مقالة منهجية

يسهل Glycoproteomics الموجه ب Glycomics التنميط الشامل للجليكوبروتيوم في البيئات الدقيقة المعقدة للورم

DOI:

10.3791/67405

⸱

فبراير 7, 2025

 ,  ,  ,  , 
1School of Natural Sciences, Faculty of Science and Engineering, Macquarie University, 2Institute for Glyco-core Research (iGCORE), Nagoya University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوضح هذا البروتوكول بالتفصيل طريقة علم السكر الجليكوبروتيوم الموجه بعلم السكر ، وهي تقنية omics متكاملة تقدم رؤى شاملة حول الجليكوبروتيوم غير المتجانس في البيئات الدقيقة المعقدة للورم المطلوبة لفهم بيولوجيا السكر في السرطانات بشكل أفضل.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الارتباط بالجليكوزيل هو تعديل بروتين شائع ومتنوع هيكليا يؤثر على مجموعة واسعة من العمليات السرطانية. ظهرت الجليكوميوم التي تعتمد على قياس الطيف الكتلي وعلم السكر البروي كأساليب قوية لتحليل الجليكان المحرر والجليكوببتيدات السليمة ، على التوالي ، مما يوفر فهما أعمق للجليكوبروتيوم غير المتجانس في البيئة المكروية للورم (TME). يوضح هذا البروتوكول بالتفصيل طريقة glycoproteomics الموجهة بعلم السكر ، وهي تقنية omics متكاملة ، والتي تستخدم أولا الجليكوميات المستندة إلى الكربون الجرافيتي المسامي LC-MS / MS لتوضيح هياكل الجليكان وتوزيعها الكمي في glycome لأنسجة الورم أو مجموعات الخلايا أو سوائل الجسم التي يتم فحصها. يسمح ذلك بتحليل الجليكوزيلات المقارن لتحديد الجليكوزيل المتغير عبر مجموعات المرضى أو مراحل المرض أو الظروف ، والأهم من ذلك ، أنه يعمل على تعزيز تحليل الجليكوبروتيوميات النهائية لنفس العينة (العينات) من خلال إنشاء مكتبة من هياكل الجليكان المعروفة ، وبالتالي تقليل وقت البحث عن البيانات ومعدل التعريف الخاطئ للبروتين السكري. مع التركيز على توصيف N-glycoproteome ، يتم تفصيل خطوات تحضير العينة لطريقة glycoproteomics الموجهة بالجليكوميكس في هذا البروتوكول ، وتناقش الجوانب الرئيسية لجمع البيانات وتحليلها. توفر طريقة glycoproteomics الموجهة بعلم السكر معلومات كمية عن البروتينات السكرية الموجودة في TME ومواقع الارتباط بالجليكوزيل ، وإشغال الموقع ، وهياكل الجليكان الخاصة بالموقع. يتم تقديم النتائج التمثيلية من أنسجة الورم المضمنة في البارافين المثبتة بالفورمالين من مرضى سرطان القولون والمستقيم ، مما يدل على أن الطريقة حساسة ومتوافقة مع أقسام الأنسجة الموجودة بشكل شائع في البنوك الحيوية. لذلك ، فإن علم السكر الجليكوبروتيوميا الموجه بالغليكوميكس يقدم رؤية شاملة لعدم تجانس وديناميكيات الجليكوبروتيوم في TMEs المعقدة ، مما يولد بيانات كيميائية حيوية قوية مطلوبة لفهم علم الأحياء السكرية للسرطانات بشكل أفضل.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الارتباط بالجليكوزيل للبروتين هو نوع سائد ومعقد من التعديل المشترك وما بعد الترجمة للبروتينات التي تنتجها الأنواع عبر شجرة النشوء والتطور للحياة1،2،3. من المعروف أن الجليكان المرتبط بالبروتين يؤثر على مجموعة واسعة من العمليات البيولوجية المهمة لصحة الإنسان ، بما في ذلك الوساطة وتنظيم التفاعلات الخلوية وأحداثالاتصال 4،5. يعتقد أن الارتباط بالجليكوزيل للبروتين الشاذ هو سبب التحول الخبيث وتطور الورموانتشاره 6،7،8. هذا يتورط الجليكان في العمليات الرئيسية للأورام في البيئة المكروية للورم (TME) ويوفر إمكانات كبيرة وغير مستغلة إلى حد كبير لاكتشاف المؤشرات الحيوية القائمة على الجليكان والتطبيقات العلاجية. لذلك ، تحظى بيولوجيا السكر باهتمام متزايد في أبحاث السرطان وعبر علومالحياة 9.

مدعوما بالتطورات الرئيسية في التحليلات الجليكوتكنولوجية والمعلوماتية على مدار العقد الماضي ،تم إنشاء 10،11،12،13،14،15،16،17 ، وقياس الطيف الكتلي الترادفي للكروماتوغرافيا السائلة (LC-MS / MS) وعلم السكر والسكريوبروتيوميا كأدوات قوية للتنميط على مستوى النظام للجليكانات المحررة والجليكوببتيدات السليمة من الخلائط المعقدة من البروتينات السكرية المستخرجة مباشرة من أصول عينتها البيولوجية مثل أنواع مختلفة من عينات مرضى السرطان (على سبيل المثال ، أنسجة الورم ، مجموعات الخلايا ، سوائل الجسم) 3،13،18،19،20.

يوفر Glycomics معلومات عن بنية وكمية ذخيرة الجليكان (glycome) ، والتي يتم إنتاجها ديناميكيا بواسطة الخلايا والأنسجة وحتى الكائنات الحية بأكملها. من ناحية أخرى ، يوفر علم السكر والدماغ معلومات كمية حول حاملات البروتين ومواقعها (مواقعها) من الارتباط بالجليكوزيل ، ومعدلات إشغال الموقع (عدم التجانس الكلي) ، وتركيبات الجليكان الخاصة بالموقع ونمط توزيع الموقع (عدم التجانس الدقيق) مع معلومات هيكلية محدودة من الجليكان (غالبا ما تقتصر على تكوين الجليكان)15 ، 16 ، 21. ومن ثم ، فإن علم السكر السكري وعلم السكر هي طرق تكميلية لمسح التفاصيل الكيميائية الحيوية للجليكوبروتيوم22.

تم تطوير عدد لا يحصى من التصميمات المنهجية والاستراتيجيات التحليلية لعلم السكر وعلم السكر والبروتين السكري وتطبيقها عبر المختبرات اعتمادا على تحليل الجليكوآليت محل الاهتمام (على سبيل المثال ، المرتبط ب N / O / C ، الجليكان / الجليكوببتيد / البروتين السكري ، المسمى / غير المسمى) ، وطبيعة العينة (على سبيل المثال ، الخلايا والأنسجة وسوائل الجسم) ، والكمية (مستويات البروتين النانوغرام / ميكروغرام / مليغرام) والأداة التحليلية المتاحة23 ، 24،25،26،27،28،29،30،31،32. على الرغم من الفوائد المعترف بها لاستخدامها الموازي ، لا يتم تطبيق علم السكر السكري وعلم السكر بشكل شائع معا بل كنهج قائم بذاته في دراسات أبحاث الجليكوبيولوجيا والسرطان نظرا لارتفاع الطلب على الخبرة التحليلية والأجهزة المتخصصة.

إدراكا لهذه الفجوة التكنولوجية ، منذ أكثر من عقد من الزمان ، قدمنا طريقة glycoproteomics بمساعدة Glycomics ، والتي هي قادرة على دمج بيانات Glycomics و glycoproteomics التي تم الحصول عليها من العينات البيولوجية المعقدة33. باختصار ، تقوم تقنية glycoproteomics بمساعدة الجليكوميكس (أو الموجهة بالجليكوميكس كما في هذا البروتوكول) بملامح N- و / أو O-glycans من خلال طريقة LC-MS / MS للكربون الجرافيتي المسامي (PGC)LC-MS / MS 34،35 ، والتي تستخدم بعد ذلك لتحليل بيانات N و / أو O-glycopeptide السليمة التي تم الحصول عليها من نفس العينة (العينات) من خلال تحديد حدود مساحة البحث عن الجليكان36. PGC-LC-MS / MS هي طريقة قوية بشكل خاص لعلم السكر لأنها توفر نظرة ثاقبة كمية للغليكوم بحساسية عالية ودقة هيكلية ، مما ينتج عنه معلومات عن الطوبولوجيا (تسلسل السكريات الأحادية ونمط التفرع) والروابط الجليكوسيدية للجليكان حتى داخل الخلائط المعقدة35،37،38. يتضمن سير عمل الجليكوبروتيوميك توليد الببتيد ، ووضع العلامات الاختيارية على الببتيد ، وتعدد الإرسال ، والتقسيم المسبق ، بالإضافة إلى التخصيب قبل تحليل LC-MS / MS في المرحلة العكسية الذي يستخدم بشكل مثالي طرق تجزئة مختلفة بما في ذلك طاقة الاصطدام المتدرجة / التفكك التصادمي عالي الطاقة (sceHCD ، ل N-glycopeptides) ونقل الإلكترون / التفكك التصادمي عالي الطاقة (EThcD ، ل O-glycopeptides) لتحديد التحليل بالنسبة لتحليل N-glycoproteome ، يمكن أن يوجه de-N-glycoproteomics المتوازي تحليل بيانات N-glycopeptide السليم من خلال تحديد مساحة البحث عن البروتين / الببتيد ومن خلال تقديم مزيد من التفاصيل حول مواقع N-glycosylation المشغولة ومعدل إشغال الموقع بينما يكشف التحليل الموازي للببتيدات غير المعدلة عن أي تغيرات في مستوى البروتين بين الظروف المدروسة.

