مقالة منهجية

الفحص في المختبر القائم على LED لتقييم الجزيئات القابلة للتنشيط الضوئي في التعطيل الضوئي البكتيري

DOI:

10.3791/67550

⸱

يناير 24, 2025

 , 
1REQUIMTE/LAQV, Department of Chemistry and Biochemistry, Faculty of Sciences, University of Porto

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول طريقة مباشرة واقتصادية لتقييم فعالية المحسسات الضوئية المحتملة في التعطيل الضوئي الديناميكي المضاد للبكتيريا (aPDI) ، باستخدام تنسيق لوحة 96 بئرا جنبا إلى جنب مع مصدر ضوء لوحة LED. يتيح هذا النهج الاختبار المتزامن لظروف تجريبية متعددة ، بما في ذلك التركيزات والمركبات المختلفة والسلالات البكتيرية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أدى ظهور العدوى المقاومة للأدوية المتعددة وعدم وجود فئات جديدة من المضادات الحيوية إلى تجديد الاهتمام بالعلاجات البديلة مثل التعطيل الضوئي الديناميكي للبكتيريا (aPDI). تتضمن هذه العملية إعطاء محسس ضوئي (PS) يتم تنشيطه بواسطة مصدر ضوء مرئي مناسب ، مما ينتج عنه مستويات متفاقمة من أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) التي تلحق الضرر بالجزيئات الحيوية الخلوية الهامة ، مما يؤدي في النهاية إلى موت الخلايا البكتيرية. من الأهمية بمكان إنشاء اختبارات أولية موحدة وسهلة الاستخدام وقابلة للتكرار لتقييم ومقارنة فعالية السمية الضوئية الناجمة عن الضوء للحساسات الضوئية المحتملة. تقدم هذه الدراسة تقنية بسيطة وفعالة في المختبر لتقييم النشاط الضوئي الديناميكي ضد الخلايا البكتيرية العوالق. من خلال استخدام تنسيق صفيحة دقيقة 96 بئرا جنبا إلى جنب مع لوحة LED كبيرة ، يسهل النظام التقييم المنهجي للمركبات المختلفة. يسمح هذا التكوين بفحص عالي الإنتاجية للحساسات الضوئية المحتملة في بيئة خاضعة للرقابة ومتسقة ، مما يبسط عملية تحديد المرشحين الواعدين لمزيد من التطوير. تعد هذه المنصة المرنة خطوة مهمة في تطوير العلاجات الضوئية الديناميكية المبتكرة لإدارة العدوى المقاومة للمضادات الحيوية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

العلاج الضوئي الديناميكي (PDT) هو نهج علاجي طفيف التوغل أظهر نتائج واعدة في السنوات الأخيرة ، لا سيما في العلاج السريري للأمراضالجلدية 1. أحد المجالات المثيرة للاهتمام بشكل خاص لتطبيق هذه الطريقة العلاجية هو علاج الالتهابات الميكروبية ، وهي عملية تعرف باسم التعطيل الضوئي الديناميكي المضاد للميكروبات (aPDI) 2. على الرغم من التغاضي عنه في البداية ، ويرجع ذلك في الغالب إلى الكفاءة الملحوظة للمضادات الحيوية ، إلا أن استئصال نمو البكتيريا بالضوء خضع لاهتمام متجدد خلال السنوات الأخيرة ، مدفوعا بظهور مقاومة مضادات الميكروبات للأدوية المتعددة (AMR) والحاجة إلى إيجاد استراتيجيات بديلة وفعالة لمعالجة هذا القلق المتعلق بالصحة العامة3،4. يمكن تحقيق نتائج مهمة في غضون ثوان أو دقائق ، مع توفير الدقة المكانية والزمانية من خلال تشعيع منطقة الاهتمام وميزة التشغيل / الإيقاف للإجراء على وجه التحديد ، على التوالي.

تعتمد الآلية الكامنة وراء مبدأ الديناميكا الضوئية على مزيج من الجزيئات الحساسة للضوء (المحسس الضوئي) والأكسجين الجزيئي ومصدر الضوء الخارجي. على الرغم من أن هذه المكونات الثلاثة غير ضارة ، إلا أنها قد تصبح قاتلة للخلايا المستهدفة عند دمجها بسبب التنشيط الضوئي للمحسس الضوئي. تؤدي التفاعلات التي يسببها الضوء إلى جيل هائل من أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) ، والتي تسبب في النهاية أضرارا جسيمة لا رجعة فيها في المكونات الخلوية الهامة ، مما يؤدي إلى موت الخلايا5،6. أيضا ، أظهر الجمع بين aPDI والعلاجات التقليدية الأخرى المضادة للميكروبات نتائج علاجية واعدة ، بما في ذلك فعالية العلاج العالية ، وتقليل وقت العلاج ، وجرعات أقل منالأدوية 7.

