مقالة منهجية

هندسة مستقبلات المستضد الخيمري - الخلايا القاتلة الطبيعية التي تستهدف الالتهابات الفطرية باستخدام نظام الينقولات الجمالية النائمة غير الفيروسية

DOI:

10.3791/67424

⸱

أكتوبر 4, 2024

 ,  ,  ,  , 
1Medizinische Klinik und Poliklinik II und Lehrstuhl für Zelluläre Immuntherapie, Medizinische Klinik und Poliklinik II, Universitätsklinikum Würzburg, 2Fraunhofer-Institut für Zelltherapie und Immunologie IZI, Außenstelle Würzburg Zelluläre Immuntherapie

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نحدد بروتوكول تعداء لإنتاج خلايا قاتلة طبيعية لمستقبلات المستضد الخيمري (CAR-NK) التي تستهدف مسببات الأمراض الفطرية باستخدام نظام الينقولات Sleeping Beauty غير الفيروسي. لتقييم التنشيط الخاص بالمستضد ، قمنا بزراعة الخلايا المهندسة بأنابيب جرثومية Aspergillus fumigatus وقمنا بقياس إفراز IFN-γ.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أظهرت العلاجات الخلوية القائمة على مستقبلات المستضد الخيمري (CAR) فعالية رائعة في علاج الأورام الخبيثة الدموية. في الآونة الأخيرة ، يتم تطوير هذه العلاجات للأمراض المعدية ، ومع ذلك لا تزال الدراسات التي تستهدف الالتهابات الفطرية نادرة. لتحديد الأهداف المثلى وتحسين المنتجات الخلوية ، قمنا بتطوير طريقة لهندسة الخلايا القاتلة الطبيعية لمستقبلات المستضد الخيمرية (CAR-NK) وتقييم استجابتها للتحفيز بواسطة الفطريات. تصف هذه الورقة طريقة مباشرة وقوية لتوليد خلايا CAR-NK المصممة خصيصا للأهداف الفطرية باستخدام نظام ينقولات الجمال النائم غير الفيروسي. يتم نقل خلايا NK-92 مع الترانسبوزاز مفرط النشاط SB100X المتجه كدائرة صغيرة للحمض النووي (MC) جنبا إلى جنب مع ينقولات CAR مشفرة بالبلازميد. يتم تقييم كفاءة التعدي بعد أسبوع واحد باستخدام تحليل قياس التدفق الخلوي. قبل الاختبار الوظيفي ، يتم إثراء الخلايا التي تعبر عن الجينات المعدلة وراثيا باستخدام فرز الخلايا المنشطة مغناطيسيا وزراعتها لمدة أسبوع آخر. لتقييم التنشيط الخاص بالمستضد ، يتم زراعة الخلايا المهندسة بشكل مشترك مع أنابيب جرثومة الرشاشيات الدخانة لمدة 6 ساعات على الأقل. بعد ذلك ، يتم قياس تركيز الإنترفيرون جاما المفرز (IFN-γ) باستخدام مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aspergillus fumigatus (A. fumigatus) هو فطر منتشر في كل مكان ، حيث يستنشق الشخص العادي ما بين 100 و 1,000 كونيديا على أساسيومي 1. في المرضى الذين يعانون من نقص المناعة المكتسب أو الخلقي ، مثل أولئك الذين يخضعون للعلاج الكيميائي أو الذين يعانون من سرطان الدم ، يمكن أن يؤدي A. fumigatus إلى داء القلاب الغازي الشديد. في كل عام، يصاب أكثر من 200,000 شخص في جميع أنحاء العالم بداء الرشاشيات. على الرغم من استخدام مضادات الفطريات للوقاية والعلاج بمشتقات الآزول ، إلا أن معدل الوفيات لا يزال بين 30٪ و 95٪ 2،3. بالإضافة إلى ذلك ، فإن العلاج له آثار جانبية كبيرة ، و 7٪ من A. fumigatus المزارع مقاومة بالفعل للآزول4.

أظهر العلاج بالخلايا التائية المهندسة بمستقبلات مستضد الخيميرية (CAR) نجاحا سريريا في علاج الأمراض الخبيثة وحقق نتائج واعدة قبل السريرية في مكافحة الأمراض المعدية مثل داء الرشاشياتالغازي 5،6،7،8. أظهرت خلايا Af-CAR-T الموصوفة سابقا والتي تستهدف بروتينا في جدار الخلية ل A. fumigatus hyphae نتائج واعدة في النماذج قبل السريرية6.

