مقالة منهجية

التثقيب الكهربائي للعضيات القشرية البشرية المقطعة لدراسات وظيفة الجينات

2.4K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/67598

⸱

نوفمبر 29, 2024

 ,  ,  , 
1Center for Regenerative Therapies Dresden, TUD Dresden University of Technology

في هذه المقالة

ملخص

هنا ، نقدم التلاعب الجيني الحاد للعضيات القشرية البشرية المقطعة عن طريق التثقيب الكهربائي. هذه النماذج العضوية القشرية قابلة بشكل خاص للحقن حيث يمكن التعرف بسهولة على الهياكل الشبيهة بالبطين بعد التقطيع ، مما يتيح التحقيق الوظيفي للتطور القشري البشري ، واضطرابات النمو العصبي ، والتطور القشري.

الملخص

أصبحت العضيات القشرية البشرية أدوات مهمة لدراسة نمو الدماغ البشري واضطرابات النمو العصبي وتطور الدماغ البشري. كانت الدراسات التي تحلل وظيفة الجينات عن طريق الإفراط في التعبير أو الضربة القاضية مفيدة في النماذج الحيوانية لتقديم رؤى ميكانيكية حول تنظيم تطور القشرة المخية الحديثة. هنا ، نقدم بروتوكولا مفصلا للضربة القاضية الجينية الحادة بوساطة CRISPR / Cas9 عن طريق التثقيب الكهربائي للعضيات القشرية البشرية المقطعة. يساعد تقطيع العضيات القشرية في تحديد الهياكل الشبيهة بالبطين للحقن والتثقيب الكهربائي اللاحق ، مما يجعله نموذجا مناسبا بشكل خاص للتلاعب الجيني الحاد أثناء التطور القشري البشري. نصف تصميم دليل الحمض النووي الريبي والتحقق من كفاءة الاستهداف في المختبر وفي العضيات القشرية. يتم إجراء التثقيب الكهربائي للعضيات القشرية في منتصف مراحل الخلايا العصبية ، مما يتيح استهداف معظم فئات الخلايا الرئيسية في القشرة المخية الحديثة النامية ، بما في ذلك الخلايا الدبقية الشعاعية القمية والخلايا السلفية القاعدية والخلايا العصبية. مجتمعة ، يمثل التثقيب الكهربائي للعضيات القشرية البشرية المقطعة أسلوبا قويا للتحقيق في وظيفة الجينات وتنظيم الجينات ومورفولوجيا الخلية أثناء التطور القشري.

المقدمة

تشير القشرة المخية الحديثة إلى الغطاء الخارجي لنصفي الكرة المخية وهي بنية فريدة من نوعها للثدييات. تمثل القشرة المخية الحديثة مقر الوظائف المعرفية العليا1،2،3،4،5. أثناء التطور ، تؤدي الخلايا الجذعية العصبية والخلايا السلفية إلى ظهور الخلايا العصبية في عملية تسمى تكوين الخلايا العصبية. توفر الدراسات الوظيفية التي تبحث في تطور القشرة المخية الحديثة البشرية الأساس لتوضيح الآليات الكامنة وراء تنظيم الخلايا الجذعية العصبية البشرية ، والأمراض العصبية ، وتطور الدماغ البشري2،6،7.

تاريخيا ، اعتمدت دراسات نمو الدماغ البشري على مناهج نسيجية وصفية باستخدام أنسجة ما بعد الوفاة ، مع أنظمة زراعة الأنسجة العائمة الحرة الحديثة التي تتيح التحقيقات الوظيفية مع أنسجة الجنين البشري8،9. بالإضافة إلى ذلك ، تبين أن أنسجة دماغ الجنين البشري لديها القدرة على التنظيم الذاتي في عضويات متوسعة على المدىالطويل 10. قدمت أبحاث أنسجة الجنين رؤى مهمة حول التنمية البشرية11،12 ، ومع ذلك فإن توافر الأنسجة المحدود والاعتبارات الأخلاقية يحد من تطبيقه على نطاق واسع للدراسات الميكانيكية لنمو الدماغ البشري. في العقد الماضي ، تم تطوير بروتوكولات تسمح بتوليد عضيات عصبية ثلاثية الأبعاد من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (hPSC) ، بما في ذلك PSC المستحث البشري (hiPSC) 13،14.

