الكشف عن الأجسام المضادة الذاتية المضادة ل MDA5 باستخدام خلايا HeLa والكيمياء الخلوية المناعية باستخدام المجهر الضوئي

اعتلال عضلي التهابي مجهول السبب (IIM) ، يشار إليه عادة باسم التهاب العضلات ، هو مجموعة غير متجانسة من اضطرابات المناعة الذاتية التي تتميز بالتهاب العضلات المزمن والمظاهر السريرية المتغيرة والنتائج العلاجية المتنوعة. تشمل الأعراض الشائعة ضعف العضلات وانخفاض القدرة على التحمل والألم العضلي¹. تشمل الأنواع الفرعية الأساسية ل IIM التهاب العضلات (PM) والتهاب الجلد والعضل (DM) ، بينما يتميز التهاب الجلد والعضل العاطفي سريريا (CADM) بطفح جلدي مميز مشابه لتلك التي تظهر في DM ولكن مع الحد الأدنى من الإصابة بالعضلات أو بدونها. من المضاعفات الرئيسية في PM، و DM، و CADM مرض الرئة الخلالي (ILD)، الذي يصيب ما يقرب من 40٪ من المرضى ويرتبط بزيادة الوفيات².

يختلف المسار السريري وتشخيص ILD في IIM اختلافا كبيرا. يميل ILD المرتبط ب DM و CADM (DM- / CADM-ILD) إلى أن يكون أكثر مقاومة للعلاج ويحمل تشخيصا أسوأ مقارنة ب ILD المرتبط ب PM. من بين هذه المرض، مرض ILD الحاد أو تحت الحاد، الذي يتطور بسرعة في غضون ثلاثة أشهر³، شديد بشكل خاص، حيث يبلغ معدل البقاء على قيد الحياة لمدة خمس سنوات 52٪ فقط، مقارنة ب 87٪ لمرض ILD المزمن الذي يتطور ببطء أو يظل مستقرا. يتميز ILD سريع التدريجي (RP-ILD) ، وهو نوع فرعي من ILD الحاد / تحت الحاد ، ببداية سريعة لضيق التنفس وتلف السنخية الواسع النطاق المرئي في تصوير الصدر. RP-ILD هي حالة تهدد الحياة مع تشخيص ضعيف ، مما يؤكد الحاجة الملحة للتشخيص المبكر والتدخل الفوري لتحسين نتائج المرضى^4،5،6.

ظهرت الأجسام المضادة الذاتية الخاصة بالتهاب العضلات (MSAs) كمؤشرات حيوية حاسمة في ILD المرتبط بالتهاب العضلات ، حيث تلعب الأجسام المضادة الذاتية المضادة ل MDA5 دورا مهما بشكل خاص. يتم اكتشاف هذه الأجسام المضادة الذاتية بشكل متكرر في المرضى الذين يعانون من PM- / DM- / CADM-ILD وتعمل كمؤشرات تنبؤية مهمة ل RP-ILD^7،8،9. MDA5 (الجين 5 المرتبط بتمايز الورم الميلانيني) هو مستقبل للتعرف على نمط العصارة الخلوية مشفر بواسطة جين محفز للإنترفيرون يكتشف الحمض النووي الريبي الفيروسي والميتوكوندريا مزدوج الشريطة ، مما يبدأ الاستجابات المناعية بوساطة الإنترفيرون¹⁰. على الرغم من أن الآليات المسببة للأمراض الدقيقة لا تزال غير واضحة ، يعتقد أن الأجسام المضادة الذاتية المضادة ل MDA5 تعطل وظيفة MDA5 ، مما يساهم في التسبب في أمراض المناعة الذاتية.

