يحدد هذا البروتوكول إجراء مفصلا لتوليد الخلايا التائية لمستقبلات المستضد الخيمري العابرة (CAR) باستخدام mRNA غير المتكامل للعلاج المناعي للسرطان ويوفر طرقا موثوقة لتقييم خلايا مستقبلات المستضد الخيمري (CAR-T وظيفتها السامة للخلايا).
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
نهج غير فيروسي لتوليد خلايا تائية عابرة لمستقبلات المستضد الخيمري باستخدام mRNA للعلاج المناعي للسرطان
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
برز العلاج بالخلايا التائية لمستقبلات المستضد الخيمري (CAR) كعلاج رائد للسرطان ، حيث حقق نجاحا غير مسبوق في علاج بعض الأورام الخبيثة الدموية مثل الأورام اللمفاوية وسرطان الدم. ومع ذلك ، مع تلقي المزيد من مرضى السرطان علاجات الخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الخيمرية ، يتم الإبلاغ بشكل متزايد عن الأورام الخبيثة الأولية الثانوية المرتبطة بالعلاج جزئيا بسبب إدخال الجينات المعدلة والمستمرة غير المتوقعة لمستقبلات المستضدات المستضدة المستضدة المستضدة ، مما يثير مخاوف خطيرة تتعلق بالسلامة. لمعالجة هذه المشكلة ، نصف هنا نهجا غير فيروسي وغير متكامل لتوليد خلايا CAR-T عابرة باستخدام mRNA. قمنا بالكهرباء للخلايا التائية باستخدام mRNA معدل لتشفير مستقبلات عامل نمو البشرة البشري 2 (HER2) الخاصة ب CAR وأنتجنا خلايا CAR-T عابرة مستهدفة HER2. تم التعبير عن CAR بكفاءة على سطح الخلية التائية بعد يوم واحد من التثقيب الكهربائي ، وزاد باليوم 2 ، وانخفض بشكل كبير بحلول اليوم الخامس. أظهرت خلايا CAR-T العابرة سمية خلوية قوية ضد خلايا سرطان المبيض SKOV-3 الإيجابية HER2 وأفرزت مستويات عالية من IFN-Υ. يوفر هذا البروتوكول دليلا تفصيليا لتطوير خلايا CAR-T عابرة صغيرة الحجم دون تكامل دائم للجينات المعدلة وراثيا ل CAR ، ويصف الإجراءات التفصيلية لإعداد CAR mRNA ، وتنشيط الخلايا التائية وتعداء الخلايا التائية ، وتقييم تعبير CAR ، والتحليل المختبري لوظيفة الخلايا التائية CAR. هذه الطريقة مناسبة لتوليد الخلايا التائية المستضدة المستضدة المستضدة المستضدة في كل من الدراسات قبل السريرية والسريرية.
المقدمة
يعد السرطان تهديدا متزايد الأهمية لصحة الإنسان ، حيث يقدر عدد الحالات المشخصة حديثا سنويا ب 23.6 مليون حالة وفاة على مستوى العالم1. يظل العلاج الجراحي جنبا إلى جنب مع الإشعاع والعلاج الكيميائي هو المعيار الذهبي للرعاية لأنواع مختلفة من السرطانات الموضعية غير الغازية والغازية2،3،4. على الرغم من أن العلاج المنهجي التقليدي قد حقق نجاحا هائلا في إدارة السرطانات في مراحله المبكرة ، إلا أنه شديد السمية وله تأثير محدود على السرطانات النقيليةوالدموية 5. يخضع المرضى المصابون بهذه السرطانات لعلاجات متكررة....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تم عزل PBMCs المستخدمة هنا سابقا من الدم الكامل من مركز الدم بمستشفى ستانفورد وفقا للبروتوكول المعتمد من مجلس المراجعة المؤسسية (IRB) (13942) باستخدام تدرج كثافة Ficoll-Paque الموصوف قبل42. لم تكن الموافقة المستنيرة للمشاركين قابلة للتطبيق لأن الدم الذي استخدمناه لجمع PBMCs تم الحصول عليه تجاريا من مركز الدم بمستشفى ستانفورد.
