مقالة منهجية

فحص التصوير النانوي المزدوج Cisterna Magna و Laser Speckle Contrast Imaging لدراسة تنظيم تدفق الدم الدماغي في الجسم الحي

1.6K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/67544

⸱

يوليو 8, 2025

 , 
1Department of Neuroscience, Center for Brain Immunology and Glia (BIG), University of Virginia School of Medicine

في هذه المقالة

ملخص

لدراسة تنظيم تدفق الدم الدماغي في الجسم الحي ، تكون الطرق الدوائية التقليدية غازية ، وغالبا ما تلحق الضرر بالجمجمة والجافية والسحائية البريمية. في هذا العمل ، قمنا بتطوير تقنية طفيفة التوغل تجمع بين حقن الماغنا داخل القناة الموجهة بالحاقن النانوي (ICM) وتصوير تباين البقع بالليزر ، مما يحافظ على سلامة الجمجمة والثبقيات.

الملخص

يعد تنظيم تدفق الدم الدماغي (CBF) أمرا بالغ الأهمية للحفاظ على الوظائف المعرفية ، لكن آلياته الأساسية لا تزال غير مفهومة جيدا. يتطلب التحقيق في العمليات الخلوية والجزيئية التي تنطوي عليها هذه اللائحة نهجا دوائيا يسمح بتوصيل الدواء بدقة إلى السائل الشوكي الدماغي (CSF) مع تمكين المراقبة في الوقت الفعلي لديناميكيات تدفق الدم الدماغي. في هذه الورقة ، نقدم طريقة لدراسة تنظيم تدفق الدم الدماغي في الجسم الحي من خلال الجمع بين حقن الماغنا داخل الحاقن القائم على الحاقن النانوي (ICM) وتصوير تباين البقع بالليزر.

تسمح تقنية حقن ICM القائمة على حاقن النانولتر بتوصيل الدواء بدقة في نطاق ديناميكي من nL / min إلى μL / min. في تجاربنا ، قلل هذا النهج بشكل كبير من حجم الحقن من 5-10 ميكرولتر التقليدي إلى 1.5 ميكرولتر فقط ، وبالتالي الحفاظ على الضغط الطبيعي داخل الجمجمة. عند دمجها مع تصوير تباين البقع بالليزر، تمكنا من مراقبة ديناميكيات تدفق الدم الدماغي (CBF) في الوقت الفعلي قبل وأثناء وبعد حقن ICM.

باستخدام هذه الطريقة ، قمنا بتقييم تغيرات CBF استجابة لحقن ICM لثلاثة موسعات مختلفة للأوعية: (S) -3،5-ثنائي هيدروكسي فينيل جلايسين (DHPG) ، أسيتيل كولين ، والأدينوزين. في حين أن موسعات الأوعية الثلاثة زادت من CBF القاعدي ، كان لها تأثيرات واضحة على ديناميكيات CBF. على سبيل المثال ، كان تأثير الأدينوزين عابرا ، بينما أنتج DHPG والأستيل كولين تأثيرات طويلة الأمد. بفضل مزاياها الفريدة ، تمثل هذه الطريقة إضافة قيمة إلى مجموعة أدوات دراسة تنظيم CBF للقوارض في الجسم الحي.

المقدمة

يضمن تدفق الدم الدماغي (CBF) إمدادا مستمرا بالأكسجين والمواد المغذية للدماغ مع إزالة النفايات الأيضية ، وهو أمر ضروري للحفاظ على الوظائف المعرفية الطبيعية1،2. في ظل ظروف التوازن ، يظل CBF مستقرا نسبيا على الرغم من التقلبات في ضغط التروية ، وهي عملية تعرف باسم التنظيم الذاتي3،4،5. بالإضافة إلى التنظيم الذاتي ، يمكن تعديل CBF المحلي ديناميكيا استجابة للنشاط العصبي القريب ، وهي ظاهرة يشار إليها باسم اقتران الأوعية الدموية العصبية6،7. يتم تنظيم كل من التنظيم الذاتي والاقتران العصبي الوعائي بواسطة مجموعة من الخلايا - الخلايا البطانية ، والخلايا الجدارية ، والخلايا النجمية ، والخلايا الليفية ، والخلايا العصبية - المعروفة مجتمعة باسم خلايا وحدة الأوعية الدموية العصبية4،7. ومع ذلك ، فإن الآليات الخلوية والجزيئية التي تنسق بها هذه الأنواع المختلفة من الخلايا لتعديل CBF لا تزال غير معروفة إلى حد كبير.

