مقالة منهجية

الحقن الأمثل في الوريد في أسماك الزرد البالغة

2.7K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/67463

⸱

ديسمبر 20, 2024

 ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, School of Clinical Medicine, LKS Faculty of Medicine, The University of Hong Kong, 2ZeBlast Technology Limited, Hong Kong Science Park, 3Centre for Oncology and Immunology, Hong Kong Science Park

في هذه المقالة

ملخص

هنا ، نقدم بروتوكولا محسنا وفعالا للحقن الوريدي للخلايا أو العوامل الدوائية في أسماك الزرد البالغة ، مما يؤدي إلى تعزيز نقش الخلايا وزيادة معدلات بقاء أسماك الزرد المعالجة.

الملخص

يعرف الحقن الوريدي (IV) على نطاق واسع بأنه الطريقة الأكثر فعالية والأكثر استخداما لتحقيق التوصيل الجهازي للمواد في نماذج أبحاث الثدييات. ومع ذلك ، فإن تطبيقه في أسماك الزرد البالغة لتوصيل الأدوية وزرع الخلايا الجذعية والدراسات التجديدية والسرطانية كان محدودا بسبب التحديات التي يفرضها صغر حجم الجسم والأوعية الدموية المعقدة. للتغلب على هذه القيود ، تم استكشاف تقنيات الحقن البديلة مثل الحقن داخل القلب والحقن الرجعي الحجاجي (RO) في الماضي لزرع الخلايا الجذعية في أسماك الزرد البالغة. ومع ذلك ، فإن هذه التقنيات لها عيوبها ، بما في ذلك الحاجة إلى تقنيات الحقن الدقيقة أو زيادة خطر الوفاة.

في هذه الدراسة ، قمنا بتطوير إجراء حقن وريدي محسن ومحسن مصمم خصيصا لأسماك الزرد البالغة ، لمعالجة التحديات المرتبطة بتشريحها الفريد. لإثبات فعالية هذه التقنية ، أجرينا حقنا وريديا ناجحة لخلايا نخاع الكلى الكاملة من أسماك Tg (mpo: EGFP) وصبغة FITC-dextran في أسماك Casper البالغة. أكد التصور اللاحق للخلايا والأصباغ المحقونة باستخدام المجهر الفلوري نجاحها وتوصيلها ونقشها داخل سمك الزرد. علاوة على ذلك ، أظهرنا أنه بالمقارنة مع الحقن داخل القلب والحقن التناضحي العكسي ، أدى الحقن الوريدي إلى تحسين معدلات البقاء على قيد الحياة وكفاءة النقش في أسماك الزرد المعالجة. يتيح هذا النهج التوصيل الدقيق للمواد وتوطينها ويحمل إمكانات كبيرة لفحص الأدوية والمواد الكيميائية على نطاق واسع باستخدام أسماك الزرد البالغة. بالإضافة إلى ذلك ، توفر القدرة على تتبع الخلايا والأصباغ المحقونة بصريا رؤى لا تقدر بثمن حول نقشها وهجرتها وتفاعلاتها مع الأنسجة المضيفة ، مما يتيح تقييما أكثر شمولا للتأثيرات العلاجية والعمليات البيولوجية في نماذج أسماك الزرد.

المقدمة

برزت أسماك الزرد (Danio rerio) ككائن حي نموذجي قيم في البحوث الطبية الحيوية ، ويرجع ذلك أساسا إلى تشابهها الجيني مع البشر ، حيث أن أكثر من 70٪ من الجينات البشرية لها نظائر من أسماك الزرد1،2. هذا التشابه الجيني ، جنبا إلى جنب مع الحجم الصغير لسمك الزرد ، ودورة التطور السريعة ، والقدرة على التلاعب الجيني على نطاق واسع ، يجعلها أداة قوية للاستكشاف العلمي. هذه السمات مفيدة بشكل خاص للتجارب التي تنطوي على زرع الخلايا وتوصيل الأدوية وتتبع الخلايا. علاوة على ذلك ، فإن الوضوح البصري لليرقات الشفافة وطفرات التصبغ المحددة ، مثل أسماك الزرد Casper ، يسمح بالتصور الدقيق للخلايا أو المواد المزروعة ، مما يوفر بديلا أكثر كفاءة وفعالية من حيث التكلفة للنماذج الحيوانية التقليدية.