إن انخفاض خطر الإصابة بمرض الكسب غير المشروع مقابل المضيف ، ومتلازمة إطلاق السيتوكين ، والسمية العصبية يجعل خلايا CAR-NK بديلا قيما لخلايا CAR-T كعلاج "جاهز" للعدوى الحادة9. بالإضافة إلى ذلك ، ثبت أن الخلايا القاتلة الطبيعية تلعب دورا مهما في الاستجابة المناعية المضادة للفطريات. عند تحفيزها باستخدام A. fumigatus ، تفرز الخلايا القاتلة الطبيعية السيتوكينات مثل IFN-ɣ والكيموكينات مثل CCL-3 و CCL-4 وتطلق حبيبات سامة للخلايا10،11.

يعد خط الخلايا NK-92 مصدرا شائعا للخلايا القاتلة الطبيعية للهندسة الوراثية ، حيث يوفر ميزة التكاثر والتوسع السريع في ظروف الاستزراع البسيطةنسبيا 12. أظهرت العديد من الدراسات قبل السريرية الإمكانات العلاجية لخلايا NK-92 المنقولة ب CAR في علاج كل من الأورام الدموية والأورام الصلبة. العديد من التجارب السريرية جارية للتحقيق في سلامتها وفعاليتها واستخدامها المحتمل كعلاج خلوي "جاهز"13.

يعد تحقيق كفاءات عالية في التعدي والتعبير المستقر للجينات المعدلة وراثيا في الخلايا القاتلة الطبيعية أمرا صعبا. في حين أن الطرق الفيروسية تعد بكفاءة عالية ، إلا أنها تنطوي على خطر حدوث طفرات في الإدخال مع تكوين الأوراماللاحق 9،14. يوفر أحدث جيل من ناقلات الينقولات Sleeping Beauty (SB) نظاما آمنا وقويا وقابلا للتطبيق اقتصاديا لنقل الجينات المستقر ، والتغلب على قيود طرق توصيل الجينات الفيروسية والعابرةغير الفيروسية 15.

لذلك ، يحدد هذا البروتوكول منهجية جديدة لتوليد خلايا Af-CAR-NK-92 ، والتي يمكن أن تكون بمثابة خيار علاجي "جاهز" للمرضى الذين يعانون من داء الرشاشيات الغازي الذي يهدد الحياة. تتجلى فعالية هذا النهج من خلال زيادة إنتاج IFN-ɣ عند التحفيز باستخدام A. fumigatus خيوط.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يجب إجراء جميع التجارب الموضحة هنا في ظل ظروف معقمة. في هذا البروتوكول ، نعرض شرطين: (I) تعداء وهمي بدون DNA يعمل كعنصر تحكم و (II) تعداء CAR باستخدام Af-CAR6 الموصوف سابقا. يحتوي بلازميد Af-CAR على تسلسل مستقبلات عامل نمو البشرة المقطوع (EGFRt) في اتجاه مجرى CAR ، والذي سيتم استخدامه كعلامة تعدي (الشكل التكميلي S1). لكل حالة ، يلزم وجود 4 × 106 خلايا NK-92.

1. زراعة خلايا NK-92

  1. قبل يوم أو يومين من التعدي ، قم بإعداد وسط زراعة الخلايا الطازجة بالتركيبة التالية: 75٪ (v / v) alpha-MEM Medium (مع النيوكليوسيدات) + 12.5٪ (v / v) مصل بقري جنيني معطل بالحرارة (FBS) + 12.5٪ (v / v) مصل حصان معطل بالحرارة + 2 ملي ل-جلوتامين.
  2. أعد تعليق ما لا يقل عن 107 خلايا NK-92 بكثافة خلية 5 × 105 خلايا / مل.
  3. أضف IL-2 إلى معلق الخلية بتركيز 150 UI / مل.
  4. استزراع الخلايا في حاضنة رطبة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2.
    ملاحظة: يمكن استخدام IL-2 بتركيز نهائي قدره 5 نانوغرام / مل.