توفر هذه الورقة بروتوكولا مفصلا وسهل المتابعة خطوة بخطوة لطريقة glycoproteomics الموجهة بالجليكوميكس (انظر الشكل 1 للحصول على نظرة عامة على سير العمل). يوفر البروتوكول تفاصيل تجريبية لخطوات تحضير العينة وتجارب علم السكر وعلم السكر القائم على LC-MS / MS ويقدم نتائج تمثيلية توضح تطبيق الطريقة على أقسام أنسجة البارافين المثبتة بالفورمالين (FFPE) للأورام المستخلصة من مرضى سرطان القولون والمستقيم (CRC) ، مما يتيح رؤى حول علم الأحياء السكرية في TME في نوع عينة قيم مؤرشفة في البنوك الحيوية للسرطان حول العالم. كما تمت مناقشة تحليل وتكامل بيانات الجليكوبروتيوميك وبيانات الجلوكوبروتيوميكس بإيجاز.

figure-introduction-1
الشكل 1: نظرة عامة على طريقة علم السكر الجليكوبروتيوميك الموجه بالجلوكيميات. توضح النظرة العامة خطوات تجريبية مفصلة في سير عمل علم السكر (يسار) وعلم السكر (يمين) ، مع نظرة عامة على المعلومات التي تم الحصول عليها (بالخط العريض) وكيفية دمج النهجين من خلال تحسين تحليل البيانات وتفسيرها. إدراج: أعمدة SPE الدقيقة محلية الصنع تستخدم لسير عمل الجليكوميديات (i) و (ii-iii) glycoproteomics. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت الموافقة على الدراسة من قبل لجنة أخلاقيات البحث البشري (العلوم الطبية) في جامعة ماكواري ، سيدني ، أستراليا (البروتوكول 5201800073).

ملاحظة: يمكن تطبيق طريقة علم السكر السكري الموجه بعلم السكر على مجموعة متنوعة من العينات البيولوجية التي تتراوح من تعقيد البروتين السكري المنخفض إلى الشديد. بالنسبة لنهج الجليكوبروتيوميك الخالية من الملصقات (التي لا يتم فيها تجميع العينات) ، يلزم وجود ما يقرب من 100-200 ميكروغرام من البروتين الكلي من المخاليط المعقدة كمادة أولية لضمان تغطية عالية للجليكوبروتيوم بعد تخصيب الجليكوببتيدات التي قد تشكل فقط 1٪ -10٪ من مجموعة الببتيدات. نظرا لضيق المساحة ، يتم استبعاد استخراج البروتين الأولي من الخلايا أو الأنسجة ، ويتم إحالة القراء إلى موارد أخرى15. تستهلك Glycomics بشكل متحفظ ~ 10-20 ميكروغرام من البروتين لكل تحليل من أجل التنميط العميق للجليكوم ، تاركا غالبية مستخلص البروتين ل glycoproteomics. إذا لم ينص على خلاف ذلك ، فقد تم ذكر التركيزات النهائية ، ويجب إذابة المواد الكيميائية في ماء عالي الجودة لعمل محاليل مائية في البروتوكول أدناه.

1. تحضير البروتين

  1. تحديد تركيز البروتين في المستخلصات باستخدام طريقة معمول بها (على سبيل المثال ، حمض البيسينشونيك أو فحوصات بروتين برادفورد). اضبط تركيز البروتين على 10 ميكروغرام / ميكرولتر في 50 ملي مولار TEAB (درجة الحموضة 8.5).
  2. قلل روابط ثاني كبريتيد عن طريق احتضان العينات ب 10 ملي مولار DTT لمدة 45 دقيقة عند 56 درجة مئوية. مجموعات الثيول الخالية من الألكيلات عن طريق احتضان عينات لاحقة مع 40 ملي مولار IAA في الظلام لمدة 30 دقيقة عند 20-25 درجة مئوية. إخماد تفاعل الألكلة مع DTT الزائد (~ 40 مليمتر).
  3. قسم كل عينة بروتين. اسمح بحوالي 10-20 ميكروغرام من البروتين الكلي للسكريوميات و 100-200 ميكروغرام من البروتين الكلي لسير عمل الجلوكوبروتيوميك.
    ملاحظة: بالإضافة إلى عينة (عينات) البروتين ذات الأهمية ، قم بتضمين نموذج معروف للبروتين السكري (على سبيل المثال ، الفيتوين البقري) أو خليط البروتين (على سبيل المثال ، محللة خط الخلية ، البلازما) لتقييم كفاءة وقابلية تكرار الإجراءات ومراقبة أداء LC-MS / MS.