يعد الكشف في الوقت المناسب عن الأجسام المضادة المضادة ل MDA5 أمرا ضروريا للتحديد المبكر وإدارة RP-ILD. تقليديا ، يعتبر الترسيب المناعي (IP) الذي يحمل علامة إشعاعية باستخدام ³⁵مستخلصا من خلايا K562 المسمى S-methionine المعيار الذهبي للكشف عن الأجسام المضادة المضادة ل MDA5¹¹. ومع ذلك ، فإن هذه الطريقة غير عملية للاستخدام السريري الروتيني نظرا لتكلفتها العالية ، والاعتماد على المعدات المتخصصة والموظفين المدربين ، واللوائح الصارمة للتخلص من النفايات المشعة ، والعمر الافتراضي المحدود للكواشف المشعة. في الممارسة السريرية ، تستخدم فحوصات اللطخة بشكل شائع كبدائل. ومع ذلك ، فهي مرتبطة بمعدل إيجابي كاذب مرتفع للأجسام المضادة الذاتية المضادة ل MDA5^12،13 ، مما يثير مخاوف بشأن دقة التشخيص. وبالتالي ، هناك حاجة ملحة لمقايسة تأكيدية موثوقة وغير مشعة للتحقق من صحة النتائج الإيجابية وتحسين الثقة في التشخيص.

لمعالجة هذه الفجوة ، نقترح استخدام الكيمياء المناعية (ICC) كاختبار تأكيدي تكميلي للأجسام المضادة الذاتية المضادة ل MDA5. يتضمن هذا النهج نقل خلايا HeLa ببنية MDA5 ، واحتضان الخلايا ببلازما المريض ، والكشف عن الأجسام المضادة الذاتية المضادة ل MDA5 المرتبطة باستخدام الأجسام المضادة الثانوية المترافقة بالإنزيم (على سبيل المثال ، بيروكسيداز الفجل) جنبا إلى جنب مع ركيزة كروموجينية للتصور تحت الفحص المجهري الضوئي. يوفر ICC منصة غير مشعة وحساسة للغاية وموحدة لتصور الأجسام المضادة الذاتية المضادة ل MDA5 داخل المقصورات الخلوية. من خلال دمج ICC مع مقايسة اللطخة ، تهدف هذه الطريقة إلى تقليل معدلات الإيجابية الكاذبة ، وتحسين دقة التشخيص ، وفي النهاية تعزيز الإدارة السريرية والنتائج للمرضى.

الهدف من هذه الدراسة هو إنشاء بروتوكول قوي غير مشع للكشف عن الأجسام المضادة الذاتية المضادة ل MDA5 ، ومعالجة قيود طرق الكشف الحالية وتزويد الأطباء بأداة عملية وموثوقة للتشخيص المبكر ل RP-ILD في المرضى الذين يعانون من PM, DM, و CADM. في سرد الفيديو المصاحب ، توصف هذه الدورة التي تهدد الحياة بالعامية بأنها "موت سريع". علميا ، يتوافق مع ILD سريع التطور (RP-ILD). يعتمد هذا العمل على الأدلة الموجودة ولديه القدرة على تحسين التقييم التنبؤي واتخاذ القرارات العلاجية بشكل كبير في الممارسة السريرية.

1. زراعة الخلايا والتعدي

1. حافظ على خلايا HeLa باستخدام وسط النسر المعدل من Dulbecco الذي يحتوي على 10٪ مصل أبقار جنيني (FBS) و 1٪ مضاد حيوي مضاد للفطريات عند 37 درجة مئوية في جو مرطب بنسبة 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ .
2. مرر الخلايا كل 2-3 أيام أو عندما تصل الخلايا إلى 90٪ -100٪ التقاء
3. البذور 7 × 10⁴ خلايا HeLa في كل بئر من صفيحة مكونة من 24 بئرا (1.9 سم² / بئر) قبل 24 ساعة من التعداء للسماح للخلايا بالوصول إلى ما يقرب من 90٪ من التقاء الهاتف.
4. تمييع 500 نانوغرام من البلازميد (pENTER-MDA5) و 1.5 ميكرولتر من كاشف تعداء كل في 25 ميكرولتر من وسط المصل المخفض.
5. أضف الحمض النووي المخفف إلى كاشف تعداء مخفف (نسبة 1: 1). تخلط جيدا وتحتضن لمدة 5 دقائق.
6. أضف الخليط إلى الخلايا المزروعة قبل يوم واحد وقم بتحريك لخلط مركب الحمض النووي والدهون على الفور. تأكد من أن الخلايا متقاربة بنسبة 80٪ -90٪.
7. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية_{في غلاف} جوي مرطب بنسبة 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 24 ساعة وتابع إجراء ICC.
   ملاحظة: استخدمنا ناقلا متاحا تجاريا (pEnter-MDA5) ؛ يمكن العثور على مزيد من المعلومات في جدول المواد. فعالية تعداء ~ 50٪.
   يمكن تحديد نجاح تعداء البروتين المستهدف والتعبير عنه عن طريق نقل الخلايا باستخدام بلازميد يعبر عن البروتين الفلوري وإجراء وصمة عار غربية لتصور التعبير عن البروتين المستهدف.

