مقالة منهجية

تطوير نظام بروتوبلاست الملفوف لدراسة تحمل نقص الأكسجة في الكرنب

DOI:

10.3791/67444

⸱

سبتمبر 20, 2024

 , 
1Department of Horticulture and Landscape Architecture, National Taiwan University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول نظام بروتوبلاست الملفوف المتوسط الفعال. تم اختبار العديد من العلاجات التي تعاني من نقص الأكسجين ، وأظهر النظام تنشيطا عاليا للجينات المستجيبة لنقص الأكسجة ، مما يسهل دراسات الآليات الجينية والجزيئية لتحمل الفيضانات في خضروات Brassicaceae .

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نظرا لأن تغير المناخ يجلب المزيد من الأمطار الغزيرة ، فإن الملفوف ، وهو من الخضروات الرئيسية من نباتات الكرنب ، يواجه خسائر كبيرة في الغلة بسبب إجهاد نقص الأكسجة الناجم عن الفيضانات. لتحديد آليات تحمل الفيضانات في الملفوف ، هناك حاجة إلى منصة متعددة الاستخدامات للدراسات الوظيفية الجينية للتغلب على طبيعة الملفوف المتمردة. في هذه الدراسة ، تم تطوير نظام التعبير العابر للملفوف البروتوبلاست وبروتوكول تحريض نقص الأكسجة البروتوبلاست المقابل. حقق هذا البروتوكول إنتاجية عالية وسلامة عزل البروتوبلاست من أوراق الملفوف ، مع كفاءة تعداء تتجاوز 40٪ باستخدام ظروف إنزيمية محسنة. للتخفيف من تأثير نقص الأكسجين المحتمل قبل العلاجات ، تم غلي محلول W5 بغاز الأكسجين لزيادة مستويات الأكسجين المذاب. تم اختبار العديد من المواد الكيميائية لضبط مستويات الأكسجين والعلاجات الفسيولوجية لكسح الأكسجين ، بما في ذلك EC-Oxyrase و OxyFluor وكبريتيت الصوديوم وحزمة امتصاص الأكسجين. أظهرت فحوصات اللوسيفيراز المزدوجة أن محفزات جينات استجابة التنفس اللاهوائي BoADH1 و BoSUS1L تم تنشيطها في بروتوبلاستات الملفوف بعد علاجات نقص الأكسجة ، مع أعلى مستوى تحريض لوحظ بعد العلاج بحزمة امتصاص الأكسجين. باختصار ، يوضح نظام التعبير العابر للملفوف البروتوبلاست جنبا إلى جنب مع علاج نقص الأكسجة منصة فعالة ومريحة. يمكن لهذه المنصة تسهيل دراسات وظيفة الجينات والآليات الجزيئية المرتبطة باستجابات نقص الأكسجة في الملفوف.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أدى تغير المناخ العالمي إلى تفاقم الفيضانات ، التي برزت كقضية بالغة الأهمية في جميع أنحاء العالم. شهدت العقود الأخيرة اتجاها تصاعديا في تواتر أحداث الفيضانات ، مما أدى إلى خسائر كبيرة في المحاصيل1،2. الملفوف (Brassica oleracea var. capitata L.) ، وهو نبات ذو أهمية عالمية كبيرة ، عرضة للآثار الضارة للأمطار الغزيرة ، مما يستلزم تطوير أصناف الملفوف التي تتحمل الفيضانات لضمان الإنتاج المستدام في مواجهة الظواهر الجوية القاسية. لذلك ، فإن فهم الآليات الجزيئية المرتبطة بإجهاد الفيضانات في الملفوف أمر ضروري لمواجهة هذا التحدي.

لفهم آليات تنظيم الجينات في النباتات في ظل ظروف مغمورة ، تستخدم الخطوط المعدلة وراثيا على نطاق واسع في الدراسات الوظيفية الجينية. ومع ذلك ، فإن هذا النهج مقيد بارتفاع التكاليف والتحول المكثف للوقت وعمليات الاستزراع الفرعي ، فضلا عن كفاءة التحويل المنخفضة في العديد من أنواع المحاصيل ، مما يستلزم تطوير منهجيات بديلة. تم تطبيق أنظمة التعبير العابر القائمة على البروتوبلاست على نطاق واسع في البحوث الجزيئية النباتية كبديل متعدد الاستخدامات وفعال. تسهل هذه الأنظمة التحقيقات في نشاط المروج ، ومسارات الإشارات استجابة للإشارات البيئية ، وتفاعلات البروتين والبروتين أو البروتين والحمض النووي ، والتوطين تحت الخلوي3. تم الإبلاغ عن إنشاء أنظمة التعبير العابر البروتوبلاست ليس فقط في النباتات النموذجية4،5 ولكن أيضا في المحاصيل المهمة اقتصاديا مثل قصب السكر6 ، والقرنفل7 ، وبساتين الفاكهة فالاينوبسيس 8 ، والباذنجان9. علاوة على ذلك ، تم تنفيذ هذه الأنظمة بنجاح في النباتات الخشبية ، بما في ذلك Camellia oleifera10و Populus trichocarpa11. ومع ذلك ، فإن بروتوكولات تطبيق أنظمة البروتوبلاست لدراسة الخضروات الورقية تحت إجهاد نقص الأكسجة الناجم عن الغمر محدودة. لذلك ، تم تطوير بروتوكول متكامل في هذا العمل للمهتمين بدراسة استجابات نقص الأكسجة في الخضروات الورقية باستخدام نظام التعبير العابر للملفوف البروتوبلاست.