تستخدم أسماك الزرد على نطاق واسع لتطوير نماذج زراعة السرطان وإجراء فحوصات الأدوية للأمراض الشديدة مثل الورم الدبقي والورم الميلانيني وأورام البنكرياس وسرطان الدم3،4،5،6،7،8،9،10. عادة ما تبدأ هذه النماذج في مرحلة اليرقات للاستفادة من الجهاز المناعي غير الناضج لليرقات والشفافية المتأصلة ، مما يبسط عملية الحقن ويعزز جدوى الدراسات قصيرة المدى. ومع ذلك ، فإن استخدام اليرقات يحد من مدة تقييم النقش والتدخلات العلاجية7،11. يؤدي نقل هذه البروتوكولات التجريبية إلى أسماك الزرد البالغة إلى تحديات مثل إجراءات الحقن الأكثر تعقيدا ، وانخفاض كفاءة النقش ، وارتفاع معدلات الوفيات ، وزيادة التباين في الاستجابات الفردية. تسلط هذه التحديات الضوء على الحاجة الماسة لتحسين تقنيات الحقن وإيصال المواد ، خاصة بالنسبة للدراسات التي شملت أسماك الزرد البالغة التي تتطلب فترات مراقبة ممتدة.

تاريخيا ، كانت الحقن داخل القلب12 والحقن الرجعية المدارية (RO)13 هي الطرق الأساسية لتوصيل الأدوية وزرع الخلايا في أسماك الزرد البالغة. يضمن الحقن داخل القلب ، والذي يتضمن حقن المواد مباشرة في القلب ، الدورة الدموية الجهازية الفورية للأدوية ولكنه يرتبط بمخاطر كبيرة ، بما في ذلك إصابات القلب المحتملة وارتفاع معدل الوفيات. من ناحية أخرى ، فإن حقن التناضح العكسي ، الذي يوصل المواد إلى الجيوب الأنفية الوريدية خلف العين ، يعزز أيضا التوزيع الجهازي السريع ولكنه يمكن أن يكون مرهقا للأسماك ويتطلب دقة عالية في التنفيذ14. تعتبر الحقن الوريدية ، الراسخة لتوصيل المواد الجهازية في الفئران والجرذان ، ضرورية لدراسات الحركية الدوائية ، وتقييمات فعالية الأدوية ، والتدخلات العلاجية في هذه النماذج15،16،17،18. في الآونة الأخيرة ، اكتسبت الحقن الوريدية مكانة بارزة في أبحاث أسماك الزرد ، لا سيما في دراسات الاستجابات المناعية الفطرية19،20 وإصابة الكلى الحادة21 في يرقات الزرد. ومع ذلك ، فإن تطبيقها في أسماك الزرد البالغة لا يزال محدودا.

في هذه الدراسة ، قمنا بتطوير وتحسين إجراء الحقن الوريدي المصمم خصيصا لأسماك الزرد البالغة ، مما يحسن بشكل كبير من معدلات البقاء على قيد الحياة والدقة وكفاءة التسليم. نوضح هذه الطريقة بصريا ونقدم بروتوكولا مفصلا باستخدام هذه التقنية المكررة. نجحنا في إجراء الحقن الوريدية لخلايا نخاع الكلى الكامل (WKM) من أسماك Tg (mpo: EGFP) وصبغة FITC-dextrann في أسماك Casper البالغة ، مع تأكيد التسليم والنقش الذي تم تقييمه بواسطة الفحص المجهري الفلوري. تظهر النتائج التي توصلنا إليها أن تقنية الحقن الوريدي المكرر أكثر كفاءة واتساقا مقارنة بالطرق التقليدية داخل القلب والتناضح العكسي مع استمرار توسع استخدام أسماك الزرد في البحث العلمي ، من المرجح أن يؤدي اعتماد تقنية الحقن الوريدي المحسنة هذه إلى تعزيز فهمنا للتسبب في المرض وتسريع تطوير مناهج علاجية جديدة.

البروتوكول

تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية من قبل لجنة استخدام المختبر والبحوث (CULATR) في جامعة هونغ كونغ (HKU).