تنقسم طرق التحقيق في تنظيم CBF بشكل عام إلى نماذج في المختبر وفي الجسم الحي . عادة ما يتم دمج الدراسات في المختبر ، التي غالبا ما تستخدم شرائح الدماغ الحادة ، مع التقنيات الفيزيولوجية الكهربية أو الدوائية لفحص كيفية تنظيم الخلايا العصبية والخلايا الدبقية لتمدد أو انقباض الأوعية الدموية الفردية8،9،10. يتمثل القيد الأساسي للنماذج في المختبر في أنها لا تتكاثر في الظروف الحية ، لا سيما عدم وجود ضغط دم فسيولوجي. تتراوح النماذج في الجسم الحي لدراسة تنظيم CBF من الأساليب الكبيرة إلى الصغرى. تقنيات الحجم الكبير ، مثل التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني (PET) والتصوير بالرنين المغناطيسي الوظيفي (fMRI) ، غير جراحية ولكنها تعاني من دقة مكانية وزمانيةمنخفضة 11،12،13،14.

الطريقة الدقيقة الأساسية لدراسة CBF في الجسم الحي هي التصوير ثنائي الفوتون ، والذي يوفر دقة مكانية وزمانيةعالية 9،15،16،17،18. ومع ذلك ، تتطلب هذه التقنية إزالة الجمجمة والأم الجافية ، وعندما تقترن بالتلاعب الدوائي ، فإنها تصبح أكثر توغلا ، مما قد يتسبب في حدوث نزيف ، وإتلاف أنسجة المخ ، وتغيير الضغط داخل الجمجمة19. لذلك ، من الأهمية بمكان أن يكون لديك طريقة للتلاعب ب CBF ومراقبته في الجسم الحي تفي بمعايير محددة: يجب أن تكون غير جراحية (تحافظ على سلامة الجمجمة ، والجحميات السحائية ، والأوعية) ، وتوفر دقة مكانية وزمانية عالية وتسمح بالتلاعب الدوائي الدقيق ل CBF. في هذه الورقة ، نقدم طريقة جديدة تجمع بين حقن النانولتر داخل الجذر (ICM) وتصوير تباين البقع بالليزر ، مما يفي بكل هذه المتطلبات.

غالبا ما تتضمن الأساليب الدوائية التقليدية لدراسة تنظيم CBF إزالة الجمجمة والسحايا لكشف أنسجة المخ لتوصيل الأدوية المحلية. في المقابل ، يتجنب حقن ICM هذا الضرر عن طريق إعطاء الأدوية مباشرة في السائل النخاعي الدماغي (CSF) ، مما يسمح لها بمتابعة التدفق الطبيعي للسائل الشوكي الدماغي وبالتالي تقليد الظروف الفسيولوجية بشكل أفضل. يتمثل أحد التحديات في حقن ICM في أنه عادة ما يتطلب كميات كبيرة من السوائل - غالبا 5 ميكرولتر أو أكثر في الفئران20. بالنظر إلى أن الحجم الكلي للنخاعي الدماغي النخاعي في الفئران البالغة يبلغ حوالي 36 ميكرولتر ، فإن حقن 5 ميكرولتر يمكن أن يزيد الضغط داخل الجمجمة ويغير ديناميكيات CBF. يوفر نظام حاقن النانو الخاص بنا، الذي يستخدم الماصات الزجاجية، سائلا مع تحكم دقيق في الحجم والسرعة دون التسبب في تسرب السائل النخاعي في موقع الحقن.

يتم استخدام اليوريثان وألفا كلورولوز في دراستنا لأنهما يوفران خط أساس فسيولوجي أكثر استقرارا لتدفق الدم الدماغي ويحافظان على اقتران الأوعية الدموية العصبية (NVC) بشكل أفضل من البدائل شائعة الاستخدام مثل الأيزوفلوران أو الكيتامين / الزيلازين (KX). باستخدام هذا النظام ، اختبرنا ثلاثة موسعات مختلفة للأوعية الدموية - (S) -3،5-ثنائي هيدروكسي فينيل جلايسين (DHPG) ، أسيتيل كولين ، والأدينوزين ، وأكدنا أنه يسمح بالتلاعب الدقيق ومراقبة ديناميكيات CBF في الجسم الحي.

البروتوكول

تمت الموافقة على هذا البروتوكول من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدامها (IACUC) في جامعة فيرجينيا. التزمت جميع التجارب بدليل المعاهد الوطنية للصحة لرعاية واستخدام المختبر. تم استخدام ستة ذكور من الفئران C57BL / 6 ، تتراوح أعمارهم بين 10 و 14 أسبوعا ، في التجارب. الإجراءات الجراحية موضحة في الشكل 1 أ.