لتنفيذ استجابة نقص الأكسجة الناجم عن الغمر على المستوى الخلوي ، تم استخدام العديد من منهجيات كسح الأكسجين في الدراسات السابقة لمحاكاة بيئات نقص الأكسجة. وتشمل هذه استخدام EC-Oxyrase و OxyFluor وكبريتات الصوديوم والأكياس المستهلكة للأكسجين. يستخدم EC-Oxyrase عادة للعلاج اللاهوائي في خطوط الخلايا البشرية12 و Arabidopsis protoplasts13. تم العثور على OxyFluor ليكون فعالا في التخفيف من التبييض الضوئي الناجم عن أنواع الأكسجين التفاعلية أثناء التصوير الفلوري للخلايا الحية14،15. تم استخدام كبريتيت الصوديوم في المعالجة اللاهوائية للديدان الخيطية16 ، ومؤخرا ، في بروتوبلاستيات الأرز ، جنبا إلى جنب مع تقنيات مثل فحوصات الترسيب المناعي للكروماتين (ChIP)17. كما أثبتت عبوات امتصاص الأكسجين ، المستخدمة بشكل أساسي في الاستزراع البكتيري اللاهوائي18 ، فعاليتها في تحفيز تنشيط محفزات ZmPORB1 في بروتوبلاستيات الذرة في ظل الظروف اللاهوائية19.

يهدف العمل الحالي إلى إنشاء خط أنابيب قوي لعزل بروتوبلاست الملفوف والتعبير العابر. بعد ذلك ، تم تقييم فعالية العديد من العلاجات لضبط الأكسجين من خلال تقييم نشاط المحفز لجينات الاستجابة اللاهوائية باستخدام فحوصات اللوسيفيراز المزدوج. من المتوقع أن يكون البروتوكول الذي تم تطويره في هذه الدراسة ذا قيمة للأبحاث المستقبلية المتعلقة بالغمر أو إجهاد نقص الأكسجة في أنظمة البراسيكا .

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم استخدام صنفين تجاريين من الملفوف (B. oleracea var. capitata) في هذه الدراسة: "Fuyudori" و "228". يظهر تمثيل رسومي لسير عمل البروتوكول في الشكل 1. تفاصيل الكواشف والمعدات المستخدمة في هذه الدراسة مدرجة في جدول المواد.

1. تحضير شتلات الملفوف

  1. زرع بذور الملفوف "Fuyudori" و "228" باستخدام الركيزة النباتية التجارية في ثقوب دائرية مربعة الشكل (D 4.5 سم × ارتفاع 4.5 سم) من صواني سدادة 48 بئرا (الطول 49 سم × العرض 28 سم × الارتفاع 5 سم). قم بتضمين البذور بعمق 1 سم تقريبا في وسط النمو.
  2. ازرع شتلات الملفوف في غرفة نمو عند 22 درجة مئوية مع دورة فاتحة وظلامية لمدة 16/8 ساعة. حافظ على شدة الضوء 100 ميكرولتر م -2 ثانية -1 (أنبوب الفلورسنت الأبيض) أثناء مرحلة الضوء.
  3. بعد 2-3 أسابيع من النمو ، استخدم شتلات الملفوف في مرحلة 2 ورقة لمزيد من عزل البروتوبلاست المتوسط.
    ملاحظة: الحجم المقترح لشتلات الملفوف هو مرحلة من ورقتين ، حيث يتم توسيع الورقة الحقيقية الثانية بالكامل ، ولكن لا يتم توسيع الورقة الحقيقية الثالثة ، وطولها أقصر من 1 سم (الشكل 2 أ). لمزامنة مراحل نمو شتلات الملفوف ، يجب أن تزرع بذور "Fuyudori" قبل يومين تقريبا من البذور "228" نظرا لمعدلات نموها المختلفة. يضمن هذا التعديل نموا ونضجا موحدا بين نباتات الملفوف في المرحلة المطلوبة.