2. سير عمل N-glycomics

  1. تثبيت البروتينات على غشاء PVDF
    1. استخدم أداة ثقب واحدة لقطع غشاء PVDF المناسب مع عدد عينات البروتين المراد رصدها.
    2. بلل الأغشية المقطوعة بالإيثانول أو الميثانول ، ثم انقل الأغشية إلى صفيحة مسطحة القاع 96 بئرا.
    3. بمجرد أن تصبح الأغشية شبه جافة ، قم بإيداع عينات البروتين بحجم أقصى يبلغ 2.5 ميكرولتر لكل بقعة لتقليل مساحة سطح عينة البروتين المترسبة. أعد تحديد العينات إذا لزم الأمر بحيث تكون الكمية الإجمالية للبروتين الثابت على الفور ~ 10-20 ميكروغرام. للقيام بذلك ، اترك البقعة تجف في الهواء قبل تكرار إجراء الإكتشاف.
      ملاحظة: أثناء الإكتشاف ، قد تكون هناك حاجة إلى إعادة ترطيب الغشاء بالإيثانول أو الميثانول لمنع الأغشية من الجفاف حتى الانتهاء.
    4. جفف الأغشية بالهواء عند 20-25 درجة مئوية لمدة 3 ساعات على الأقل ، ويفضل بين عشية وضحاها. تجنب أي تلوث للأغشية أثناء التجفيف.
      ملاحظة: كخطوة اختيارية لمراقبة الجودة ، يمكن تصور البروتينات المرقطة على الأغشية عن طريق تلطيخها بمحلول Direct Blue 71 كما هو موضح سابقا34.
  2. إطلاق N-glycans المرتبط بالبروتين
    1. أضف 100 ميكرولتر من 1٪ (وزن / حجم) PVP40 في الميثانول إلى كل بئر يحتوي على الأغشية المرقطة. تأكد من أن جانب الغشاء الذي تم رصد عينة البروتين عليه متجها لأعلى طوال تحضير العينة.
    2. رج اللوحة في محلول PVP40 لمدة 5 دقائق عند 20-25 درجة مئوية ، ثم تخلص من محلول PVP40.
      ملاحظة: يمنع محلول PVP40 أغشية PVDF والآبار لمنع الارتباط غير المحدد ل PNGase F (وأي إكزوغليكوزيزيداسات يمكن تطبيقها لتحقيق معلومات خاصة بالارتباط في تجارب متوازية ؛ انظر المناقشة أدناه) في الخطوات اللاحقة.
    3. اغسل كل بئر يحتوي على بقع البروتين المسدودة ب 100 ميكرولتر من الماء عالي النقاء ورج الطبق لمدة 5 دقائق. كرر هذه الخطوة 3x. تأكد من التخلص من الماء تماما بعد كل غسلة.
    4. أضف 15 ميكرولتر من محلول PNGase F (0.5 وحدة / ميكرولتر ، مخفف في ماء فائق النقاء من محلول مخزون 10 U / μL) إلى كل بئر ، بافتراض أن 15 ميكروغرام بروتين لكل عينة قد تم ترسيبها.
    5. أضف الماء إلى الآبار الفارغة المحيطة لمنع جفاف العينة أثناء خطوات الحضانة اللاحقة ، واستخدم غشاء شفافا لإغلاق اللوحة بعناية. احتضان اللوحة لمدة 8 ساعات على الأقل عند 37 درجة مئوية.
    6. قم بتجميع اللوحة لمدة 5 دقائق لمساعدة أي قطرات متبخرة على جانب الآبار على التجمع في قاع اللوحة.
    7. انقل عينات N-glycan التي تم إطلاقها بعناية إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيقة الفردية (1.5 مل). اغسل آبار العينة 2x ب 20 ميكرولتر من الماء عالي النقاء ، وقم بتوزيعه والشفط عدة مرات. اجمع أي عينة متبقية من كل بئر في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة التي تحتوي على عينات N-glycan.
      ملاحظة: تجنب استخدام أنابيب منخفضة الارتباط لتحضير عينة N-glycomics ، حيث قد ترتبط الجليكانات المحبة للماء بشكل لا رجعة فيه بالأنابيب المطلية.
    8. أضف 10 ميكرولتر من 100 ملي مولار أسيتات الأمونيوم درجة الحموضة 5.0 واحتضان العينات لمدة ساعة واحدة عند 20-25 درجة مئوية.
      ملاحظة: تقوم هذه الخطوة بهيدروكسيل بقايا N-acetylglucosamine الممتنة على الطرف المختزل من N-glycans التي تم إطلاقها ، مما يسمح بانخفاض شامل في الخطوة اللاحقة. اضبط 100 ملي مولار من أسيتات الأمونيوم على درجة الحموضة 5.0 حيث تعتمد معدلات التحويل العالية من الجليكوزيلامين إلى الهيدروكسيل في الطرف المختزل من N-glycans المنفصلة على الحموضة الضعيفة للمحلول.
    9. جفف عينات N-glycan في نظام مكثف فراغي.
  3. الحد من N-glycans المحررة
    1. أضف 20 ميكرولتر من 1 M NaBH4 في 50 ملي KOH المحضرة حديثا إلى عينات N-glycan المجففة واخلطها جيدا.
      ملاحظة: يجب تحضير NaBH4 طازجا في KOH في يوم استخدامه.
    2. أغلق أغطية كل أنبوب بإحكام واحتضان العينات لمدة 3 ساعات عند 50 درجة مئوية.
      ملاحظة: تخضع N-glycans لتخفيض ، والذي يحول أنومرات α و β للطرف المختزل إلى شكل ألديتول واحد ، مما يؤدي إلى ذروة كروماتوغرافية واحدة في تحليل PGC-LC-MS / MS.
    3. بعد الحضانة ، قم بتدوير أنابيب العينة في جهاز طرد مركزي دقيق لإحضار السائل إلى قاع الأنابيب.
    4. أضف 100 ميكرولتر من الماء فائق النقاء إلى كل عينة. أضف 2 ميكرولتر من حمض الخليك الجليدي لتحييد عينات N-glycan القلوية. قم بتدوير أنابيب العينة في جهاز طرد مركزي دقيق لإحضار عينات إلى قاع الأنابيب.
      ملاحظة: يعمل حمض الخليك الجليدي على تحييد العينات القلوية مما يؤدي إلى تكوين غاز الهيدروجين (H2) والفوران اللاحق أثناء التفاعل.
  4. تحلية N-glycans باستخدام PGC-C18-SPE
    1. قم بإعداد أعمدة PGC-C18-SPE الدقيقة محلية الصنع كما هو موضح أدناه.
      1. باستخدام حقنة مناسبة، قم بتوصيل أقراص C18 ونقلها إلى أطراف ماصة مناسبة (10 ميكرولتر).
        ملاحظة: هنا ، يمكن أيضا استخدام الأعمدة الصغيرة التجارية C18-SPE.
      2. الماصة 10 ميكرولتر من راتنج PGC معلق في 50٪ (حجم / حجم) الميثانول في الأعمدة الدقيقة C18-SPE. ضع الأعمدة الدقيقة في أنابيب سعة 2 مل مزودة بمحولات أجهزة الطرد المركزي الدقيقة. قم بتدوير الأنابيب لإنشاء أعمدة صغيرة PGC-C18-SPE بارتفاع عمود ~ 0.5 سم (انظر الشكل 1i). قم بإعداد عمود دقيق PGC-C18-SPE واحد لكل عينة.
        ملاحظة: يضمن استخدام المحولات تعليق الأعمدة الدقيقة في وسط الأنبوب.
      3. بالنسبة لخطوات الغسيل وتحميل العينات اللاحقة، اضبط جهاز طرد مركزي على 6,000 دورة في الدقيقة (~2,000 × جم) وقم بالدوران لمدة 60 ثانية لتسهيل مرور المراحل المتنقلة عبر الأعمدة الدقيقة PGC-C18-SPE. اغسل وقم بتكييف كل عمود دقيق PGC-C18-SPE بالتتابع باستخدام 50 ميكرولتر 0.1٪ (حجم / حجم) TFA في ACN ثلاث مرات متبوعا ب 50 ميكرولتر 0.1٪ (حجم حجمي) TFA ثلاث مرات.