1. تحضير مواد الحقن

  1. تحضير وسط تعليق الخلية: 0.9x PBS + 5٪ مصل بقري للجنين (FBS) + 1٪ بنسلين / ستربتومايسين (قلم / بكتيريا).
  2. قم بتعقيم حقنة هاميلتون والإبرة المرفقة (34 جم ، طول 10 مم ، سعة 10 ميكرولتر ، انظر جدول المواد) تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية بطول موجي 270-280 نانومتر وفضح العناصر لمدة ساعتين.
  3. تحضير براعم قطنية معقمة ووسادات رغوية ومناديل ورقية.
  4. تحضير خليط التخدير عن طريق تخفيف التريكيين بماء السمك المعقم إلى تركيز نهائي يبلغ 0.2 مجم / مل.
  5. لزرع خلايا WKM في أسماك كاسبر ، قبل يومين من الزرع ، قم بإعطاء جرعة تشعيع شبه مميتة تبلغ 25 غراي ، مقسمة إلى جلستين من 12.5 غراي لكل منهما ، تعطى في نفس اليوم بفاصل 7-8 ساعات بين الجرعات. لعملية التشعيع ، ضع 5-10 أسماك بالغة في طبق بتري مقاس 100 مم يحتوي على ماء السمك وقم بتعريضها في مشعاع جاما.
    ملاحظة: تم تحديد الجرعة لتكون شبه مميتة بناء على تحليل البقاء على قيد الحياة بعد تعريض أسماك كاسبر لمستويات تشعيع مختلفة تصل إلى 35 غراي ، تمت مراقبتها على مدار 30 يوما (الشكل 1 أ). يجب معايرة المدة الدقيقة للتعرض وفقا لإعدادات المشع. لا حاجة إلى تشعيع للإجراءات التي تنطوي على توصيل الدواء فقط.
  6. استخدم معقم الأوتوكلاف بالبخار في المختبر لتعقيم مياه السمك المخصصة لإيواء الأسماك المعالجة (انظر جدول المواد) للوقاية من العدوى وضمان بيئة تعافي آمنة للأسماك بعد الحقن.
    ملاحظة: تم تصميم عملية التعقيم وفقا لوحدة الأوتوكلاف المحددة المستخدمة ، ونحن نلتزم بإرشادات الشركة المصنعة لتعقيم المحاليل السائلة لتحضير مياه السمك.
  7. تحضير المخزن المؤقت لغسل الإبرة: عدة أنابيب من 75٪ من الإيثانول والماء عالي النقاء في أنابيب أجهزة الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.5 مل.
  8. قم بإعداد المخزن المؤقت للزرع عن طريق إذابة FITC-Dextran (الوزن الجزيئي: 10,000) في وسط تعليق الخلية المعد مسبقا (0.9x PBS مع 5٪ FBS و 1٪ قلم / بكتيريا). اضبط التركيز على 100 ميكروغرام / مل.
    ملاحظة: سيتم استخدام هذا المخزن المؤقت للحقن ، بحجم مخطط يبلغ 2 ميكرولتر لكل سمكة.

2. تحضير نخاع الكلى الكامل للزرع

  1. قم بالقتل الرحيم للعدد اللازم من أسماك Tg (mpo: EGFP) عن طريق غمرها في محلول tricaine 0.4 مجم / مل ، مع ضمان بقائها في المحلول لمدة 10 دقائق على الأقل بعد توقف الحركة الجراحية.
  2. قم بتشريح أسماك Tg (mpo: EGFP) لعزل ونقل نخاع الكلى (KM) إلى وسط تعليق الخلية داخل أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل كما هو موضحسابقا 22.
  3. قم بتقسيم خلايا KM عن طريق سحب العينات وتصفية التعليق من خلال مصفاة خلية نايلون 40 ميكرومتر.
  4. الطرد المركزي التعليق عند 500 × جم لمدة 8 دقائق.
  5. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في 500 ميكرولتر من وسط تعليق الخلية.
  6. عد الخلايا باستخدام عداد آلي مع 10 ميكرولتر من تعليق الخلية.
  7. جهاز طرد مركزي مرة أخرى عند 500 × جم لمدة 8 دقائق.
  8. اضبط تركيز الخلية على 150,000 خلية/ميكرولتر باستخدام المخزن المؤقت للزرع.