2. عزل بروتوبلاستي الملفوف

  1. تحضير 12.5 مل من محلول الإنزيم (الجدول 1) قبل كل عزل بروتوبلاست.
    1. قم بتسخين محلول مسبقا ب 10 ملي مولار MES (درجة الحموضة 5.7) و 0.6 متر من المانيتول عند 55 درجة مئوية. استمر في تسخين المحلول عند 55 درجة مئوية لمدة 10 دقائق بعد إضافة 1.5٪ Cellulase R10 و 0.75٪ Macerozyme R10.
    2. بعد أن يبرد محلول الإنزيم إلى درجة حرارة الغرفة (25 درجة مئوية) ، أضف 10 ملي مولار من كلوريدالكالسيوم 2 و 0.1٪ ألبومين مصل البقر (BSA). قم بتعقيم محلول الإنزيم المحضر في طبق بتري مقاس 9 سم باستخدام مرشح حقنة 0.22 ميكرومتر.
      ملاحظة: يزيد التسخين المسبق للمحلول من قابلية ذوبان الإنزيم ويعطل البروتياز. تختلف تأثيرات الهضم اعتمادا على الأنواع المختلفة من إنزيمات السليولاز. مزيج من Cellulase R10 و Macerozyme R10 مناسب لعزل الملفوف البروتوبلاستي.
  2. اجمع الأوراق الحقيقية الثانية الموسعة حديثا من خمس إلى ثماني شتلات ملفوف ، وقم بتقطيعها إلى شرائح 0.5-1.0 مم باستخدام شفرة حلاقة حادة. انقل شرائح الأوراق على الفور إلى محلول الإنزيم الطازج.
    ملاحظة: يعد اختيار أوراق صحية ومخصصة من الملفوف في المرحلة المناسبة أمرا بالغ الأهمية. توفر الأوراق الحقيقية الثانية الموسعة حديثا من شتلات الملفوف في مرحلة 2 ورقة أعلى كفاءة لعزل البروتوبلاست. لا ينصح بالنباتات الناضجة أو الفلقات أو الأوراق القديمة لعزل البروتوبلاست. يمكن لخمس إلى اثنتي عشرة ورقة حقيقية موسعة جيدا أن تنتج بنجاح بروتوبلاست الملفوف في 12.5 مل من محلول الإنزيم. يعتمد عدد الأوراق المطلوبة لعزل البروتوبلاست على الكمية المطلوبة من البروتوبلاست المطلوبة. عادة ما تكون البلاستيات البروتوبلاستية التي يتم الحصول عليها من خمس إلى ثماني أوراق كافية للإجراءات التجريبية اللاحقة.
  3. بعد التسلل بالفراغ في الظلام لمدة 30 دقيقة (الشكل 2 ب) ، احتفظ بشرائح أوراق الملفوف مغمورة في محلول الإنزيم (الشكل 2 ج) في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 4-16 ساعة أخرى.
    ملاحظة: قد يختلف وقت هضم الإنزيم بين أصناف الملفوف ويجب تحسينه وفقا للنمط الجيني المحدد. على سبيل المثال ، يتطلب "Fuyudori" وقتا أطول للهضم (16 ساعة) مقارنة ب "228" (4 ساعات) بسبب الأوراق السميكة من "Fuyudori".
  4. قم بتخفيف المحلول المحتوي على البروتوبلاست بحجم متساو من محلول W5 ، والذي يتكون من 2 ملي مولار من MES (درجة الحموضة 5.7) ، و 154 ملي مولار من كلوريد الصوديوم ، و 125 ملي مولار من كلوريدالصوديوم 2 ، و 5 ملي مولار من كلوريد البترول ، و 5 ملي مولار من الجلوكوز (انظر الجدول 1 للتحضير) ، لوقف الهضم الأنزيمي.
  5. حرر تعليق البروتوبلاست عن طريق الدوران اللطيف أو باستخدام شاكر مداري. قم بتصفية معلق الخلية من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر في أنبوب مخروطي سعة 50 مل.
    ملاحظة: البروتوبلاست المعزولة قادرة على المرور عبر مصفاة خلية 70 ميكرومتر ، بينما يتم الاحتفاظ ببقايا النبات غير المهضومة بواسطة المصفاة ثم إزالتها لاحقا من المعلق. يمكن إعادة استخدام مصافي الخلايا والاحتفاظ بها في 75٪ من الإيثانول بعد الغسيل ، ولكن من الضروري شطف مصافي الخلايا بالكامل بمحلول W5 لإزالة الإيثانول المتبقي قبل الاستخدام.
  6. قم بالطرد المركزي لمحلول البروتوبلاست ب 150 × جم لمدة دقيقتين عند 4 درجات مئوية ثم قم بإزالة المادة الطافية بعناية. اغسل البروتوبلاستات المحببة برفق عن طريق إضافة 10 مل من محلول W5 على طول جدار الأنبوب المخروطي بمعدل تدفق تقريبي يبلغ 1 مل · ثانية -1. قم بالطرد المركزي للأنبوب عند 150 × جم لمدة دقيقتين عند 4 درجات مئوية ، وكرر إجراء الغسيل هذا مرة أخرى لضمان الإزالة الكاملة لمحلول الإنزيم.
  7. أعد تعليق البروتوبلاست في محلول W5 وضعه على الجليد لمدة 30 دقيقة. بعد حضانة الجليد ، قم بإزالة المادة الطافية بواسطة ماصة 1 مل في المرة الواحدة حتى تتم إزالة كل المادة الطافية.
  8. أعد تعليق البروتوبلاست في محلول MMG مبرد مسبقا بالثلج يتكون من 4 ملي مولار من MES (درجة الحموضة 5.7) ، و 0.4 متر من المانيتول ، و 15 ملي مولار من MgCl2 (انظر الجدول 1 للتحضير).
  9. قم بقياس تركيز البروتوبلاست باستخدام مقياس الدم واضبط التركيز النهائي على 4 × 105 بروتوبلاست · مل -1 باستخدام محلول MMG.