        ملاحظة: يمكن تحضير الأعمدة الدقيقة PGC-SPE قبل ساعات ، ولكن يجب تخزينها رطبة في درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام.
    2. قم بتطبيق عينات N-glycan على الأعمدة الدقيقة PGC-C18-SPE في حجم تحميل يصل إلى 40 ميكرولتر وتدور عند 6,000 دورة في الدقيقة (~2,000 × جم) لمدة 60 ثانية بعد كل إضافة. كرر خطوة التحميل حتى يتم تطبيق عينة N-glycan بالكامل على العمود الدقيق.
      ملاحظة: على الرغم من أن الكسور المتدفقة يجب ألا تحتوي على الجليكانات ، فإننا نوصي بالاحتفاظ بهذه الكسور حتى يتم الحصول على بيانات الجليكوميكس بنجاح في حالة الاحتفاظ غير الكامل بالأعمدة الدقيقة PGC-C18-SPE.
    3. اغسل الأعمدة الدقيقة PGC-C18-SPE ب 20 ميكرولتر من الماء فائق النقاء. انقل الأعمدة الدقيقة PGC-C18-SPE إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة جديدة سعة 1.5 مل استعدادا لشطف N-glycan.
    4. قم بإزالة N-glycans عن طريق إضافة 40 ميكرولتر من 0.1٪ TFA في 50٪ (كلاهما v/v) ACN إلى كل عمود صغير PGC-C18-SPE ، ثم تدور. كرر هذا الإجراء واجمع بين الشطف.
      ملاحظة: من المهم مراقبة الأعمدة الدقيقة بعد كل دورة للتأكد من أن المحلول قد تم نسجه بالكامل ، لأن هذا سيسهل الشطف الفعال.
    5. جفف N-glycans المحلى في نظام مكثف فراغي.
  5. الاستحواذ على PGC-LC-MS / MS
    1. تحضير مذيبات LC كما هو موضح أدناه.
      1. المذيب أ: قم بإعداد 100 مل من محلول مخزون بيكربونات الأمونيوم 100 ملي مولار (NH4HCO3) في ماء فائق النقاء. قم بتصفية محلول المخزون من خلال قرص مرشح نايلون 0.2 ميكرومتر باستخدام وحدة ترشيح فراغ لإزالة الجسيمات. بعد ذلك ، قم بإعداد 1 لتر من محلول 10 ملي مولار NH4HCO3 (المذيب أ) عن طريق تخفيف 100 مل من محلول مخزون 100 ملي مولار NH4HCO3 في 900 مل من الماء عالي النقاء. مذيب صوتي أ لمدة 15 دقيقة لتفريغ المحلول. يمكن تخزين المذيب A لمدة أسبوع واحد عند 20-25 درجة مئوية ، بينما يمكن تخزين محلول مخزون 100 ملي مولار NH4HCO3 لمدة شهر واحد عند 4 درجات مئوية.
      2. المذيب ب: قم بإعداد 1 لتر من 10 ملي مولار NH4HCO3 في 70٪ (حجم / حجم) ACN في ماء فائق النقاء (المذيب B) عن طريق إضافة 100 مل من محلول مخزون 100 ملي مولار NH4HCO3 (انظر الخطوة السابقة 2.5.1.2) إلى 700 مل من ACN وتخفيفه إلى حجم إجمالي قدره 1 لتر بماء فائق النقاء. مذيب صوتي B لمدة 15 دقيقة لإزالة الغازات. يمكن تخزين المذيب B لمدة أسبوعين عند 20-25 درجة مئوية.
    2. أعد تعليق N-glycans المحلى في 10 ميكرولتر من الماء فائق النقاء واخلطه جيدا. قم بتدوير العينات عند 14,000 × جم لمدة 5 دقائق ، ثم انقل المادة الطافية بعناية إلى قوارير عينة MS ، مع ترك ما يقرب من 0.5 ميكرولتر خلفك لتجنب نقل أي جسيمات وحطام مرئي أو غير مرئي من شأنه أن يضر بنظام LC-MS / MS.
    3. قم بحقن وفصل N-glycans على عمود شعري PGC-LC يتم تسخينه إلى 50 درجة مئوية باستخدام تدرج خطي لمدة 60 دقيقة (أو مناسب بأي شكل آخر) من 0٪ -70٪ (v / v) مذيب B في المذيب A على نظام HPLC. تأكد من توصيل نظام HPLC بمقياس طيف الكتلة ويعمل بمعدل تدفق ثابت يبلغ 20 ميكرولتر / دقيقة (اضبط معدل التدفق ليتناسب مع هندسة عمود PGC-LC).
    4. اكتشف N-glycans المنفصلة باستخدام مطياف كتلة رباعي الأقطاب لمصيدة الأيونات الخطية (أو نظام MS آخر مناسب منخفض أو عالي الدقة) مركب بمصدر أيون الرش الكهربائي ويعمل في وضع قطبية الأيونات السالبة.
    5. اضبط نطاق مسح اكتساب MS1 على m/z 150-2,000 مع عرض ذروة مسح التكبير/التصغير m /z 0.25 ونصف العرض الكامل (FWHM) عند m/z 200. اضبط جهد المصدر على 3.2 كيلو فولت. بالنسبة لعمليات مسح MS1 ، اضبط التحكم التلقائي في الكسب (AGC) على 5 × 104 أيونات مع وقت تراكم أقصى يبلغ 50 مللي ثانية (أو إعدادات مناسبة).
      ملاحظة: يجب أن يشمل بدء التشغيل المنخفض m / z الكشف عن السكريات الأحادية وثنائية السكريات التي غالبا ما تساهم في N- و O-glycome.
    6. بالنسبة إلى MS / MS ، اضبط الدقة على m / z 0.25 FWHM عند m / z 200 ، و AGC إلى 2 × 104 أيونات ، والحد الأقصى لوقت التراكم على 300 مللي ثانية. قم بتمكين الاستحواذ المعتمد على البيانات (DDA) وحدد السلائف الخمسة الأكثر وفرة في كل فحص كامل ل MS1 للتجزئة باستخدام تنشيط الرنين (مصيدة الأيونات) والتفكك الناجم عن الاصطدام (CID) عند طاقة تصادم طبيعية (NCE) تبلغ 33٪. قم بإلغاء تحديد الاستبعاد الديناميكي لتجنب فقدان أيزومرات N-glycan متساوية الضغط عن كثب.
  6. تحليل بيانات بيانات الجليكومكس LC-MS/MS
    1. تصفح البيانات الأولية LC-MS/MS التي تم إنشاؤها باستخدام البرامج المناسبة لضمان جودة عالية للبيانات بعد التأكد من عرض ذروة LC الضيق ، وفصل أيزومر N-glycan الفعال ، ودقة MS العالية ، والدقة ، والإشارة إلى الضوضاء ، وكفاءة تجزئة CID-MS / MS العالية.
    2. حدد يدويا N-glycans في العينة بناء على كتلة السلائف أحادية النظير ، ونمط تجزئة CID-MS / MS ، ووقت الاحتفاظ النسبي والمطلق PGC-LC.
      ملاحظة: يمكن أن يساعد RawMeat v2.1 و GlycoMod و GlycoWorkBench v2.1 في عملية تحديد الهوية كما هو موضح26. يمكن أن تضيف قيود التخليق الحيوي المعروفة والارتباط الهيكلي بين التحليلات المرصودة أيضا مزيدا من الثقة في N-glycans26 المحدد. بدلا من ذلك ، يمكن إجراء تحديد الجليكان شبه التلقائي والتعليق التوضيحي الطيفي باستخدام البرامج التجارية.
    3. بالنسبة للقياس الكمي النسبي N-glycan ، قم بإنشاء قائمة انتقالية تحتوي على السلائف أحادية النظير m / z لجميع أيزومرات N-glycan المحددة واستخدم برنامجا تجاريا لتحديد قيم المنطقة تحت المنحنى (AUC) بناء على الكروماتوغرامات الأيونية المستخرجة (EICs) لجميع أيونات السلائف N-glycan كما هو موضح26.