علاوة على ذلك ، فإن الإدارة الموضعية للحساسات الضوئية (PS) في PDT تسمح بالعلاج المستهدف مع الحد الأدنى من الضرر للأنسجة المحيطة والتأثيرات الجهازية المنخفضة ، مما يجعله خيارا يحظى بتقدير كبير لعلاج التهابات الجلد السطحية8. إن راحة العلاج الموضعي والطبيعة السطحية للعديد من الالتهابات والآفات الجلدية تجعله هدفا جذابا ل PDT. دعمت الدراسات فعالية aPDI في علاج التهابات الحروق والتهابات الجروح الجراحية والآفات المتقرحة والأمراض السطحية الأخرى مثل حب الشباب والقوباء9،10،11.

تم اختبار العديد من الجزيئات ، الطبيعية والاصطناعية ، واقتراحها ل aPDI. ومع ذلك ، فإن استخدام معلمات مختلفة وغير محددة في كثير من الأحيان في البروتوكولات التجريبية يجعل من الصعب مقارنة النتائج ، مما يؤثر على وضوح النتائج العلمية. يمكن أن يؤدي تطوير اختبارات بسيطة وقابلة للتكرار إلى تسهيل الفحص السريع للعديد من المركبات ، مما يؤدي إلى تسريع تحديد المرشحين الواعدين. تعتبر البروتوكولات المباشرة والقابلة للتكرار والفعالة من حيث التكلفة ذات قيمة خاصة في الاختبارات في المراحل المبكرة ، لأنها تتيح مقارنة النتائج عبر مرافق البحث المختلفة. تسهل عمليات الفحص الفعالة أيضا استكشاف مجموعة واسعة من الجزيئات ، مما قد يؤدي إلى اكتشاف واختيار محسسات ضوئية جديدة لمزيد من الاختبارات في منهجيات أكثر تقدما وتعقيدا وتكلفة.

يحدد هذا البروتوكول طريقة مباشرة لتقييم السمية الضوئية للحساسات الضوئية المحتملة على البكتيريا باستخدام لوحة LED بكثافة ضوء تبلغ 25 ميجاواط / سم2. تم استخدام سلالة بكتيرية تمثيلية ، S. aureus ، وتم اختيار قناة الضوء الأبيض ، مما يوفر تغطية كاملة للطيف المرئي. تضمن الإجراء فترة ما قبل الحضانة لمدة 30 دقيقة تليها التعرض للضوء لمدة 15 دقيقة (22.5 جول / سم2). بينما تستند النتائج إلى هذه الظروف التجريبية المحددة ، يمكن تخصيصها وفقا للبروتوكولات الفردية. من الضروري تحديد هذه الإعدادات بوضوح وإدراجها في الوصف الإجرائي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم توضيح الوصف العام للبروتوكول في الشكل 1. تفاصيل الكواشف والمعدات المستخدمة مدرجة في جدول المواد.

1. إعداد الثقافة البكتيرية

  1. تنمو بكتيريا المكونويات الذهبية (ATCC 29213) على أجار مولر هينتون (MH) من مزارع المخزون. احتضان ألواح MH عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة قبل الفحص للحصول على مزارع جديدة.
  2. تلقيح البكتيريا: اجمع 2-3 مستعمرات جديدة من صفيحة أجار وخفف في 6 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) الرقم الهيدروجيني 7.4 ، مفلتر معقم.
  3. دوامة (1200 دورة في الدقيقة) اللقاح 3-4 مرات لضمان التجانس المناسب للعينة. اسحب 3 مل إلى كوفيت يمكن التخلص منه.
  4. قم بقياس OD600 واضبطه على 0.1 (حوالي 1 × 108 CFU / مل) باستخدام PBS.
    ملاحظة: يمكن أن يختلف تحويل OD إلى CFU الدقيق بناء على سلالة المكورات العنقودية الذهبية. يمكن للمرء أن ينشئ منحنى نمو قياسي للسلالة المحددة والظروف التجريبية المعملية التي تعمل معها.