1. تحضير CAR mRNA
- إعداد القالب
ملاحظة: يمكن أن يكون إما البلازميد الخطي أو جزء PCR بمثابة قالب لتصنيع CAR mRNA في المختبر ، بشرط أن تحتوي على محفز مناسب 5 'SP6 أو T7 ، ومنطقة 5 'غير مترجمة (UTR) ، وجين معدل CAR ، و 3'UTR ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
قمنا ببناء الجيل الثاني من CAR المستهدف HER2 يحتوي على scFv مشتق من الجسم المضاد أحادي النسيلة للفأر المضاد ل HER2 (mAb) 4D547 ، وهو منطقة عبر الغشاء ، ومجال تكلفة داخل الخلايا 4-1BB متبوعا بمجال تنشيط CD3ζ (الشكل 1 أ). احتوى تسلسل الحمض النووي الذي يشفر CAR على محفز SP5 'SP6 لدفع نسخ CAR mRNA في المختبر (الشكل 1 ب). كان طول الرنا المرسال CAR حوالي 2 كيلو بايت ، والذي تم التحقق منه عن طريق الرحلان الكهربائي للهلام (
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
في هذه الدراسة ، نصف نهجا مفصلا غير فيروسي وغير متكامل لتوليد خلايا CAR-T عابرة ونقدم إجراءات فنية لتقييم وظيفة الخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات النوعية. يتجنب هذا النهج استخدام نواقل الفيروسات القهقرية التقليدية والفيروسات العكسية لتوصيل الجينات المعدلة والمستمرة CAR بشكل دائم وعشوائي ، وبدلا من ذلك يستفيد من التثقيب الكهربائي لإدخال CAR mRNA المعدل في المختبر بكفاءة في الخلايا التائية. تتيح هذه الطريقة تعبير CAR عابر عالي المستوى على سطح الخلية التائية ، مما يقلل بشكل كب.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
المؤلفون ليانغ هو ، وروبرت بيراهوفيتش ، ويانوي هوانغ ، وشيمينغ تشانغ ، وجينينج صن ، وشيانغونغ ليو ، وهوا تشو ، وشيرلي ، وشو ، وهاوكي لي ، وفيتا جولوبوفسكايا هم موظفون في ProMab Biotechnologies. Lijun Wu هو موظف ومساهم في ProMab Biotechnologies.
شكر وتقدير
تم دعم هذا العمل من قبل ProMab Biotechnologies.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 7-AAD صبغة الجدوى | Biolegend | 420404 | |
| ACEA Novocyte مقياس التدفق الخلوي | Agilent | NovoCyte 3000 | |
| AIM-V متوسط | Gibco | 12055083 | |
| APC الماعز المضاد للإنسان IgG F (ab') 2 الجسم المضاد | مختبرات Jackson ImmunoResearch | 109-136-097 | |
| إنزيم تقييد BglII | نيو إنجلاند BioLabs (NEB) | R0144L | |
| 3 & حاد ؛ -O-Me-m7G (5 ') PPP (5 ') G RNA Cap هيكل تناظري | NEB | S1411S | |
| DMEM ، ارتفاع نسبة الجلوكوز | Gibco | 11965092 | |
| Dynabeads Human T-Activator CD3 / CD28 الخرز | Gibco | 11131D | |
| E-Plate 96 | Agilent | 5232376001 | |
| Ethanol | Sigma | 459844-4L | |
| FBS Lonza.com | 14-503F | ||
| HiScribe SP6 RNA Synthesis Kit | New England BioLabs (NEB) | E2070S | |
| Human IL-2 Requetinant Protein | Gibco | 15140122 | |
| Millennium RNA Markers | Invitrogen | AM7150 | |
| Monarch RNA Cleanup Kit (500 & mu ؛ ز) | NEB | T2050L | |
| N1-Methylpseudo-UTP | Trilink | N-1081-10 | |
| نيون جهاز تعداء | Invitrogen | MPK5000 | |
| نظام تعداء النيون 100-&mu ؛ L كيت | إنفيتروجين | MPK10096 | |
| البنسلين الستربتومايسين (10000 وحدة / مل) | جيبكو | 14-503F | |
| RPMI 1640 | جيبكو | متوسط 11875135 | |
| التربسين-EDTA (0.05٪) ، الفينول الأحمر | جيبكو | 25300120 | |
| فائق النقاء الفينول: الكلوروفورم: كحول الأيزواميل (25:24: 1 ، الخامس / الحجم) | Invitrogen | 15593049 | |
| xCELLigence أداة تحليل الخلايا في الوقت الحقيقي (RTCA) | Agilent | RTCA MP | |
| ZymoPURE II Plasmid Midiprep Kit | Zymo Research | D4201 |
المراجع
- Ataeinia, B., et al. National and subnational incidence, mortality, and years of life lost due to breast cancer in iran: Trends and age-period-cohort analysis since 1990. Front Oncol. 11, 561376(2021).
- Jordan, R. M., Oxenberg, J.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