3. سير عمل N-glycoproteomics

  1. هضم خليط البروتين
    1. هضم 100-200 ميكروغرام من مستخلص البروتين المختزل والمؤلكل (من الجزء 1) عن طريق إضافة التربسين (1:50 إنزيم: نسبة البروتين ، وزن / وزن) و / أو البروتياز الآخر المفضل لكل عينة.
      ملاحظة: على عكس تحضير عينة الجليكوميكس ، استخدم ، إن أمكن ، أنابيب الطرد المركزي الدقيقة منخفضة الارتباط لخطوات تحضير عينة الجليكوبروتيوميك لتحقيق أقصى قدر من استعادة الببتيد.
    2. احتضان العينات لمدة 8-12 ساعة عند 37 درجة مئوية. تأكد من أن الرقم الهيدروجيني ~ 8.5 لأن المحلول القلوي المعتدل يحسن كفاءة هضم التربسين.
      ملاحظة: يفضل استخدام البروتياز المحدد الذي ينتج أنماط انقسام يمكن التنبؤ بها ويترك معظم N-glycopeptides مع تكملة واحدة (موقع الارتباط بالجليكوزيل) ، مثل التربسين و Lys-C. تجنب الإفراط في احتضان العينات لتقليل الانقسامات غير المحددة للبروتينات بواسطة التربسين أو البروتياز الآخر.
    3. أوقف عملية الهضم عن طريق التحمض (لتجنب الانقسامات غير المحددة الناتجة عن الهضم لفترات طويلة) عن طريق إضافة 1٪ (حجم / حجم) TFA.
  2. تحلية الببتيد باستخدام Oligo R3-C18-SPE
    1. قم بإعداد أعمدة Oligo R3-C18-SPE الصغيرة محلية الصنع كما هو موضح أدناه.
      1. باستخدام حقنة مناسبة، قم بتوصيل أقراص C18 ونقلها إلى أطراف ماصة سعة 10 ميكرولتر.
        ملاحظة: هنا ، يمكن أيضا استخدام الأعمدة الصغيرة التجارية C18-SPE.
      2. قم بإيداع ملاط من راتنج Oligo R3 معلق في ACN أنيق في الأعمدة الدقيقة C18-SPE. ضع الأعمدة الدقيقة في أنابيب سعة 2 مل مزودة بمحولات أجهزة الطرد المركزي الدقيقة لضمان تعليق الأعمدة الدقيقة في وسط الأنبوب وتدويرها لإنشاء أعمدة صغيرة Oligo R3-C18-SPE بارتفاع عمود ~ 1 سم (انظر الشكل 1ii). قم بإعداد عمود صغير واحد من Oligo R3-C18-SPE لكل عينة.
    2. بالنسبة لخطوات الغسيل وتحميل العينات اللاحقة ، اضبط جهاز الطرد المركزي العلوي على 6,000 دورة في الدقيقة (~ 2,000 × جم) والدوران لمدة 60 ثانية للسماح للأطوار المتنقلة بالمرور عبر الأعمدة الدقيقة Oligo R3-C18-SPE. اغسل وقم بتكييف كل عمود صغير من Oligo R3-C18-SPE بالتتابع باستخدام 50 ميكرولتر من ACN الأنيق ، 3x ، ثم 50 ميكرولتر من 0.1٪ (v / v) TFA ، 3x.
      ملاحظة: يمكن تحضير الأعمدة الدقيقة Oligo R3-C18-SPE مسبقا وتخزينها رطبة لساعات في درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام.
    3. ضع الأعمدة الدقيقة المكيفة Oligo R3-C18-SPE في أنابيب جديدة سعة 1.5 مل جنبا إلى جنب مع محولات أجهزة الطرد المركزي الدقيقة. ضع مخاليط الببتيد المهضومة بالتربتيك على الأعمدة الدقيقة Oligo R3-C18-SPE وتدور عند 2,000 × جم لمدة 60 ثانية. قد تكون هناك حاجة إلى جولات متعددة من التحميل لأحجام العينات الأكبر من 50 ميكرولتر.
    4. اغسل الأعمدة الدقيقة Oligo R3-C18-SPE ب 50 ميكرولتر من 0.1٪ (حجم / حجم) TFA ، 3x. انقل الأعمدة الدقيقة Oligo R3-C18-SPE إلى أنابيب جديدة سعة 1.5 مل استعدادا لشطف الببتيدات المحلاة.
    5. قم بإزالة الببتيدات المحلاة عن طريق تطبيق 50 ميكرولتر من 0.1٪ TFA في 50٪ (كلاهما v/v) ACN ، متبوعا ب 50 ميكرولتر من 0.1٪ TFA في 70٪ (كلاهما v / v) ACN على كل عمود صغير Oligo R3-C18-SPE. تدور بعد كل خطوة.
      ملاحظة: من المهم مراقبة الأعمدة الدقيقة بعد كل دورة للتأكد من أن المحلول قد تم نسجه بالكامل ، لأن هذا سيسهل الشطف الفعال.
    6. اجمع الببتيدات المحلاة واجمعها وجففها في نظام مكثف مفرغ.
      ملاحظة: في حالة إجراء البروتينات المتوازية وإزالة النيتروجين الجليكوبروتيوميك (انظر المناقشة) ، قم بتقسيم عينات الببتيد المحلية ووضع جانبا كسورا منفصلة قبل التجفيف.
  3. تخصيب N-glycopeptide باستخدام ZIC-HILIC-C8-SPE
    1. قم بإعداد الأعمدة الدقيقة ZIC-HILIC-C8-SPE محلية الصنع كما هو موضح أدناه.
      1. باستخدام حقنة مناسبة، قم بتوصيل أقراص C8 ونقلها إلى أطراف ماصة سعة 10 ميكرولتر.
      2. قم بإيداع ملاط من راتنج ZIC-HILIC المعلق في الميثانول في الأعمدة الدقيقة C8-SPE. ضع الأعمدة الدقيقة في أنابيب سعة 2 مل مزودة بمحولات أجهزة الطرد المركزي الدقيقة لضمان تعليق الأعمدة الدقيقة في وسط الأنبوب وتدويرها لإنشاء أعمدة صغيرة ZIC-HILIC-C8-SPE بارتفاع عمود ~ 1 سم (انظر الشكل 13). قم بإعداد عمود صغير واحد ZIC-HILIC-C8-SPE لكل عينة.
    2. بالنسبة لخطوات الغسيل وتحميل العينات اللاحقة ، اضبط جهاز الطرد المركزي العلوي على 6,000 دورة في الدقيقة (~ 2,000 × جم) وقم بالدوران لمدة 60 ثانية للسماح للأطوار المتنقلة بالمرور عبر الأعمدة الدقيقة ZIC-HILIC-C8-SPE. اغسل وقم بتكييف كل عمود صغير ZIC-HILIC-C8-SPE بالتتابع باستخدام 50 ميكرولتر من الميثانول ، و 3x ، ثم 50 ميكرولتر من الماء فائق النقاء ، و 3x ، وأخيرا 50 ميكرولتر من 1٪ TFA في 80٪ (كلاهما الحجمي / الحجم) ACN ، 3x.
      ملاحظة: يمكن تحضير الأعمدة الدقيقة ZIC-HILIC-C8-SPE قبل ساعات ولكن يجب تخزينها رطبة في درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام.
    3. أعد تعليق مخاليط الببتيد المجففة المخصصة لتخصيب N-glycopeptide في 50 ميكرولتر من 1٪ TFA في 80٪ (كلاهما v/v) ACN واخلطها جيدا.
      ملاحظة: إذا كان من الصعب إعادة إذابة الببتيدات في مذيب تحميل HILIC ، فيمكن إعادة إذابة الببتيدات أولا في 10٪ (v / v) TFA ثم تخفيفها بسرعة في ACN للوصول إلى تركيزات مذيب تحميل HLIC. تجنب تسخين العينة بتركيز TFA مرتفع لتجنب إحداث التحلل المائي.
    4. ضع الأعمدة الدقيقة المكيفة ZIC-HILIC-C8-SPE في أنابيب جديدة سعة 1.5 مل جنبا إلى جنب مع محولات أجهزة الطرد المركزي الدقيقة. ضع مخاليط الببتيد المعلقة على الأعمدة الدقيقة ZIC-HILIC-C8-SPE وتدور عند 2,000 × جم لمدة 60 ثانية. قد تكون هناك حاجة إلى جولات متعددة من التحميل لأحجام العينات الأكبر من 50 ميكرولتر.
    5. اجمع الكسور (الكسور) المتدفقة وأعد تطبيق الكسور (الكسور) على نفس العمود الصغير ZIC-HILIC-C8-SPE. كرر إعادة التطبيق 2x وحافظ على أنابيب التدفق.
    6. اغسل الأعمدة الدقيقة ZIC-HILIC-C8-SPE 2x مع 50 ميكرولتر من 1٪ TFA في 80٪ (كلاهما v/v) ACN ، قم بالدوران ، وادمج هذا التدفق مع التدفق من الخطوة 3.3.4.
      ملاحظة: يحتوي جزء التدفق المركب عادة على ~ 90٪ من إجمالي مادة الببتيد ، مما يشكل بشكل فعال جزء الببتيد غير المعدل والذي ، وبالتالي ، يمكن استخدامه لتحليل منفصل في اتجاه مجرى النهر (بدلا من إجراء تجربة منفصلة من نوع البروتينات).
    7. انقل الأعمدة الدقيقة ZIC-HILIC-C8-SPE إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة جديدة منخفضة الارتباط سعة 1.5 مل. قم بإزالة N-glycopeptides المحتفظ بها بالتتابع باستخدام 50 ميكرولتر من 0.1٪ (v / v) TFA ، متبوعا ب 50 ميكرولتر من بيكربونات الأمونيوم 25 ملي مولار ، ثم 50 ميكرولتر من 50٪ (حجم / حجم) ACN. تدور عند 2,000 × جم لمدة 60 ثانية بعد كل خطوة.