2. إعداد المحسس للضوء

  1. محلول المخزون: قم بإعداد محلول مخزون لمركب الحساسية الضوئية (انظر قسم النتائج للحصول على التفاصيل) في مذيب مناسب (على سبيل المثال ، DMSO أو PBS ؛ الشكل 2).
  2. حل العمل: تمييع محلول المخزون في PBS. يضمن استخدام PBS بدلا من وسائط الثقافة البكتيرية عدم تداخل مكونات الوسائط مع امتصاص الضوء أثناء تجارب aPDI.
  3. دوامة العينة لضمان التجانس الكامل. استخدم حماما بالموجات فوق الصوتية إذا لزم الأمر لضمان الذوبان الكامل وتحقيق حل واضح (في هذه الحالة ، تحكم بعناية. بالنسبة للمركبات الكارهة للماء ، قد تكون هناك حاجة إلى تعديل نظام المذيبات (على سبيل المثال ، إضافة نسبة مئوية من DMSO أو الإيثانول). تأكد من فحص تأثير المذيب على قابلية الخلية دائما.
    ملاحظة: ستختلف شروط الصوتنة اعتمادا على نوع المركب والتركيز ومذيب النظام. قد تكون الأوقات الأقصر (على سبيل المثال ، 5 دقائق) كافية للمركبات القابلة للذوبان بسهولة ، بينما قد تكون هناك حاجة إلى أوقات أطول (20-30 دقيقة) للمركبات شديدة المساء.

3. إعداد اللوحة

  1. قم بإعداد طبقين منفصلين من 96 بئرا: أحدهما للتعرض للضوء والآخر للاحتفاظ به في الظلام (التحكم في الظلام).
  2. في كل لوحة من الألواح ، امزج 100 ميكرولتر من محلول المحسس للضوء مع 100 ميكرولتر من المعلق البكتيري. الماصة لأعلى ولأسفل 5-10 مرات.
  3. احتضان الصفائح عند 37 درجة مئوية لفترة زمنية محددة مسبقا (في هذه الدراسة ، تم استخدام فترة 30 دقيقة) للسماح للمحسس للضوء بالتفاعل مع الخلايا البكتيرية.

4. التشعيع

  1. قم بإزالة الألواح من الحاضنة وعرض إحداها للضوء المنبعث من لوحة LED (يتكون الجهاز المستخدم في هذه التجربة من جهاز عرض LED مستطيل بقوة 50 واط ؛ IP65 ؛ جهد الإدخال: تيار متردد 85-265 فولت) ، مما يحافظ على الآخر محميا من التعرض للضوء.
  2. ضع إحدى اللوحات فوق لوحة LED. لضمان الضبط الدقيق للوحة من خلال العديد من تكرارات البروتوكول ، ضع علامة على حواف اللوحة المكونة من 96 بئرا مباشرة على سطح LED.
  3. كشف اللوحة لوقت تشعيع مناسب (في هذه الدراسة ، تم استخدام فترة 15 دقيقة).
    ملاحظة: تأكد من أن جرعة الضوء كافية لتنشيط المحسس الضوئي دون المساس بصلاحية الخلية. لهذا السبب ، يجب تضمين التحكم في الضوء (البكتيريا المعرضة للضوء في حالة عدم وجود محسس للضوء).

5. ما بعد التشعيع وأخذ عينات لوحة أجار

  1. استخدم لوحا آخر مكون من 96 بئرا لإعداد التخفيفات التسلسلية للعينات (الآبار الضابطة وغير المشعة والمشععة).
  2. أضف 180 ميكرولتر من PBS / بئر وفقا لعدد العينات. لتحديد التصميم بشكل صحيح ، ضع في اعتبارك أن هناك حاجة إلى صف من 6 آبار للتخفيف التسلسلي لعينة واحدة (التخفيف 10 أضعاف ، من 10-1 إلى 10-6).
  3. Aliquot 20 ميكرولتر من كل بئر (من الصفيحة المشععة وغير المشععة المكونة من 96 بئر) إلى العمود الأول من اللوحة المملوءة مسبقا ب PBS.
  4. باستخدام الماصة الدقيقة متعددة القنوات، قم بإجراء تخفيف تسلسلي بسيط من البئر 1 إلى 6 (10-1 إلى 10-6). ملاحظة: يعد تجانس العينة أمرا بالغ الأهمية في هذه المرحلة لضمان خليط موحد ومتسق. في كل خطوة تخفيف، قم بتحريك الماصة لأعلى ولأسفل 5-10 مرات.
  5. قسم لوحة الأجار إلى ستة أجزاء متساوية ، كل قسم يتوافق مع أحد التخفيفات (انظر الشكل 3).
  6. اقتبس 10 ميكرولتر من كل بئر على القسم المقابل على سطح صفيحة الأجار (لكل عينة ، قم بتضمين 3 تكرارات على الأقل). تجنب وضع الحصص بالقرب من بعضها البعض. انقل ألواح الأجار برفق إلى الحاضنة وانتظر لمدة 18-20 ساعة.
    ملاحظة: ضع في اعتبارك أن مورفولوجيا CFUs تختلف اختلافا كبيرا تبعا لأنواع البكتيريا. على سبيل المثال ، في حين أن المكورات العنقودية الذهبية من السهل نسبيا عد مستعمرات ، فإن المتصورة الزنجارية تميل إلى تكوين مستعمرات أكثر انتشارا. يمكن تعديل عدد التكرارات مع الأخذ في الاعتبار ذلك.