3. إجراء الحقن

  1. اغسل حقنة هاميلتون جيدا 3-4x مع 75٪ إيثانول قبل الحقن. اشطف المحقنة 3-4 مرات بالماء فائق النقاء لإزالة أي بقايا إيثانول.
  2. قم بتخدير سمك الزرد عن طريق غمره في خليط التخدير حتى يتم تخديره بالكامل ، كما يتضح من تناقص الحركة وفقدان الاستجابات الانعكاسية. بمجرد تخدير الأسماك ، ضعها بحيث يكون جانبها الظهري متجها لأعلى ورأسها موجه إلى اليسار (الشكل 1 ب). ضع السمك بعناية على مناديل ورقية نظيفة ورطبة ، مما يساعد على تثبيتها للحقن. تأكد من أن الأنسجة رطبة بدرجة كافية لمنع الأسماك من الجفاف ، ولكنها ليست رطبة لدرجة أنها تسبب الانزلاق.
  3. أمسك حقنة هاميلتون بإحكام وقم بزاوية الإبرة عند ~ 45 درجة إلى الوعاء الأساسي (الوريد الذيلي) لاستهدافها بشكل فعال مع تقليل الضرر الذي يلحق بالأنسجة المحيطة. بالنسبة لأسماك الزرد الكبرية ، استهدف جزءا من الوعاء يمكن رؤيته من خلال جسمه الشفاف لوضع الإبرة بدقة (الشكل 1 ب). بالنسبة لأسماك الزرد من النوع البري (Tubingen ، TU) ذات الجلد المصطبغ ، استهدف الأوعية الأولية التي تقع على طول محور الجسم وخلف فتحة الشرج في منطقة الأوعية الأولية (الشكل 1 ب). أدخل الإبرة برفق وسلاسة في الوعاء المخصص ، وقم بإدارة الحقن (2 ميكرولتر) ببطء لتقليل الإجهاد ، وضمان الامتصاص الأمثل للمادة ، والضغط برفق على الموقع باستخدام برعم قطني لمدة 10 ثوان للسيطرة على أي نزيف بعد الحقن.
  4. راقب تحت المجهر للتأكد من وجود إشارات GFP ، مما يضمن فعالية الحقن. تأكد من ظهور الخلايا أو الأصباغ كإشارات خضراء داخل الوعاء الدموي (الشكل 2 أ).
  5. اسمح للأسماك بالتعافي في ماء السمك المعقم حديثا بعد الحقن لمدة 10 دقائق حتى يتم نقلها إلى خزان ثابت.
  6. نظف الإبرة كما هو موضح سابقا بين حقن الكواشف المختلفة.
  7. لمنع تكتل الخلايا ، قم بنقر تعليق الخلية كل 10 دقائق لإعادة تعليق الخلايا.
  8. احتفظ بحد أقصى 15 سمكة مزروعة في خزان سعة 4 لتر تحت ظروف المياه الساكنة طوال مدة العلاج. بدلا من ذلك ، قم بتخزين الأسماك المزروعة بشكل فردي في خزانات ثابتة سعة 1 لتر. جهز الخزان بمضخة أكسجين وقم بإجراء تغييرات يومية في المياه لتقليل مخاطر العدوى.
  9. مراقبة وتقييم تعبير GFP عن طريق قياس التدفق الخلوي في الأسماك بعد 14 يوما تقريبا من الزرع لتقييم معدل النقش. سجل معدل الوفيات اليومي للأسماك لحساب معدلات البقاء على قيد الحياة بدقة. قم بإجراء ANOVA أحادي الاتجاه لتحليل النقش واختبار التصنيف اللوغاريتمي لتحليل البقاء على قيد الحياة.

النتائج

لتقييم فعالية ودقة طرق الحقن المختلفة في أسماك كاسبر البالغة ، تم إجراء تحليل مقارن باستخدام تقنيات داخل القلب والتناضح العكسي والوريد (الشكل 2 أ). تم حقن كميات متفاوتة من خلايا WKM من أسماك Tg (mpo: EGFP) ، كل منها مختلط بصبغة FITC-dextrann بتركيزات 1 × 105 و 3 × 105 خلايا. تم تحديد نجاح كل طريقة من خلال التقييم المجهري الفوري لوجود إشارة GFP بعد الحقن. كشفت النتائج عن اختلافات كبيرة في نجاح التسليم عبر الطرق. أظهرت طريقة الحقن الوريدي أعلى فعالية ، حيث تم اكتشاف إشارات GFP في 41 من أصل 43 سمكة. في المقابل ، أظهرت طريقة التناضح العكسي نجاحا محدودا ، حيث لوحظت الحقن الناجحة في 3 فقط من أصل 37 سمكة. حققت الطريقة داخل القلب ولادة ناجحة في 11 من أصل 40 سمكة (الشكل 2 أ). كما تمت مراقبة بقاء الأسماك المزروعة. كان للأسماك المحقونة عبر طرق التناضح العكسي وداخل القلب معدلات بقاء أقل بكثير مقارنة بتلك التي يتم حقنها عن طريق الوريد (الشكل 2 ب). والجدير بالذكر أن عدد الخلايا المحقونة أثر على معدلات البقاء على قيد الحياة بين الأسماك المحقونة بالحقن الوريدي ، حيث تلقى المتلقين 3 × 105 خلايا أظهروا بقاء أفضل. تسلط هذه النتائج الضوء على الفعالية والموثوقية الفائقة لطريقة الحقن الوريدي في توصيل الخلايا والمواد إلى أسماك الزرد البالغة.