1. التحضير للجراحة

  1. ضع وسادة تسخين على الإطار التجسيمي وقم بتسخينها مسبقا إلى 37 درجة مئوية ~ 20 دقيقة قبل الجراحة. تحضير اليوريثان الطازج (750 ملغم/كجم) والكلورالوز (50 ملغم/كجم) في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) للتخدير.
    ملاحظة: لتحضير محلول ألفا كلوورالوز في PBS ، قمنا بتسخين المحلول في حمام مائي 40 درجة مئوية وقمنا بتدويره كل 10-15 دقيقة حتى يذوب تماما. تم ترشيح كل من محاليل اليوريثان وألفا كلورالوس باستخدام مرشح حقنة 0.22 ميكرومتر قبل الاستخدام.
  2. قبل الجراحة ، اجمع جميع الأدوات الجراحية اللازمة ، بما في ذلك المقص والملقط وحاملات الإبر الدقيقة ومرقئ الدم ومسحات القطن والمساحات والخيوط. تعقيم الأدوات عن طريق التعقيم (121 درجة مئوية عند 15 رطل لكل بوصة مربعة لمدة 60 دقيقة).
  3. تحضير أنابيب شعرية زجاجية (القطر الخارجي 1.14 مم ، القطر الداخلي 0.53 مم ، طول 88.9 مم). استخدم مجتذب زجاجي لإنشاء ماصات زجاجية للحقن21. تبلغ مقاومة الماصة المفضلة حوالي 80 - 100 MΩ. عقم الماصات الزجاجية وخزنها في وعاء نظيف.
  4. قم بإعداد حاقن نانوي بحجم حقن مناسب (25 نانولتر - 4.5 ميكرولتر) وسرعة (6 نانولتر / ثانية - 644 نانولتر / ثانية).
  5. تحضير محاليل موسع الأوعية الدموية التالية في السائل الدماغي النخاعي الاصطناعي (aCSF): (S) -3،5-ثنائي هيدروكسي فينيل جلايسين (DHPG) عند 5 ملي مولار ، أستيل كولين عند 0.5 ملي مولار ، والأدينوزين عند 10 ملي مولار.
  6. تحضير ميلوكسيكام (4.0 ملغم/كغ) لتخفيف الآلام أثناء الجراحة. يتم تطبيق ميلوكسيكام تحت الجلد للفئران قبل 30 دقيقة تقريبا من الجراحة لضمان التسكين الكافي.

2. الإجراء الجراحي

  1. قم بوزن ستة فئران ذكور C57BL / 6 (10-14 أسبوعا) وقم بتخديرها عن طريق الحقن داخل الصفاق من اليوريثان (750 مجم / كجم) والكلورالوز (50 مجم / كجم). ضع الفئران في غرفة تخدير مع 1٪ أيزوفلوران للحفاظ على التخدير. تستغرق هذه العملية حوالي 40 دقيقة إلى 1 ساعة.
    ملاحظة: يمكن أن يسرع الأيزوفلوران تحريض التخدير.
  2. قم بإزالة الفئران بعناية من غرفة التخدير وتقييم عمق التخدير عن طريق تأكيد عدم وجود منعكس قرصة إصبع القدم. باستخدام قطعة قطن ، ضعي كريم إزالة الشعر على الجزء العلوي من الجمجمة ومؤخرة العنق لإزالة الفراء.
  3. ضع مرهم العين على العينين لمنع الجفاف وأعد وضعه حسب الحاجة طوال العملية. راقب بانتظام أثناء التجربة وقم بإعطاء مرهم إضافي عند الضرورة.
  4. ضع الماوس في اتجاه الانبطاح داخل الإطار التجسيمي ، مما يضمن تهوية كافية مع الهواء الطبي بمعدل تدفق من 1 إلى 2 لتر / دقيقة. قم بتأمين الماوس بقضبان الأذن للتثبيت المناسب ، ثم قم بإمالة الرأس برفق لأسفل لتشكيل زاوية 120 درجة مع الجسم ، وبالتالي تعريض الصهريج الماغنا.
    ملاحظة: يستخدم الأيزوفلوران حصريا لتحريض التخدير وليس أثناء مرحلة الصيانة.
  5. تطهير المنطقة الجراحية باستخدام ثلاثة تطبيقات متناوبة على الأقل من الكحول بنسبة 70٪ ومقشر جراحي (على سبيل المثال ، الكلورهيكسيدين أو بوفيدون اليود) لضمان تعقيم الجلد بشكل مناسب.
  6. حدد موقع القمة القذالية تحت المجهر الجراحي. ارفع الجلد المغطى بالملاقط وقم بعمل شق خط الوسط بطول 1 سم. السيطرة على أي نزيف باستخدام مسحات القطن.
  7. كشف عضلات الرقبة وشقها بعناية وفصلها على طول خط الوسط باستخدام الملقط. استخدم ملقطين منحنيين ، أحدهما في كل يد ، لسحب العضلات برفق وفضح الأم الجافية ، التي تشكل الحدود الخارجية لصهريج ماجنا.
  8. اضبط موضع الرأس عن طريق إمالته لأسفل لتشكيل زاوية 150 درجة مع الجسم للحصول على التعرض الأمثل للصهريج العظيم.
  9. قم بعمل شق 5 مم على طول الخيط السهمي ، يغطي نقاط لامدا وبريجما. باستخدام ملقطين منحنيين ، اسحب الجلد جانبا برفق ، ونظف سطح الجمجمة بالمحلول الملحي. تأكد من عدم وجود شعر على الجمجمة المكشوفة.
  10. بعد التنظيف ، ضع طبقة من جل الموجات فوق الصوتية بسمك ~ 1 مم على الجمجمة المكشوفة باستخدام مسحات قطنية للحفاظ على الرطوبة في المنطقة. نظرا لأن جل الموجات فوق الصوتية قد يحتوي على فقاعات هواء ، فتأكد من إزالة جميع فقاعات الهواء قبل التصوير.
  11. ضع الماوس تحت عدسة نظام تصوير تباين البقع بالليزر. قم بتشغيل النظام والبرامج المصاحبة له. تأكد من توسيط دماغ الماوس داخل مجال التصوير ، ثم استخدم وظيفة التركيز التلقائي لتحقيق التركيز البؤري الصحيح للتصوير. إذا لزم الأمر ، قم بإزالة أي شعر متبقي أو فقاعات هواء برفق من مجال التصوير باستخدام الملقط.