3. تعداء البروتوبلاست

  1. امزج الحجم الإجمالي 10 ميكرولتر من البلازميد (5-10 ميكروغرام) (الملف التكميلي 1) مع 100 ميكرولتر من البروتوبلاست (4 × 104 بروتوبلاستات) وضعه على الثلج لمدة 10 دقائق.
    ملاحظة: لتنقية البلازميد من الدرجة النفقة ، يتم استخدام مجموعة البلازميد المتوفرة تجاريا باتباع تعليمات الشركة المصنعة. عادة ما يتم استخدام ما يقرب من 4 × 104 بروتوبلاست في مقايسة مراسل ثنائي اللوسيفيراز. بالنسبة للتجارب على نطاق أوسع ، تتوفر كمية أكبر من البروتوبلاستات للتعداد. على وجه التحديد ، يظهر حوالي 2 × 105 بروتوبلاست منقولة ب 10 ميكروغرام من البلازميد كفاءة تعداء مثبتة تتراوح من 30٪ إلى 40٪.
  2. أضف حجما متساويا (110 ميكرولتر) من محلول PEG المحضر حديثا (انظر الجدول 1 للتحضير) يحتوي على 40٪ بولي إيثيلين جلايكول 4000 (PEG4000) ، و 0.1 متر من CaCl2 ، و 0.2 متر من المانيتول في محلول البروتوبلاست واخلطه برفق.
  3. احتضان خليط البروتوبلاست في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة 10 دقائق ، ثم أضف 440 ميكرولتر من محلول W5 لإنهاء التفاعل.
  4. الطرد المركزي البروتوبلاستات المنقولة عند 150 × جم لمدة دقيقتين عند 4 درجات مئوية وإعادة تعليق الحبيبات في 750 ميكرولتر من محلول W5 المخصب بالأكسجين. انقل البروتوبلاستات المعلقة إلى صفيحة زراعة أنسجة مكونة من 6 آبار مطلية مسبقا بنسبة 1٪ BSA.
    ملاحظة: يجب أن يكون محلول W5 المستخدم في حضانة الخلايا فقاعات بالأكسجين باستخدام مكثف أكسجين (~ 90٪ أكسجين) متصل بحجر هوائي لمدة 5 دقائق (الشكل 2 د). بعد عملية الأكسجين هذه ، زاد تركيز الأكسجين المذاب النهائي في محلول W5 من 7.84 مجم · L-1 ± 0.05 مجم · L-1 إلى 29.18 ملغ· L-1 ± 0.43 ملغ· L-1 ، كما تم قياسه بمقياس الأكسجين المذاب. يعتمد حجم محلول W5 لإعادة تعليق البروتوبلاست المنقول على نوع لوحة زراعة خلايا الأنسجة المستخدمة. بالنسبة لألواح زراعة الخلايا المكونة من 12 بئرا أو 24 بئرا ، ينصح بتقليل حجم محلول W5 للتخفيف من إجهاد نقص الأكسجة أثناء الحضانة بسبب العمق الأعمق داخل الآبار. بالنسبة لطلاء BSA ، تلقى كل بئر من لوحة الثقافة 1 مل من محلول BSA بنسبة 1٪ ، والذي سمح له بتغطية الآبار لمدة 10 ثوان. ثم تم التخلص من محلول BSA من كل بئر ، وتم إعادة تعبئة الآبار لاحقا بمحلول W5. يهدف هذا الإجراء إلى إنشاء سطح مؤقت غير ملتصق باستخدام BSA ، مما يمنع بشكل فعال البروتوبلاست من الالتصاق بالسطح البلاستيكي للوحة الاستزراع أثناء الخطوات التجريبية اللاحقة.

4. علاج نقص الأكسجة على بروتوبلاستي الملفوف

  1. إجراء علاجات نقص الأكسجة الكيميائية أو الجسدية مباشرة بعد تعداء البروتوبلاست.
    ملاحظة: يوصى بتطبيق علاج نقص الأكسجة مباشرة بعد تعداء البروتوبلاست. قد تؤدي الحضانة المطولة للبروتوبلاست إلى تقليل استجابة نقص الأكسجة اللاحقة.
    1. بالنسبة لنقص الأكسجة الناجم كيميائيا عن بروتوبلاست الملفوف ، أضف OxyFluor و EC-Oxyrase وكبريتيت الصوديوم إلى محلول W5 protoplast.
      ملاحظة: كان استخدام 0.6 وحدة · مل -1 EC-oxyrase ، و 0.6 وحدة · مل -1 OxyFluor ، و 1 جم · مل -1 كبريتيت الصوديوم في W5 هي الظروف المختبرة القادرة على إحداث محفز BoADH1 و BoSUS1L (الشكل 3 أ) مع ضرر منخفض لسلامة البروتوبلاست في نوعي الملفوف اللذين تم فحصهما.
    2. لنقص الأكسجة الناجم عن الكيس الذي يستهلك الأكسجين ، ضع عبوتين لامتصاص الأكسجين في وعاء لاهوائي سعة 3.5 لتر لخلق بيئة تعاني من نقص الأكسجين.
  2. حصاد البروتوبلاست المعالج بنقص الأكسجة عن طريق الطرد المركزي عند 150 × جم لمدة دقيقتين عند 4 درجات مئوية. قم بتجميد البروتوبلاست الذي تم جمعه باستخدام النيتروجين السائل وتخزينه في فريزر -80 درجة مئوية لإجراء فحوصات لاحقة.