تم تقييم كفاءة نقش خلايا WKM في أسماك كاسبر المتلقية بدقة من خلال مراقبة إشارة GFP من الخلايا المزروعة. في الأسماك التي تلقت الحقن الوريدية ، كان من الممكن اكتشاف إشارات GFP في وقت مبكر من اليوم الثالث بعد الزرع (الشكل 2 ج) ، مما يشير إلى عملية نقش سريعة وفعالة. في المقابل ، أظهرت الأسماك التي خضعت لحقن التناضح العكسي والحقن داخل القلب ظهور إشارة GFP متأخرة ، مما يشير إلى معدل نقش أبطأ. بحلول اليوم السابع عشر بعد الزرع ، كانت الخلايا المزروعة قد أعادت في الغالب توطين نخاع الكلى ، مع ملاحظة إشارات GFP الأكثر وضوحا في الأسماك المحقونة بالوريد (الشكل 2 ج). أكد تحليل قياس التدفق الخلوي ل KM من المستلمين على فعالية طريقة الحقن الوريدي. في المتلقين الذين تم حقنهم في البداية ب 3 × 105 خلايا عن طريق الوريد ، كان ما يقرب من 18٪ من الخلايا في KM إيجابية GFP ، وهي نسبة مشابهة لتلك الموجودة في نخاع الكلى لأسماك Tg (mpo: EGFP) المانحة التي لم تخضع لأي عملية زرع (الشكل 2D ، E). في المقابل ، نتج عن الحقن داخل القلب حوالي 5٪ من الخلايا الإيجابية ل GFP ، بينما أسفرت طريقة RO عن حوالي 2٪ فقط من الخلايا الإيجابية ل GFP في نخاع الكلى للمتلقين. بالإضافة إلى ذلك ، ارتبط معدل النقش بشكل إيجابي بعدد الخلايا المحقونة ، مما يدل على أن جرعات الخلايا العالية أدت إلى زيادة النقش. تؤكد هذه النتائج متانة تقنية الحقن الوريدي في تسهيل نقش الخلايا وإعادة توطين نخاع الكلى اللاحقة.