تظهر العضيات الدماغية ميزات مهمة للدماغ النامي ، مثل تكوين هياكل شبيهة بالبطين ، والقطبية القاعدية ، والهندسة الخلوية القشرية ، والهجرة النووية بين الحركية أثناء الانقسام الدبقي الشعاعي ، والهجرة العصبية. الأهم من ذلك ، أن هذه النماذج العضوية البشرية الجديدة تلخص خصائص الدماغ النامي البشري التي لم يتم نمذجتها بشكل جيد في الفأر ، بما في ذلك أنواع السلف العصبية الرئيسية ذات الصلة التطوري ، ولا سيما الخلايا الدبقية الشعاعية القاعدية (أو الخلايا الدبقية الشعاعية الخارجية) 7،14،15. تمت معالجة العديد من القيود المفروضة على بروتوكولات العضوية الدماغية المبكرة - مثل المشكلات المتعلقة بعدم التجانس العضوي ، وإمدادات المغذيات المحدودة للقلب الداخلي ، والهوية الإقليمية المتنوعة - في التطورات الحديثة في البروتوكول ويمكن توقع المزيد من التحسينات في السنوات القادمة15،16،17،18،19. سرعان ما أصبحت العضيات الدماغية والقشرية البشرية نماذج رئيسية لدراسة التطور القشري البشري20 ، والاضطرابات العصبية21،22،23،24 وتطور الدماغ25،26،27،28،29 ، وإجراء مناهج فحص واسعة النطاق30،31،32.

للتلاعب الجيني الحاد ، تم استخدام طريقتين بشكل أساسي في النماذج الحيوانية لتطور القشرة المخية الحديثة: التوصيل الفيروسي عن طريق إصابة الخلايا المستهدفة33 وفي الرحم أو التثقيب الكهربائي في المختبر 34،35. يوفر حقن الحمض النووي - ومؤخرا ، مجمعات البروتين النووي الريبي CRISPR / Cas9 (RNP)36 - في البطينين الجانبيين ، متبوعا بالكهرباء ، ميزة أنه يمكن استهداف مناطق معينة من الدماغ بناء على اتجاه أقطاب التثقيب الكهربائي. يتضمن التثقيب الكهربائي نبضات كهربائية قصيرة تزيد مؤقتا من نفاذية غشاء الخلية ، مما يسمح بإدخال الحمض النووي والجزيئات المشحونة الأخرى في الخلايا. في الرحم ، تم إجراء التثقيب الكهربائي لأول مرة في الفأر37 ، حيث سرعان ما أصبح منهجية مطبقة على نطاق واسع لعلم الأعصاب التنموي. تم تطبيق الطريقة لاحقا أيضا على الأنواع الأخرى ، مثل الجرذ38،39 والنمس40،41،42 ، وهو نوع جيروسياكي يستخدم لدراسة تمدد القشرة المخية الحديثة والطي القشري3،43،44،45.

أصبح التثقيب الكهربائي أيضا طريقة مهمة في أبحاث العضيات في الدماغ البشري46. في العضيات الدماغية ، تم تطبيق التثقيب الكهربائي لتصور مورفولوجيا الخلية والمحاور العصبية14،47 ، لتقديم كواشف ضربة قاضية للجينات22،48،49 ، وللتحقيق في وظيفة الجينات عن طريق الإفراط في التعبير50. لا تقتصر الطريقة على النماذج البشرية ولكن تم تطبيقها أيضا للتعديل الجيني للعضيات الدماغية للرئيسيات50،51. علاوة على ذلك ، تم وصف التثقيب الكهربائي للعضيات القشرية المتولدة في مفاعل حيوي يدور ΩSpin 52.