2. تثبيت الخلية

1. بعد الحضانة ، اغسل الخلايا 2x باستخدام PBS لإزالة أي وسائط متبقية.
   ملاحظة: يمكن إجراء الغسيل عن طريق هز اللوحة على شاكر مداري.
2. ثبت الخلايا في 4٪ بارافورمالديهايد في برنامج تلفزيوني. اترك الخلايا لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
   تنبيه: بارافورمالديهايد سام. استخدم إرشادات المناولة المناسبة.
3. استنشق الكاشف المثبت واستخدم PBS لغسل الخلايا 2x.

3. نفاذية الخلية

1. أضف كاشف Triton X-100 (0.3٪ في PBS) واترك الخلايا لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
2. بعد 10 دقائق ، تخلص من المنظف.
3. أضف PBS لغسل الخلايا مرة واحدة.

4. حجب الخلايا

1. قم بإجراء الحجب باستخدام مصل أبقار الجنين بنسبة 10٪ في PBS (1x) واحتضان الخلايا لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
2. قم بإزالة الكاشف الحاجب ، ثم أضف PBS لغسل الخلايا مرة واحدة.

5. تهجين الجسم المضاد للمريض

1. أضف بلازما المريض المخففة إلى الخلايا. تأكد من تخفيف عينة المريض (1: 5,000 تخفيف في PBS) في PBS قبل الاستخدام.
   ملاحظة: اضبط التخفيف لتحسين الإشارة أو تقليل الخلفية حسب الحاجة. لضمان نتائج غير متحيزة ، لم يكن لدى الموظفين الذين أجروا الاختبارات أي معرفة بالعينات التي تخص المرضى وأيها من أفراد أصحاء.
2. احتضان العينة عند 4 درجات مئوية لمدة 12-16 ساعة (بين عشية وضحاها).
3. بعد فترة الحضانة ، قم بإزالة عينة المريض وغسل الخلايا 3x باستخدام PBS.

6. تهجين الأجسام المضادة الثانوية

1. عالج الخلايا باستخدام IgG المضاد للإنسان المترافق بالفجل المخفف ب IgG المضاد للإنسان (تخفيف 1: 250 في برنامج تلفزيوني) ، واترك الخلايا لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
2. بعد ساعة ، تخلص من الأجسام المضادة الثانوية.
3. اشطفيه باستخدام PBS 3x.

7. تلطيخ الخلية

1. بعد غسل الخلايا ، قم بتلطيخ الخلايا ب 300 ميكرولتر من محلول العمل DAB / البئر.
   ملاحظة: تم تحضير هذا المحلول عن طريق خلط مركز الكروموجين DAB ومخفف DAB وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
2. بعد تلطيخ الخلايا لمدة 5 دقائق ، قم بإزالة الصبغة ، واشطفها بالماء المقطر منزوع الأيونات ، ورجها لمدة 5 دقائق.

8. تلطيخ الخلية

1. قم بتلطيخ نواة الخلية بالهيماتوكسيلين المخفف.
   ملاحظة: نستخدم Hematoxylin Gill II في تخفيف 10 أضعاف وننتظر لمدة 5 دقائق لعملية التلوين.
2. بعد 5 دقائق ، تخلص من الهيماتوكسيلين ، ثم اغسله بالماء المقطر منزوع الأيونات لمدة 2 × 5 دقائق.