3. إعداد الحقن النانوي

  1. قم بتثبيت المضخة بذراع مناور التجسيم وقم بتوصيل الكابل بوحدة التحكم. قم بتشغيل وحدة التحكم وحدد المضخة المستهدفة. في لوحة التحكم ، اضبط DIRECTION على INFUSE. اضبط السرعة على 2 ميكرولتر في الدقيقة والحجم على 4.5 ميكرولتر.
    ملاحظة: يتكون نظام الحقن النانوي من مكونين رئيسيين: مضخة الحقن ووحدة التحكم. يمكن لكل وحدة تحكم تشغيل مضختين في وقت واحد. بالنسبة لحقن ICM ، نستخدم مضخة واحدة فقط.
  2. بعد اكتمال INFUSE ، أخرج ماصة زجاجية واحدة من الحاوية واملأها بزيت معدني عديم اللون والرائحة باستخدام إبرة مرنة 34 جم من MicroFil أو نوع مماثل من الإبرة. تأكد من أن الماصة الزجاجية بالكامل مملوءة بالزيت.
  3. قم بفك كوليت المضخة ، وأدخل الماصة الزجاجية ، ثم شد الطوق. تأكد من عدم وجود فقاعات هواء داخل الماصة الزجاجية.
  4. قم بتغيير DIRECTION في لوحة التحكم الخاصة ب PULL. اضبط السرعة على 2 μ لتر / دقيقة ومستوى الصوت على 4.5 μ لتر.
  5. حرك الذراع التجسيمي لإدخال الماصة برفق في المحلول المحضر وسحب الحجم المطلوب.

4. حقن موسعات الأوعية الدموية في الصهريج ومراقبة CBF

  1. تأكد من تثبيت المضخة بإحكام على ذراع مناور التجسيم. اضبط زاوية ذراع مناور التجسيم إلى 45 درجة في المستوى الأمامي الخلفي.
  2. باستخدام ملاقط منحنية تحت مجهر التشريح ، قم بتعريض الصهريج بعناية. نظف المنطقة بالمحلول الملحي لإزالة أي دم. استخدم المعالج الدقيق التجسيمي لوضع الماصة الزجاجية بالقرب من الأم الجافية لصهريج الصهريج.
  3. بمجرد أن تلامس الماصة الزجاجية الجافية ، قم بالمناورة برفق لتمر إلى وسط الصهريج العظيم ، وتجنب أي اختراق في المخيخ أو النخاع. تأكد من إدخال طرف الماصة الزجاجية على عمق 1-2 مم قبل تحرير الملقط.
    ملاحظة: يعد الإطار التجسيمي الرقمي ضروريا لمراقبة عمق تغلغل الماصة الزجاجية في صهريج الماغناء.
  4. قم بتغيير DIRECTION في لوحة التحكم إلى INFUSE. اضبط سرعة الحقن على 300 نانولتر / دقيقة والحجم على 1.5 ميكرولتر.
  5. قم بتشغيل برنامج تصوير تباين البقع بالليزر (LSCI) واضبط التركيز للحصول على أوضح صورة للأوعية الدموية. تأكد من عدم وجود فقاعات شعر أو هواء في مجال الرؤية.
  6. اضبط الفاصل الزمني للتصوير على 5 ثوان في لوحة تحكم LSCI. سجل CBF الأساسي لمدة 10 دقائق تقريبا، مع ضمان بقاء خط الأساس مستقرا. إذا كانت هناك تقلبات في خط الأساس، فاستمر في التسجيل لفترة أطول حتى يتحقق الاستقرار.
  7. بعد 10 دقائق من التسجيل الأساسي المستقر ، ابدأ الحقن النانوي ولاحظ وقت بدء الحقن في نظام تسجيل LSCI. بمجرد اكتمال الحقن ، حدد وقت الانتهاء واستمر في التسجيل لمدة 20 دقيقة إضافية أو أكثر. بعد الانتهاء من التجربة ، قم بتروية الفئران المصابة ب PBS عبر القلب وجمع أنسجة المخ للتحليل النسيجي.