في هذا البروتوكول ، نوجز التثقيب الكهربائي للعضيات القشرية البشريةالمقطعة 15 لدراسات وظيفة الجينات في التطور القشري. تزيد العضيات الخاصة بمنطقة الدماغ من قابلية التكاثر والاتساق ، وهي ضرورية لنجاح التحليل الكمي ، على سبيل المثال ، في نمذجة الأمراض. في البروتوكول العضلي القشري البشريمقطعا 15, يتم تطبيق إشارات الزخرفة القوية أثناء التمايز iPSC للحصول على مجموعة متجانسة من أسلاف الدماغ الأمامي الظهري, الذي يتبعه تطبيق وسائط الثقافة التي تعزز نمو الأنسجة مع عدد أقل من الإشارات الإرشادية53,54. ثبت أن تقطيع العضيات القشرية يقلل من موت الخلايا الناتج عن انخفاض توافر العناصر الغذائية والأكسجين في النواة العضوية15. علاوة على ذلك ، يدعم التقطيع تطوير الهياكل الشبيهة بالبطين التي تحتوي على الخلايا الدبقية الشعاعية القاعدية الوفيرة ، مع تكوين الخلايا العصبية المستمر الذي يؤدي إلى تكوين منطقة تشبه الصفيحة القشرية الموسعة15. كما أن التقطيع المتكرر في هذا البروتوكول يجعل هذه العضيات القشرية مناسبة بشكل خاص للتثقيب الكهربائي ، حيث يمكن التعرف بسهولة على تجويف البطين واستهدافه عن طريق الحقن. تم تطبيق التثقيب الكهربائي للعضيات القشرية المقطعة لدراسة المناطق التنظيمية للجينات والتطور القشري26،55.

أثناء إجراء التثقيب الكهربائي ، يتم تسليم مزيج الحقن إلى تجويف الهياكل الشبيهة بالبطين. عند تطبيق مجال كهربائي نبضي ، يتم امتصاص المزيج بواسطة الخلايا الدبقية القمية الشعاعية التي تبطن البطين. عندما تنقسم الخلايا الدبقية الشعاعية القمية وتؤدي إلى ظهور أنواع خلايا أكثر التزاما4 ، تنتقل العوامل المكهربة إلى الخلايا السلفية القاعدية والخلايا العصبية. يتم توزيع النسل الكهربائي في المنطقة البطينية (VZ) والمنطقة تحت البطينية (SVZ) بعد 3 أيام وتمتد على معظم الجدار القشري ، بما في ذلك المنطقة الشبيهة بالصفيحة القشرية (CP) ، في 7 أيام بعد التثقيب الكهربائي خلال المراحل العصبية المتوسطة26،55.

هنا ، نصف الاضطراب الجيني بوساطة CRISPR / Cas956 عن طريق التثقيب الكهربائي في شرائح العضيات القشرية البشرية26. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أيضا تطبيق طريقة التثقيب الكهربائي للإفراط في التعبير الجيني ، وتصور مورفولوجيا الخلية والعمليات الخلوية عن طريق التعبير عن بروتينات الفلورسنت ، وتسليم مكتبات البلازميد لمقايسات المراسل المتوازي الضخم (MPRA) ، وتسليم أدوات تحرير الإبيجينوم ووضع العلامات على الخلايا للتصوير الحي.

البروتوكول

تم إجراء جميع التجارب التي تنطوي على الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة البشرية (hiPSC) وفقا للمعايير الأخلاقية الموضحة في إعلان هلسنكي لعام 1964 ووافقت عليها لجنة المراجعة الأخلاقية لمستشفى جامعة دريسدن (IRB00001473; IORG0001076. رقم الموافقة الأخلاقية SR-EK-456092021).