5. اختبار لوسيفيراز مزدوج

  1. قم بإجراء فحص مراسل اللوسيفيراز المزدوج وفقا لتعليمات الشركة المصنعة مع تعديل طفيف.
    1. أعد تعليق بروتوبلاستي الملفوف في 50 ميكرولتر من 1x عازلة التحلل السلبي والدوامة لمدة 10 ثوان.
    2. احتضان البروتوبلاستات المعطلة على الجليد لمدة 10 دقائق وجمع المادة الطافية بعد الطرد المركزي عند 10,000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    3. أضف 20 ميكرولتر من محللة الخلية إلى كل بئر من الصفيحة الدقيقة. قم بتوزيع 100 ميكرولتر من كاشف فحص لوسيفيراز II في الآبار وقم بقياس نشاط لوسيفيراز اليراع باستخدام قارئ صفيحة دقيقة.
    4. أضف 100 ميكرولتر من كاشف الفحص المتاح تجاريا إلى كل بئر وقم بقياس نشاط Renilla luciferase باستخدام قارئ صفيحة دقيقة.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نجح هذا العمل في تطوير نظام تعبير عابر باستخدام بروتوبلاستات الملفوف (انظر الشكل 1 لسير العمل). تم عزل البروتوبلاست من أوراق الملفوف الحقيقية التي يبلغ عمرها 2 إلى 3 أسابيع ذات الحجم المناسب (الشكل 2 أ) من أصناف الملفوف التجارية "Fuyudori" و "228" باستخدام هضم السليلوز / الماكيروزيم والتسلل الفراغي الداكن (الشكل 2 ب ، ج). للتخفيف من ظروف نقص الأكسجين التي تعاني منها البروتوبلاستات المغمورة أثناء الحضانة ، تم أكسجة محلول W5 باستخدام فقاعات حجر الهواء المتصلة بآلة أكسجين (الشكل 2 د). رفعت هذه العملية بشكل كبير تركيز الأكسجين المذاب في محلول W5 من 7.84 مجم · L-1 ± 0.05 ملغم · L-1 إلى 29.18 ملغ· L-1 ± 0.43 ملغم · L-1 بعد 5 دقائق من فقاعات الأكسجين. بعد عملية العزل ، كان عائد البروتوبلاست 1.04 × 107 ل "Fuyudori" و 4.00 × 106 protoplasts ·g −1 وزن جديد ل "228" بعد فترة هضم بين عشية وضحاها (الشكل 2 ه). بعد ذلك ، تم استخدام GFP كجين مراسل لتقييم كفاءة التحويل لطريقة التعدي بوساطة PEG ، مما يدل على أن كفاءة تعدين البروتوبلاست في الملفوف كانت أعلى من 40٪ في كلا الصنفين (الشكل 2F) ، مما يؤكد جدوى هذا النظام.

علاوة على ذلك ، تم إدخال تركيبات المحفز لجينات استجابة التنفس اللاهوائي للملفوف ، BoADH1p :: Luc و BoSUS1Lp :: Luc (الشكل 3 أ) ، في بروتوبلاستي الملفوف كمراسلين لتقييم تأثيرات تحريض نقص الأكسجين للعديد من العلاجات. كما تم تطبيق العديد من معالجات ضبط الأكسجين على نظام نموذج التعبير العابر هذا. أظهرت النتائج أن جميع علاجات كسح الأكسجين ، باستثناء كبريتيت الصوديوم ، نجحت في إحداث استجابة نقص الأكسجة في بروتوبلاست الملفوف (الشكل 3 ب). على وجه التحديد ، زاد نشاط المحفز ل BoADH1 بحوالي 2.6 ضعف و 3.2 ضعف مقارنة بالتحكم بعد العلاج باستخدام EC-Oxyrase و OxyFluor ، على التوالي ، وعلى وجه الخصوص ، بأكثر من 7.0 أضعاف مع معالجة حزمة امتصاص الأكسجين (الشكل 3 ب). وبالمثل ، ارتفع نشاط محفز BoSUS1L بحوالي 1.7 مرة و 1.8 مرة مع معالجة EC-Oxyrase و OxyFluor ، على التوالي ، بينما أدى علاج حزمة امتصاص الأكسجين إلى زيادة كبيرة تزيد عن 5.6 ضعف (الشكل 3 ب). تشير هذه النتائج إلى أن حزمة امتصاص الأكسجين تظهر فعالية فائقة في خلق بيئة ناقصة الأكسجين في هذا النظام التجريبي للملفوف البروتوبلاست.