النتائج

بعد الانتهاء من الجراحة ، قمنا بتأمين الماوس في إطار تجسيمي مع قراءة رقمية (الشكل 1 أ ، ب). لقياس تدفق الدم الدماغي (CBF) ، قمنا بتفكيك الجلد بعناية فوق الجمجمة بعد الشق وقمنا بتطبيق جل شفاف بالموجات فوق الصوتية للحفاظ على الرطوبة على سطح الجمجمة (الشكل 1 ج). لتسهيل حقن العظمة داخل الخزف (ICM) ، قمنا بتشريح عضلات الرقبة حول القمة القذالية لفضح الصهريج الماغنا. بعد ذلك ، سحبنا المحلول المستهدف باستخدام الماصة الزجاجية ، واستخدمنا المعالج الدقيق لتوجيه الماصة الزجاجية لاختراق أغشية صهريج الصهريج إلى عمق 1-2 مم (الشكل 1D ، E). تم إمالة الذراع التجسيمية بزاوية 45درجة للمساعدة في الإدخال.

بعد ذلك ، قمنا بفحص التغيرات الديناميكية CBF استجابة لثلاثة موسعات مختلفة للأوعية: (S) -3،5-dihydroxyphenylglycine (DHPG) ، أسيتيل كولين ، والأدينوزين22،23،24،25. سجلنا في البداية خط أساس مدته 10 دقائق قبل حقن 1.5 ميكرولتر من كل موسع للأوعية الدموية بسرعة 300 نانولتر / دقيقة على مدى 5 دقائق. بعد الحقن ، سجلنا 20 دقيقة إضافية من البيانات. أظهرت نتائجنا أن موسعات الأوعية الثلاثة زادت من CBF ، على الرغم من ديناميكيات متميزة. تسبب DHPG في زيادة حادة في CBF ، تلاه انخفاض تدريجي بعد الحقن (الشكل 2 أ ، ب). في المقابل ، أثار الأستيل كولين زيادة تدريجية في CBF طوال فترة التسجيل (الشكل 2C ، D). أنتج الأدينوزين أيضا زيادة عابرة في CBF ، والتي عادت إلى مستوى خط الأساس بعد حوالي 15-20 دقيقة من الحقن (الشكل 2E ، F).

figure-results-1
الشكل 1: ملخص إجراءات الجراحة. (أ) الإجراءات الجراحية الرئيسية خطوة بخطوة لنموذج الحقن النانوي + LSCI. (ب) مخططات توضح نظام الحقن النانوي + LSCI المركب. يتم تثبيت الحاقن النانوي بثبات على الذراع التجسيمية ويتم إمالة الذراع بمقدار 45درجة لتسهيل تغلغل الغشاء الأطلسي القذالي في صهريج الصهريج. (ج) عرض من أعلى إلى أسفل لجمجمة الفأر تحت نظام LSCI. الجمجمة مغطاة بهلام الموجات فوق الصوتية. (د) منظر خلفي يظهر الماصة الزجاجية تخترق الصهريج. كانت الماصة الزجاجية مليئة باللون الأزرق إيفانز لتسهيل التصور. استخدم الإطار التجسيمي الرقمي لهذه التجربة بحيث يمكن تحديد مسافة الاختراق بدقة. (ه) مخططات توضح موقع طرف الماصة الزجاجية في الصهريج. تم إمالة رأس الفأر بمقدار 30درجة لتسهيل حقن الصهريج. اختصار: LCSI = تصوير تباين البقع بالليزر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: زيادة تدفق الدم الدماغي بعد الحقن النانوي لموسعات الأوعية. (أ) صور تمثيلية توضح تغيرات تدفق الدم الدماغي قبل وبعد حقن DHPG. سرعة الدم مرمزة بالألوان. يمثل اللون الأزرق السرعة المنخفضة والأحمر يمثل السرعة العالية. (ب) تدفق الدم في الوقت الفعلي في المنطقة المميزة بخط أحمر، مما يشير إلى النافذة الزمنية لحقن DHPG. (ج) صور تمثيلية توضح تغيرات تدفق الدم الدماغي قبل وبعد حقن الهرمون المليتوغرافي. سرعة الدم مرمزة بالألوان. يشير اللون الأزرق والأحمر إلى سرعات منخفضة وعالية ، على التوالي. (د) تدفق الدم في الوقت الحقيقي في المنطقة المميزة بالخط الأحمر ، مما يشير إلى النافذة الزمنية لحقن ACh. (ه) صور تمثيلية تظهر تغيرات تدفق الدم الدماغي قبل وبعد حقن الأدينوزين. سرعة الدم مرمزة بالألوان. يشير اللون الأزرق والأحمر إلى سرعات منخفضة وعالية ، على التوالي. (و) تدفق الدم في الوقت الفعلي في المنطقة المميزة بالخط الأحمر، مما يشير إلى النافذة الزمنية لحقن الأدينوزين. الاختصارات: DHPG = (S) -3،5-Dihydroxyphenylglycine ؛ ACh = أستيل كولين. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

المناقشة

نقدم طريقة جديدة للتحقيق في تنظيم تدفق الدم الدماغي (CBF) في الجسم الحي من خلال الجمع بين الحقن النانوي الدقيق للزرهرية وتصوير تباين البقع بالليزر (LSCI). يسمح هذا النهج بتوصيل الدواء بدقة إلى السائل النخاعي الدماغي (CSF) مع تمكين المراقبة في الوقت الفعلي ل CBF ، مما يسهل تقييم تفاعل الأوعية الدموية الدماغية.