2. تعداء غير فيروسي

  1. تحقق من جودة الخلايا تحت المجهر. يشير تعليق مجموعات الخلايا والخلفية الواضحة إلى ثقافة خلية صحية.
  2. في طبق مكون من 6 آبار ، أضف 2 مل من وسط زراعة الخلايا لكل بئر لكل حالة. ضع اللوحة في حاضنة مرطبة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2.
    ملاحظة: يمكن أن تقلل المضادات الحيوية من صلاحية الخلية بعد التعداد. حافظ على الوسط خاليا من المضادات الحيوية.
  3. عد الخلايا وتحقق من صلاحية الخلية باستخدام (على سبيل المثال ، تلطيخ التريبان الأزرق).
  4. انقل 8 × 106 خلايا NK-92 إلى أنبوب سفلي مخروطي سعة 15 مل. جهاز طرد مركزي عند 200 × جم لمدة 5 دقائق مع تسارع وتباطؤ 3. استخدم هذا البرنامج لجميع خطوات الطرد المركزي التالية.
  5. أثناء الطرد المركزي ، قم بإعداد أنبوبين من التفاعل سعة 1.5 مل. قم بوضع الحمض النووي ل Af-CAR (8 ميكروغرام من البلازميد DNA و 4 ميكروغرام من SB100X Mini Circle ، الجدول 1) في أحد الأنابيب. احتفظ بالثاني خاليا من الحمض النووي ليكون عنصرا تحكم وهميا.
  6. عندما يكون جهاز الطرد المركزي جاهزا ، تخلص برفق من المادة الطافية واملأ الأنبوب الذي يحتوي على الخلايا بما يصل إلى 15 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS).
  7. جهاز الطرد المركزي (الخطوة 2.4).
  8. أثناء الطرد المركزي ، قم بإعداد أنبوب نظام تعداء واحد لكل حالة عن طريق إضافة 3 مل من المخزن المؤقت الإلكتروليتي في كل أنبوب. ضع الأنبوب الأول في محطة الماصة.
  9. عندما يكون جهاز الطرد المركزي جاهزا ، تخلص برفق من المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات الخلية في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت لإعادة التعليق (100 ميكرولتر / 4 × 106 خلايا).
    ملاحظة: تجنب ترك الخلايا في مخزن مؤقت لإعادة التعليق لأكثر من 15-30 دقيقة ، لأن هذا يقلل من قابلية الخلية للحياة وكفاءة التعداد.
  10. أضف 100 ميكرولتر من معلق الخلية في كل من أنبوبي التفاعل. تخلط بلطف.
    ملاحظة: تجنب فقاعات الهواء أثناء سحب العينات لأن فقاعات الهواء تسبب الانحناء، مما يؤدي إلى موت الخلايا.
  11. ماصة خليط خلايا الحمض النووي من أنبوب التفاعل الأول مع ماصة نظام التعدي وإدخال الماصة عموديا في الأنبوب الموضوع في محطة الماصة.
    ملاحظة: تأكد من أن الطرف مناسب بشكل صحيح.
  12. اضبط النبضة الأولى على 1,650 فولت ووقت النبض لمدة 20 مللي ثانية واضغط على ابدأ.
  13. بعد الانتهاء ، اضبط النبضة الثانية على 500 فولت ووقت النبض لمدة 100 مللي ثانية. اضغط على ابدأ.
  14. بعد الانتهاء، قم بإزالة الماصة ببطء من محطة الماصة وانقل الخلايا على الفور إلى بئر واحد من لوحة الاستزراع المحضرة التي تحتوي على 2 مل من وسط زراعة الخلايا الدافئ مسبقا (انظر الخطوة 2.2). حرك اللوحة برفق في اتجاه الدائرة للتأكد من توزيع الخلايا بالتساوي.
  15. بالنسبة للعينة الوهمية، خذ 100 ميكرولتر من تعليق الخلية من أنبوب التفاعل الخالي من الحمض النووي (انظر الخطوة 2.9) وكرر نفس الإجراء من الخطوة 2.11 إلى الخطوة 2.14، باستخدام أنبوب جديد وطرف ماصة جديد.
  16. احتضان اللوحة في حاضنة مرطبة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2.
  17. بعد 30 دقيقة من الحضانة ، أضف IL-2 بتركيز نهائي قدره 150 UI / mL.

3. التحقق من كفاءة التعدي باستخدام قياس التدفق الخلوي

  1. بعد أسبوع واحد من زراعة الخلايا وتقسيمها كل يومين ، خذ 1-5 × 105 خلايا من كل حالة في أنبوب دائري القاع من البوليسترين.
  2. اغسل الخلايا بإضافة 1 مل من المخزن المؤقت (PBS + 0.5٪ (v / v) FBS + 2 ملي مولار EDTA) ؛ جهاز الطرد المركزي والتخلص من المادة الطافية.
  3. أعد تعليق حبيبات الخلية في 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت. أضف 1 ميكرولتر من 7-AAD للكشف عن الخلايا الميتة.
  4. أضف 5 ميكرولتر من الجسم المضاد المضاد للفلور 647 المضاد ل tEGFR-Alexa لتلطيخ الخلايا المنقولة.
  5. احتضن لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
  6. اغسل الخلايا (انظر الخطوة 3.2).
  7. أعد تعليق حبيبات الخلية في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت.
  8. قم بقياس العينات على مقياس التدفق الخلوي.
    ملاحظة: إذا كانت كفاءة التعدي غير مرضية ، فتابع تخصيب الخلايا التي تعبر عن الجينات المعدلة وراثيا.

4. إثراء الخلايا التي تعبر عن الجينات المعدلة وراثيا عن طريق فرز الخلايا المنشطة مغناطيسيا (MACS)

ملاحظة: للحصول على أفضل النتائج ، ابدأ البروتوكول ب 8-10 × 106 خلايا. يتم تنفيذ جميع خطوات الطرد المركزي عند 4 درجات مئوية.