      ملاحظة: يحتوي الشطف عادة على ~ 10٪ من إجمالي مادة الببتيد ، ويجب أن يكون معظمها N-glycopeptides إذا تم تحقيق كفاءة تخصيب عالية. من المهم مراقبة الأعمدة الدقيقة بعد كل دورة للتأكد من أن الحل قد تم نسجه بالكامل ، لأن هذا سيسهل الشطف الفعال.
    8. جمع ودمج وتجفيف N-glycopeptides المخصب و (إذا لزم الأمر) تدفق الببتيد غير المعدل عبر الكسور في نظام مكثف الفراغ.
  4. LC-MS / MS عكسي الطور ل N-glycopeptides السليمة
    1. تحضير مذيبات LC كما هو موضح أدناه.
      1. المذيب أ: قم بإعداد 1 لتر من حمض الفورميك 0.1٪ (حجم / حجم) في ماء فائق النقاء. Sonicate لمدة 15 دقيقة لتفريغ المذيب. يمكن تخزين المذيب A لمدة شهر واحد عند 20-25 درجة مئوية.
      2. المذيب ب: قم بإعداد 1 لتر من حمض الفورميك 0.1٪ في 99.9٪ (كلاهما v / v) ACN. Sonicate لمدة 15 دقيقة حتى degas. يمكن تخزين المذيب B لمدة شهر واحد عند 20-25 درجة مئوية.
    2. أعد تعليق أجزاء الببتيد المجففة في 0.1٪ (حجم / حجم) حمض الفورميك إلى تركيز حوالي 0.2-0.5 ميكروغرام من الببتيد / ميكرولتر واخلطها جيدا. قم بتدوير العينات عند 14,000 × جم لمدة 5 دقائق ، ثم انقل المادة الطافية بعناية إلى قوارير عينة MS ، مع ترك ما يقرب من 0.5 ميكرولتر خلفك لتجنب نقل أي جسيمات وحطام غير مرغوب فيه.
    3. لكل عينة ، قم بحقن ~ 0.5-1 ميكروغرام من الببتيد الكلي على عمود مصيدة C18-LC وافصل الببتيدات على عمود تحليلي C18-LC بمعدل تدفق ثابت يبلغ 250 نانولتر / دقيقة باستخدام نظام UPHLC المتصل بمقياس طيف الكتلة بتدرج 2٪ -30٪ مذيب B على مدى 100 دقيقة ، 30٪ -50٪ B خلال 18 دقيقة ، 50٪ -95٪ B على مدى دقيقة واحدة ، و 9 دقائق عند 95٪ (كل V / v) B في المذيب A (أو إعداد مناسب).
    4. اكتشف الببتيدات باستخدام مطياف كتلي عالي الدقة مقترنا بنظام nanoLC المجهز بمصدر أيون الرش الكهربائي النانوي ويعمل في وضع قطبية الأيونات الموجبة.
    5. بالنسبة إلى MS1 ، استخدم نطاق مسح استحواذ من m / z 350-1,800 ، ودقة عالية عند 60,000-120,000 FWHM عند m / z 200 ، وجهد مصدر ~ 2.5 كيلو فولت. اضبط AGC على 3 × 106 أيونات بحد أقصى لوقت التراكم يبلغ 50 مللي ثانية (أو الإعدادات المناسبة).
    6. بالنسبة إلى MS/MS، حدد أكثر 20 أيونات سلائف وفرة من كل مسح ضوئي كامل ل MS1 للتجزئة باستخدام وضع DDA باستخدام HCD-MS/MS مع NCE ثابت بنسبة 35٪ أو sceHCD مع NCE بنسبة 25٪ و 35٪ و 45٪. الأهم من ذلك ، قم بإصلاح قيمة m / z الأقل إلى 110 (على سبيل المثال ، نطاق المسح m / z 110 - 1,800) لمراقبة جميع أيونات الأكسونيوم منخفضة الكتلة في كل طيف جزء.
    7. حدد السلائف التي تحمل أكثر من شحنتين (Z ≥ 2) للتجزئة. الحصول على أطياف (sce) HCD-MS/MS بدقة 30,000-45,000 FWHM عند m/z 200 مع AGC من 1 × 105 أيونات ووقت تراكم 90 مللي ثانية باستخدام نافذة عزل السلائف من ± 1.0 Th. تمكين الاستبعاد الديناميكي لمدة 30 ثانية بعد العزل الفردي وتجزئة أيون سلائف معين.
      ملاحظة: إذا كان ETD متاحا ، ففكر أيضا في الحصول على EThcD-MS / MS من عينات N-glycopeptide السليمة باستخدام تشغيل الأيونات المعتمد على المنتج. قم بتنفيذ هذه الخطوة عندما تكون أيونات أوكسونيوم الجليكان التشخيصية (على سبيل المثال ، m / z 138.0545 و 204.0867 و 366.1396) من بين أفضل 20 أيونات شظية داخل كل طيف HCD-MS /MS 39. اكتشف شظايا EThcD-MS / MS بدقة 30,000-45,000 FWHM عند m / z 200 مع AGC من 4 × 105 أيونات ، ووقت حقن 250 مللي ثانية ، و HCD NCE من 15٪ ، وعرض عزل السلائف 1.6 Th.
  5. تحليل بيانات LC-MS / MS GLYCOPROTEOMICS
    1. تأكيد تخصيب البيانات الأولية LC-MS/MS باستخدام N-glycopeptides عن طريق التحقق من أن معظم أطياف HCD-MS/MS تحتوي على أيونات أكسونيوم الجليكان (على سبيل المثال، m/z 138.0545 و 204.0867 و 366.1396) و (بالنسبة لاستراتيجيات وضع العلامات) ميزة الفصل الأساسي لأيونات مراسل TMT منخفضة الكتلة، وكفاءة التجزئة العالية في أطياف MS/MS وعرض ذروة LC الضيق، ودقة MS العالية، الدقة والإشارة إلى الضوضاء.
    2. باستخدام محرك بحث (تتوفر عدة موارد ؛ انظر أدناه) ، ابحث في بيانات MS / MS عن N-glycopeptides السليمة مقابل قاعدة بيانات مناسبة للبروتين / الببتيد تستهدف العينة التي يتم فحصها (على سبيل المثال ، تم الحصول عليها من تجربة de-N-glycoproteomics) أو مقابل جميع بروتينات UniProtKB البشرية التي تمت مراجعتها. قم بتخصيص البحث ضد الببتيد N-glycosylation من خلال البحث عن الببتيدات مع Asn المترجمة بالتكملة. الأهم من ذلك ، حدد قاعدة بيانات N-glycan مستنيرة بعلم الجليكومات ، أي الجليكان المحددة من بيانات الجليكوميكس في الخطوة 2 ، لتقييد مساحة البحث على الجليكان المعروف بوجوده في العينة (العينات).
      ملاحظة: يمكن النظر في عمليات البحث المتوازية باستخدام قاعدة بيانات N-glycan واسعة محددة مسبقا لاستبعاد وجود تركيبات N-glycan إضافية في البيانات.
    3. قم بتخصيص متغيرات البحث المتبقية وفقا للعينة التي تتم دراستها ، وإجراءات معالجة العينات المحددة التي تم إجراؤها ، وإعدادات MS المستخدمة والأجهزة المستخدمة. تتضمن إعدادات البحث الشائعة للبحث عن بيانات N-glycoproteomics ما يلي:
      السلائف وتحمل كتلة المنتج: 10 جزء في المليون و 20 جزء في المليون
      خصوصية البروتياز: محدد تماما و / أو شبه محدد (N-ragged)
      الانقسامات الفائتة المسموح بها: 2
      التعديلات الثابتة: Cys carbamidomethylation (+57.021 Da)
      التعديلات المتغيرة: التقى الأكسدة (+15.994 دال) (مشترك 1)
      التعديلات المتغيرة المسموح بها لكل ببتيد: 1 أو 2
      تعديلات الجليكان: قاعدة بيانات الجليكان المستنيرة ب Glycomics (نادرة 1)
      قاعدة بيانات شرك البروتين والملوثات: ممكن
    4. قم بتصفية جميع عمليات البحث إلى <1٪ معدل اكتشاف خاطئ (FDR) على مستوى البروتين ومستوى الببتيد. ضع في اعتبارك فقط N-glycopeptides التي تم تحديدها بثقة عالية (على سبيل المثال ، درجات PEP 2D < 0.001) وقم بإجراء تعليق توضيحي / تنظيم يدوي للمخرجات المصفاة لتقليل معدل تحديد N-glycopeptide غير الصحيح كما تمت مناقشته36،40،41.
      ملاحظة: جليكوببتيدات مع N-glycans sialylated و multi-fucosylated و glycopeptides التي تحمل تعديلات متغيرة أخرى بالإضافة إلى الجليكان (أي أكسدة Met وإزالة Asn / Gln) معرضة بشكل خاص لسوء التفسير من قبل محركات البحث41. وينبغي إيلاء اهتمام خاص للتحقق من صحة هؤلاء المرشحين قبل تقديم التقارير.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم توفير النتائج التمثيلية لطريقة glycoproteomics الموجهة بالجليكوميكس المطبقة على شريحة أنسجة FFPE من مريض يعاني من CRC في المرحلة الثانية في هذا القسم.