يعد التلاعب الدوائي وتقنيات توصيل الأدوية أمرا بالغ الأهمية لدراسة CBF وتفاعل الأوعية الدموية الدماغية في الجسم الحي. غالبا ما تتطلب الطرق التقليدية لاستخدام الأدوية ، مثل استخدام موسعات الأوعية الدموية أو المضيقات ، إزالة الجمجمة ، مما قد يؤدي إلى إتلاف البريميات السحائية وحتى حمة الدماغ9،10،18. يمكن لهذه التقنيات الغازية أن تعطل البيئة الدقيقة للدماغ ، لا سيما عن طريق التسبب في تلف الأوعية الدموية والنزيف ، وبالتالي الفشل في تكرار الظروف الفسيولوجية الحقيقية. في المقابل ، تقدم طريقتنا أربع مزايا مهمة.

أولا ، نهجنا في تطبيق الأدوية غير جراحي ويحافظ على الظروف الفسيولوجية. ثانيا ، تعتمد طرق حقن ICM الكلاسيكية عادة على المحاقن أو القنيات ، مما قد يؤدي إلى تسرب الأدوية أو الآثار و CSF بسبب الحجم الكبير للأطراف. غالبا ما تتطلب هذه الطرق التقليدية كميات كبيرة من الدواء أو الأثر - عادة 5 ميكرولتر أو أكثر ، مما قد يغير الضغط داخل الجمجمة. في المقابل، لا يتطلب حقن ICM الموجه بالحاقن النانوي سوى حجم صغير لا يقل عن 1.5 ميكرولتر أو أقل. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن التحكم في سرعة الحقن بدقة عبر نطاق واسع ، من 1 نانولتر / ثانية إلى 100 نانولتر / ثانية. عادة ما نستخدم سرعة 5 نانولتر / ثانية (300 نانولتر / دقيقة) ، لأن هذا المعدل لا يؤثر على الضغط داخل الجمجمة. ثالثا ، على عكس حقن الأدوية الموجهة بالماصة في حمة الدماغ أو نضح المخدرات على سطح القشرة ، فإن توصيل الدواء القائم على حقن الصهريج يتبع التدفق الطبيعي للنخاعي الدماغي النخاعي ، ويحاكي عن كثب الظروف الفسيولوجية. أخيرا ، نظرا لأن طريقتنا تحافظ على سلامة الجمجمة والسحايا ، يمكننا إجراء قياسات على نفس المجموعة من الفئران في نقاط زمنية مختلفة ، مما يسمح بإجراء مقارنات طولية - وهو أمر غير ممكن مع طرق استخدام الأدوية الأخرى. لدراسات البقاء على قيد الحياة والمقارنات الطولية ، يجب اتباع تقنيات معقمة صارمة ، بما في ذلك التحضير المناسب للجلد ، واستخدام الأدوات والمواد المعقمة ، والامتثال للإرشادات المؤسسية لرعاية. يجب السماح بفترة نقاهة لمدة أسبوعين لالتئام الجروح.

يمكن أن تؤثر طريقة التخدير بشكل كبير على CBF. على سبيل المثال ، يمكن أن يرفع تخدير الكيتامين الزيلازين CBF بأكثر من 50٪ فوق مستويات خط الأساس ، بينما يمكن أن يضاعف الأيزوفلوران مستوى CBF الأساسي. في تجاربنا ، اخترنا اليوريثان والكلورالوز نظرا لتأثيرهما الضئيل على نظام القلب والأوعية الدموية ، مما يساعد في الحفاظ على المستويات الفسيولوجية ل CBF ، كما هو شائع الاستخدام في هذا المجال26،27. بالإضافة إلى ذلك ، تخطينا القنية داخل الشرايين لقياس غازات الدم المتكرر ليكون غير جراحي ، على الرغم من أنه يمكن دمج هذه الإجراءات مع طريقتنا26.

يدمج نهجنا نظامين: نظام حقن ICM القائم على الحقنالنانوي 28 ونظام التصوير بتباين البقع بالليزر (LSCI)29. يجب تدريب المجربين في كلا النظامين لتنفيذ الإجراء بنجاح. نظرا لأن نظام LSCI يشغل كل المساحة فوق رأس الماوس ، فإن إمالة الذراع بمقدار 45درجة لا يسهل حقن ICM فحسب ، بل يضمن أيضا التوافق بين النظامين. هذا الإعداد أمر بالغ الأهمية لنجاح التجربة.

بالنسبة للمبتدئين الذين يستخدمون حقن ICM الموجه بالحاقن النانوي ، يلزم ممارسة مكثفة لإتقان تنسيق فصل العضلات باستخدام الملقط في يد واحدة أثناء مناورة الملاعب الدقيقة لتوجيه الماصة الزجاجية باليد الأخرى. يعد ضوء الليزر الجيد والمجهر الاستريو للذراع المفصلية ضروريين للتصور الأمثل أثناء العملية.