figure-results-1
الشكل 1: التمثيل الرسومي لسير عمل عزل البروتوبلاست. يوضح هذا الشكل العملية خطوة بخطوة التي ينطوي عليها عزل البروتوبلاست من أنسجة أوراق الملفوف. يتم تصوير سير العمل بصريا لتوفير فهم واضح للإجراء. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: عزل البروتوبلاست من أنسجة أوراق الملفوف. (أ) يظهر ظهور أصناف الملفوف التجارية "Fuyudori" و "228" في مرحلة النمو الموصى بها. يتم اختيار الأوراق الحقيقية الثانية الموسعة حديثا (المشار إليها برأس السهم) للملفوف في المرحلة المكونة من ورقتين لعزل البروتوبلاست. شريط المقياس: 2 سم (ب) يتم استخدام مضخة تفريغ ومجفف لعملية التسلل الفراغي لشرائح أوراق الملفوف ، مع إجراء تسلل لمدة 30 دقيقة قبل الهضم الأنزيمي. (ج) يتم تصوير حالة شرائح أوراق الملفوف أثناء الهضم الأنزيمي. يتطلب الهضم الكامل لأنسجة الأوراق ما مجموعه 4-16 ساعة. شريط المقياس: 3 سم (D) توضح الصور استخدام مكثف أكسجين متصل بحجر هوائي لزيادة تركيز الأكسجين المذاب في محلول W5. شريط المقياس: 5 سم (E) تم الحصول على أكثر من 4.00 × 106 بروتوبلاست متوسطي لكل جرام من الوزن الطازج (FW) من كل من أصناف الملفوف "Fuyudori" و "228" وتم ملاحظتها تحت المجهر. شريط المقياس: 200 ميكرومتر. (F) تظهر كفاءة تعداء البروتوبلاست من كلا النمطين الوراثيين للملفوف ، باستخدام مراسل GFP معبر عنه بشكل أساسي ، أعلى من 40٪. شريط المقياس: 200 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-3
الشكل 3: استجابة نقص الأكسجة لبروتوبلاست الملفوف في ظل ظروف نقص الأكسجين. (أ) يتم استخدام التركيبات الجينية لاستجابة نقص الأكسجة ، محفزات BoADH1 و BoSUS1L ، كمراسلين لتقييم استجابة نقص الأكسجة في بروتوبلاستي الملفوف "Fuyudori". (ب) يتم تحويل ما مجموعه 5 ميكروغرام من بلازميدات المراسل إلى بروتوبلاست ملفوف "Fuyudori" ، والتي يتم تحضينها في محلول W5 المليء بالأكسجين قبل التعرض لعلاجات نقص الأكسجة لمدة 4 ساعات. يتم تقليل مستويات الأكسجين أثناء الحضانة عن طريق إضافة EC-oxyrase (0.6 وحدة · مل -1) ، وأوكسي فلور (0.6 وحدة · مل -1) ، وكبريتيت الصوديوم (1 جم · مل -1) إلى محلول W5. يتم إجراء معالجة عبوة امتصاص الأكسجين عن طريق وضع كيسين لامتصاص الأكسجين في وعاء لاهوائي سعة 3.5 لتر. تمثل مجموعة "CK" المجموعة الضابطة دون أي علاج لنقص الأكسجة. بعد العلاج ، يتم حصاد البروتوبلاست لإجراء اختبار لوسيفيراز مزدوج. تمثل كل قيمة متوسط ± SD ، مع n = 4. تشير الأحرف المختلفة إلى اختلافات كبيرة (P < 0.05) بناء على ANOVA أحادي الاتجاه مع اختبار LSD اللاحق. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1: تحضير محلول الإنزيم ومحلول W5 ومحلول MMG. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

الملف التكميلي 1: تفاصيل البلازميد لتعداء البروتوبلاست. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يقدم هذا البروتوكول طريقة مبسطة لعزل البروتوبلاست من صنفين تجاريين من الملفوف. يتم تقييم فعالية هذه الطريقة بشكل أساسي من خلال معلمتين حاسمتين لمراقبة الجودة: إنتاجية البروتوبلاست القابلة للحياة وكفاءة تعداء البروتوبلاست. أدى تنفيذ هذا البروتوكول إلى عائد يتجاوز 4.00 × 106 بروتوبلاستات · ز − 1 · FW من أنسجة الميزوفيل من كلا صنفي الملفوف (الشكل 2E ، F). هذا المحصول مشابه لتلك التي تم الإبلاغ عنها في الأنواع الأخرى ، بما في ذلك الباذنجان والقرنفل وقصب السكر والكاميليا أوليفيرا ، حيث تراوحت غلة البروتوبلاست من 2.5 × 106 إلى 1.4 × 107 بروتوبلاست · جم −1 · FW6،7،9،17. تشير هذه النتائج إلى إمكانية تطبيق البروتوكول عبر خلفيات وراثية متنوعة مع B. oleracea.

يتوقف نجاح البروتوكول على عدة عوامل حاسمة. قبل كل شيء هو استخدام الأوراق المحددة من شتلات الملفوف الصحية في مرحلة نمو مناسبة (الشكل 2 أ). قد يؤدي استخدام النباتات القديمة أو غير الصحية إلى إنتاج بروتوبلاست رديء الجودة. من الضروري أيضا تقطيع أنسجة الأوراق بعناية إلى شرائح 0.5-1.0 مم وتجنب سحقها بشفرة حادة. تعد عملية هضم الإنزيم ، التي تستمر ما بين 4-16 ساعة ، خطوة حاسمة أخرى. قد تؤدي فترات الهضم الأقصر من 4 ساعات إلى عدم اكتمال الهضم ، في حين أن تلك التي تتجاوز 16 ساعة من الهضم تخاطر بالإجهاد الخلوي. والجدير بالذكر أن الأنماط الجينية ذات الأوراق السميكة ، مثل "Fuyudori" ، قد تستفيد من أوقات الهضم الطويلة لزيادة محصول البروتوبلاست. في المقابل ، تطلب "228" 4 ساعات فقط للهضم الكامل. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن توفر مجموعة واسعة من أوقات الهضم مرونة أكبر في الجدولة التجريبية. على سبيل المثال ، يسمح الهضم لمدة 4 ساعات بعزل البروتوبلاست والفحوصات العابرة اللاحقة في غضون يوم واحد. على العكس من ذلك ، يسمح الهضم لمدة 16 ساعة ببدء هضم الإنزيم في المساء ويتيح إكمال الخطوات اللاحقة في اليوم التالي ، مما قد يعزز الراحة عند تطبيق هذا البروتوكول. علاوة على ذلك ، من الضروري التعامل مع البروتوبلاست برفق طوال عملية عزل البروتوبلاست بأكملها نظرا لهشاشتها وقابليتها للإجهاد الميكانيكي.