  1. قم بإعداد المخزن المؤقت كما هو موضح في الخطوة 3.2. تمييع الخلايا بتركيز 1-2 × 106/100 ميكرولتر مع المخزن المؤقت في أنبوب سفلي مخروطي سعة 15 مل.
  2. أضف 1 ميكرولتر من البيوتين المضاد للإيجفرات لكل 1-2 × 106 خلايا ، وقم بتدوير الأنبوب برفق لضمان توزيع محلول بالتساوي.
  3. احتضن لمدة 25 دقيقة عند 4 درجات مئوية ، ثم املأ الأنبوب بما يصل إلى 10 مل من المخزن المؤقت.
  4. الطرد المركزي. تخلص من المادة الطافية.
  5. أضف 8 ميكرولتر / 1 × 106 خلايا من المخزن المؤقت البارد.
  6. أضف 2 ميكرولتر من الخرز المغناطيسي المضاد للبيوتين لكل 1 × 106 خلايا.
  7. احتضن لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
  8. يغسل عن طريق ملء ما يصل إلى 10 مل بالمخزن المؤقت.
  9. الطرد المركزي. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت.
  10. ضع عمود LS في مغناطيس MACS واغسله ب 3 مل من المخزن المؤقت.
  11. بمجرد ترحيل المخزن المؤقت بالكامل عبر العمود، أضف تعليق الخلية.
  12. اغسل العمود 3x ، كل منها يحتوي على 3 مل من المخزن المؤقت.
  13. قم بإزالة العمود من المغناطيس وضعه في أنبوب سفلي مخروطي نظيف سعة 15 مل.
  14. أضف 5 مل من المخزن المؤقت إلى العمود. باستخدام المكبس ، اغسل الخلايا الموجبة ل EGFR في أسرع وقت ممكن.
  15. زراعة الخلايا لبضعة أيام. ثم تحقق من الكفاءة عن طريق قياس التدفق الخلوي.

5. الاختبار الوظيفي

ملاحظة: بالنسبة للتجربة القادمة، قم بإعداد الوسيط التالي واستخدامه: RPMI + 20٪ FBS.

  1. اليوم 1 - بذر الرشاشيات fumigatus conidia
    1. تحضير معلق A. fumigatus conidia بتركيز 2.5 × 105 كونيديوم / مل في الوسط.
    2. في صفيحة استزراع 96 بئرا ، قم بتعبئة 100 ميكرولتر من معلق الكونيديا لكل بئر وتحتضن عند 25 درجة مئوية لمدة 16 ساعة.
      ملاحظة: بعد فترة الحضانة ، سوف تنبت الكونيديا (الشكل 1).
  2. اليوم 2 - الزراعة المشتركة مع خلايا CAR NK-92
    1. اغسل خلايا Mock و Af-CAR NK-92 2x بالوسط.
    2. الزراعة المشتركة مع الفطريات بنسبة المستجيب إلى الهدف 2: 1 عن طريق إضافة 5 × 104 خلايا في 100 ميكرولتر من الوسط لكل بئر (الشكل 2).
    3. للتحكم الإيجابي ، أضف 1 نانوغرام من PMA و 100 نانوغرام من الأيونوميسين لكل بئر في 100 ميكرولتر من الوسط. استخدم الخلايا في الوسط فقط كعنصر تحكم سلبي.
    4. احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO2 المرطبة لمدة 6 ساعات على الأقل.
    5. جهاز الطرد المركزي للوحة عند 300 × جم لمدة 5 دقائق.
    6. حصاد 100 ميكرولتر من كل بئر ؛ تجنب لمس الجزء السفلي. نقل المواد الطافية إلى أنابيب التفاعل.
      ملاحظة: تأكد من أن المادة الطافية فقط هي التي يتم سحب العينة وليس الفطريات المزروعة. إذا كنت في شك ، أضف خطوة طرد مركزي أخرى.
    7. قم بإجراء IFN-ɣ ELISA باتباع تعليمات الشركة المصنعة أو قم بتخزين العينات عند -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تستغرق العملية الكاملة لتوليد خلايا Af-CAR NK-92 ، بما في ذلك التعداء والاستعادة والتخصيب والتوسع ، حوالي 14 يوما. بعد التعدي ، يتم زراعة الخلايا وانقسامها كل يومين. قد تنخفض صلاحية الخلية خلال الانقسام الأول بعد يومين من التعدي. عادة ، تتعافى الخلايا بعد 4 أيام من التعدي وتبدأ في التكاثر ، مع وقت مضاعفة يبلغ 48 ساعة.

بعد التعافي ، يتم قياس كفاءات التعدي ومن المتوقع أن تصل إلى 10-20٪ (النتائج التمثيلية الموضحة في الشكل 3). يؤدي إثراء الخلايا الإيجابية ل EGFR عبر MACS إلى زيادة النسبة المئوية لخلايا Af-CAR NK-92 إلى أكثر من 95٪ (النتائج التمثيلية الموضحة في الشكل 4).