باستخدام هذه الطريقة ، قمنا بتقييم كيفية تأثير موسعات الأوعية الدموية الكلاسيكية مثل DHPG والأستيل كولين والأدينوزين على CBF. كما هو متوقع ، زادت جميع موسعات الأوعية الدموية الثلاثة من CBF. ومع ذلك ، فقد تسببت في ديناميكيات مختلفة. تسبب DHPG في زيادة حادة في CBF ، تلاه اضمحلال بطيء ، بينما أثار الأسيتيل كولين زيادة تدريجية. في المقابل ، أنتج الأدينوزين ارتفاعا عابرا فقط في CBF.

يجب أن تكون هذه الطريقة قابلة للتطبيق أيضا على نماذج الفئران. ومع ذلك ، نظرا لأن سمك جمجمة الفئران يبلغ حوالي 0.5-1 مم ، فستحتاج إلى تخفيفها لتصوير تباين البقع بالليزر. بالإضافة إلى ذلك ، في حين أن الطريقة الحالية يمكن تكييفها مع الفئران المستيقظة المثبتة على الرأس ، إلا أنها تتطلب تدريبا مكثفا لتقليل حركة أثناء التجارب. استخدمنا عددا محدودا من الفئران لإثبات طريقتنا. لذلك ، فإن دراستنا مقيدة إحصائيا ، ويجب توخي الحذر عند استخلاص استنتاجات واسعة من النتائج التي توصلنا إليها.

من أجل قياسات CBF متسقة وموثوقة ، من المهم للمجربين أن يدركوا أن المعلمات الفسيولوجية الأخرى ، مثل درجة حرارة الجسم وضغط الدم ومستويات ثاني أكسيد الكربون2 ، تلعب دورا مهما في التقييم الفسيولوجي الشامل ويجب أخذها في الاعتبار بعناية في الدراسات المستقبلية. باختصار ، نقدم طريقة جديدة في الجسم الحي لدراسة تنظيم CBF في الفئران. هذا النهج دقيق وبسيط التوغل ، مما يجعله مناسبا تماما للتحقيق في ديناميكيات CBF التي يسببها المخدرات.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل من خلال منح المعاهد الوطنية للصحة (NS108763 ، NS127392 ، NS125788 ، NS125677).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
(RS) -3،5-ثنائي هيدروكسي فينيل جلايسينتوكرسكات. رقم 0342
كلوريد أستيل كولينسيجماA6625-25G
أدينوزينسيجماA9251-25G
مسحة كحول 70٪ كحول الأيزوبروبيلفيتركس الطبية A / S520213
AmScope SM-8T سلسلة مفصلية ذراع تكبير مجهر ستيريوAmScopeSM-8TZ-144S-10M
جل نقل بالموجات فوق الصوتيةواضحة AquasonicAquasonicGelPLI 03-50
تجسيمية للماوس الرقميستوئلينغ51730D
الكحول الإيثيليسيجما459836-2L
الألياف الخفيفة DC950 المنوردولان جينر الصناعاتDC950H
استبدال الزجاج 1.14 ممأدوات الدقةالعالمية 504949
مناديل Kimtech Science Precision مساحات المناديلKimberly Clark Professional5511
Laser Speckle Contrast ImagerToolsMOORFLPI-2
Lasik Eye Spear (100 لكل حالة)  hospeqBV40815
ميكروفيل إبرة مرنةالعالمية أدوات الدقةMF34G-5
الزيوت المعدنيةسيجماM5904
وسادة تسخين الماوسفيشر العلمية50-195-4000
ناير زبدة الكاكاو زبدة مزيل الشعرغسول أمازونASIN ‏ : ‎ B000GCW5CS
NANOLITER 2020 حاقنالعالم للأدوات الدقيقةNANOLITER2020
P-2000 مجتذب الماصةالدقيقة أداةSutter P-2000
Puritan & reg ؛ مسحات ، رأس قطن ، عمود خشبي ، زيوتمعقمة للعين من بيوريتان الطبية806-WC
Medi-Vet11897
UrethaneSigmaU2500
Vetbond Tissue GlueWorld Precision InstrumentsVETBOND
& alpha ؛ -ChloraloseSigma23120
أدوات تشحيم