1. تصميم دليل الحمض النووي الريبي للضربة القاضية الجينية الحادة بوساطة CRISPR / Cas9

  1. صمم زوجا من الحمض النووي الريبي التوجيهي (gRNAs) الذي يستهدف نفس exon بمسافة 7-11 نقطة أساس (تجنب مضاعفات 3 نقاط أساس) بين الزخارف المجاورة للفاصل الأولي (PAMs) لزيادة احتمالية تعطل البروتين باستخدام البرامج أو الأدوات عبر الإنترنت.
    ملاحظة: من الناحية المثالية ، يجب استهداف exons التي تشفر المجالات الوظيفية. بدلا من ذلك ، يمكن اختيار الإكسونات الأولى من النص (الشكل 1 أ). حدد دليل الحمض النووي الريبي بناء على درجة النشاط (قريبة من 1)57 ودرجة الخصوصية (قريبة من 100٪)58.

2. ثقافة الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة عن طريق الإنسان

  1. لتوليد العضيات القشرية البشرية والتحقق من صحة وظيفة الحمض النووي الريبي المرسال ، استخدم خط hiPSC CRTDi004-A59 المشتق من متبرع سليم.
  2. استزراع iPSCs كما هو موصوف سابقا60 على مصفوفة الغشاء القاعدي المغلفة 6 ألواح الآبار في وسط الخلايا الجذعية تحت الظروف القياسية (37 درجة مئوية, 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2). يجب تمرير PSCs المستحثة عند التقاء 80٪ باستخدام إنزيم لتفكك الخلية المفردة مع مكملات مثبطات مسار ROCK (1: 1,000) خلال أول 24 ساعة.
    ملاحظة: يمكن استخدام خطوط iPSC أخرى لتوليد العضوية والتحقق من صحة الحمض النووي الريبي.

3. استخراج الحمض النووي الجيني من الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان

  1. استخدم 2 بئر من 80٪ -90٪ hiPSC ملتقى من صفيحة 6 آبار لاستخراج الحمض النووي الجيني. افصل الخلايا عن اللوحة باستخدام إنزيم لعمل معلق أحادي الخلية. خذ الخلايا في 1 مل من وسط الخلايا الجذعية (الحجم الإجمالي) ، ثم قم بالدوران لمدة 10 دقائق عند 600 × جم وقم بإزالة المادة الطافية.
  2. أعد تعليق حبيبات الخلية في 250 ميكرولتر من محلول التحلل (50 ملي مولار TrisHCl (الرقم الهيدروجيني 7.5) ، 100 ملي كلوريد الصوديوم ، 0.5٪ SDS ، 5 ملي مولار EDTA في H2O) و 12.5 ميكرولتر من البروتيناز K (مخزون 10 مجم / مل). احتضن لمدة ساعتين عند 55 درجة مئوية و 250 دورة في الدقيقة.
  3. امزج 100 ميكرولتر من 5 ملي كلوريد الصوديوم. تدور لمدة 10 دقائق عند 18,000 × جم عند 4 درجات مئوية وانقل المادة الطافية إلى أنابيب تفاعل جديدة سعة 1.5 مل.
  4. أضف 250 ميكرولتر من الأيزوبروبانول ، واقلب الأنابيب عدة مرات ، وقم بالدوران لمدة 15 دقيقة عند 18,000 × جم عند 4 درجات مئوية.
  5. قم بإزالة المادة الطافية ، واغسلها ب 500 ميكرولتر من 70٪ EtOH (درجة البيولوجيا الجزيئية) ، واقلب الأنابيب ، وقم بالدوران لمدة 10 دقائق عند 18,000 × جم عند 4 درجات مئوية.
  6. أخيرا ، قم بإزالة المادة الطافية تماما عن طريق ماصتها بعناية والضغط على أنابيب التفاعل المفتوحة على المناشف الورقية.
  7. اترك الحبيبات تجف في الهواء لمدة 10 دقائق عند RT, ثم قم بإذابة الحبيبات في 100 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكلياز لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  8. قم بقياس تركيز الحمض النووي باستخدام مطياف. يكون الحمض النووي الجيني المعزول مستقرا عند -20 درجة مئوية لعدة أشهر.

