مقالة منهجية

التقدم في الخلايا القاتلة الطبيعية المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات المشتقة من الخلايا الجذعية

DOI:

10.3791/67438

⸱

فبراير 14, 2025

 , 
1Department of Medicine, Division of Regenerative Medicine, University of California, San Diego, 2Sanford Stem Cell Institute, University of California, San Diego

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا, نقدم طريقة لتفريق وتوسيع مستقبلات المستضد الخيمري المشتق من iPSC البشري (CAR) التي تعبر عن الخلايا القاتلة الطبيعية مع تحسين القتل ضد الأورام الخبيثة المختلفة. يوضح هذا البروتوكول تمايز وتوسيع خلايا CAR-NK المحسنة المشتقة من iPSC القاتل الطبيعي (NK) وقياس النشاط المضاد للأورام ضد خطوط الخلايا السرطانية المختلفة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الخلايا القاتلة الطبيعية (NK) هي خلايا مناعية فطرية تلعب دورا مهما في دفاع الجسم ضد الأورام والالتهابات الفيروسية. ظهر توليد مستقبلات المستضد الخيمري المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات (CAR) التي تعبر عن الخلايا القاتلة الطبيعية المستحثة البشرية كوسيلة واعدة للعلاج المناعي للسرطان "جاهزة". هنا ، استخدمنا بنية CAR المحسنة لخلية NK والتي تتضمن مجال الغشاء ل NKG2D ، ومجال التحفيز المشترك 2B4 ، ومجال إشارات CD3ζ ، والذي ثبت أنه يحفز نشاط مضاد للأورام القوي بوساطة الخلايا القاتلة الطبيعية الخاصة بالمستضد. يوفر استخدام iPSCs لتوليد خلايا CAR NK العديد من المزايا, بما في ذلك التعبير المتجانس عن CAR ، وقابلية التوسع ، والقابلية للتكرار ، وإمكانية التطبيق السريري. يتيح هذا البروتوكول المفصل خطوة بخطوة من هندسة الخلايا إلى التمايز توليد خلايا NK المشتقة من CAR المشتقة من iPSC المحسنة للخلايا القاتلة الطبيعية ، مما يوفر علاجا مناعيا موحدا ومستهدفا للسرطان مع نشاط مضاد للأورام محسن وتسليط الضوء على إمكاناتها كخيار علاجي واعد للأورام الخبيثة المختلفة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعتبر الخلايا القاتلة الطبيعية ، وهي نوع من الخلايا الليمفاوية داخل الجهاز المناعي الفطري ، محورية في الدفاع المبكر ضد الأورام والخلايا المصابة فيروسيا. على عكس الخلايا التائية ، لا تتطلب الخلايا القاتلة الطبيعية عرضا للمستضد عبر جزيئات مركب التوافق النسيجي الرئيسي (MHC). بدلا من ذلك ، تمتلك الخلايا القاتلة الطبيعية ذخيرة من المستقبلات المنشطة والمثبطة التي تنظم نشاطها3. يستخدم النشاط السام للخلايا بوساطة الخلايا القاتلة الطبيعية آليات مختلفة ، بما في ذلك إطلاق البيرفورين والجرانزيم ، وإشراك مستقبلات الموت ، وإنتاج السيتوكينات المؤيدة للالتهابات مثل IFN-γ و TNF-α. يضع هذا النمط الفريد من العمل خلايا NK كمرشح جذاب للعلاج المناعي للسرطان ، لا سيما في علاج السرطانات الصلبة حيث يمثل التهرب المناعي عقبة كبيرة1،2،3،4.

سرطان الخلايا الكبدية (HCC) هو أحد أكثر أشكال سرطان الكبد شيوعا وفتكا في جميع أنحاءالعالم 5. عادة ما توفر الأساليب العلاجية التقليدية ، بما في ذلك الجراحة والعلاج الكيميائي والعلاج الإشعاعي ، فائدة سريرية محدودة وتؤدي إلى معدلات تكرار عالية6،7. أثرت التطورات الحديثة في العلاج المناعي والعلاج الموجه بشكل كبير على علاج سرطان الكبد8،9. أظهرت مثبطات نقاط التفتيش المناعية ، مثل nivolumab و pembrolizumab ، نتائج واعدة من خلال تعزيز استجابة الخلايا المناعية ضد الخلايا السرطانية10،11. أدت هذه العلاجات إلى تحسين معدلات البقاء على قيد الحياة وتحسين نوعية الحياة لبعض المرضى. ومع ذلك ، يمكن أن تسبب أيضا آثارا ضارة مرتبطة بالمناعة ، مما قد يحد من استخدامها في بعض المرضى12. العلاجات المستهدفة ، مثل سورافينيب ولينفاتينيب ، تمنع على وجه التحديد المسارات التي تعزز نمو الخلايا السرطانية وتكوين الأوعيةالدموية 13. هذه العلاجات لها فعالية معروفة للسيطرة على تطور المرض وإطالة البقاء على قيدالحياة 8،14. ومع ذلك ، عادة ما تتطور مقاومة العلاجات المستهدفة ، والآثار الجانبية للعلاج شائعة15،16. من بين السبل الواعدة في استراتيجيات العلاج المناعي للسرطان ، أحدث ظهور الخلايا التائية لمستقبلات المستضد الخيمري (CAR) ثورة في علاج السرطان ، خاصة في علاج الأورام الخبيثة الدموية مثل سرطان الغدد الليمفاوية والورم النقوي المتعدد17،18،19.

تمثل الخلايا القاتلة الطبيعية التي تعبر عن CAR ، والتي تجمع بين النشاط الفطري السام للخلايا لخلايا NK والاستهداف الدقيق لتقنية CAR ، نهجا مبتكرا وتحويليا محتملا للأورام الصلبة مثل HCC20،21،22،23،24. يمكن للخلايا المصممة من قبل CAR التعرف على الخلايا السرطانية التي تعبر عن المستضد المستهدف وقتلها مع الحفاظ على الأنسجة الطبيعية ، وبالتالي تقليل مخاطر التأثيرات غير المستهدفة المرتبطة بالعلاجات التقليدية25،26،27. عادة ما يتم إنتاج خلايا CAR-NK المنتجة من الخلايا القاتلة الطبيعية المعزولة من الدم المحيطي أو دم الحبل السري عن طريق تحويل الخلايا القاتلة الطبيعية مع تركيبات CAR التي تتكون من مجال التعرف على المستضد خارج الخلية ، ومجال الغشاء ، ومجالات الإشارات داخل الخلايا اللازمة للتنشيط والتكاثر28،29،30.

يمكن معالجة التحدي المتمثل في هندسة مجموعة مستقرة ومتجانسة من الخلايا القاتلة الطبيعية المعدلة وظيفيا للعلاج السريري من خلال استخدام الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSCs) 31،32. توفر هندسة iPSCs البشرية مع CARs المحسنة للخلايا القاتلة الطبيعية إشارة تنشيط الخلايا القاتلة الطبيعية المحسنة وتكاثر وتوفر مجموعة لا تنضب ومتجانسة من الخلايا القاتلة الطبيعية التي تعبر عن CAR كوحدة موحدة, "العلاج الجاهز"20,33. في هذا البروتوكول, التعديل الجيني ل iPSCs لتوليد خلايا NK المشتقة من iPSC عبر عن CAR ينطوي على دمج بنية CAR الأمثل لخلية NK التي تتضمن مجالات الغشاء والإشارات المشتقة من الخلايا القاتلة الطبيعية (NKG2D-2B4-CD3ζ) ومضاد للجليبيكان-3 (GPC3) scFv كما هو موضح في دراساتنا السابقة23. ثم يتم تمييز iPSCs المعدلة وراثيا وتوسيعها باستخدام بروتوكول تمايز الخلايا القاتلة الطبيعية الذي تم تطويره سابقا34. تتمتع خلايا NK المشتقة من iPSC المعدلة هندسيا عن CAR بالقدرة على التعرف على سرطان الكبد والخلايا السرطانية الأخرى التي تعبر عن مستضدات معينة مرتبطة بالورم والقضاء عليها ، مثل Glypican 3 (GPC3) ، والتي يتم التعبير عنها بشكل مفرط في سرطان الكبد والأورام الخبيثة الأخرى35،36،37،38.