تم استخدام الثقافات التي تحتوي على أكثر من 95٪ من خلايا Af-CAR للمقايسات الوظيفية. هنا ، قمنا بزراعة الخلايا مع A. fumigatus الأنابيب الجرثومية لمدة 6 ساعات وقمنا بقياس إفراز IFN-ɣ كعلامة تنشيط. كما هو موضح في الشكل 5 ، أظهرت خلايا Af-CAR إفراز كبير للسيتوكين (المتوسط = 340.6 ± 86.5 بيكوغرام / مل) مقارنة بخلايا Mock NK-92 (المتوسط = 75.6 ± 19.5 بيكوغرام / مل) ، مما يشير إلى تنشيط أعلى بكثير لخلايا Af-CAR (قيمة p = 0.03).

figure-results-1
الشكل 1: الأنابيب الجرثومية من الرشاشيات fumigatus. صورة مجهرية ل A. fumigatus بعد 16 ساعة من الحضانة. لوحظت الأنابيب الجرثومية / الخيوط الصغيرة وتوزع بشكل متجانس حول البئر. شريط المقياس = 400 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-2
الشكل 2: الزراعة المشتركة لأنابيب جرثومة الرشاشيات مع الخلايا NK-92. صورة مجهرية للثقافة المشتركة. تشكل خلايا NK-92 مجموعات وهي على اتصال مع A. fumigatus الأنابيب الجرثومية شريط المقياس = 400 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-3
الشكل 3: تم تقييم كفاءة التعدي عن طريق تلطيخ علامة التعدي EGFR. في اليوم الخامس ، بعد التثقيب الكهربائي ، تم تلطيخ خلايا NK-92 ب 7-AAD ومضاد ل EGFR. تظهر النتائج لتجربة تمثيلية واحدة لخلايا (A) Mock و (B) Af-CAR NK-92. يظهر العمود الأيسر مخططات نقطية لحجم الخلية مقابل دقة الخلية. تم تعيين البوابة على خلايا NK-92. يتم التخلص من الخلايا الميتة باستخدام وضع العلامات 7-AAD (العمود الثاني). تظهر النسبة المئوية لخلايا EGFR + الحية في العمود الثالث. الاختصارات: EGFR = مستقبلات عامل نمو البشرة. 7-AAD = 7-أمينواكتينومايسين د ؛ CAR = مستقبلات مستضد خيمرية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4
الشكل 4: نتائج تلطيخ سطح الخلية بعد تخصيب الخلايا NK-92 التي تعبر عن الجين المعدل وراثيا. على اليسار، يتم عرض الخلايا الوهمية. على اليمين ، تظهر خلايا Af-CAR-NK. تمثل الرسوم البيانية الحمراء الخلايا غير الملطخة. تمثل الرسوم البيانية الزرقاء الخلايا الملطخة المقابلة. يتم تعيين البوابة على خلايا EGFR + ؛ توضح الأرقام النسبة المئوية للخلايا الموجبة. الاختصارات: EGFR = مستقبلات عامل نمو البشرة. CAR = مستقبلات مستضد خيمرية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-5
الشكل 5: إفراز السيتوكين للخلايا القاتلة الطبيعية التي يتم تنشيطها بواسطة أنابيب جرثومة الرشاشيات الدخانية . تقدم المخططات نتائج إفراز IFN-ɣ للخلايا Af-CAR و Mock في الزراعة المشتركة مع الفطريات المقاسة بواسطة ELISA بعد 6 ساعات من الزراعة المشتركة. البيانات المعروضة هي متوسط ± SD لثلاث تجارب تم إجراؤها بشكل مستقل (ن = 3). قيمة P محسوبة بواسطة اختبار ويلش t باستخدام GraphPad Prism 10 ، * ص < 0.05. الاختصارات: NK = قاتل طبيعي. IFN-ɣ = إنترفيرون جاما. CAR = مستقبلات مستضد خيمري. ELISA = مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

اسمشركةتركيز المخزونمرجع
الترانسبوزازSB100X ميني سيركلمصنع البلازميد1 ميكروغرام / ميكرولتر19
الينقولاتبلازميد Af-CARأنتجت في المنزل1 ميكروغرام / ميكرولتر6

الجدول 1: الحمض النووي المستخدم في هذا البروتوكول.