المراجع

  1. Lassen, N. A., Ingvar, D. H., Skinhøj, E. Brain function and blood flow. Sci Am. 239 (4), 62-71 (1978).
  2. Leenders, K., et al. Cerebral blood flow, blood volume and oxygen utilization: normal values and effect of age. Brain. 113 (Pt 1), 27-47 (1990).
  3. Armstead, W. M. Cerebral blood flow autoregulation and dysautoregulation. Anesthesiolo Clin. 34 (3), 465-477 (2016).
  4. Claassen, J. A., Thijssen, D. H., Panerai, R. B., Faraci, F. M. Regulation of cerebral blood flow in humans: physiology and clinical implications of autoregulation. Physiol Rev. 101 (4), 1487-1559 (2021).
  5. Strandgaard, S., Paulson, O. Cerebral autoregulation. Stroke. 15 (3), 413-416 (1984).
  6. Iadecola, C. The neurovascular unit coming of age: a journey through neurovascular coupling in health and disease. Neuron. 96 (1), 17-42 (2017).
  7. Girouard, H., Iadecola, C. Neurovascular coupling in the normal brain and in hypertension, stroke, and Alzheimer disease. J. Appl. Physiol. 100 (1), 328-335 (2006).
  8. Peppiatt, C. M., Howarth, C., Mobbs, P., Attwell, D. Bidirectional control of CNS capillary diameter by pericytes. Nature. 443 (7112), 700-704 (2006).
  9. Zonta, M., et al. Neuron-to-astrocyte signaling is central to the dynamic control of brain microcirculation. Nat Neurosci. 6 (1), 43-50 (2003).
  10. Girouard, H., et al. Astrocytic endfoot Ca2+ and BK channels determine both arteriolar dilation and constriction. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (8), 3811-3816 (2010).
  11. Grafton, S. T., et al. Functional anatomy of human procedural learning determined with regional cerebral blood flow and PET. J Neurosci. 12 (7), 2542-2548 (1992).
  12. Tillfors, M., et al. Cerebral blood flow in subjects with social phobia during stressful speaking tasks: a PET study. Am J Psychiatry. 158 (8), 1220-1226 (2001).
  13. Goense, J., Merkle, H., Logothetis, N. K. High-resolution fMRI reveals laminar differences in neurovascular coupling between positive and negative BOLD responses. Neuron. 76 (3), 629-639 (2012).
  14. Wang, J., et al. Perfusion functional MRI reveals cerebral blood flow pattern under psychological stress. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (49), 17804-17809 (2005).
  15. Takano, T., et al. Astrocyte-mediated control of cerebral blood flow. Nat Neurosci. 9 (2), 260-267 (2006).
  16. Holstein-Rønsbo, S., et al. Glymphatic influx and clearance are accelerated by neurovascular coupling. Nat Neurosci. 26 (6), 1042-1053 (2023).
  17. Shih, A. Y., et al. Two-photon microscopy as a tool to study blood flow and neurovascular coupling in the rodent brain. J Cereb Blood Flow Metab. 32 (7), 1277-1309 (2012).
  18. Otsu, Y., et al. Calcium dynamics in astrocyte processes during neurovascular coupling. Nat Neurosci. 18 (2), 210-218 (2015).
  19. Cai, C., et al. Stimulation-induced increases in cerebral blood flow and local capillary vasoconstriction depend on conducted vascular responses. Proc Natl Acad Sci U S A. 115 (25), E5796-E5804 (2018).
  20. Xavier, A. L., et al. Cannula implantation into the cisterna magna of rodents. J Vis Exp. (135), e57378(2018).
  21. Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Making patch-pipettes and sharp electrodes with a programmable puller. J Vis Exp. (20), e939(2008).
  22. Liu, X., et al. Epoxyeicosatrienoic acid-dependent cerebral vasodilation evoked by metabotropic glutamate receptor activation in vivo. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 301 (2), H373-H381 (2011).
  23. Yamada, M., et al. Cholinergic dilation of cerebral blood vessels is abolished in M5 muscarinic acetylcholine receptor knockout mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (24), 14096-14101 (2001).
  24. O'Regan, M. Adenosine and the regulation of cerebral blood flow. Neurol Res. 27 (2), 175-181 (2005).
  25. Morii, S., Ngai, A., Ko, K. R., Winn, H. R. Role of adenosine in regulation of cerebral blood flow: effects of theophylline during normoxia and hypoxia. Am J Physiol. 253 (1 Pt 2), H165-H175 (1987).
  26. Park, L., et al. Aβ-induced vascular oxidative stress and attenuation of functional hyperemia in mouse somatosensory cortex. J Cereb Blood Flow Metab. 24 (3), 334-342 (2004).
  27. Park, L., et al. NADPH oxidase-derived reactive oxygen species mediate the cerebrovascular dysfunction induced by the amyloid β peptide. J. Neurosci. 25 (7), 1769-1777 (2005).
  28. Herz, J., et al. GABAergic neuronal IL-4R mediates T cell effect on memory. Neuron. 109 (22), 3609-3618.e9 (2021).
  29. Sun, Y. -Y., et al. Prophylactic edaravone prevents transient hypoxic-ischemic brain injury: implications for perioperative neuroprotection. Stroke. 46 (7), 1947-1955 (2015).

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

حقن الصهريج الكبيرتصوير بقع الليزرالاقتران الوعائي العصبيتنظيم الخلايا الدبقية الصغيرةحقن موسع للأوعية الدمويةمقايسة في الجسم الحيجراحة تثبيت إحداثيتصوير دماغ القوارضحقن داخل الصهريج
فحص التصوير النانوي المزدوج Cisterna Magna و Laser Speckle Contrast Imaging لدراسة تنظيم تدفق الدم الدماغي في الجسم الحي
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.