تطبيق خلايا CAR-NK المشتقة من iPSC لعلاج السرطانات المتنوعة يحمل وعدا كبيرا 30,39,40; العديد من خلايا CAR-NK المشتقة من iPSC هي حاليا في التجارب السريرية 41,42,43. لتسهيل التقدم في هذا المجال ، يتيح هذا البروتوكول الإنتاج الفعال لخلايا CAR-NK المشتقة من iPSC ، من هندسة الخلايا إلى التمايز إلى خلايا NK الناضجة والتوسع في المختبر.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. طريقة الثقافة الخالية من المغذيات من iPSCs البشرية

ملاحظة: قم بإذابة iPSCs البشرية المجمدة غير المتمايزة وزراعتها باستخدام mTeSR 1-plus على Matrigel (يشار إليها من الآن فصاعدا باسم مصفوفة الغشاء القاعدي [BMM]) لوحات المغلفة مسبقا, كما هو موضح سابقا23,34. من المهم جدا التأكد من عدم تمييز iPSCs قبل وبعد الهندسة. يجب أن يتم استزراع iPSCs مذابة حديثا لحوالي 2-3 مقاطع لإظهار مورفولوجيا متعددة القدرات بما يتفق مع الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات. تستخدم التعليمات التالية لتمرير الخلايا من بئر واحد من صفيحة 6 آبار.

  1. قبل اجتياز iPSCs, قم بتغطية لوحة الآبار الجديدة 6 ب 1x BMM (1 مل / بئر) واحتضانها في حاضنة 37 °C لمدة 2-4 ساعات قبل الاستخدام.
  2. تحضير 1x BMM الذوبان.
    1. قم بإذابة قارورة مخزون سعة 5 مل من BMM عند 4 درجات مئوية طوال الليل.
    2. قم بنقل BMM بسرعة باستخدام أطراف مبردة مسبقا في أنابيب أجهزة الطرد المركزي الدقيقة المبردة مسبقا.
    3. يحفظ في درجة حرارة -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر.
    4. لتحضير حل عمل 1x BMM ، قم بتعليق كمية BMM واحدة بنسبة 1: 100 في وسط DMEM / F12 بارد. يمكن تخزين حل العمل 1x BMM عند -4 درجة مئوية لمدة أسبوعين.
    5. قم بتغطية اللوحة بحجم كاف لتغطية السطح (على سبيل المثال ، استخدم 1 مل لكل بئر من 6 آبار).
    6. احتضن في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 2-4 ساعات قبل الاستخدام.
  3. قم بإذابة قارورة iPSCs المجمدة (عادة 1 × 106 خلايا/قارورة) في حمام مائي عند 37 درجة مئوية.
  4. إضافة تدريجيا iPSCs مذابة إلى 15 مل أنبوب مخروطي يحتوي على 5 مل من mTeSR زائد الوسط الدافئ مسبقا, السماح للخلايا بالتأقلم عن طريق إضافتها قطرة قطرة لتقليل الصدمة الخلوية.
  5. الطرد المركزي للخلايا عند 300 × جم لمدة 5 دقائق.
  6. استنشق المادة الطافية واغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام 5 مل من PBS.
  7. أعد تعليق الخلايا في وسط mTeSR Plus وقم بتلويها بكثافة حوالي 200,000 خلية / 3 مل / بئر في لوحة BMM المكونة من 6 آبار مطلية مسبقا.
  8. ممر iPSCs.
    1. بمجرد أن تصل iPSCs إلى 70-80٪ التقاء, استنشاق الوسائط وإجراء مرور خلية واحدة مع TrypLE ل 5 دقائق عند 37 درجة مئوية (1 مل/بئر في 6 لوحة جيدا).
    2. بعد 5 دقائق ، أضف 3 مل من 1x PBS لإيقاف تفاعل التفكك وغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام 3 مل من PBS.
    3. الطرد المركزي للخلايا عند 300 × جم لمدة 5 دقائق. بعد الغسيل, أعد تعليق iPSCs خلية واحدة في وسط mTeSR Plus, ثم لوحة على BMM المغلفة مسبقا 6 لوحة آبار.
      ملاحظة: إجمالي حجم الوسائط المطلوب هو 3 مل / بئر في صفيحة 6 آبار. يجب تغيير الوسائط كل 2-3 أيام, والخطوة 1.8 يجب تكرارها عندما تصبح الخلايا 70-80٪ ملتقى لما لا يقل عن 1-2 ممرات قبل هندسة iPSCs.
  9. تحقق بانتظام من تعدد القدرات من iPSCs. وصمة عار iPSCs مع Allophycocyanin (APC) مترافق TRA-1-81 و PE-Cy7 مترافق المرحلة الخاصة مستضد جنيني-4 (SSEA-4) الجسم المضاد ل 30 دقيقة على الجليد, ثم تحليلها باستخدام قياس التدفق الخلوي كما هو موضح سابقا23,41.
    ملاحظة: يتم تكييف iPSCs المستخدمة في هذه التجربة مع TrypLE. تتطلب iPSCs التي لم يتم تمريرها من قبل مع TrypLE عادة 8-10 مقاطع لتصبح تتكيف تماما مع TrypLE, مما يضمن إنتاج الأجسام الجنينية تدور عالية الجودة (EBs).

2. هندسة iPSCs البشرية للتعبير عن سيارة المضادة ل GPC3 باستخدام ناقل piggyBac

  1. قم بتغطية صفيحة جديدة مكونة من 6 آبار ب BMM واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة على الأقل (يمكن أن تكون أطول طالما أن السائل لا يجف).
  2. التسخين المسبق mTeSR Plus مع 10 ميكرومتر من Rho ، لفائف ملفوفة تحتوي على مثبط بروتين كيناز (ROCK) (Y-27632) (من مخزون 1 ملي محضر في ماء مقطر معقم) عند 37 درجة مئوية.
  3. قم بتشغيل نظام Nucleofection. حدد الوحدة X ، ثم حدد مواقع الآبار المراد نقلها. اختر الحل P3 وأدخل الكود يدويا (CA-137).
  4. حصاد iPSCs في 70-80٪ التقاء مع 1 مل من TrypLE واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. تحقق تحت المجهر لتأكيد التفكك.
  5. الماصة 4-6 مرات للحصول على تعليق أحادي الخلية ، ثم تحييد ب 5 مل من PBS والحبيبات عند 300 × جم لمدة 5 دقائق.
  6. اغسل الخلايا برفق مرة أخرى لإزالة جميع آثار TrypLE.
  7. أعد التعليق في 1 مل من mTeSR Plus باستخدام مثبط الصخور وعد الخلايا.
  8. لإنشاء iPSCs المضادة ل GPC3 CAR, استخدم 1 × 106 خلايا لكل تعداء في أنبوب الطرد المركزي الدقيق وتدور لأسفل عند 300 × جم لمدة 5 دقائق.
  9. أثناء الدوران ، اجمع بين الحمض النووي للينقولات التي تعبر عن CAR مع ناقل تعبير الترانسبوزياز الفائق PiggyBac في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل بنسبة 3: 1 (على سبيل المثال ، 3 ميكروغرام من البلازميد الذي يحتوي على الينقولات إلى 1 ميكروغرام من بلازميد الترانسبوزياز).
  10. قم بتضمين التحكم الإيجابي في البروتين الفلوري الأخضر (GFP) (جدول المواد) باستخدام 0.5 ميكرولتر من محلول 1 مجم / مل ، وتحكم سلبي غير منقول لتأكيد تعبير GFP.
  11. أعد تعليق حبيبات الخلية بعناية في 20 ميكرولتر من محلول نوكليوفكتور P3 بدرجة حرارة الغرفة (RT) مع المكمل الموجود في مجموعة Nucleofection. بعد ذلك ، أضف هذا الخليط إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل يحتوي على الحمض النووي البلازميد ، مما ينتج عنه حجم نهائي يبلغ حوالي 22-25 ميكرولتر.
    ملاحظة: إعادة تعليق جميع iPSCs ليتم نقلها في محلول P3 Nucleofector قبل إضافة بلازميدات GPC3 CAR أو بلازميد التحكم GFP إلى الخلايا.
  12. انقل تعليق الخلية / الحمض النووي إلى شرائط سعة 20 ميكرولتر سعة 16 بئر. تأكد من أن العينة تغطي قاع الكوفيت بدون أي فقاعات.
  13. اضغط برفق على 16 شريطا بئرا على الجزء العلوي من المقعد لإزالة أي فقاعات هواء وتسوية الخلايا في الأسفل.
  14. ضع شرائط 16 بئر تحتوي على iPSCs ومزيج الحمض النووي CAR في نظام Nucleofection, حدد البرنامج CA-137, محلول P3, ثم ابدأ البرنامج. سينتهي هذا البرنامج في 1 ثانية ويظهر علامة خضراء.
  15. أضف 80 ميكرولتر من mTeSR Plus الدافئ مسبقا مع وسط ROCK-Inhibitor إلى البئر وانقل الخلايا بعناية إلى صفيحة 6 آبار مطلية ب BMM (الحجم النهائي 1 مل لكل بئر).
  16. افحص الخلايا تحت المجهر الفلوري لفترة وجيزة بعد 4 ساعات بحثا عن أي تعبير GFP لتأكيد معدل نجاح التعدين.
  17. فحص iPSCs للتعبير GFP لتقييم كفاءة التعدي 24 ساعة بعد التعدي باستخدام قياس التدفقالخلوي 23,41 لتأكيد تعبير GFP.
  18. احتضان لمدة 4 أيام عند 37 درجة مئوية ، وتغيير الوسائط كما هو مطلوب قبل الشروع في اختيار الدواء.
    ملاحظة: كل نوة يتطلب 0.2-2 × 106 iPSCs لكل تفاعل. اعتمادا على عدد التفاعلات ، يمكن استخدام ألواح 24 بئرا أو ألواح 6 آبار.