لمحاكاة الظروف اللاهوائية التي تمثل إجهاد الفيضانات ، استخدم هذا البروتوكول عوامل مسح الأكسجين الشائعة والأكياس المستهلكة للأكسجين لخلق بيئات ناقصة الأكسجين. لتعزيز فعالية النظام ، يتم استخدام آلة أكسجين لتزويد محلول W5 بالأكسجين (الشكل 2 د) ، بهدف تقليل إشارات استجابة نقص الأكسجين في الخلفية في بروتوبلاست الملفوف خلال فترة حضانة ما قبل المعالجة. تعمل عملية الأكسجين لمدة 5 دقائق على رفع مستوى الأكسجين المذاب بشكل كبير من 7.84 مجم · L-1 ± 0.05 مجم · L-1 إلى 29.18 ملغ· L-1 ± 0.43 مجم · L-1 ، مما يشير إلى تأثير واضح في التخفيف من حالات نقص الأكسجة. من بين طرق كسح الأكسجين المستخدمة في هذه الدراسة ، أظهرت حزم امتصاص الأكسجين أداء فائقا ، مما أدى إلى أعلى نشاط محفز في جينين أساسيين للاستجابة اللاهوائية (الشكل 3). علاوة على ذلك ، توفر هذه الطريقة ميزة إضافية تتمثل في قابلية التوسع ، مما يسمح بالمعالجة المتزامنة لعينات متعددة من خلال استخدام أكياس مستهلكة للأكسجين في جرة لاهوائية واحدة ، بدلا من التطبيق الفردي لعوامل كسح الأكسجين على كل لوحة زراعة خلية. باختصار ، توفر عبوات امتصاص الأكسجين منصة مريحة وفعالة مناسبة لتقييم استجابة بروتوبلاستات الملفوف في ظل ظروف نقص الأكسجين.

في حين أن هذا البروتوكول يوضح العديد من المزايا ، فمن المهم الاعتراف بحدوده ، لا سيما كفاءة التعداء المتواضعة نسبيا لبروتوبلاست الملفوف. على الرغم من أن هذه الكفاءة لا تصل إلى 90٪ التي تم الإبلاغ عنها ل Arabidopsis5 ، إلا أنها لا تزال كافية للدراسات اللاحقة الناجحة حول نشاط المروج (الشكل 3) ، مما يشير إلى إمكانات كبيرة للتحليل الوظيفي في هذا النظام.

نظرا للأهمية العالمية للملفوف كمحصول نباتي رئيسي ، فإن دمج هذا البروتوكول مع علاجات نقص الأكسجة وتقنيات التحليل الجيني يبشر باكتساب مزيد من الأفكار حول الآليات التنظيمية في الملفوف في ظل ظروف الفيضانات. يمكن أن تؤدي هذه الأفكار إلى تسريع تطوير أصناف الملفوف التي تتحمل الفيضانات ، وتلبية حاجة ماسة في مواجهة الطقس القاسي وزيادة أحداث الفيضانات.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود مصالح متنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من قبل المجلس الوطني للعلوم والتكنولوجيا (MOST 111-2313-B-002-029- و NSTC 112-2313-B-002-050-MY3). بالنسبة للشكل 1 ، تم الحصول على الرموز التجريبية من BioRender.com.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
2- (N-morpholino) حمض الإيثانسلفونيك (MES)مختبرات PhytoTechM825لتحضير محلول الإنزيم
228 بذور ملفوفTakii & Co.، Ltd. (كيوتو ، اليابان)
50 مل أنبوب مخروطيSPL علومالحياة 50050لتحضير محلول الإنزيم
لوحة زراعة الأنسجة ذات 6 آبارAlpha Plus16106لحضانة البروتوبلاست
70 & مو مصفاة الخلايا mSorfa SCS701لترشيح البروتوبلاست
بتري 9 سمألفا بلس16001للهضم الأنزيمي
جرة لاهوائيةهيميدياجرة لاهوائية 3.5لتر لعلاج نقص الأكسجة  
ألبومين مصل الأبقارSigma-AldrichA7906لتحضير محلول W5 وطلاء لوحة الثقافة
كلوريد الكالسيومJTBaker131301لمحلول W5 وتحضير محلول PEG
Cellulase R10Yakultلتحضير محلول الإنزيم
DesiccatorTarsons & nbsp ؛402030للتسلل بالفراغ
D-GlucoseBioshopGLU501لإعداد محلول W5
مقياس الأكسجين المذابThermo ScientificOrion Star A223لقياس الأكسجين
D-MannitolSigma-AldrichM1902لمحلول الإنزيم ومحلول PEG وإعداد محلول MMG
نظام فحص مراسل لوسيفيرازالمزدوج PromegaE1960لاختبار مراسل ثنائي اللوسيفيراز
EC-OxyraseOxyrase Inc.EC-0005لعلاج نقص الأكسجة
Fuyudori بذور الملفوفKobayashi Seed Co.، Ltd. (Kakogawashi ، اليابان)
أجهزة الطرد المركزي المبردةعالية السرعة HitachiCR21GIIIلحصاد البروتوبلاست
Macerozyme R10 & nbsp ؛Yakultلتحضير محلول الإنزيم
كلوريد المغنيسيومAlfa Aesar12315لتحضير محلول MMG
طرد مركزي دقيقهيتاشيCT15REلحصاد البروتوبلاست
MicroplateGreiner655075لمقايسة مراسل ثنائي لوسيفيراز
قارئ Microplateالأجهزة الجزيئيةSpectraMax Miniل اختبار مراسل ثنائي لوسيفيراز
Millex 0.22 & م حقنة مرشحMerckSLGP033RS لإعداد محلول الإنزيم
مضخة فراغ خالية من الزيتهزاز  Rocker 300لتسلل الفراغ
OxyFluorOxyrase Inc.OF-0005لعلاج نقص الأكسجة
حزمة امتصاص الأكسجينMitsubishi Gas Chemical CompanyAnaeroPack ، MGCC1لعلاج نقص الأكسجة
مكثف الأكسجينULTIMATE PERFECTAII-Xلفقاعات الأكسجين في محلول W5
ركيزة النباتKlasmann-DeilmannPotgrond Hلتحضير شتلات الملفوف
بلازميد ميدي كيتQIAGEN12145لتنقية الحمض النووي البلازميد من الدرجة الشفافية 
البولي إيثيلين جلايكول 4000فلوكا81240لنقل البروتوبلاست
كلوريد البوتاسيومJTBaker304001لتحضير محلول W5
شفرة الحلاقةجيليتلتحضير شرائح أوراق الملفوف
كلوريد الصوديومBioshopSOD002لتحضير محلول W5
كبريتيت الصوديومSigma-AldrichS0505لعلاج نقص الأكسجة
حمام مائيYihderBU-240Dلتحضير محلول الإنزيم
طبق جهاز