9. الملاحظة

1. راقب نتائج التلوين باستخدام المجهر الضوئي.
   ملاحظة: يظهر الإيجابي الحقيقي تلطيخا بنيا قويا داخل خلايا HeLa تعبر عن MDA5 ؛ هذا يؤكد الأجسام المضادة المضادة ل MDA5 في عينة المريض. تظهر النتيجة السلبية خلايا HeLa بدون تلطيخ بني ، مما يشير إلى عدم وجود أجسام مضادة ذاتية مضادة ل MDA5. تظهر النتيجة الإيجابية الكاذبة تلطيخا بنيا واسعا في جميع الخلايا بغض النظر عن تعبير MDA5. يجب تمييز هذا التلوين غير المحدد ، الذي يظهر في حالات المناعة الذاتية الأخرى ، عن الإيجابية الحقيقية لتجنب التشخيص الخاطئ.

تم تعمية الموظفين الذين أجروا الاختبارات عن هويات العينات ، بما في ذلك المرضى المحددين الذين تم الحصول عليها منهم ، لتقليل التحيز المحتمل في عملية التقييم. ومع ذلك ، في حين أن عينات التحكم الصحية لم تتعرض للعمى ، إلا أنها أسفرت باستمرار عن نتائج واضحة لا لبس فيها.

يوضح الشكل 1 أ التعبير الناجح عن MDA5 في خلايا HeLa المنقولة باستخدام بنية pENTER-MDA5. للتحقق من كفاءة تعداء التعدي ، تم إجراء ICC باستخدام جسم مضاد تجاري مضاد ل MDA5. لوحظ تلطيخ سيتوبلازم بني قوي في حوالي 50٪ من الخلايا المنقولة ، مما يشير إلى تعبير قوي عن بروتين MDA5. في المقابل ، لم تظهر الخلايا غير المنقولة التي تمت معالجتها في ظل ظروف متطابقة أي تلطيخ سيتوبلازمي ، مما يؤكد خصوصية الجسم المضاد وغياب تعبير MDA5 الداخلي.

باتباع بروتوكول ICC ، أظهرت عينات تمثيلية من المرضى المضادين ل MDA5 الإيجابيين ، والتي تم تأكيدها بواسطة الترسيب المناعي المسمى إشعاعا ، تلطيخا سيتوبلازميا بنيا واضحا في خلايا HeLa التي تعبر عن MDA5 ، بينما ظلت الخلايا غير المنقولة غير ملطخة (الشكل 1 ب). يشير نمط التلوين هذا إلى وجود أجسام مضادة ذاتية مضادة ل MDA5 في بلازما المريض ويتماشى مع الكشف القياسي الذهبي المعمول به باستخدام 35مستخلصا من خلايا K562 المسمى S-methionine.

يتم تلخيص خصائص المريض في الجدول التكميليS1 ، الذي يحدد التشخيصات السريرية ، وحالة الأجسام المضادة ل MDA5 ، والتصنيف إلى ثلاث مجموعات: مضاد MDA5 إيجابي ، وإيجابي كاذب ، وتحكم صحي. بالإضافة إلى حالة الأجسام المضادة ، يلخص الجدول التكميلي S1 الآن أيضا التركيبة السكانية للمريض ، بما في ذلك العمر والجنس والتشخيص الأساسي لكل مجموعة. تم تصنيف تفاعل الأجسام المضادة شبه كمية على أنه ضعيف (1+) أو معتدل (2+) أو قوي (3+) بناء على شدة النطاق ، مما يعكس زيادة مستويات الأجسام المضادة. يوفر هذا سياقا سريريا لتفسير نتائج ICC ، مع الحفاظ على التركيز المنهجي الأساسي للدراسة الحالية. تضمنت مجموعة الدراسة 10 مرضى يعانون من الأجسام المضادة الذاتية المؤكدة المضادة ل MDA5 (المجموعة الإيجابية) ، وخمسة مرضى يعانون من أمراض المناعة الذاتية الذين أسفروا عن نتائج إيجابية كاذبة عن طريق اختبار اللطخة التجارية (مجموعة إيجابية كاذبة) ، و 10 أفراد أصحاء (مجموعة تحكم صحية). تم اختبار كل عينة جنبا إلى جنب مع الضوابط الإيجابية والسلبية والتحقق منها بشكل مستقل باستخدام الترسيب المناعي ذو العلامات الراديوية. بالنسبة للعينات ذات نتائج تلطيخ واضحة وقاطعة ، اعتبر تشغيل ICC واحد كافيا. في الحالات التي يكون فيها التلوين غامضا أو حدوديا ، تم إجراء مزيد من الاختبارات ، بما في ذلك التخفيفات التسلسلية ومقايسات ICC المكررة ، لضمان التفسير الدقيق. كفل هذا النهج كلا من الدقة المنهجية وكفاءة الموارد في التحقق من أداء طريقة الكشف المستندة إلى غرفة التجارة الدولية.