6. تحديد الجدوى الخلوية (عد وحدات تشكيل المستعمرة)

  1. قم بإزالة ألواح الأجار من الحاضنة وحدد المناطق المناسبة لعد الخلايا.
    ملاحظة: تجنب العد داخل الأقسام ذات المستعمرات الوفيرة والمتداخلة وغير المحددة جيدا.
  2. داخل كل قسم ، احسب عدد وحدات تشكيل المستعمرة (CFUs) وحدد متوسط 3 مكررات
  3. قم بتحويل عدد CFU المحسوبة إلى CFU / مل ، واضرب متوسط العد في عامل التخفيف والتقسيم في حجم الثقافة المطلية بالمل.

7. تحليل البيانات

  1. تحويل بيانات CFU / mL إلى المقياس اللوغاريتمي وتمثيل الجدوى الخلوية في السجل10 |CFU / مل | كدالة للتركيز الذي تم اختباره.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

مركبات الفلافيليوم القائمة على الأمينو (الشكل 2): 7-ثنائي إيثيل أمينو -4 ′-ثنائي ميثيل أمينوفلافيليوم (7NEt24′NMe 2) ، 7-ثنائي إيثيل أمينو -2- (ثنائي ميثيل أمينوستيريل) -1-بنزوبيريليوم (7NEt2st4′NMe 2) ، 7-ثنائي إيثيل أمينو -4 ′-أمينوفلافيليوم (7NEt24′NH2) و 7-ثنائي إيثيل أمينو -4 ′-هيدروكسي فلافيليوم (7NEt24′OH) ، التي تمت مناقشة طبيعتها المستجيبة للضوءسابقا 12،1...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

على الرغم من أن هذا البروتوكول يعمل كمنصة اختبار للمرحلة الأولية ، إلا أنه من المهم النظر في ظروف اختبار أكثر جدوى لعلاج الالتهابات الميكروبية في مرحلة دراسة أكثر تقدما. عند تقييم فعالية aPDI ، يجب إجراء تجارب على المنظمات البكتيرية من نوع الأغشية الحيوية بدلا من البكتيريا العوالق. تتضمن العديد من الحالات السريرية كائنات دقيقة منظمة في هذا التشكل الأكثر مقاومة ، مثل الجروح المزمنة والتليف الكيسي وعلى الأجهزة الطبية المزروعة14.

من المهم ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل ماليا من قبل مشروع FCT FERMEN. إلى - الأطعمة المخمرة للنضال MEtabolic syNdrome. نهج ديناميكي متكامل في المختبر (2023.00164.RESTART). تم دعم هذا العمل من قبل المختبر المساعد للكيمياء الخضراء - LAQV (LA/P/0008/2020 https://doi.org/10.54499/LA/P/0008/2020; UIDP / 50006/2020 https://doi.org/10.54499/UIDP/50006/2020 ؛ UIDB/50006/2020 https://doi.org/10.54499/UIDB/50006/2020) التي تمولها الصناديق الوطنية من FCT/MCTES. تشكر PC منحة الدكتوراه من FCT (SFRH / BD / 150661/2020). تعترف إيفا فرنانديز بعقد الأستاذ المساعد (https://doi.org/10.54499/CEECINST/00064/2021/CP2812/CT0004).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
كاري 60 UV-Vis مقياس الطيفAgilentG6860A
ثنائي ميثيل سلفوكسيدسيجما-ألدريتشD8418
كوفيت يمكن التخلص منه PMMABRAND GMBH + CO KG759030
Eppendorfs (500 مل) أنابيب15625367فيشر
Scientific (15 مل) أنابيبCorning430791
Falcon ( 50 مل)Corning430291
LED IP65 50W
Micropippete (100 uL)Transferpette S705874
Micropippete (1000 uL)Transferpette S705880
Mueller Hinton agar OxoidCM0405
pippete متعدد القنوات 12 قناةTransferpette S
Nunc MicroWell 96-Well MicroplatesThermo Scientific260844
Phospate أقراص ملحية مخزنة درجة الحموضة 7.4Panreac ApplichemA9177
ماصات مصلية (10 مل)Thermo Scientific170356N
ماصات مصلية (5 مل)Thermo Scientific170366N
طبق ثقافةالأنسجة TPP Techno Plastic Products AG93150
الضوئي الصقر لوحة