3. اختيار نسيلي وتأكيد تعدد القدرات من GPC3-CAR iPSCs

  1. قم بإجراء سلسلة من تحديدات zeocin (1: 10,000) على iPSCs المنقولة لتحديد GPC3-CAR التي تعبر عن iPSCs بشكل مستنساخ.
  2. لتأكيد كفاءة التعدي ، قم بقياس تعبير GFP باستخدام مجهر الفلورسنت وقياس التدفقالخلوي 23،41.
    ملاحظة: تم دمج بنية CAR مع علامة FLAG44,45 لغرض تقييم تعبير CAR أثناء مرحلة iPSC وبعد تمايز الخلايا القاتلة الطبيعية.
  3. الحفاظ على معطلونات مستقبلات المستضدات المستضدة للمستقبلات المستضدة تحت اختيار الدواء حتى تحقق جين CAR الأمثل والتعبير العالمي الإيجابي.
  4. لضمان التعبير المتجانس عن GFP و CAR ، قم بتمديد مدة اختيار الدواء لمدة 2-3 أسابيع.
  5. إجراء فرز الخلايا على أساس التعبير GFP أو CAR باستخدام قياس التدفق الخلوي للحصول على مجموعة متجانسة من iPSCs المختارة نسليا23.
  6. يحتوي هيكل CAR المستخدم هنا على علامة اختيار دواء الزيوسين. حدد الخلايا المنقولة لجين GPC3 CAR عن طريق إضافة زيوسين (50 ميكروغرام / مل من الزيوسين) إلى وسط الاستزراع.
  7. بعد اختيار زيوسين, تخفيف الجين GPC3 CAR المنقولة iPSCs ووصفها في لوحة 96 بئر لتحقيق ما يقرب من خلية واحدة لكل بئر. يمكن القيام بذلك من خلال التخفيف التسلسلي أو باستخدام فارز الخلايا.
    ملاحظة: استخدم فرز الخلايا المنشطة بالفلورة (FACS) لعزل الخلايا المفردة المنقولة بناء على التعبير عن علامة الفلورسنت المرتبطة ببناء CAR.
  8. اسمح للخلايا المفردة بالتوسع إلى مستعمرات في الصفيحة المكونة من 96 بئرا.
  9. قم بتغذية الخلايا بوسط استزراع طازج كل 3-4 أيام مرة واحدة ، وراقب الآبار بحثا عن نمو المستعمرة.
  10. فحص المستعمرات لتعبير CAR. يمكن القيام بذلك عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) ، أو تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR) ، أو النشاف الغربي للتحقق من وجود بناء CAR23،47.
  11. بدلا من ذلك ، استخدم قياس التدفقالخلوي 23،41 للكشف عن التعبير السطحي لبروتين CAR.
    ملاحظة: في هذه الدراسة ، تم قياس تعبير CAR عن طريق تعبير علامة FLAG باستخدام قياس التدفق الخلوي.
  12. بالإضافة إلى ذلك ، قم بإجراء التنميط النووي لتحديد أي تشوهات كروموسومات.
    ملاحظة: يمكن القيام بذلك من قبل منظمات خارجية مثل Wicell (wicell.org) أو Thermo Fisher Scientific (thermofisher.com).
  13. بمجرد تحديد المستنسخة الإيجابية ل CAR دون أي تشوهات ، قم بتوسيع هذه المستنسخة في أوعية استزراع أكبر مثل 6 ألواح آبار وقارورة T75.
  14. حافظ على أجهزة CAR iPSCs الموسعة نسليا بالتبريد باستخدام وسيط الحفظ بالتبريد في قوارير متعددة للاستخدام في المستقبل.
    ملاحظة: يوصى بالنقاط التالية في هذه الخطوة: (i) الحفاظ على ظروف الثقافة المثلى ل iPSCs لمنع التمايز. (ثانيا) السماح 1-4 أسابيع لتحقيق مجموعة متجانسة من تعبير CAR و GFP في iPSCs بعد اختيار المخدرات. (ثالثا) الاستمرار في مراقبة الخلايا للتأكد من استقرار تعبير CAR وعلامات تعدد القدرات. (4) استخدام الضوابط المناسبة أثناء خطوات الفحص والتحقق. (ت) بعد الانتقاء النسيلي والتوسع، تحقق من تعدد القدرات عن طريق تقييم تعبير TRA-1-81 و SSEA-4 على iPSCs المعبرة عن CAR.

4. توليد الخلايا السلفية المكونة للدم من CAR iPSCs المهندسة عن طريق تشكيل الجسم الجنيني الدوري (EB)

ملاحظة: يتم استخدام بروتوكول الدوران EB أو بروتوكول العضوية المكونة للدم لإنتاج أسلاف المكونة للدم23،34. تتمايز الخلايا الموجودة داخل EBs إلى خلايا لحمية لدعم نمو الخلايا الليمفاوية38 ، وبالتالي تلغي الحاجة إلى الخلايا اللحمية المشتقة من xeno مثل OP923،34،48. فيما يلي تعليمات لجمع الخلايا من بئر واحد من صفيحة مكونة من 6 آبار لتكوين EB.