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tanoue, M., Hirabayashi, Y., Ikeuchi, H. Global-scale river flood in the last 50 years. Sci Rep. 6 (1), 36021(2016).
  2. Voesenek, L. aC. J., Bailey-Serres, J. Flood adaptive traits and processes: An overview. New Phytol. 206 (1), 57-73 (2015).
  3. Sheen, J. Signal transduction in maize and Arabidopsis mesophyll protoplasts. Plant Physiol. 127 (4), 1466-1475 (2001).
  4. Chen, S., et al. A highly efficient transient protoplast system for analyzing defense gene expression and protein-protein interactions in rice. Mol Plant Pathol. 7 (5), 417-427 (2006).
  5. Yoo, S. -D., Cho, Y. -H., Sheen, J. Arabidopsis mesophyll protoplasts: A versatile cell system for transient gene expression analysis. Nat Protoc. 2 (7), 1565-1572 (2007).
  6. Wang, Q., et al. Optimization of protoplast isolation, transformation, and its application in sugarcane (Saccharum spontaneum L). Crop J. 9 (1), 133-142 (2021).
  7. Adedeji, O. S., et al. Optimization of protocol for efficient protoplast isolation and transient gene expression in carnation. Sci Hortic. 299, 111057(2022).
  8. Lin, H. -Y., Chen, J. -C., Fang, S. -C. A protoplast transient expression system to enable molecular, cellular, and functional studies in Phalaenopsis orchids. Front Plant Sci. 9, (2018).
  9. Wang, Y., et al. A highly efficient mesophyll protoplast isolation and PEG-mediated transient expression system in eggplant. Sci Hortic. 304, 111303(2022).
  10. Lin, Z., et al. Development of a protoplast isolation system for functional gene expression and characterization using petals of Camellia oleifera. Plant Physiol Biochem. 201, 107885(2023).
  11. Guo, J., et al. Highly efficient isolation of Populus mesophyll protoplasts and its application in transient expression assays. PLOS One. 7 (9), e44908(2012).
  12. Gottschald, O. R., et al. TIAR and TIA-1 mRNA-binding proteins co-aggregate under conditions of rapid oxygen decline and extreme hypoxia and suppress the HIF-1α pathway. J Mol Cell Biol. 2 (6), 345-356 (2010).
  13. Cho, H. -Y., Chou, M. -Y., Ho, H. -Y., Chen, W. -C., Shih, M. -C. Ethylene modulates translation dynamics in Arabidopsis under submergence via GCN2 and EIN2. Sci Adv. 8 (22), eadm7863(2022).
  14. Boudreau, C., et al. Excitation light dose engineering to reduce photo-bleaching and photo-toxicity. Sci Rep. 6 (1), 30892(2016).
  15. Shcherbakova, D. M., Cox Cammer, N., Huisman, T. M., Verkhusha, V. V., Hodgson, L. Direct multiplex imaging and optogenetics of Rho GTPases enabled by near-infrared FRET. Nat Chem Biol. 14 (6), 591-600 (2018).
  16. Jiang, B., et al. Sodium sulfite is a potential hypoxia inducer that mimics hypoxic stress in Caenorhabditis elegans. J Biol Inorg Chem. 16 (2), 267-274 (2011).
  17. Lin, C. -C., et al. SUB1A-1 anchors a regulatory cascade for epigenetic and transcriptional controls of submergence tolerance in rice. PNAS Nexus. 2 (7), pgad229(2023).
  18. Zhang, X., et al. Bis-molybdopterin guanine dinucleotide modulates hemolysin expression under anaerobiosis and contributes to fitness in vivo in uropathogenic Escherichia coli. Mol Microbiol. 116 (4), 1216-1231 (2021).
  19. Liu, N., et al. The light and hypoxia-induced gene zmPORB1 determines tocopherol content in the maize kernel. Sci China Life Sci. 67 (3), 435-448 (2024).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Cabbage Protoplast SystemHypoxia ToleranceProtoplast IsolationTransient ExpressionHypoxia InductionOxygen Absorber PackDual Luciferase AssayAnaerobic JarFlooding StressBrassica Hypoxia

مقالات ذات صلة