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Correia, J. H., Rodrigues, J. A., Pimenta, S., Dong, T., Yang, Z. Photodynamic therapy review: principles, photosensitizers, applications, and future directions. Pharmaceutics. 13 (9), 1332(2021).
  2. Hamblin, M. R. Antimicrobial photodynamic inactivation: A bright new technique to kill resistant microbes. Curr Opin Microbiol. 33 (6), 67-73 (2016).
  3. Aroso, R. T., Oliveira, S. M., Almeida, A., Carvalho, C. M. B. Photodynamic disinfection and its role in controlling infectious diseases. Photochem Photobiol Sci. 20 (11), 1497-1545 (2021).
  4. Rapacka-Zdończyk, A., Woźniak, A., Podbielska, H., Kasprzycka, A. Factors determining the susceptibility of bacteria to antibacterial photodynamic inactivation. Front Med. 8, 733501(2021).
  5. Dolmans, D. E. J. G. J., Fukumura, D., Jain, R. K. Photodynamic therapy for cancer. Nat Rev Cancer. 3 (5), 380-387 (2003).
  6. Lima, E., Reis, L. V., Silva, A. L. C., Carvalho, M. T. Photodynamic therapy: From the basics to the current progress of N-heterocyclic-bearing dyes as effective photosensitizers. Molecules. 28 (13), 5103(2023).
  7. Pérez-Laguna, V., Pérez-Artiaga, L., Royo-Díaz, D., Gilaberte, Y. A combination of photodynamic therapy and antimicrobial compounds to treat skin and mucosal infections: A systematic review. Photochem Photobiol Sci. 18 (5), 1020-1029 (2019).
  8. Babilas, P., Karrer, S., Szeimies, R. M. Photodynamic therapy in dermatology: state-of-the-art. Photodermatol Photoimmunol Photomed. 26 (3), 118-132 (2010).
  9. Pérez-Laguna, V., Pérez-Artiaga, L., Gilaberte, Y. Photodynamic therapy combined with antibiotics or antifungals against microorganisms that cause skin and soft tissue infections: a planktonic and biofilm approach to overcome resistances. Pharmaceutics. 14 (6), 1-16 (2021).
  10. Almenara-Blasco, M., López-Roca, A., Pérez-Sanchez, A., Valiente, R. Antimicrobial photodynamic therapy for dermatological infections: current insights and future prospects. Front Photobiol. 2, 773502(2024).
  11. de Oliveira, A. B., Reis, C., Soares, M. T., Batista, S. L. Photodynamic therapy for treating infected skin wounds: a systematic review and meta-analysis from randomized clinical trials. Photodiagnosis Photodyn Ther. 40 (5), 103-118 (2022).
  12. Correia, P., Oliveira, S. R., Batista, A. L. Light-activated amino-substituted dyes as dual-action antibacterial agents: bio-efficacy and AFM evaluation. Dyes Pigm. 224, 111975(2024).
  13. Oliveira, H., Santos, A. R., Costa, L. M. Photoactivated cell-killing amino-based flavylium compounds. Sci Rep. 11 (1), 22005(2021).
  14. Sharma, S., Singh, V., Kaur, S., Mehta, A. Microbial biofilm: A review on formation, infection, antibiotic resistance, control measures, and innovative treatment. Microorganisms. 11 (6), 1614(2023).
  15. Barolet, D., Christiaens, F., Misery, L. Light-emitting diodes (LEDs) in dermatology. Semin Cutan Med Surg. 27 (3), 227-238 (2009).
  16. Algorri, J. F., López-Higuera, J. M., Rodríguez-Cobo, L., Cobo, A. Advanced light source technologies for photodynamic therapy of skin cancer lesions. Pharmaceutics. 15 (7), 2075(2023).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

LED Staphylococcus Aureus 96

مقالات ذات صلة