  1. مرور ~ 200،000 خلية / بئر من 6 آبار BMM - لوحة مطلية مسبقا قبل يومين من تشكيل دوران EB. تأكد من وصوله إلى التقاء 70-80٪ في يوم إعداد EBs للدوران. بشكل عام ، يكفي بئر واحد من صفيحة 6 آبار للوحين من الدوران EB.
  2. قم بإزالة وسط المزرعة وفصل الخلايا عن طريق احتضانها ب 1 مل من TrypLE Select المسخن مسبقا عند 37 درجة مئوية 5 دقائق.
  3. قم بفصل مجاميع الخلايا بعناية إلى معلق خلية واحدة باستخدام ماصة دقيقة سعة 1 مل وانقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل. أضف 3 مل من 1x PBS لإيقاف تفاعل التفكك ، واغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام 3 مل من PBS.
  4. أعد تعليق الخلايا في وسط mTesR Plus وقم بالتصفية من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر لإزالة الركام.
  5. قم بتدوير الخلايا لإزالة المادة الطافية ، واغسل الخلايا مرة أخرى باستخدام 5 مل PBS. ثم أعد تعليق الخلايا في 1 مل من وسط STEMdiff APEL (وسط تكوين EB).
  6. عد الخلايا وتخفيفها إلى الكثافة المناسبة باستخدام وسط تكوين EB الذي يحتوي على السيتوكينات التالية (SCF: 40 نانوغرام / مل ، BMP4: 20 نانوغرام / مل ، VEGF: 20 نانوغرام / مل) بالإضافة إلى 10 ميكرومتر مثبط ROCK.
  7. بذرة 3000-10000 خلية / بئر في 100 ميكرولتر من الوسائط (100,000 خلية / مل) في الألواح المكونة من 96 بئر.
    ملاحظة: قد يختلف عدد الخلايا المستخدمة في تكوين EB اعتمادا على خط iPSC. يوصى باختبار ما بين 3,000 و 10,000 خلية لكل بئر في ألواح 96 بئرا.
  8. باستخدام ماصة متعددة القنوات، قم بتحميل معلق الخلية في ألواح سعة 96 بئرا عند 100 ميكرولتر/بئر.
    ملاحظة: من أجل تكوين أجسام جنينية أفضل (EBs) ، يوصى باستخدام ألواح مستديرة القاع ذات 96 بئرا منخفضة للغاية.
  9. قم بالطرد المركزي للوحة 96 بئرا عند 300 × جم لمدة 5 دقائق ، ثم احتضن الألواح عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 6 أيام.
    ملاحظة: وجدت الدراسات الأولية 6 أيام كافية لظهور خلايا CD34 >30٪ لخطوط CAR iPSC في هذه الدراسة.
  10. تحقق من جودة EB عن طريق قياس التدفقالخلوي 23،41.
    1. تحضير 4 مل من 0.25٪ تريبسين مسخن مسبقا مع مصل دجاج 0.4٪ (16 ميكرولتر لكل 4 مل من التربسين) لفصل EBs.
    2. نقل 10-30 EBs إلى أنبوب مخروطي 15 مل.
    3. أضف محلول مصل التربسين / الدجاج إلى EBs واحتضنه في حمام مائي لمدة 10 دقائق ، مع الدوران كل 30 ثانية لضمان التفكك الكامل ل EBs.
    4. ماصة EBs التربسينية. امزج لأعلى ولأسفل عدة مرات لفصل EBS تماما.
    5. أضف 5 مل من 1x PBS لإيقاف عملية التربسين.
    6. قم بتصفية محلول الخلية من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر في أنبوب مخروطي جديد.
    7. الطرد المركزي للخلايا عند 300 × جم لمدة 5 دقائق.
    8. استنشق المادة الطافية وأعد تعليقها في 3-5 مل من الوسائط الطازجة.
    9. عد الخلايا ، وصمة عار بعلامات EB النموذجية مثل CD34 و CD31 و CD43 و CD45 ، وقم بتحليلها باستخدام قياس التدفقالخلوي 23،41 (الشكل 3).
    10. أضف الحجم الموصى به من الأجسام المضادة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة إلى كل أنبوب يحتوي على خلايا مفردة منفصلة من EB في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتدفق واحتضانه على الجليد لمدة 30 دقيقة39،41.
    11. بعد الحضانة ، اغسل الخلايا مرتين باستخدام المخزن المؤقت للتدفق ، وأضف بقعة SYTOX الزرقاء الحية / الميتة ، وقم بتحليلها باستخدام قياس التدفق الخلوي.
      ملاحظة: عادة, >30٪ يتم الحصول على خلايا CD34 + من إجمالي السكان من الأجسام الجنينية تدور منفصلة في اليوم 6 باستخدام iPSCs المستخدمة في هذه الدراسة, على الرغم من أن هذه النسبة المئوية يمكن أن تختلف تبعا لمصدر iPSC وظروف الثقافة.

5. تمايز الخلايا القاتلة الطبيعية المشتقة من GPC3 CAR iPSC من Spin EBs

ملاحظة: يمكن نقل مصابيح Spin EBs التي تعبر عن GPC3 CAR إما إلى ألواح ذات 24 بئرا أو ألواح ذات 6 آبار مطلية بجيلاتين بنسبة 2٪ أو بدون طلاء. بالنسبة للتغييرات المتوسطة ، تكون الألواح المكونة من 6 آبار أكثر ملاءمة ، بينما يعزز طلاء الجيلاتين بنسبة 2٪ مرفق EBs.

  1. قم بإعداد ألواح 6 آبار مطلية بالجيلاتين باتباع الخطوات أدناه.
    1. تحضير محلول جيلاتين بنسبة 2٪ (وزن / حجم) عن طريق إذابة الجيلاتين في ماء زراعة الأنسجة.
    2. قم بتعقيم المحلول عن طريق التعقيم عند 121 درجة مئوية ، 15 رطل لكل بوصة مربعة لمدة 30 دقيقة.
    3. قم بتغطية سطح كل بئر ب 5-10 ميكرولتر من محلول الجيلاتين لكل سم2 (~ 1 مل لكل بئر من صفيحة 6 آبار).
    4. احتضان الألواح عند 37 درجة مئوية لمدة 2-4 ساعات قبل الاستخدام. بعد الحضانة ، استنشق أي محلول جيلاتين متبقي قبل الشروع في نقل EBs.
  2. تحضير وسط تمايز الخلايا القاتلة الطبيعية: أضف 56.6٪ DMEM + GlutaMAX-I ، 28.3٪ F12 + GlutaMAX-I ، 15٪ مصل AB بشري معطل بالحرارة ، 1٪ P / S ، 2 ملي لجلوتامين ، 1 ميكرومتر β-ميركابتو إيثانول ، 5 نانوغرام / مل سيلينيت الصوديوم ، 50 ميكرومتر إيثانول أمين ، و 20 مجم / لتر حمض الأسكوربيك. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية في الظلام.
  3. أضف 3 مل من وسط تمايز NK الذي يحتوي على السيتوكينات التالية إلى كل بئر من ألواح 6 آبار المطلية بالجيلاتين (IL-3: 5 نانوغرام / مل ، SCF: 20 نانوغرام / مل ، IL-7: 20 نانوغرام / مل ، و IL-15: 10 نانوغرام / مل).
  4. في اليوم 6 ، قم بنقل Spin EBs مباشرة إلى ألواح 6 آبار المحضرة المطلية بالجيلاتين والتي تحتوي على وسط تمايز NK باتباع الخطوات أدناه.
    1. انقل EBs بعناية من ألواح 96 بئرا إلى طبق بحجم 10 سم ، باستخدام ماصة مصلية سعة 10 مل لإزالة معظم الوسط.
    2. أضف 3 مل من وسط التمايز NK الذي يحتوي على السيتوكينات المذكورة أعلاه إلى كل بئر من الصفيحة المكونة من 6 آبار مطلية بالجيلاتين.
    3. قم بتوزيع 16-20 EBs في كل بئر من الصفيحة المكونة من 6 آبار باستخدام ماصة دقيقة سعة 1 مل.
      ملاحظة: في المتوسط ، يمكن استخدام EBs من صفيحة واحدة مكونة من 96 بئرا لبذر لوحة واحدة مكونة من 6 آبار للوحة التمايز NK.
  5. قم بإجراء تغييرات متوسطة كل 5-7 أيام. بعد الأسبوع الأول من تمايز الخلايا القاتلة الطبيعية ، استبعد IL-3 من الوسائط.
    ملاحظة: بعد 14 يوما ، يجب تغيير الوسيط كل 3-4 أيام.
  6. استمر في التغييرات المتوسطة لمدة 3-4 أسابيع. تقييم التعبير عن علامات الخلايا القاتلة الطبيعية (CD45 + CD56 +) عن طريق قياس التدفقالخلوي 24،42 على الخلايا المعلقة.
  7. عندما تعبر >80٪ من خلايا التعليق عن CD45 + CD56 + ، قم بحصاد الخلايا عن طريق تمريرها عبر مرشح 70 ميكرومتر لإزالة أي كتل.
  8. تم حصاد الخلايا القاتلة الطبيعية بالزراعة المشتركة مع 100 aAPCs مشعةرمادية 34،48 وزراعة في وسط تمدد NK يحتوي على IL-2 (100ng / mL) و IL-15 (10 نانوغرام / مل).