الشكل التكميلي S1: خريطة البلازميد للينقولات Af-CAR: تخطيطي لناقل البلازميد وتصميم الينقولات CAR. الاختصارات: EF1 = عامل الاستطالة -1 بروموتور ألفا ؛ ORI = الأصل البكتيري للنسخ المتماثل ؛ LIR = التكرار المقلوب الأيسر ؛ RIR: التكرار المقلوب الأيمن. Cyto = السيتوبلازمي. Tm = الغشاء. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوفر البروتوكول المقدم طريقة بسيطة وموثوقة لإنشاء خلايا CAR-NK التي تستهدف مسببات الأمراض الفطرية باستخدام نظام ينقولات الجمال النائم غير الفيروسي. تسمح هذه الطريقة بإدخال الجينات المعدلة وراثيا الكبيرة بشكل مستقر ودائم ، مما يتيح توسيع الخلايا للحصول على الكميات اللازمة لمزيد من التحليل14،16.

يمكن أن تؤثر العديد من العوامل الرئيسية على نجاح التعدي ، بما في ذلك عدد الخلية وقابليتها للحياة ، وقوة النبض ومدته ، بالإضافة إلى جودة الحمض النووي وكميته17. من الأهمية بمكان تقييم صحة الخلايا قبل البدء ، وضمان بقاء لا يقل عن 90٪. لقد ثبت أن قوة النبض المرتفعة يمكن أن تعزز كفاءة التعدي لمجموعة الخلايا. ومع ذلك ، يمكن أن يؤدي هذا النهج أيضا إلى انخفاض كبير في صلاحية الخلية. في الحالات التي تحتوي على خلايا زائدة وكمية أو نوعية محدودة من الحمض النووي ، قد يكون عدد الخلايا التي تمتص البلازميد بنجاح غير كاف17. ومع ذلك ، فقد ثبت أن التركيزات العالية من الحمض النووي سامة وتقلل من صلاحية الخلية18.

حققت الدراسات السابقة كفاءات أعلى في التعدي ولكنها ركزت فقط على التعبير عن البروتين العابر17. في المقابل ، يضمن بروتوكولنا إدخالا مستقرا للجينات المعدلة وراثيا. لمعالجة كفاءات التعداء المنخفضة ، قمنا بتنفيذ تخصيب الخلايا التي تم نقلها بشكل إيجابي وحققنا ما يقرب من 95٪ من الخلايا التي تعبر عن CAR. ومع ذلك ، أدى هذا إلى زيادة وقت الإنتاج إلى ~ 1 أسبوع. إذا كانت أوقات الإنتاج أقصر مطلوبة ، فيمكن تسليم الحمض النووي للينقولات كدائرة صغيرة ، والتي يمكن أن تعزز كفاءة التعدي وقد تلغي الحاجة إلى خطوة التخصيب19. ومع ذلك ، لا يمكن تقليل وقت الإنتاج إلى < أسبوع للسماح باستعادة الخلايا وتكاثرها.

بالنظر إلى الطبيعة الحادة لداء الرشاشيات الغازي ، فإن العلاجات الخلوية "الجاهزة" ستكون مفيدة. أدت التحديات والتكاليف المرتبطة بعزل الخلايا عن المرضى وتوسيع الخلايا الأولية إلى زيادة شعبية NK-92 كخط خلوي مناسب لإنتاج خلايا CAR-NK20. خلايا NK-92 قوية بشكل عام وتتكاثر بسرعة في وجود IL-2 ، مما يسهل الوصول إلى كميات كبيرة من الخلايا في فترة قصيرة نسبيا. في ضوء هذه المزايا ، قمنا بتطوير بروتوكول لهندسة الجينات لخلايا NK-92 ، مما يدل على أنه من الممكن نقل وإعداد منتجات CAR-NK الخلوية بأمان بنقاوة عالية. في حين يمكن تكييف هذا البروتوكول لإعداد خلايا CAR-NK الأولية ، يجب النظر في العديد من التعديلات. وتشمل هذه تحسين عدد وشدة النبضات ، وكمية الحمض النووي المستخدمة ، وإنشاء بروتوكول توسع مناسب. ستتطلب أي تعديلات على البروتوكول تحقيقا شاملا لضمان الفعالية. ومع ذلك ، يوفر بروتوكولنا نموذجا أساسيا يمكن تكييفه مع خلايا NK الأولية في التجارب المستقبلية.

باختصار ، يعد بروتوكول التعداء المبتكر هذا لإنتاج خلايا Af-CAR-NK مستقرة طريقة فعالة وقابلة للتكرار يمكن استخدامها لاستهداف الأمراض الأخرى. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدامه كطريقة فعالة من حيث التكلفة للكشف عن CAR الجديدة التي تستهدف مجموعة متنوعة من المستضدات.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