لتحقيق مادة بداية كافية للبروتين للبروتوكول ، تم دمج مستخلصات البروتين من شريحتين (مكدسات z) من نفس كتلة أنسجة FFPE باتباع بروتوكول منشور وتم تطبيق نهج وضع العلامات TMT لزيادة حساسية تجربة glycoproteomics (انظر الخطوات الاختيارية أدناه) 42.

أولا ، حدد تحليل بيانات N-glycomics المستندة إلى P...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الخطوات الحاسمة في البروتوكول
في ورقة البروتوكول هذه ، حددنا خطوة بخطوة طريقة glycoproteomics الموجهة بالجليكوميكس ، والتي توفر رؤية شاملة لعدم تجانس وديناميكيات الجليكوبروتيوم في TME المعقد.

تتمثل إحدى الخطوات الحاسمة في البروتوكول في ضمان التحلل البروتيني الكامل دون الإفراط في هضم خليط البروتين. تعمل الانقسامات غير المحددة للبروتينات بطبيعتها على زيادة مساحة البحث عن الببتيد ، مما يؤدي إلى أوقات بحث أطول وارتفاع معدل التعريف الخاطئ للجليك...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم دعم THC من خلال منحة برنامج التدريب البحثي الدولي الممولة من الحكومة الأسترالية. يتم دعم NB من خلال منح التميز البحثي الدولية بجامعة ماكواري بتمويل من جامعة ماكواري. يتم دعم AC من خلال منحة برنامج التدريب البحثي الممولة من الحكومة الأسترالية. تم دعم RK من قبل معهد السرطان في نيو ساوث ويلز (ECF181259). حصلت MTA على زمالة مجلس البحوث الأسترالي المستقبلي (FT210100455).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
<قوي>كيماويات
أسيتات الأمونيوم بدائل Sigma AldrichA1542المتاحة
بيكربونات الأمونيوم والنقاء & 99.0٪Sigma AldrichA6141البدائل المتاحة
الأسيتونيتريل اللامائي (ACN) ، LC-MS الصفSigma Aldrich34851البدائل المتاحة
Fetuin الأبقارSigma AldrichF3004البدائل المتاحة
Dithiothreitol (DTT)Sigma AldrichD0632البدائل المتاحة
الإيثانولSigma AldrichE7023البدائل المتاحة
حمض الفورميك ، LC-MS الصفسيجما ألدريتش00940البدائل المتاحة
حمض الخليك الجليديسيجما ألدريتشA6283البدائل المتاحة
يودوأسيتاميد (IAA)سيجما ألدريتشI1149البدائل المتاحة
الميثانولسيجما ألدريتشM1775المتاحة
الببتيد-N-جليكوزيداز F (PNGase F)PromegaV4831Elizabethkingia miricola PNGase F (10 U/μ L) معبرا عنها بشكل مؤتلف في الإشريكية القولونية & nbsp ؛
بولي فينيل بيروليدون 40 (PVP)بدائلسيجما ألدريتشPVP40المتاحة
هيدروكسيد البوتاسيوم (KOH)بدائل سيجما ألدريتش484016المتاحة
تريبسين الخنازير من الدرجة المتسلسلة بدائلPromegaV5113
بوروهيدريد الصوديوم (NaBH 4< / sub>) بدائلSigma Aldrich213462المتاحة
بيكربونات ثلاثي إيثيل الأمونيوم (TEAB) ، LC-MS درجةSigma AldrichT7408البدائل المتاحة
حمض ثلاثي فلورو أسيتيك (TFA) ، LC-MS درجةSigma AldrichT6508بدائل متاحة
أقراص <قوية > أدوات / مواد < / قوية >
C18أقراص Empore66883-U
C8Empore66882-U
بولي بروبيلين مسطحة القاع 96 بئر   ؛كورنينج3364
Immobilon-PSQ ثنائي فلوريد البولي فينيليدين (PVDF) غشاءميليبورIPVH20200حجم المسام: 0.45 & mu ؛ m 
أجهزة الطرد المركزيالدقيقة Eppendorf5452000069البدائل المتاحة
محولات الطرد المركزي الدقيقة تأتي شركة Nest Group، Inc. ، MASS18VMiniSpin Column Collar ، مع أعمدة Microspin
Oligo R3Thermo1133903حجم الجسيمات 30 & م
بارافيلمبارافيلم إمPM996
أنابيب بروتين LoBind 1.5 ملأنابيب Eppendorf0030108450
Protein LoBind 2.0 ملEppendorf0030108442
أنابيب القفل الآمن 1.5 ملEppendorf0030120086
أنابيب القفل الآمن 2.0 ملEppendorf0030120094
شاكرEppendorf5382000066البدائل المتاحة
مثقاب ثقب واحدSwingline74005
مكثف SpeedVacMartin ChristRVC 2-25 بدائل CDplusالمتاحة
Supelclean ENVI-Carb SPE راتنجSupelco57088حجم الجسيمات 120-400 شبكة. يمكن استخراج الراتنج يدويا من الخراطيش ، ويمكن تخزينه على المدى الطويل في 50٪ (حجم / حجم) الميثانول في حقنة ماء MilliQ
5 ملسيجما ألدريتشZ116866البدائل المتاحة
حاضنة يتم التحكم في درجة حرارتهاثيرمولينE7.30البدائل المتاحة
الحمام بالموجات فوق الصوتيةUnisonicsFXPالبدائل المتاحة
ZIC-HILIC راتنجميرك150455حجم الجسيمات / المسام ، 5 مو ؛ م / 200 Å. يمكن استخراج الراتنج يدويا من عمود LC ، ويمكن تخزينه على المدى الطويل في 50٪ (v / v) الميثانول في
أعمدة استخراج الطور الصلب MilliQ ZipTip C18 (SPE) المائية   ؛MilliporeZTC18S096بدلا من ذلك ، يمكن للأعمدة الدقيقة C18-SPE محلية الصنع أن تحل محل المنتج
التجاري < قوي>LC-MS / MS Analysis< / strong>
1260 Infinity Capillary HPLC System   ؛تتوفر بدائلAgilent
عمود LC تحليلي معبأ مسبقا براتنج ReproSil-Pur C18 AQDr Maisch ، Ammerbuch-Entringen ، ألمانياr13.aq.s2570حجم الجسيمات / المسام: 3 & mu ؛ م / 120 Å, الطول/القطر الداخلي: 25 سم / 75 & m. أعمدة C18 nano-LC التجارية متوفرة أيضا/ 
نظام Dionex UltiMate 3000 RSLCnano LC  الحراريةالمتاحة
HyperCarb KAPPA PGC الشعيرات الدموية LC العمود  الجسيمات / المسام الحرارية المتوقفة ، 3 مو ؛ م / 250 Å; طول العمود ، 30 مم ؛ القطر الداخلي ، 0.180 مم. تتوفر الأشكال الهندسية الأكبر لأعمدة HyperCarb PGC-LC ، والتي تنتج بيانات جودة مماثلة تجاريا (على سبيل المثال ، Thermo # 35003-031030). عمود SupelTMCarb LC من شركة ميرك بحجم جسيم / مسام ، 2.7 & m / 200 وأطوال أعمدة مختلفة وقطر داخلي متوفرة أيضا (على سبيل المثال ، Merck # 59994-U). 
LCMS-grade acetonitrileLiChrosolv100029البدائل المتاحة
مطياف كتلة مصيدة أيونية Velos Pro (glycomics)  البدائلالحرارية
Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer (glycoproteomics)Thermoتتوفر أيضا أنظمة MS الأخرى عالية الدقة مع أو بدون ETD (مطلوبة فقط ل O-glycoproteomics) (على سبيل المثال ، Q-Exactive HF-X Hybrid Quadrupole-Orbitrap أو Thermo أو TIMS-ToF-MS أو Bruker أو مطياف كتلة مماثل عالي الأداء من بائعين آخرين)
قوارير لولبية زجاجية شفافة للاسترداد الكلي 0.9 ملالبدائلالحرارية THC11093563
الاسترداد الكلي قوارير برغي الزجاج الشفاف مطابقة أغطيةالبدائل الحراريةTHC09150869المتاحة
فخ LC عمود معبأة في المنزل مع راتنج ReproSil-Pur C18 AQ   ؛الدكتور مايش ، Ammerbuch-Entringen ، ألمانياr15.aq.s0202حجم الجسيمات / المسام: 5 & mu ؛ م / 120 Å, الطول / القطر الداخلي: 2 سم / 100 & m. تتوفر أيضا أعمدة LC المصيدة التجارية C18. 
Software
ByonicProtein Metrics Incv2.6.46 أو أعلىمحرك بحث جليكوببتيد تجاري و PTM ، يقبل البيانات الأولية LC-MS / MS من معظم بائعي MS
ByosProtein Metrics Incv3.9-7 أو أعلىبرنامج تجاري للفحص اليدوي للمرشحين للجليكوببتيد والتعليق التوضيحي التلقائي لأطياف glycan MS / MS
GlycoModالوصول المفتوح Expasy، يساعد على شرح بيانات الجليكوميكس (https://web.expasy.org/glycomod/)
برنامج الوصول المفتوح GlycoWorkBenchEUROCarbDBv2.1، مما يساعد على شرح بيانات الجليكوميكس ورسم الرسوم الكاريكاتورية الجليكان
RawMeatVAST Scientificv2.1برنامج الوصول المفتوح ، واستخراج م / ياء من أيونات السلائف الجليكان من البيانات الطيفية الخام
SkylineBrendan X. MacLeanv21.2 أو أعلىبرنامج الوصول المفتوح للقياس الكمي النسبي للجليكان
XcaliburThermov2.2 أو أعلىلتصفح بيانات LC-MS / MS الخام
المتاحة لوحة البدائل حجم المتاحة المتاحة برنامج