6. توسيع الخلايا القاتلة الطبيعية المشتقة من المضادة ل GPC3 CAR iPSC

ملاحظة: عادة ، يمكن الحصول على عائد من 2-20 × 106 خلايا NK من صفيحة واحدة مكونة من 6 آبار ، حتى قبل التمدد. لتسهيل المزيد من التوسع في الخلايا القاتلة الطبيعية للتطبيقات النهائية ، يتم استخدام الخلايا العارضة للمستضد الاصطناعي (aAPCs) لتوليد خلايا >1 × 109 NK.

  1. استخدم خلايا K562 المصممة هندسيا التي تعبر عن 41BBL و IL-21 المرتبط بالغشاء (41BBL-mbIL-21) 48 كخلايا aAPCs للحث على توسع الخلايا القاتلة الطبيعية.
  2. قبل الزراعة المشتركة ل aAPCs مع الخلايا القاتلة الطبيعية ، قم بإشعاع aAPCs ب 100 رمادي واحتفظ بها كمخزونات مجمدة.
  3. حصاد الخلايا المعلقة من الصفيحة المكونة من 6 آبار وزراعة الخلايا القاتلة الطبيعية في وسط تمدد NK مع 50 U / مل IL-2 و IL-15 (10 نانوغرام / مل ؛ يضاف طازجا) بكثافة 5 × 105 خلايا / مل.
  4. أضف aAPCs المذابة المشععة إلى الخلايا القاتلة الطبيعية بنسبة 1: 1.
  5. قم بتجديد وسط الاستزراع كل 3-4 أيام ، مع إضافة IL-2 و IL-15 الطازج بتركيز 50 U / مل و 10 نانوغرام / مل ، على التوالي.
  6. تأكد من أن الخلايا القاتلة الطبيعية المشتقة من CAR iPSC تحافظ على القدرة على التمدد على مدى >3 أشهر ، مما يحافظ على كل من صلاحية الخلية ونشاط التحلل الخلوي.

7. التوصيف الظاهري والوظيفي لخلايا القاتل الطبيعية المشتقة من GPC3 CAR iPSC

ملاحظة: يتضمن توصيف خلايا الخلايا القاتلة الطبيعية المشتقة من GPC3 CAR iPSC تقييما شاملا لملف النمط الظاهري والنشاط الوظيفي.

  1. تقييم مستقبلات تنشيط NK ، بما في ذلك CD45 و CD56 و CD94 و CD16 و NKp30 و NKp44 و NKp46 و NKG2D و DNAM و TRAIL و FasL ، والتعبير عن الخلايا القاتلة الطبيعية المضادة ل GPC3 CAR iPSC المشتقة من خلال قياس التدفقالخلوي 24،42 لتحديد نشاط خلية CAR NK وحالة النضج (الشكل 4).
  2. تقييم النشاط الوظيفي في المختبر لخلايا القاتل الطبيعية المشتقة من GPC3 CAR iPSC باستخدام فحوصات Caspase-3/7 القائمة على قياس التدفق الخلوي ، وفحوصات إطلاق حبيبات CD107a ، وفحوصات إطلاق السيتوكين IFN-γ و TNF-α ضد أهداف الورم المختلفة.
  3. بالنسبة لمقايسة Caspase3/7، اتبع الخطوات أدناه.
    1. عد الخلايا المستهدفة وقم بلطخها مسبقا بصبغة الفلورسنت لتتبع الخلايا بتركيز نهائي قدره 5 ميكرومتر في PBS لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
    2. اغسل الخلايا المستهدفة الملطخة في وسط مزرعة كامل قبل الزراعة المشتركة مع الخلايا القاتلة الطبيعية المشتقة من CAR iPSC عند مستجيب مختلف لنسب (E:T) عند 37 درجة مئوية.
    3. بعد 3 ساعات و 30 دقيقة من الزراعة المشتركة ، أضف كاشف الكشف الأخضر Caspase-3/7 لمدة 30 دقيقة أخرى من الحضانة ، مما ينتج عنه وقت حضانة إجمالي يبلغ 4 ساعات.
    4. أضف 1 ميكرولتر من محلول تلطيخ الخلايا الميتة خلال آخر 5 دقائق من التلوين ، واخلطه برفق.
    5. قم بتحليل الخلايا الملطخة باستخدام قياس التدفقالخلوي 23،41 (الشكل 5).
  4. تنفيذ هذا البروتوكول لضمان فهم شامل لخصائص النمط الظاهري والنشاط الوظيفي لخلايا القاتل الطبيعية المشتقة من GPC3 CAR iPSC ، مما يتيح تقييما قويا لإمكاناتها العلاجية.
    ملاحظة: يستغرق الأمر عادة من 4 إلى 5 أسابيع للحصول على خلايا CD45 + CD56 + >90٪ من تمايز الخلايا القاتلة الطبيعية المشتقة من GPC3 CAR iPSC المستندة إلى الدوران EB وظروف تمدد NK باستخدام خطوط GPC3 CAR iPSC. قد تتطلب بعض خطوط خلايا iPSC فقط 3 أسابيع, وبعض الخطوط قد تستغرق وقتا أطول (حول 4-5 أسابيع).

8. استكشاف الأخطاء وإصلاحها العناصر والحلول

ملاحظة: يمكن أن يتضمن استكشاف أخطاء التمايز والتوسع والاختبار الوظيفي لخلايا GPC3 CAR NK المشتقة من iPSC باستخدام طريقة الجسم الجنيني الدوراني (EB) عدة خطوات. فيما يلي بعض المشكلات الشائعة التي قد يواجهها المرء ، إلى جانب الحلول المقترحة:

  1. أعراض تكوين EB غير المتسق
    1. تحقق مما إذا كانت EBs صغيرة جدا أو كبيرة جدا ، بأشكال غير منتظمة.
  2. حل لتشكيل EB غير المتسق
    1. اضبط سرعة أجهزة الطرد المركزي ومدتها المستخدمة لتشكيل EBs. سرعة حوالي 200-300 × جم لمدة 5-10 دقائق نموذجية.
    2. تأكد من استخدام الألواح السفلية على شكل حرف U المناسبة أو أطباق الثقافة منخفضة التركيب للغاية لتسهيل تكوين EB.
    3. تأكد من أن iPSCs متجانسة وخالية من الخلايا المتمايزة التي قد تؤثر على تكوين EB.
  3. أعراض ضعف التمايز بين الخلايا الجذعية الجذعية المزمنة إلى الخلايا القاتلة الطبيعية
    1. تحقق من انخفاض التعبير عن علامات الخلايا القاتلة الطبيعية (على سبيل المثال ، CD56 ، NKp46).
    2. تحقق من عدم وجود فشل في تكوين EBs أو EBs سيئة التكوين.
  4. حل لضعف التمايز بين iPSCs إلى الخلايا القاتلة الطبيعية
    1. تأكد من أن تركيزات عوامل النمو الأساسية (على سبيل المثال ، VEGF و BMP4 و Y-27632 و FLT3 و IL-15 و IL-7 و SCF و IL-3) هي الأمثل لتكوين EB وتمايز الخلايا القاتلة الطبيعية. اضبط التركيزات بناء على الدراسات السابقة23،34،41.
    2. تأكد من أن كثافة البذر الأولية ل iPSCs مناسبة. عادة ، يوصى بكثافة 8000-10,000 خلية / 100 ميكرولتر لتكوين EB.
    3. تحقق من صياغة وسيط التمايز بشكل صحيح ، بما في ذلك المكملات الغذائية الضرورية (على سبيل المثال ، المصل أو البدائل الخالية من المصل ، والسيتوكينات الأخرى).
    4. اترك وقتا كافيا لتكوين EB ، على الأقل من 6 أيام إلى 12 يوما قبل التحول إلى وسط تمايز الخلايا القاتلة الطبيعية.
  5. أعراض ضعف توسع الخلايا القاتلة الطبيعية
    1. تحقق من وجود إنتاجية خلية محدودة أثناء التمدد.
    2. تحقق من انخفاض قابلية الخلايا القاتلة الطبيعية الموسعة.
  6. حلول للتوسع الضعيف للخلايا القاتلة الطبيعية
    1. زيادة تركيز IL-15 و IL-2 خلال مرحلة التمدد. هذا يمكن أن يعزز بشكل كبير تكاثر الخلايا القاتلة الطبيعية.
    2. ضع في اعتبارك استخدام الخلايا المغذية مثل aAPCs المشعة لتحسين بقاء الخلايا القاتلة الطبيعية وتوسعها.
    3. راقب كثافة الخلايا بانتظام وقم بمرور الخلايا قبل أن تصل إلى الاكتظاظ للحفاظ على ظروف النمو المثلى.
  7. أعراض نتائج الاختبارات الوظيفية دون المستوى الأمثل
    1. تحقق من انخفاض السمية الخلوية ضد الخلايا المستهدفة.
    2. تحقق من انخفاض مستويات إفراز السيتوكين (على سبيل المثال ، IFN-γ و TNF-α).
  8. حلول لنتائج الاختبارات الوظيفية دون المستوى الأمثل
    1. تحسين نسبة الهدف إلى المستجيب في فحوصات السمية الخلوية. ابدأ بنسبة 10: 1 واضبطها بناء على النتائج.
    2. تأكد من تنشيط الخلايا القاتلة الطبيعية بشكل كاف قبل المقايسات الوظيفية. قد يشمل ذلك التحفيز المسبق بالسيتوكينات أو الزراعة المشتركة مع aAPCs المشععة.
    3. تحقق من حساسية خط الخلية المستهدفة للتحلل بوساطة الخلايا القاتلة الطبيعية. استخدم أهدافا حساسة معروفة كعناصر تحكم.
    4. قم بتمديد مدة المقايسات الوظيفية للسماح بوقت كاف لظهور نشاط الخلايا القاتلة الطبيعية.
  9. أعراض مستويات تعبير CAR المتغيرة
    1. تحقق من وجود تعبير CAR غير متناسق بين الخلايا القاتلة الطبيعية.
  10. حلول لمستويات تعبير CAR المتغيرة
    1. تحقق من كفاءة طريقة تعداء CAR (على سبيل المثال ، النقل الفيروسي ، التثقيب الكهربائي). اضبط وزارة الداخلية (تعدد العدوى) أو ظروف التثقيب الكهربائي إذا لزم الأمر.
    2. تنفيذ علامات التحديد المناسبة لإثراء خلايا CAR+ KN. استخدم اختيار المضادات الحيوية أو فرز علامات الفلورسنت حسب الضرورة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