م.ح.: مخترع في طلبات براءات الاختراع ومنح براءات اختراع متعلقة بتكنولوجيا CAR ، مرخصة جزئيا للصناعة. المؤسس المشارك ومالك الأسهم T-CURX GmbH ، فورتسبورغ. المتحدث الأكريمي: BMS ، Janssen ، Kite / Gilead ، Novartis. دعم البحث: BMS. أبلغ إم بي عن دعم السفر من شركة الأدوية "Eli Lilly and Company" ، وهو أمر لا علاقة له بهذه الدراسة. المؤلفون الآخرون ليس لديهم أي تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم توفير التمويل والدعم للمشروع من قبل مؤسسة فيلهلم ساندر ، والمشروع 2020.017.1 إلى M.H. ، و J.L. ؛ Deutsche Forschungsgemeinschaft (مركز البحوث التعاونية / Transregio 124 الفطريات المسببة للأمراض ومضيفها البشري: شبكات التفاعل - FungiNet ؛ المشروع A8 إلى MH و H.E.).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
15 مل أنابيب سفلية مخروطية الشكلGreiner Bio-One188271PP ، 17/120 مم ، CELLTAR ، معقمة
50 مل أنابيب سفلية مخروطية الشكلGreiner Bio-One227270PP ، 30/115 مم ، Cellstar ، معقمة
6 و 96 Well- Cell CulturePlateCorning Inc. LifeSciences83-3736 / 83-3474ألواح آبار متعددة معالجة ب TC ، قيعان مسطحة ، معالجة لربط الخلايا الأمثل ، معقمة بإشعاع جاما ، غير البيروجينيك
7-AAD (7-Aminoactinomycin D)BD Biosciences559925صبغة الحمض النووي سهلة الاستخدام لاستبعاد الخلايا غير القابلة للحياة في فحوصات قياس التدفق
الخلوي Alexa Fluor 647 الأجسام المضادة للإنسانEGFR Biolegend352918استنساخ AY13
MicroBeads المضادة للبيوتين UltraPureMiltenyi Biotec130-105-637UltraPure MicroBeads مترافقة مع الفأر أحادي النسيلة المضاد للبيوتين الأجسام المضادة
Aspergillus fumigatusATCC46645
نصائح مرشح المحيط الحيوي (20 و 100 & mu; L) Sarstedt70.3030.365 / 70.3030.275
Dulbecco & prime; s محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)سيجما ألدريتشD8537  ؛ معدل ، بدون كلوريد الكالسيوم وكلوريد المغنيسيوم ، سائل ، مفلتر معقم ، مناسب لزراعة الخلايا ، السموم الداخلية ، تم اختبار
ELISA MAX Deluxe Set Human IFN- & gamma ؛Biolegend430104
محلول ملح ثنائي الصوديوم حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA)سيجما ألدريتشE7889للبيولوجيا الجزيئية ، 0.5 & nbsp ؛ M في H2< / sub>O ، DNase ، RNase ، NICKase والبروتياز ، لم يتم الكشف عن أي منها ، 0.2 & mu ؛ م تمت تصفيته.
FACS نظيفBD Biosciences340345
FACS Flow Sheath FluidBD Biosciences342003
FACS Rinse SolutionBD Bioscience340346
مصل الأبقار الجنيني (FBS)Sigma-AldrichF7524معقم مفلتر ، مناسب لزراعة الخلايا ، معطل الحرارة قبل الاستخدام
Gibco ، MEM & alpha ؛ ، نيوكليوسيداتThermofisher 22571020 العلميالفينول الأحمر ، الريبونوكليوسيدات ، الديوكسي ريبونوكليوسيدات ، مصل بيكربونات الصوديوم
الحصان ثيرمو فيشر العلمي16050122معقمة ، معطلة الحرارة قبل الاستخدام
الإنسان IL-2 IS ، درجة البحثMiltenyi Biotec130-097-742درجة البحث. ED50 هو ≤ 0.3 نانوغرام / مل ، يتوافق مع نشاط & ge ؛ 3 & مرات 106< / sup> IU / mg.
IonomycinSigma-AldrichI0634-1MGمن Streptomyces conglobatus ، يستخدم كتحكم إيجابي لإفراز السيتوكين   ؛
L-GlutamineSigma-AldrichW368401لزراعة الخلايا
MACS LS العمودMiltenyi Biotec130-042-401  الأعمدة والغطاس, معقمة معبأة
NK-92DSMZACC 488
نيون Transfektionssystem 100  مو L-KitThermo Fisher ScientificMPK10096Resuspension Buffer R ، عازلة كهربائية E2 ، 100 & mu ؛ L نيون نصائح ، أنابيب التثقيب الكهربائي النيون
Phorbol-12-myristat-13-acetat (PMA)Sigma-AldrichP1585-1MGتستخدم كتحكم إيجابي لإفراز السيتوكين   ؛
أنبوب البوليسترين ذو القاع المستدير ، 5 ملBD BioscienceS-452400يستخدم لقياس التدفق
الخلوي أنبوب التفاعل ، 1.5 ملGreiner Bio-One7،26،90،001PP ، شفاف ، غطاء مرفق ، مع تخرج محقون. معقم قبل الاستخدام.
RPMI 1640 متوسط, GlutaMAXثيرمو فيشر العلمي72400021GlutaMax I,  الفينول الأحمر ، HEPES ،
TipOne 1000 & mu L XL تلميح مرشح متدرجStarLabS1122-1730
Equipment< / strong>
BD FACSCaliburBD Bioscience
CO2< / sub> حاضنة C60 & nbsp ؛Labotect
Heraeus Multifuge 3SRThermo Scientific
HydroFLEX غسالة ميكروبليت  Tecan
NanoQuant Infinite M200 ProTecan
نظام تعداء النيونInvitrogen
Pipettes Eppendorf
Quadro MACS فاصل  ميلتيني بيوتيك