figure-results-1
الشكل 1: نتائج البقاء على قيد الحياة بعد التشعيع والحقن الوريدي في أسماك الزرد البالغة. (أ) تعرضت أسماك كاسبر لإشعاع يصل إلى 35 غراي وراقبت البقاء على قيد الحياة على مدى 30 يوما ، مما يؤكد 25 غراي كجرعة شبه مميتة (ن = 10 لجميع المجموعات). (ب) مخططات تخطيطية توضح مواقع الحقن لكل من أسماك الزرد Casper و TU ، جنبا إلى جنب مع أمثلة على الأسماك المحقونة بنجاح. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: مقارنة بين الحقن الرجعية الحجاجية وداخل القلب والحقن الوريدي في أسماك الزرد البالغة. (أ) التمثيلات التخطيطية والنتائج التمثيلية لطرق الحقن التناضحية وداخل القلب والحقن الوريدي في أسماك الزرد البالغة. تشير الأرقام الموجودة في الزاوية اليمنى السفلية إلى عدد الأسماك المحقونة أو الخاطئة التي تم حقنها بنجاح بالنسبة للعدد الإجمالي الذي تمت تجربته لكل طريقة ، تم التحقق من إشارة GFP تحت المجهر الفلوري مباشرة بعد الحقن. (ب) البقاء على قيد الحياة بشكل عام للمتلقين بعد زرعهم بأعداد مختلفة من خلايا نخاع الكلى المتبرع بها بطرق حقن مختلفة (IV-100K: n = 24; داخل القلب -100 كيلو: ن = 10 ؛ RO-100K: ن = 12 ؛ رابعا -300 كلف: ن = 20 ؛ داخل القلب -300 كيلو: ن = 6 ؛ RO-300K: ن = 8). (ج) مراقبة كفاءة النقش في المتلقين بعد الزرع عبر طرق الحقن التناضحية وداخل القلب والحقن الوريدي (د) مخطط قياس التدفق الخلوي التمثيلي للخلايا الإيجابية ل GFP في KM للمتلقين في 17 يوما بعد الزرع. (ه) النسبة المئوية لخلايا GFP + في إدارة البترول المتلقين بعد 17 يوما من الزرع، وكذلك في الطب السليم للأسماك المانحة Tg(mpo:EGFP) دون تشعيع (IV-100K: n = 30؛ داخل القلب -100 كيلو: ن = 28 ؛ RO-100K: ن = 22 ؛ رابعا -300 كلف: ن = 22 ؛ داخل القلب -300 كيلو: ن = 26 ؛ RO-300K: ن = 18). البيانات متوسطة ± s.e.m. تم إجراء ANOVA أحادي الاتجاه ل D. تم إجراء اختبار Log-Rank ل B. *P < 0.05 ، ** P < 0.01 ، ***P < 0.001 ، ****P < 0.0001. أشرطة المقياس = 1 مم (A ، C). الاختصارات: RO = الرجعية المدارية. IV = عن طريق الوريد; GFP = بروتين الفلورسنت الأخضر. KM = نخاع الكلى ؛ SSC-A = منطقة ذروة الانتثار الجانبي؛ FITC-A = منطقة ذروة الفلورسينات إيزوثيوسيانات. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

المناقشة

في هذه الدراسة ، قمنا بتطوير بروتوكول حقن وريدي مصمم خصيصا لأسماك الزرد البالغة لتعزيز دقة واتساق توصيل الخلايا أو الأدوية. عنصر حاسم في هذه الطريقة هو القدرة على توطين الوريد الأساسي وتصوره ، وهو أمر بالغ الأهمية للإدارة الدقيقة للمواد. في حين يوصى باستخدام سلالة أسماك الزرد Casper الشفافة من أجل الرؤية المثلى للوعاء ، فإن بروتوكولنا قابل للتكيف للاستخدام مع العديد من سلالات أسماك الزرد البالغة ، بشرط إجراء تعديلات مناسبة للرؤية والدقة. كان اختيار مقياس الإبرة المناسب ضروريا لتقليل تلف الأوعية الدموية وضمان النقل الفعال للمواد. علاوة على ذلك ، أعطيت الأولوية للرعاية الشاملة بعد الحقن ، بما في ذلك الحفاظ على مياه نظيفة وأكسجين جيدا. لم تقم هذه الممارسات بتبسيط عملية الحقن فحسب ، بل حسنت أيضا بشكل كبير صحة وبقاء أسماك الزرد ، مما أدى إلى نتائج تجريبية أكثر موثوقية وقابلية للتكرار.

علاوة على ذلك ، أجرينا تحليلا مقارنا لتقنيات الحقن داخل القلب ، والتناضح العكسي ، والوريد في أسماك الزرد البالغة ، مما يدل على المزايا المميزة للطريقة الوريدية في تعزيز معدلات البقاء على قيد الحياة وتعزيز نقش الخلايا. على الرغم من استخدامها التقليدي ، ترتبط الحقن داخل القلب بمعدلات وفيات عالية13 ، والدقة المطلوبة لحقن التناضح العكسي الفعالة تمثل تحديا لتحقيق14 باستمرار. تخفف الطبيعة طفيفة التوغل للتقنية الوريدية بشكل كبير من الإجهاد والصدمات الجسدية للأسماك ، مما يؤدي إلى تحسين كبير في نتائج البقاء على قيد الحياة والنقش بعد الحقن. بالإضافة إلى ذلك ، فإن إمكانية الكشف السريع لإشارات GFP بحلول اليوم 3 بعد الزرع في الأسماك المحقونة بالحقن الوريدي تؤكد كفاءة الطريقة في تسهيل النقش الفعال للخلية. في المقابل ، فإن الظهور البطيء لإشارات GFP في الأسماك المحقونة داخل القلب والغياب شبه التام للإشارات في الأسماك المحقونة بالتناضح العكسي يؤكد على قيود هذه الطرق البديلة ، مما يشير إلى النهج الوريدي كنهج أكثر فعالية.

