الحمض النووي
TransIT-LT1	Mirus Bio	MIR2300	كاشف
تعداء الحمض النوويTris(hydroxymethyl) aminomethane	Nacalai Tesque	35406-75	مادة للمخزن المؤقت Tris ، المخزن المؤقت للعينة ومحلول A68
Trypan Blue Dye 0.40٪	Bio-Rad	1450021	عد
الخلايا أنبوب مفتوح فائق الوضوح ، 16 × 96 مم & nbsp ؛	361706 جمع بيكمان كولتر		لكسر P1
EV ، 14 × 89 مم	بيكمان كولتر	344059	الجمع لكسر P2 EV
Vectastain ABC Standard Kit	Vector Laboratories ؛	زجاجة غسيل PK-4000	immunoblotting
	كواحد	1-4640-02	غشاء
غسيل mu & - شريحة 8 بئر عالية	ibidi	80806

حمامات ترموستاتي من الألومنيوم من ناقل المناعي لأنبوب فائق الوضوح

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tanaka, Y., Hasegawa, M. Profilin 1 mutants form aggregates that induce accumulation of prion-like tdp-43. Prion. 10 (4), 283-289 (2016).
Mehta, P. R., Brown, A. L., Ward, M. E., Fratta, P. The era of cryptic exons: Implications for als-ftd. Mol Neurodegener. 18 (1), 16(2023).
Kawakami, I., Arai, T., Hasegawa, M. The basis of clinicopathological heterogeneity in tdp-43 proteinopathy. Acta Neuropathol. 138 (5), 751-770 (2019).
Chatterjee, M., et al. Plasma extracellular vesicle tau and tdp-43 as diagnostic biomarkers in ftd and als. Nat Med. 30 (6), 1771-1783 (2024).
Kasai, T., et al. Combined use of csf nfl and csf tdp-43 improves diagnostic performance in als. Ann Clin Transl Neurol. 6 (12), 2489-2502 (2019).
Iguchi, Y., et al. Exosome secretion is a key pathway for clearance of pathological tdp-43. Brain. 139 (Pt 12), 3187-3201 (2016).
Ding, X., et al. Exposure to als-ftd-csf generates tdp-43 aggregates in glioblastoma cells through exosomes and tnts-like structure. Oncotarget. 6 (27), 24178-24191 (2015).
Mizushima, N., Levine, B. Autophagy in human diseases. N Engl J Med. 383 (16), 1564-1576 (2020).
Sasaki, S. Autophagy in spinal cord motor neurons in sporadic amyotrophic lateral sclerosis. J Neuropathol Exp Neurol. 70 (5), 349-359 (2011).
Ling, S. C., Polymenidou, M., Cleveland, D. W. Converging mechanisms in als and ftd: Disrupted rna and protein homeostasis. Neuron. 79 (3), 416-438 (2013).
Nguyen, D. K. H., Thombre, R., Wang, J. Autophagy as a common pathway in amyotrophic lateral sclerosis. Neurosci Lett. 697, 34-48 (2019).
Tanaka, Y., et al. Possible involvement of lysosomal dysfunction in pathological changes of the brain in aged progranulin-deficient mice. Acta Neuropathol Commun. 2, 78(2014).
Tanaka, Y., et al. Dysregulation of the progranulin-driven autophagy-lysosomal pathway mediates secretion of the nuclear protein tdp-43. J Biol Chem. 299 (11), 105272(2023).
Tanaka, Y., Ito, S., Suzuki, G. TDP-43 secretion via extracellular vesicles is regulated by macroautophagy. Autophagy Rep. 3 (1), (2024).
Ratajczak, M., Ratajczak, J. Extracellular microvesicles/exosomes: discovery, disbelief, acceptance, and the future. Leukemia. 34 (12), 3126-3135 (2020).
Tanaka, Y., Kozuma, L., Hino, H., Takeya, K., Eto, M. Abemaciclib and vacuolin-1 decrease aggregate-prone tdp-43 accumulation by accelerating autophagic flux. Biochem Biophys Rep. 38, 101705(2024).
Dingjan, I., et al. Endosomal and phagosomal snares. Physiol Rev. 98 (3), 1465-1492 (2018).
Tanaka, Y., et al. Progranulin regulates lysosomal function and biogenesis through acidification of lysosomes. Hum Mol Genet. 26 (5), 969-988 (2017).
Kanda, Y. Investigation of the freely available easy-to-use software 'EZR' for medical statistics. Bone Marrow Transpl. 48 (3), 452-458 (2013).
Cookson, N. A., Cookson, S. W., Tsimring, L. S., Hasty, J. Cell cycle-dependent variations in protein concentration. Nucleic Acids Res. 38 (8), 2676-2681 (2010).
Plate, L., et al. Small molecule proteostasis regulators that reprogram the ER to reduce extracellular protein aggregation. eLife. 5, e15550(2016).
Mizushima, N. The role of mammalian autophagy in protein metabolism. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 83 (2), 39-46 (2007).
Nanayakkara, R., et al. Autophagic lysosome reformation in health and disease. Autophagy. 19 (5), 1378-1395 (2023).
Nozawa, T., Minowa-Nozawa, A., Aikawa, C., Nakagawa, I. The STX6-VTI1B-VAMP3 complex facilitates xenophagy by regulating the fusion between recycling endosomes and autophagosomes. Autophagy. 13 (1), 57-69 (2017).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

TDP 43 A1 siRNA 6

تقييم إطلاق LC3-II عبر الحويصلات خارج الخلية فيما يتعلق بتراكم الحويصلات الإيجابية LC3 داخل الخلايا

في هذه المقالة

ملخص

الملخص

المقدمة

البروتوكول

النتائج

المناقشة

الإفصاحات

شكر وتقدير

المواد

المراجع

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

مقالات ذات صلة