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fang, W., Latgé, J. -P. Microbe profile: Aspergillus fumigatus: A saprotrophic and opportunistic fungal pathogen. Microbiology (Reading). 164 (8), 1009-1011 (2018).
  2. Brown, G. D., et al. Hidden killers: Human fungal infections. Sci Transl Med. 4 (165), 165rv113(2012).
  3. Sun, K. S., Tsai, C. F., Chen, S. C., Huang, W. C. Clinical outcome and prognostic factors associated with invasive pulmonary aspergillosis: An 11-year follow-up report from Taiwan. PLoS One. 12 (10), e0186422(2017).
  4. Meis, J. F., Chowdhary, A., Rhodes, J. L., Fisher, M. C., Verweij, P. E. Clinical implications of globally emerging azole resistance in Aspergillus fumigatus. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 371 (1709), 20150460(2016).
  5. Seif, M., Einsele, H., Löffler, J. CAR T cells beyond cancer: Hope for immunomodulatory therapy of infectious diseases. Front Immunol. 10, 2711(2019).
  6. Seif, M., et al. CAR T cells targeting Aspergillus fumigatus are effective at treating invasive pulmonary aspergillosis in preclinical models. Sci Transl Med. 14 (664), eabh1209(2022).
  7. Kumaresan, P. R., et al. Bioengineering T cells to target carbohydrate to treat opportunistic fungal infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (29), 10660-10665 (2014).
  8. Kumaresan, P. R., et al. A novel lentiviral vector-based approach to generate chimeric antigen receptor T cells targeting Aspergillus fumigatus. mBio. 15 (4), e0341323(2024).
  9. Lu, H., Zhao, X., Li, Z., Hu, Y., Wang, H. From CAR-T cells to CAR-NK cells: A developing immunotherapy method for hematological malignancies. Front Oncol. 11, 720501(2021).
  10. Robertson, M. J., Ritz, J. Biology and clinical relevance of human natural killer cells. Blood. 76 (12), 2421-2438 (1990).
  11. Ziegler, S., et al. CD56 is a pathogen recognition receptor on human natural killer cells. Sci Rep. 7 (1), 6138(2017).
  12. Esmaeilzadeh, A., Hadiloo, K., Jabbari, M., Elahi, R. Current progress of chimeric antigen receptor (car) t versus car nk cell for immunotherapy of solid tumors. Life Sci. 337, 122381(2024).
  13. Zhang, J., Zheng, H., Diao, Y. Natural killer cells and current applications of chimeric antigen receptor-modified NK-92 cells in tumor immunotherapy. Int J Mol Sci. 20 (2), 317(2019).
  14. Hu, Y., Tian, Z. G., Zhang, C. Chimeric antigen receptor (CAR)-transduced natural killer cells in tumor immunotherapy. Acta Pharmacol Sin. 39 (2), 167-176 (2018).
  15. Hudecek, M., et al. Going non-viral: The Sleeping Beauty transposon system breaks on through to the clinical side. Crit Rev Biochem Mol Biol. 52 (4), 355-380 (2017).
  16. Amberger, M., Ivics, Z. Latest advances for the Sleeping Beauty transposon system: 23 years of insomnia but prettier than ever. BioEssays. 42 (11), 2000136(2020).
  17. Ingegnere, T., et al. Human car nk cells: A new non-viral method allowing high efficient transfection and strong tumor cell killing. Front Immunol. 10, 957(2019).
  18. Stacey, K. J., Ross, I. L., Hume, D. A. Electroporation and DNA-dependent cell death in murine macrophages. Immunol Cell Biol. 71 (Pt 2), 75-85 (1993).
  19. Monjezi, R., et al. Enhanced CAR T-cell engineering using non-viral Sleeping Beauty transposition from minicircle vectors. Leukemia. 31 (1), 186-194 (2017).
  20. Moscarelli, J., Zahavi, D., Maynard, R., Weiner, L. M. The next generation of cellular immunotherapy: Chimeric antigen receptor-natural killer cells. Transplant Cell Ther. 28 (10), 650-656 (2022).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

NK NK 92

مقالات ذات صلة