النتائج الإيجابية الخاطئة موضحة في الشكل 2. في هذه العينات ، تم استخدام البلازما من المرضى الذين يعانون من أمراض المناعة الذاتية بخلاف الاعتلال العضلي الالتهابي مجهول السبب (IIM). على عكس الشكل 1 ، لوحظ تلطيخ السيتوبلازم البني على نطاق واسع عبر جميع الخلايا ، بغض النظر عن حالة تعبير MDA5. يشير نمط التلوين هذا إلى ارتباط غير محدد ويسلط الضوء على احتمالية حدوث إيجابيات كاذبة في عينات من المرضى الذين يعانون من أمراض المناعة الذاتية الأخرى. يتم عرض النتائج السلبية في الشكل 3 ، حيث تم اختبار البلازما من الأفراد الأصحاء. لم يلاحظ أي تلطيخ سيتوبلازمي بني تقريبا في خلايا HeLa المنقولة أو غير المنقولة ، مما يشير إلى عدم وجود أجسام مضادة ذاتية مضادة ل MDA5 في هذه العينات.

الشكل 1: التحقق من صحة تعبير MDA5 والكشف عن الأجسام المضادة الذاتية المضادة ل MDA5 باستخدام ICC. (أ) تم تلطيخ خلايا HeLa المنقولة ببلازميد يعبر عن MDA5 باستخدام جسم مضاد تجاري مضاد ل MDA5. لوحظ تلطيخ سيتوبلازمي بني قوي ، مما يشير إلى تعبير قوي عن بروتين MDA5. في المقابل ، لم تظهر الخلايا غير المنقولة التي تمت معالجتها في ظل ظروف متطابقة أي تلطيخ ، مما يؤكد خصوصية الأجسام المضادة وغياب تعبير MDA5 الداخلي. (ب) تم تحضين خلايا HeLa المنقولة باستخدام MDA5 بالبلازما من المرضى الذين تأكدوا أنهم إيجابيون ضد MDA5 عن طريق الترسيب المناعي الموسوم به إشعاعيا. لوحظ تلطيخ بني سيتوبلازمي واضح ، مما يدل على وجود أجسام مضادة ذاتية مضادة ل MDA5 في عينة المريض. قضبان المقياس = 50 ميكرومتر. الاختصار: ICC = الكيمياء الخلوية المناعية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: الكشف عن الإشارات الإيجابية الكاذبة باستخدام البلازما من المرضى الذين يعانون من أمراض المناعة الذاتية بخلاف IIM. لوحظ تلطيخ سيتوبلازم بني واسع الانتشار في كل من الخلايا المنقولة وغير المنقولة ، مما يشير إلى ارتباط الأجسام المضادة غير المحددة. توضح هذه النتائج إمكانية الكشف الإيجابي الكاذب في فحوصات لطخة الخط عند استخدام البلازما من المرضى الذين يعانون من أمراض المناعة الذاتية غير المرتبطة بمرضى IIM الإيجابيين ل MDA5. قضبان المقياس = 50 ميكرومتر. اختصار: IIM = اعتلالات عضلية التهابية مجهولة السبب. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: نتائج تلطيخ سلبية بالبلازما من أفراد تحكم أصحاء. أظهرت خلايا HeLa التي تم نقلها باستخدام MDA5 والمحتضنة بالبلازما من الأفراد الأصحاء القليل من التلوين السيتوبلازمي البني. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول التكميلي S1: خصائص المريض. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

ليس لدى المؤلفين مصالح متنافسة للإعلان.

تم إنشاء أجزاء من هذه المخطوطة بمساعدة GPT-4 من OpenAI. قام المؤلفون بمراجعة المحتوى وتحريره لضمان الدقة والأصالة.