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gagneux, P., Panin, V., Hennet, T., Aebi, M., Varki, A. Essentials of glycobiology. , Cold Spring Harbor. NY. 265-278 (2022).
  2. Tjondro, H. C., Loke, I., Chatterjee, S., Thaysen-Andersen, M. Human protein paucimannosylation: Cues from the eukaryotic kingdoms. Biol Rev Camb Philos Soc. 94 (6), 2068-2100 (2019).
  3. West, C. M., Malzl, D., Hykollari, A., Wilson, I. B. H. Glycomics, glycoproteomics, and glycogenomics: An inter-taxa evolutionary perspective. Mol Cell Proteomics. 20, 100024(2021).
  4. Varki, A. Biological roles of glycans. Glycobiology. 27 (1), 3-49 (2016).
  5. Reily, C., Stewart, T. J., Renfrow, M. B., Novak, J. Glycosylation in health and disease. Nat Rev Nephrol. 15 (6), 346-366 (2019).
  6. Leite-Gomes, E., et al. Bringing to light the risk of colorectal cancer in inflammatory bowel disease: Mucosal glycosylation as a key player. Inflamm Bowel Dis. 28 (6), 947-962 (2022).
  7. He, K., et al. Decoding the glycoproteome: A new frontier for biomarker discovery in cancer. J Hematol Oncol. 17 (1), 12(2024).
  8. Mereiter, S., Balmana, M., Campos, D., Gomes, J., Reis, C. A. Glycosylation in the era of cancer-targeted therapy: Where are we heading. Cancer Cell. 36 (1), 6-16 (2019).
  9. Seeberger, P. H., et al. What comes next in glycobiology. Cell. 187 (11), 2628-2632 (2024).
  10. Abrahams, J. L., et al. Recent advances in glycoinformatic platforms for glycomics and glycoproteomics. Curr Opin Struct Biol. 62, 56-69 (2020).
  11. Thaysen-Andersen, M., Packer, N. H., Schulz, B. L. Maturing glycoproteomics technologies provide unique structural insights into the N-glycoproteome and its regulation in health and disease. Mol Cell Prot. 15 (6), 1773-1790 (2016).
  12. Gaunitz, S., Nagy, G., Pohl, N. L., Novotny, M. V. Recent advances in the analysis of complex glycoproteins. Anal Chem. 89 (1), 389-413 (2017).
  13. Chernykh, A., Kawahara, R., Thaysen-Andersen, M. Towards structure-focused glycoproteomics. Biochem Soc Trans. 49 (1), 161-186 (2021).
  14. Hu, H., Khatri, K., Zaia, J. Algorithms and design strategies towards automated glycoproteomics analysis. Mass Spectrom Rev. 36 (4), 475-498 (2017).
  15. Bagdonaite, I., et al. Glycoproteomics. Nat Rev Meth Primers. 2 (1), 48(2022).
  16. Peng, W., et al. MS-based glycomics and glycoproteomics methods enabling isomeric characterization. Mass Spectrom Rev. 42 (2), 577-616 (2023).
  17. Aoki-Kinoshita, K. F., et al. Essentials of glycobiology. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. NY. 705-718 (2022).
  18. Thomas, D. R., Scott, N. E. Glycoproteomics: Growing up fast. Curr Opin Struct Biol. 68, 18-25 (2021).
  19. Thaysen-Andersen, M., Kolarich, D., Packer, N. H. Glycomics & glycoproteomics: From analytics to function. Mol Omics. 17 (1), 8-10 (2021).
  20. Trbojevic-Akmacic, I., et al. High-throughput glycomic methods. Chem Rev. 122 (20), 15865-15913 (2022).
  21. Oliveira, T., Thaysen-Andersen, M., Packer, N. H., Kolarich, D. The hitchhiker's guide to glycoproteomics. Biochem Soc Trans. 49 (4), 1643-1662 (2021).
  22. Rudd, P. M., et al. Essentials of glycobiology. , Cold Spring Harbor. NY. 689-704 (2022).
  23. Madunić, K., et al. Colorectal cancer cell lines show striking diversity of their O-glycome reflecting the cellular differentiation phenotype. Cell Mol Life Sci. 78 (1), 337-350 (2021).
  24. Parker, R., et al. Mapping the SARS-CoV-2 spike glycoprotein-derived peptidome presented by HLA class II on dendritic cells. Cell Rep. 35 (8), 109179(2021).
  25. Zhao, P., et al. Virus-receptor interactions of glycosylated SARS-CoV-2 spike and human ACE2 receptor. Cell Host Microbe. 28 (4), 586-601.e6 (2020).
  26. Chatterjee, S., et al. Serum N-glycomics stratifies bacteremic patients infected with different pathogens. J Clin Med. 10 (3), 516(2021).
  27. Osimanjiang, W., et al. Analysis of N- and O-linked glycosylation: Differential glycosylation after rat spinal cord injury. J Neurotrauma. 37 (18), 1954-1962 (2020).
  28. Chatterjee, S., et al. Trends in oligomannosylation and α1,2-mannosidase expression in human cancers. Oncotarget. 12 (21), 2188-2205 (2021).
  29. Chang, D., Klein, J. A., Nalehua, M. R., Hackett, W. E., Zaia, J. Data-independent acquisition mass spectrometry for site-specific glycoproteomics characterization of SARS-CoV-2 spike protein. Anal Bioanal Chem. 413 (29), 7305-7318 (2021).
  30. Pan, J., et al. Glycoproteomics-based signatures for tumor subtyping and clinical outcome prediction of high-grade serous ovarian cancer. Nat Commun. 11 (1), 6139(2020).
  31. Venkatakrishnan, V., et al. Glycan analysis of human neutrophil granules implicates a maturation-dependent glycosylation machinery. J Biol Chem. 295 (36), 12648-12660 (2020).
  32. Sethi, M. K., et al. In-depth matrisome and glycoproteomic analysis of human brain glioblastoma versus control tissue. Mol Cell Proteom. 21 (4), 100216(2022).
  33. Parker, B. L., et al. Site-specific glycan-peptide analysis for determination of N-glycoproteome heterogeneity. J Proteome Res. 12 (12), 5791-5800 (2013).
  34. Jensen, P. H., Karlsson, N. G., Kolarich, D., Packer, N. H. Structural analysis of N- and O-glycans released from glycoproteins. Nat Protoc. 7 (7), 1299-1310 (2012).
  35. Hinneburg, H., et al. Post-column make-up flow (pcmf) enhances the performance of capillary-flow PGC-LC-MS/MS-based glycomics. Anal Chem. 91 (7), 4559-4567 (2019).
  36. Chau, T. H., et al. Glycomics-assisted glycoproteomics enables deep and unbiased N-glycoproteome profiling of complex biological specimens. Meth Mol Biol. 2628, 235-263 (2023).
  37. Madunic, K., Wagt, S., Zhang, T., Wuhrer, M., Lageveen-Kammeijer, G. S. M. Dopant-enriched nitrogen gas for enhanced electrospray ionization of released glycans in negative ion mode. Anal Chem. 93 (18), 6919-6923 (2021).
  38. Zhang, T., Wang, W., Wuhrer, M., De Haan, N. Comprehensive O-glycan analysis by porous graphitized carbon nanoliquid chromatography-mass spectrometry. Anal Chem. 96 (22), 8942-8948 (2024).
  39. Wu, S. W., Pu, T. H., Viner, R., Khoo, K. H. Novel LC-MS2 product dependent parallel data acquisition function and data analysis workflow for sequencing and identification of intact glycopeptides. Anal Chem. 86 (2), 5478-5486 (2014).
  40. Kawahara, R., et al. The complexity and dynamics of the tissue glycoproteome associated with prostate cancer progression. Mol Cell Proteom. 20, 100026(2021).
  41. Chau, T. H., Chernykh, A., Kawahara, R., Thaysen-Andersen, M. Critical considerations in N-glycoproteomics. Curr Opin Chem Biol. 73, 102272(2023).
  42. Carnielli, C. M., et al. Comprehensive glycoprofiling of oral tumors associates N-glycosylation with lymph node metastasis and patient survival. Mol Cell Proteom. 22 (7), 100586(2023).
  43. Sethi, M. K., et al. In-depth N-glycome profiling of paired colorectal cancer and non-tumorigenic tissues reveals cancer-, stage- and EGFR-specific protein N-glycosylation. Glycobiology. 25 (10), 1064-1078 (2015).
  44. Magdeldin, S., Yamamoto, T. Toward deciphering proteomes of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues. Proteomics. 12 (7), 1045-1058 (2012).
  45. Ostasiewicz, P., Zielinska, D. F., Mann, M., Wiśniewski, J. R. Proteome, phosphoproteome, and N-glycoproteome are quantitatively preserved in formalin-fixed paraffin-embedded tissue and analyzable by high-resolution mass spectrometry. J Proteome Res. 9 (7), 3688-3700 (2010).
  46. Tian, Y., Gurley, K., Meany, D. L., Kemp, C. J., Zhang, H. N-linked glycoproteomic analysis of formalin-fixed and paraffin-embedded tissues. J Proteome Res. 8 (4), 1657-1662 (2009).
  47. Cozzolino, F., et al. New label-free methods for protein relative quantification applied to the investigation of an animal model of huntington disease. PLoS One. 15 (9), e0238037(2020).
  48. Sethi, M. K., et al. Quantitative proteomic analysis of paired colorectal cancer and non-tumorigenic tissues reveals signature proteins and perturbed pathways involved in CRC progression and metastasis. J Proteomics. 126, 54-67 (2015).
  49. Rosati, D., et al. Differential gene expression analysis pipelines and bioinformatic tools for the identification of specific biomarkers: A review. Comput Struct Biotechnol J. 23, 1154-1168 (2024).
  50. Niu, B., et al. Nonspecific cleavages arising from reconstitution of trypsin under mildly acidic conditions. PLoS One. 15 (7), e0236740(2020).
  51. Delafield, D. G., Li, L. Recent advances in analytical approaches for glycan and glycopeptide quantitation. Mol Cell Proteom. 20, 100054(2021).
  52. Viner, R. I., Snovida, S., Bodnar, E., Perreault, H., Saba, J. A novel workflow for glycopeptide analysis using cellulose-based separation cartridges, TMT-labeling and LTQ Orbitrap ETD. J Biomol Tech. 21 (3 Suppl), S25(2010).
  53. Kawahara, R., et al. Community evaluation of glycoproteomics informatics solutions reveals high-performance search strategies for serum glycopeptide analysis. Nat Meth. 18 (11), 1304-1316 (2021).
  54. Polasky, D. A., Nesvizhskii, A. I. Recent advances in computational algorithms and software for large-scale glycoproteomics. Curr Opin Chem Biol. 72, 102238(2023).
  55. Polasky, D. A., Yu, F., Teo, G. C., Nesvizhskii, A. I. Fast and comprehensive N- and O-glycoproteomics analysis with MSFragger-Glyco. Nat Meth. 17 (11), 1125-1132 (2020).
  56. Goodson, H., et al. Α-mannosylated HLA-II glycopeptide antigens dominate the immunopeptidome of immortalised cells and tumour tissues. Glycobiology. 34 (11), cwae057(2024).
  57. Shajahan, A., Heiss, C., Ishihara, M., Azadi, P. Glycomic and glycoproteomic analysis of glycoproteins-a tutorial. Anal Bioanal Chem. 409 (19), 4483-4505 (2017).
  58. Rosenbalm, K. E., Tiemeyer, M., Wells, L., Aoki, K., Zhao, P. Glycomics-informed glycoproteomic analysis of site-specific glycosylation for SARS-CoV-2 spike protein. STAR Prot. 1 (3), 100214-100214 (2020).
  59. Zhao, P., et al. Virus-receptor interactions of glycosylated SARS-CoV-2 spike and human ACE2 receptor. Cell Host Microbe. 28 (4), 586-601.e6 (2020).
  60. Chandler, K. B., et al. Multi-isotype glycoproteomic characterization of serum antibody heavy chains reveals isotype- and subclass-specific N-glycosylation profiles. Mol Cell Proteomics. 18 (4), 686-703 (2019).
  61. Haab, B. B., Klamer, Z. Advances in tools to determine the glycan-binding specificities of lectins and antibodies. Mol Cell Proteom. 19 (2), 224-232 (2020).
  62. Zhang, L., Luo, S., Zhang, B. The use of lectin microarray for assessing glycosylation of therapeutic proteins. MAbs. 8 (3), 524-535 (2016).
  63. Goumenou, A., Delaunay, N., Pichon, V. Recent advances in lectin-based affinity sorbents for protein glycosylation studies. Front Mol Biosci. 8, 746822(2021).
  64. Parker, B. L., et al. Terminal galactosylation and sialylation switching on membrane glycoproteins upon TNF-alpha-induced insulin resistance in adipocytes. Mol Cell Proteomics. 15 (1), 141-153 (2016).
  65. Blazev, R., et al. Integrated glycoproteomics identifies a role of N-glycosylation and galectin-1 on myogenesis and muscle development. Mol Cell Proteomics. 20, 100030(2021).
  66. Thaysen-Andersen, M., et al. Human neutrophils secrete bioactive paucimannosidic proteins from azurophilic granules into pathogen-infected sputum. J Biol Chem. 290 (14), 8789-8802 (2015).
  67. Loke, I., Ostergaard, O., Heegaard, N. H. H., Packer, N. H., Thaysen-Andersen, M. Paucimannose-rich N-glycosylation of spatiotemporally regulated human neutrophil elastase modulates its immune functions. Mol Cell Proteom. 16 (8), 1507-1527 (2017).
  68. Loke, I., Packer, N. H., Thaysen-Andersen, M. Complementary LC-MS/MS-based N-glycan, N-glycopeptide, and intact N-glycoprotein profiling reveals unconventional ASN71-glycosylation of human neutrophil cathepsin g. Biomolecules. 5 (3), 1832-1854 (2015).
  69. Tjondro, H. C., et al. Hyper-truncated Asn355- and Asn391-glycans modulate the activity of neutrophil granule myeloperoxidase. J Biol Chem. 296, 100144(2021).
  70. Kawahara, R., et al. Glycoproteome remodeling and organelle-specific N-glycosylation accompany neutrophil granulopoiesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 120 (36), e2303867120(2023).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

N

مقالات ذات صلة