رسم تخطيطي لتمايز الخلايا القاتلة الطبيعية المشتقة من المضادة ل GPC3-CAR iPSC وتمددها
يوضح الرسم التخطيطي التمايز في المختبر لخلايا NK المضادة ل GPC3-CAR المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة البشرية (iPSCs) وتمثيل تخطيطي لناقل piggyBac الذي يحمل بناء GPC3 CAR. في البداية, يتم نقل iPSCs غير المعدلة مع ناقل piggyBac تشفر GPC3 CAR (مستقبلات المستضد الخيمري). بعد تعداد, يتم توسيع iPSCs التي تعبر عن GPC3 CAR بشكل استنساخي ثم يتم تمييزها إلى خلايا NK الوظيفية المشتقة من CAR iPSC. تخضع...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يحدد هذا البروتوكول نهجا موحدا وقابلا للتكرار لتوليد خلايا NK المشتقة من iPSC التي تعبر عن CAR من مصدر خلوي ثابت يهدف إلى تسهيل العلاج المناعي للسرطان "الجاهز" المستهدف. أظهرت العديد من الدراسات قبل السريرية والسريرية فعالية العلاج المناعي القائم على الخلايا القاتلة الطبيعية في علاج السرطانات مع تقليل السمية ، مثل أمراض الكسب غير المشروع مقابل المضيف (GvHD) أو متلازمة إطلاق السيتوكينات (CRS) 23،42 ، 4...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DSK هو مؤسس مشارك ومستشار لشركة Shoreline Biosciences ولديه حصة في الشركة. يقدم DSK أيضا استشارات ل Therabest و RedC Bio اللذين يتلقى دخلا و / أو حقوق ملكية. وقد استعرضت جامعة كاليفورنيا في سان دييغو شروط هذه الترتيبات ووافقت عليها وفقا لسياساتها المتعلقة بتضارب المصالح. يعلن المؤلفون الباقون عن عدم وجود مصالح متضاربة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر جميع أعضاء مختبر كوفمان على دعمهم ورؤاهم العلمية ومناقشاتهم. تم دعم هذه الدراسات من قبل منح المعاهد الوطنية للصحة / المعهد الوطني للصحة U01CA217885 ، P30CA023100 (الملحق الإداري) ومعهد سانفورد للخلايا الجذعية في جامعة كاليفورنيا في سان فرانسيسكو. JT: كتابة ومراجعة المخطوطة. DSK: مراجعة المخطوطة وتحريرها.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
aAPC مختبر دين أ. لي N / A
a-MEM استزراع وسيط فيشر العلمية Cat # 12634
APC anti-DYKDDDDK (علامة العلم) BDBiosciences Cat # 637308
APC - مكافحة الإنسان TRA-1-81   ؛ThermoFisher17-8883-42 
APC-CD16BD Biosciences Cat#302015
APC-CD43 BD BiosciencesCat# 560198 
APC-CD45 BD BiosciencesCat# 555485 
APC-GPC3BD Biosciences Cat#DB100B
APC-NKG2D BD Biosciences Cat# 558071 
كاشف الكشف الأخضر CellEvent Caspase-3/7  ثيرمو فيشر Cat # C10423
CellTrace Violet Cell Proliferation Kit   ;ثيرمو فيشر Cat # C34571صبغة الفلورسنت لتتبع الخلايا   ؛
حل CryoStor تقنيات الخلايا الجذعيةhttps://www.stemcell.com/products/cryostor-cs10.htmlوسط الحفظ بالتبريد
CTS NK XpanderGibcoA5019001
CTS NK-Xpander تقنياتالحياةالمتوسطة Cat # A5019001
DMEMGibco11965084
DMEM ، نسبة عالية من الجلوكوز ، مكمل GlutaMAX ، البيروفاتجيبكو10569010
مجموعة تخصيب الخلايا البشرية EasySep NK شركة StemCell Technologies، Inc. Cat # 19055
EthanolamineSigma AldrichE9508
مصل الأبقار الجنينية فيشر العلمية Cat# 10437010
FITC-CD94  BD Biosciences Cat # 555888
GlutaMAX SupplementGibco35050061
GolgiPlug   ؛BD Biosciences Cat#555029
GolgiStop BD Biosciences Cat # 554724
المغذيات F-12 Ham ، مكمل GlutaMAXGibco31765035
مصل الحصان ؛فيشر العلمية Cat#16050130
مصل بشري AB Sigma-AldrichCat # BP2525100
الخلايا الجذعية البشرية NucleofectorTM  Lonza Cat # VPH-5012
الإنسان: خلايا HePG2   ;ATCC Cat # HB-8065
الإنسان: خلايا HePG2-td-طماطم-luc   ;دان س. كوفمان مختبرN / A
الإنسان: خلايا iPS  دان س. كوفمان لاب غير متاح
للإنسان: خلايا SNU-449  ATCCCat # CRL-2234
الإنسان: SNU-449-td-طماطم-luc cells دان S. كوفمان مختبرN / A
IncuCyte Caspase-3/7 Green Apoptosis Assay Essenbioscience Cat # 4440
L-Ascorbic acidSigma AldrichA5960
MP Biomedicals  مصل بشري ، من النوع ABMP BiomedicalsICN2938249
mTeSR plusStemCell Technologies، Inc.   ؛100-0276
برنامج NovoExpress ACEA Biosciences https://www.agilent.com/en/product/research-flow-cytometry/flow-cytometry-software/novocyte-novoexpress-software-1320805
PE / Cy7 المضاد للإنسان SSEA-4 الأجسام المضادة   ؛Biolegend330420
PE-CD16 BD Biosciences Cat#560995 
PE-CD226BD Biosciences Cat # 559789
PE-CD34   ؛BD BiosciencesCat# 555822 
PE-CD45 BD Biosciences القط# 555483 
PE-CD94 BD Biosciences Cat#555888 
PE-cy7-CD56 BioLegendCat# 318318 
PE-FAS Ligand BD Biosciences القط # 564261   ؛
PE-NKp30BD BiosciencesCat# 558407
PE-NKp44  BD Biosciences القط# 558563 
PE-NKp46BD Biosciences Cat#331908
PE-NKp46 BD Biosciences Cat#557991 
معطف مصفرة الدم المحيطي بنك الدم في سان دييغو (https://www. sandiegobloodbank.org/) N / A
PE-TRAIL   ؛BD Biosciences Cat#565499 
pKT2-mCAG-IRES-GFP-ZEO مختبر براندن مورياريتي N / A
pMAX-GFP البلازميدLonzaN / AGFP التحكم الإيجابي  
بريزم 9Graphpad الإصدار 9
pSpCas9  GenScriptPX165
RBC Lysis Buffer (10x)BiolegendCat#420301
مؤتلف bFGF البشري أساسي R & D Systems Cat # 4114-TC
مؤتلف BMP-4   ؛PeproTechCat # 120-05
المؤتلف البشري FLT-3 Ligand   ؛PeproTechCat # 300-19
مؤتلف الإنسان IL-15   ;PeproTechCat # 200-15
المؤتلف البشري IL-2   ;PeproTechCat # 200-02
مؤتلف بشري IL-3   ؛PeproTechCat # 200-03
مؤتلف بشري IL-7   ؛PeproTechCat # 200-07
بروتين عقدي بشري مؤتلفR & D Systems Cat # 3218-ND-025
SCF البشري المؤتلف   ؛PeproTechCat # 300-07
المؤتلف البشري TGF- & beta ؛ 1PeproTechCat # 100-21
VEGF البشري المؤتلف   ؛PeproTechCat # 100-20
RPMI1640Gibco11875093
سيلينيت الصوديومSigma Aldrich214485
STEMdiff APEL 2 MediumStemCell Technologies، Inc.  5270EB تشكيل متوسط
STEMdiff APEL2 متوسط شركة StemCell Technologies، Inc. Cat # 05270
Super piggyBac Transposase Expression VectorSBICat # PB210PA-1
SYTOX AADvanced Dead Cell Stain KitThermoFisher ScientificS10274 ، S10349طقم محلول تلطيخ الخلايا الميتة
& beta & -mercaptoethanolGibco21985023
مزيج مجموعة