4. التحقق من التعرف على القالب بواسطة gRNA (في المختبر)

ملاحظة: كطريقة أولى للتحقق من صحة التعرف الناجح على القالب بواسطة gRNAs ، قم بإجراء تفاعل Cas9 في المختبر حيث يتم تقسيم الحمض النووي المزدوج الشريطة إلى جزأين يمكن تمييزهما عن طريق الرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز40،61،62.

  1. لإنشاء القالب ، قم بإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) مع مزيج رئيسي عالي الدقة PCR و 10 ميكرومتر أولي على الحمض النووي الجيني المعزول من hiPSC (القسم 3) باستخدام ظروف التدوير التالية: التمسخ الأولي عند 98 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، 40 دورة [98 درجة مئوية ، 10 ثوان ؛ 60 درجة مئوية ، 30 ثانية ؛ 72 درجة مئوية ، 1 دقيقة] واستطالة نهائية عند 72 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
    1. اضبط درجة حرارة التلدين وفقا لبادئات PCR. تأكد من أن حجم الamplicon يتراوح من 800 نقطة أساس إلى 1.5 كيلو بايت مع توطين غير متماثل لمواقع ربط gRNA.
    2. قم بحل منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل عن طريق الرحلان الكهربائي للهلام على هلام الاغاروز بنسبة 1.5٪ ، وقم بقطع الشريط المقابل من الجل واستخرج الحمض النووي26.
    3. قم بقياس تركيز الحمض النووي لمنتج تفاعل البوليميراز المتسلسل المستخرج باستخدام مطياف.
  2. قم بتجميع gRNA الوظيفي عن طريق الجمع بين 10 ميكرومتر من الحمض النووي الريبي CRISPR (crRNA ، تسلسل مخصص ، مخزون 100 ميكرومتر) و 10 ميكرومتر tracrRNA (مخزون 100 ميكرومتر) في مخزن مؤقت مزدوج خال من النوكلياز (الحجم الكلي 5 ميكرولتر). احتضن المزيج لمدة 5 دقائق عند 95 درجة مئوية ، ثم اتركه ليبرد إلى درجة حرارة الغرفة (RT).
  3. قم بإنشاء مركب البروتين النووي الريبي (RNP) عن طريق الجمع بين 10 ميكرومتر من gRNA من الخطوة 4.2 و 1 ميكرومتر Cas9 إنزيم (من Streptococcus pyogenes ، مخزون 62 ميكرومتر) في PBS لمدة 15 دقيقة عند RT (الحجم الكلي 25 ميكرولتر).
  4. لإجراء تفاعل الهضم في المختبر ، امزج 1 ميكرومتر من مركب RNP (من الخطوة 4.3) مع قالب DNA 0.1 ميكرومتر (منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل من الخطوة 4.1) و 1x مخزن تفاعل نوكلياز Cas9 (يحتوي على 200 ملي مولار HEPES ، 1 M كلوريد الصوديوم ، 50 ملي مولار MgCl2 ، 1 ملي مولار EDTA ؛ درجة الحموضة 6.5 ؛ يمكن تخزينها في حصص عند -20 درجة مئوية).
    1. املأ ما يصل إلى حجم نهائي قدره 10 ميكرولتر بالماء الخالي من النوكلياز.
    2. احتضان التفاعل عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
    3. أضف 2 مجم / مل من البروتيناز K واحتضنه لمدة 10 دقائق أخرى عند 56 درجة مئوية لتحرير ركيزة الحمض النووي من إنزيم Cas9. قم بتخزين مزيج التفاعل المهضوم عند 4 درجات مئوية أو -20 درجة مئوية حتى التحليل النهائي.
      ملاحظة: باستخدام نسبة مولارية 10: 1 من Cas9-RNP: يوصى باستخدام ركيزة الحمض النووي للحصول على أفضل كفاءة انقسام. قم بتخفيف منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل في الماء الخالي من النوكلياز إلى التركيز المطلوب ، إذا لزم الأمر. كعنصر تحكم سلبي ، يمكن أخذ مزيج تفاعل يفتقر إلى إنزيم gRNA أو Cas9.
  5. تصور المنتجات المشقوقة عن طريق الرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز على جل الاغاروز بنسبة 2٪.
    ملاحظة: من الناحية المثالية ، يجب أن يكون شريطان مختلفان الحجم مرئيين ويجب أن يختفي نطاق القالب أو يتم تقليله بشدة للحصول على gRNAs الفعالة (الشكل 1 ب).