في حين أن طريقة الحقن الوريدي توفر مزايا كبيرة ، إلا أن لها قيودا محتملة ، مثل الحاجة إلى معدات متخصصة وتدريب لتحقيق دقة عالية. علاوة على ذلك ، في حين أن شفافية سلالة كاسبر تسهل تصور الوريد ، فإن تكييف هذه الطريقة مع السلالات الأقل شفافية قد يتطلب رؤية إضافية وتحسينات تكنولوجية. بالإضافة إلى ذلك ، هناك حاجة إلى مزيد من التحقيق لتقييم الآثار طويلة المدى للحقن الوريدي وتقييم استقرار الخلايا المطعمة على مدى فترات طويلة في أسماك الزرد ، والتي ستكون حاسمة للتحقق من صحة النجاح المستمر وسلامة هذه التقنية.

إن فعالية تقنية الحقن الوريدي في توصيل المواد إلى مجرى الدم وتحقيق مستويات عالية من النقش في أسماك الزرد البالغة لها العديد من الآثار على الأبحاث المستقبلية. تتيح هذه الطريقة استخداما أكثر فعالية لأسماك الزرد البالغة في الدراسات طويلة الأجل ، ومعالجة بعض القيود المرتبطة بنماذج اليرقات. تعزز موثوقية الطريقة الوريدية دقة النماذج لدراسة الأمراض المعقدة وإجراء فحوصات الأدوية ، مما قد يؤدي إلى تقدم كبير في الاستراتيجيات العلاجية. بالإضافة إلى ذلك ، فإن نجاح الحقن الوريدية في تحقيق نقش قوي يضع أساسا قويا لمزيد من الاستكشاف في التلاعب الجيني والزرع ، وهو أمر ضروري للتحقيق في الاضطرابات الوراثية والاستجابات المناعية. تستعد التطورات في بروتوكول الحقن الوريدي هذا لتقديم مساهمات كبيرة في أبحاث أسماك الزرد ، وأدوات تحسين البحوث الطبية الحيوية وتسريع التقدم في فهم الأمراض البشرية وعلاجها.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإعلان عنه.

شكر وتقدير

نشكر مرفق أسماك الزرد من مركز أبحاث الطب المقارن (CCMR) في جامعة هونغ كونغ. نشكر السيدة جو يو لينغ وونغ على مساعدة. تم دعم الأعمال من قبل مخطط البحث القائم على الموضوع (T12-702 / 20-N) ، ومشاريع صندوق البحوث الصحية والطبية رقم 08192066 ورقم 08193106 ، ومؤسسة العلوم الطبيعية الوطنية الصينية (NSFC) / مجلس المنح البحثية (RGC) مخطط البحث المشترك 2021/22 N_HKU745/21 ، والبرنامج الوطني للبحث والتطوير الرئيسي في الصين (2023YFA1800100) ومركز الأورام والمناعة في إطار مبادرة Health@InnoHK الممولة من لجنة الابتكار والتكنولوجيا ، حكومة منطقة هونغ كونغ الإدارية الخاصة، الصين (A.Y.H.L.).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
الأوتوكلاف معقم بالبخارHIRAYAMA HRG-140
جهاز طرد مركزي 5424Eppendorf
Countess 3 عداد الخلايا الآليThermofisher
Countess II FLInvitrogen
Ethyl 3-aminobenzoate ملح ميثان سولفونات (Tricaine)Sigma-aldrichMKCL9483
Falcon 40 & micro ؛ مصفاة خلية مكورنينجبلو ، معقمة ، معبأة بشكل فردي ، 50 / علبة
FBS ، مؤهلةمن Gibco26140079
FITC-Dextern (MW 10000)   ؛MedChemExpress60842-46-8
إبرة حقنهاميلتون  HAMI20743434 جم ، 10 مم طول
حقنة صغيرةهاميلتون & nbsp ؛7635-01 10 وميكرو ؛ L السعة ، موديل 701 RN
نيكون SMZ18
PBS درجة الحموضة 7.4 (1x)Gibco10010023
البنسلين ستربتومايسين (5,000 U / mL)Gibco & trade ؛15070063100x
ماصة نصائحEppendorf epTIPS
ماصة أحادية القناةEppendorf 05-403-151
10977015المقطر المقطر فائق
النقاء