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chan, I. S., Ewald, A. J. The changing role of natural killer cells in cancer metastasis. J Clin Invest. 132 (6), e143762(2022).
  2. Yu, Y. The function of NK cells in tumor metastasis and NK cell-based immunotherapy. Cancers (Basel). 15 (8), 2323(2023).
  3. Paul, S., Lal, G. The molecular mechanism of natural killer cells function and its importance in cancer immunotherapy. Front Immunol. 8, 1124(2017).
  4. Myers, J. A., Miller, J. S. Exploring the NK cell platform for cancer immunotherapy. Nat Rev Clin Oncol. 18 (2), 85-100 (2021).
  5. Llovet, J. M., et al. Hepatocellular carcinoma. Nat Rev Dis Primers. 7, 6(2021).
  6. Yang, Y., Xiong, L., Li, M., Jiang, P., Wang, J., Li, C. Advances in radiotherapy and immunity in hepatocellular carcinoma. J Transl Med. 21 (1), 526(2023).
  7. Rich, N. E., Yopp, A. C., Singal, A. G. Medical management of hepatocellular carcinoma. J Oncol Pract. 13 (6), 356-364 (2017).
  8. Niu, M., Yi, M., Li, N., Wu, K., Wu, K. Advances of Targeted Therapy for Hepatocellular Carcinoma. Front Oncol. 11, 719896(2021).
  9. Yu, S. J. Immunotherapy for hepatocellular carcinoma: Recent advances and future targets. Pharmacol Ther. 244, 108387(2023).
  10. Ntellas, P., Chau, I. Updates on systemic therapy for hepatocellular carcinoma. Am Soc Clin Oncol Educ Book. 44, e430028. 44, e430028(2024).
  11. Liu, T. -H., Shen, Y. -C., Cheng, A. -L. Immune checkpoint inhibitors for hepatocellular carcinoma - A game changer in treatment landscape. J Formos Med Assoc. 121 (8), 1371-1383 (2022).
  12. Sun, Q., Hong, Z., Zhang, C., Wang, L., Han, Z., Ma, D. Immune checkpoint therapy for solid tumours: clinical dilemmas and future trends. Signal Transduct Target Ther. 8 (1), 320(2023).
  13. Huang, A., Yang, X. -R., Chung, W. -Y., Dennison, A. R., Zhou, J. Targeted therapy for hepatocellular carcinoma. Signal Transduct Target Ther. 5 (1), 146(2020).
  14. Girardi, D. M., Pacífico, J. P. M., Guedes de Amorim, F. P. L., Dos Santos Fernandes, G., Teixeira, M. C., Pereira, A. A. L. Immunotherapy and targeted therapy for hepatocellular carcinoma: A literature review and treatment perspectives. Pharmaceuticals (Basel). 14 (1), 28(2020).
  15. Laface, C., et al. Targeted therapy for hepatocellular carcinoma: Old and new opportunities. Cancers (Basel). 14 (16), 4028(2022).
  16. Shyam Sunder, S., Sharma, U. C., Pokharel, S. Adverse effects of tyrosine kinase inhibitors in cancer therapy: pathophysiology, mechanisms and clinical management. Signal Transduct Target Ther. 8 (1), 262(2023).
  17. Cappell, K. M., Kochenderfer, J. N. Long-term outcomes following CAR T cell therapy: what we know so far. Nat Rev Clin Oncol. 20 (6), 359-371 (2023).
  18. June, C. H., O'Connor, R. S., Kawalekar, O. U., Ghassemi, S., Milone, M. C. CAR T cell immunotherapy for human cancer. Science. 359 (6382), 1361-1365 (2018).
  19. Schuster Stephen, J., et al. Chimeric antigen receptor T cells in refractory B-cell lymphomas. N Engl J Med. 377 (26), 2545-2554 (2017).
  20. Schmidt, D., et al. Engineering CAR-NK cells: how to tune innate killer cells for cancer immunotherapy. Immunother Adv. 2 (1), Itac003(2022).
  21. Zhang, B., et al. Chimeric antigen receptor-based natural killer cell immunotherapy in cancer: from bench to bedside. Cell Death Dis. 15 (1), 50(2024).
  22. Wang, K., et al. Reprogramming natural killer cells for cancer therapy. Mol Ther. 32 (9), 2835-2855 (2024).
  23. Li, Y., Hermanson, D. L., Moriarity, B. S., Kaufman, D. S. Human iPSC-derived natural killer cells engineered with chimeric antigen receptors enhance antitumor activity. Cell Stem Cell. 23 (2), 181-192.e5 (2018).
  24. Liu, E., Marin, D., et al. Use of CAR-transduced natural killer cells in CD19-positive lymphoid tumors. N Engl J Med. 382 (6), 545-553 (2020).
  25. Chen, L., Xie, T., Wei, B., Di, D. L. Current progress in CAR-T cell therapy for tumor treatment. Oncol Lett. 24 (4), 358(2022).
  26. Rafiq, S., Hackett, C. S., Brentjens, R. J. Engineering strategies to overcome the current roadblocks in CAR T cell therapy. Nat Rev Clin Oncol. 17 (3), 147-167 (2020).
  27. Sterner, R. C., Sterner, R. M. CAR-T cell therapy: current limitations and potential strategies. Blood Cancer J. 11 (4), 69(2021).
  28. Albinger, N., Hartmann, J., Ullrich, E. Current status and perspective of CAR-T and CAR-NK cell therapy trials in Germany. Gene Ther. 28 (9), 513-527 (2021).
  29. Dagher, O. K., Posey, A. D. Forks in the road for CAR T and CAR NK cell cancer therapies. Nat Immunol. 24 (12), 1994-2007 (2023).
  30. Xie, G., Dong, H., Liang, Y., Ham, J. D., Rizwan, R., Chen, J. CAR-NK cells: A promising cellular immunotherapy for cancer. EBioMedicine. 59, 102975(2020).
  31. Cichocki, F., van der Stegen, S. J. C., Miller, J. S. Engineered and banked iPSCs for advanced NK- and T-cell immunotherapies. Blood. 141 (8), 846-855 (2023).
  32. Goldenson, B. H., Hor, P., Kaufman, D. S. iPSC-derived natural killer cell therapies - Expansion and targeting. Front Immunol. 13, 841107(2022).
  33. Zhu, H., Kaufman, D. S. Engineered human pluripotent stem cell-derived natural killer cells: the next frontier for cancer immunotherapy. Blood Sci. 1 (1), 4-11 (2019).
  34. Knorr, D. A., et al. Clinical-scale derivation of natural killer cells from human pluripotent stem cells for cancer therapy. Stem Cells Transl Med. 2 (4), 274-283 (2013).
  35. Shimizu, Y., Suzuki, T., Yoshikawa, T., Endo, I., Nakatsura, T. Next-generation cancer immunotherapy targeting Glypican-3. Front Oncol. 9, 248(2019).
  36. Schepers, E. J., Glaser, K., Zwolshen, H. M., Hartman, S. J., Bondoc, A. J. Structural and functional impact of posttranslational modification of Glypican-3 on liver carcinogenesis. Cancer Res. 83 (12), 1933-1940 (2023).
  37. Batra, S. A., et al. Glypican-3-specific CAR T cells coexpressing IL15 and IL21 have superior expansion and antitumor activity against hepatocellular carcinoma. Cancer Immunol Res. 8 (3), 309-320 (2020).