5. التحقق من وظيفة الحمض النووي الريبي في الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة عن الإنسان

ملاحظة: يوصى باختبار كفاءة الحمض النووي الريبي الريبي الذي يستهدف نفس خط الخلية الذي سيتم من خلاله إنشاء العضيات القشرية26. لهذا الغرض ، يتم نقل مجمعات RNP التي تحتوي على gRNAs ذات الصلة مع بلازميد تعبير GFP إلى hiPSCs ، ويتم زراعة الخلايا لمدة 3 أيام ، ويتم عزل الحمض النووي الجيني لاحقا لتحليل التسلسل. لكل اختبار gRNA ، يلزم وجود ما يقرب من 200,000 خلية. يجب ألا تزيد الخلايا عن 70٪ -80٪ ملتقية ويجب أن تكون قد تم تمريرها مرتين على الأقل بعد الذوبان. من المهم أن تأخذ التحكم السلبي (gLACZ)36،63 وحالة وهمية (محلول نوة بدون RNP).

  1. قم بتغيير وسيط hiPSC ليشمل مثبط ROCK (1: 1,000) قبل ساعتين من التجربة لزيادة صلاحية الخلايا في غطاء زراعة الخلايا.
  2. قم بتغطية العدد المناسب من الآبار من صفيحة مكونة من 6 آبار بمصفوفة غشاء قاعدية.
  3. ابدأ وحدة النواة ("وحدة X" لشرائط 16 بئرا) وحدد البرنامج "خلايا ES ، H9" كمبرمج مسبقا (نبضة CB150). حدد العدد المناسب من آبار الشريط.
  4. قم بإعداد مجمعات RNP عن طريق الجمع بين 24 ميكرومتر crRNA و 24 ميكرومتر tracrRNA في المخزن المؤقت على الوجهين.
    1. احتضن عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، ثم اتركه يبرد إلى RT ، كما هو موضح في الخطوة 4.2.
    2. في غضون ذلك ، قم بتخفيف إنزيم Cas9 إلى 8 ميكرومتر في PBS.
    3. اجمع بين 3 ميكرولتر من gRNA و 3 ميكرولتر من Cas9 ، واحتضن لمدة 15 دقيقة في RT لتجميع RNP.
      ملاحظة: النسبة المولية البالغة 3: 1 gRNA: Cas9 تعطي كفاءة الانقسام المثلى. لاختبار gRNAs كزوج ، قم بإعداد كل RNP على حدة واجمع 1.5 ميكرولتر من كل RNP في النهاية.
  5. خلال حضانة RNP لمدة 15 دقيقة ، قم بإعداد hiPSC للنوة تحت غطاء زراعة الخلايا.
    1. يستبدل طلاء الغشاء القاعدي ب 1.5 مل من وسط الخلايا الجذعية المكمل بمثبط ROCK (1: 1,000) و 1x البنسلين / الستربتومايسين لكل بئر.
    2. قم بإعداد محلول النواة كمزيج رئيسي على الثلج باتباع تعليمات الشركة المصنعة.
    3. افصل hiPSCs عن اللوحة لعمل تعليق خلية واحدة (كما هو موضح في القسم 2) وعد الخلايا ذات تلطيخ Trypan Blue في غرفة عد Neubauer.
    4. بيليه 200,000 خلية حية لكل زوج من الحمض النووي الريبي عند 600 × جم لمدة 5 دقائق.
  6. في غطاء زراعة الخلية ، على الجليد ، أضف 3 ميكرولتر من RNP إلى 20 ميكرولتر من محلول النواة بالإضافة إلى 0.2 ميكروغرام / ميكرولتر pCAG-GFP البلازميد.