المراجع

  1. Choi, T. Y., Choi, T. I., Lee, Y. R., Choe, S. K., Kim, C. H. Zebrafish as an animal model for biomedical research. Exp Mol Med. 53 (3), 310-317 (2021).
  2. Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8 (5), 353-367 (2007).
  3. Wu, J. Q., et al. Patient-derived xenograft in zebrafish embryos: a new platform for translational research in gastric cancer. J Exp Clin Cancer Res. 36 (1), 160(2017).
  4. Welker, A. M., et al. Correction: Standardized orthotopic xenografts in zebrafish reveal glioma cell-line-specific characteristics and tumor cell heterogeneity. Dis Model Mech. 9 (9), 1063-1065 (2016).
  5. Stoletov, K., Montel, V., Lester, R. D., Gonias, S. L., Klemke, R. High-resolution imaging of the dynamic tumor cell vascular interface in transparent zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (44), 17406-17411 (2007).
  6. Etchin, J. P. K. J., Look, A. T. Zebrafish as a model for the study of human cancer. Methods Cell Biol. 105, 309-337 (2011).
  7. Khan, N., Mahajan, N. K., Sinha, P., Jayandharan, G. R. An efficient method to generate xenograft tumor models of acute myeloid leukemia and hepatocellular carcinoma in adult zebrafish. Blood Cells Mol Dis. 75, 48-55 (2019).
  8. Corkery, D. P., Dellaire, G., Berman, J. N. Leukaemia xenotransplantation in zebrafish--chemotherapy response assay in vivo. Br J Haematol. 153 (6), 786-789 (2011).
  9. He, B. L., et al. Functions of flt3 in zebrafish hematopoiesis and its relevance to human acute myeloid leukemia. Blood. 123 (16), 2518-2529 (2014).
  10. Wang, D., et al. Transgenic IDH2(R172K) and IDH2(R140Q) zebrafish models recapitulated features of human acute myeloid leukemia. Oncogene. 42 (16), 1331(2023).
  11. Fan, R. Y., et al. Zebrafish xenograft model for studying mechanism and treatment of non-small cell lung cancer brain metastasis. J Exp Clin Cancer Res. 40 (1), 371(2021).
  12. LeBlanc, J., Bowman, T. V., Zon, L. Transplantation of whole kidney marrow in adult zebrafish. J Vis Exp. (2), e159(2007).
  13. Pugach, E. K., Li, P., White, R., Zon, L. Retro-orbital injection in adult zebrafish. J Vis Exp. (34), e1645(2009).
  14. Benjamin, D. C., Hynes, R. O. Intravital imaging of metastasis in adult zebrafish. BMC Cancer. 17 (1), 660(2017).
  15. Hilligan, K. L., et al. Intravenous administration of BCG protects mice against lethal SARS-CoV-2 challenge. J Exp Med. 219 (2), e20211862(2022).
  16. Moreo, E., et al. Intravenous administration of BCG in mice promotes natural killer and T cell-mediated antitumor immunity in the lung. Nat Commun. 14 (1), 6090(2023).
  17. Wang, Z., et al. Intravenous administration of IL-12 encoding self-replicating RNA-lipid nanoparticle complex leads to safe and effective antitumor responses. Sci Rep. 14 (1), 7366(2024).
  18. Saleem, M., et al. A new best practice for validating tail vein injections in rat with near-infrared-labeled agents. J Vis Exp. (146), e59295(2019).
  19. Rojas, A. M., Shiau, C. E. Brain-localized and Intravenous Microinjections in the Larval Zebrafish to Assess Innate Immune Response. Bio Protoc. 11 (7), e3978(2021).
  20. van Soest, J. J., et al. Comparison of static immersion and intravenous injection systems for exposure of zebrafish embryos to the natural pathogen Edwardsiella tarda. BMC Immunol. 12, 58(2011).
  21. Cianciolo Cosentino, C., Roman, B. L., Drummond, I. A., Hukriede, N. A. Intravenous microinjections of zebrafish larvae to study acute kidney injury. J Vis Exp. (42), e2079(2010).
  22. Gerlach, G. F., Schrader, L. N., Wingert, R. A. Dissection of the adult zebrafish kidney. J Vis Exp. (54), e2839(2011).

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

الحقن الأمثل في الوريد في أسماك الزرد البالغة
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.