  38. Gao, W., et al. Immunotoxin targeting glypican-3 regresses liver cancer via dual inhibition of Wnt signalling and protein synthesis. Nat Commun. 6, 6536(2015).
  39. Thangaraj, J. L., Coffey, M., Lopez, E., Kaufman, D. S. Disruption of TGF-β signaling pathway is required to mediate effective killing of hepatocellular carcinoma by human iPSC-derived NK cells. Cell Stem Cell. 31 (9), 1327-1343.e5 (2024).
  40. Maddineni, S., Silberstein, J. L., Sunwoo, J. B. Emerging NK cell therapies for cancer and the promise of next generation engineering of iPSC-derived NK cells. J Immunother Cancer. 10 (5), e004693(2022).
  41. Zhu, H., et al. Metabolic reprograming via deletion of CISH in human iPSC-derived NK cells promotes in vivo persistence and enhances antitumor activity. Cell Stem Cell. 27 (2), 224-237.e6 (2020).
  42. Strati, P., et al. Preliminary results of a phase I trial of FT516, an off-the-shelf natural killer (NK) cell therapy derived from a clonal master induced pluripotent stem cell (iPSC) line expressing high-affinity, non-cleavable CD16 (hnCD16), in patients (pts) with relapsed/refractory (R/R) B-cell lymphoma (BCL). J Clin Oncol. 39, 7541-7541 (2021).
  43. Hong, D., et al. Preliminary results of an ongoing phase I trial of FT500, a first-in-class, off-the-shelf, induced pluripotent stem cell (iPSC) derived natural killer (NK) cell therapy in advanced solid tumors. J Immunother Cancer. 8 (3), A231-A232 (2020).
  44. Zah, E., et al. Systematically optimized BCMA/CS1 bispecific CAR-T cells robustly control heterogeneous multiple myeloma. Nat Commun. 11 (1), 2283(2020).
  45. Ahn, S., et al. Cancer immunotherapy with T cells carrying bispecific receptors that mimic antibodies. Cancer Immunol Res. 7 (5), 773-783 (2019).
  46. Ludwik, K. A., Telugu, N., Schommer, S., Stachelscheid, H., Diecke, S. ASSURED-optimized CRISPR protocol for knockout/SNP knockin in hiPSCs. STAR Protoc. 4 (3), 102406(2023).
  47. Zhu, H., Kaufman, D. S. An improved method to produce clinical scale natural killer cells from human pluripotent stem cells. Methods Mol Biol. 2048, 107-119 (2019).
  48. Denman, C. J., et al. Membrane-bound IL-21 promotes sustained ex vivo proliferation of human natural killer cells. PLoS One. 7 (1), e30264(2012).
  49. Leivas, A., et al. NKG2D-CAR-transduced natural killer cells efficiently target multiple myeloma. Blood Cancer J. 11 (8), 146(2021).
  50. Ramdial, J. L., et al. A phase II clinical trial of "Off-the-Shelf" NK cells with allogeneic stem cell transplantation to decrease disease relapse in patients with high-risk myeloid malignancies. Blood. 140 (Supplement 1), 7484-7485 (2022).
  51. Bachanova, V., et al. Initial clinical activity of FT596, a first-in-class, multi-antigen targeted, off-the-shelf, iPSC-derived CD19 CAR NK cell therapy in relapsed/refractory B-cell lymphoma. Blood. 136, 8(2020).
  52. Bae, W. K., et al. A phase I study of locoregional high-dose autologous natural killer cell therapy with hepatic arterial infusion chemotherapy in patients with locally advanced hepatocellular carcinoma. Front Immunol. 13, 879452(2022).
  53. Marin, D., et al. Safety, efficacy and determinants of response of allogeneic CD19-specific CAR-NK cells in CD19+ B cell tumors: a phase 1/2 trial. Nat Med. 30 (3), 772-784 (2024).
  54. Fehniger, T. A., et al. A phase 1 trial of CNDO-109-activated natural killer cells in patients with high-risk acute myeloid leukemia. Biol Blood Marrow Transplant. 24 (8), 1581-1589 (2018).
  55. Nguyen, R., et al. A phase II clinical trial of adoptive transfer of haploidentical natural killer cells for consolidation therapy of pediatric acute myeloid leukemia. J Immunother Cancer. 7 (1), 81(2019).
  56. Miller, J. S., et al. Successful adoptive transfer and in vivo expansion of human haploidentical NK cells in patients with cancer. Blood. 105 (8), 3051-3057 (2005).
  57. Liu, E., et al. Use of CAR-transduced natural killer cells in CD19-positive lymphoid tumors. N Engl J Med. 382 (6), 545-553 (2020).
  58. Daher, M., Melo Garcia, L., Li, Y., Rezvani, K. CAR-NK cells: the next wave of cellular therapy for cancer. Clin Transl Immunology. 10 (4), e1274(2021).
  59. Lin, X., Sun, Y., Dong, X., Liu, Z., Sugimura, R., Xie, G. IPSC-derived CAR-NK cells for cancer immunotherapy. Biomed Pharmacother. 165, 115123(2023).
  60. Bachanova, V., et al. Safety and efficacy of FT596, a first-in-class, multi-antigen targeted, off-the-shelf, iPSC-derived CD19 CAR NK cell therapy in relapsed/refractory B-cell lymphoma. Blood. 138, 823(2021).
  61. Saetersmoen, M. L., Hammer, Q., Valamehr, B., Kaufman, D. S., Malmberg, K. J. Off-the-shelf cell therapy with induced pluripotent stem cell-derived natural killer cells. Semin Immunopathol. 41 (1), 59-68 (2019).
  62. Gerew, A., et al. Deletion of CISH and TGFβR2 in iPSC-derived NK cells promotes high cytotoxicity and enhances in vivo tumor killing. Blood. 138, 2780(2021).
  63. Goldenson, B. H., Hor, P., Kaufman, D. S. iPSC-derived natural killer cell therapies - Expansion and targeting. Front Immunol. 13, 841107(2022).
  64. Karvouni, M., Vidal-Manrique, M., Lundqvist, A., Alici, E. Engineered NK cells against cancer and their potential applications beyond. Front Immunol. 13, 825979(2022).
  65. Ayuso, J. M., et al. Microphysiological model reveals the promise of memory-like natural killer cell immunotherapy for HIV± cancer. Nat Commun. 14 (1), 6681(2023).
  66. Miller, J. S., et al. Safety and virologic impact of haploidentical NK cells plus interleukin 2 or N-803 in HIV infection. J Infect Dis. 229 (5), 1256-1265 (2024).
  67. Gutiérrez-Hoya, A., Soto-Cruz, I. NK cell regulation in cervical cancer and strategies for immunotherapy. Cells. 10 (11), 3104(2021).
  68. Lisco, A., et al. Treatment of relapsing HPV diseases by restored function of natural killer cells. N Engl J Med. 385 (10), 921-929 (2021).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

NK NK

مقالات ذات صلة