  7. أعد تعليق الخلايا المحببة في 23 ميكرولتر من مزيج النوكولافكتيون النهائي وانقلها إلى بئر واحد من شريط نوة 16 بئرا على الجليد.
  8. بمجرد أن تصبح جميع الظروف في الشريط ، ضعه في وحدة X لآلة النواة خارج غطاء المحرك واضغط على زر البدء لبدء النواة.
  9. بعد ذلك ، انقل شريط النواة مرة أخرى تحت غطاء مزرعة الخلية وانقل الخلايا النووية إلى الصفيحة المكونة من 6 آبار محضرة عن طريق شطف الآبار الشريطية ببعض الوسائط من اللوحة.
  10. استزراع hiPSC لمدة 3 أيام ، مع تغيير الوسط الذي يحتوي على 1x Penicillin / Streptomycin يوميا. بعد 24 ساعة، لم تعد هناك حاجة إلى مثبط ROCK.
  11. تحقق من وجود إشارة GFP تحت مجهر الفلورسنت التقليدي (الشكل 1C).
    1. في اليوم 3 ، قم بفرز وجمع الخلايا الإيجابية ل GFP عن طريق فرز الخلايا المنشطة بالفلورسنت (FACS).
    2. قم بإعداد المخزن المؤقت للفرز باستخدام 2٪ FBS في PBS واحتفظ به عند 4 درجات مئوية.
    3. قم بتبريد جهاز الطرد المركزي الذي يسطح الطاولة إلى 4 درجات مئوية. قم بإعداد أنابيب تفاعل سعة 1.5 مل مع 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت للفرز الذي يحتوي على مثبط ROCK (1: 1,000) لتجميع الخلايا بعد FACS على الجليد و 5 مل من أنابيب البوليسترين المستديرة القاع مع أغطية مصفاة الخلية على الجليد.
    4. اصنع معلقات أحادية الخلية للخلايا النووية.
    5. أعد تعليق الخلايا في 1 مل من وسط الخلايا الجذعية الذي يحتوي على مثبط ROCK (1: 1,000) لكل عينة وجهاز طرد مركزي عند 600 × جم لمدة 5 دقائق.
    6. قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للفرز باستخدام مثبط ROCK (1: 1,000) ، ثم أضف 0.4 ميكرولتر من DAPI (2 نانوغرام / ميكرولتر) لتحديد الخلايا الحية بواسطة FACS.
    7. قم بسحب محلول الخلية من خلال غطاء مصفاة الخلية للأنابيب المستديرة السفلية المبردة لإزالة أي كتل خلوية متبقية.
      ملاحظة: قد يضر DAPI بصلاحية الخلية بمرور الوقت ، وبالتالي ، من الأفضل إضافة طازجة إلى كل عينة قبل الفرز.
    8. قم بفرز 10,000 خلية حية إيجابية ل GFP (سلبية DAPI) في أنابيب تفاعل 1.5 مل معدة مسبقا مع 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت للفرز الذي يحتوي على مثبط ROCK (على الجليد).
  12. بعد FACS ، استخرج الحمض النووي الجيني مباشرة من الخلايا التي تم فرزها.
    1. قم بتدوير الخلايا المجمعة والمصنفة في مخزن الفرز المؤقت عند 600 × جم لمدة 10 دقائق.
    2. قم بإزالة المادة الطافية وتناول حبيبات الخلية في 250 ميكرولتر من محلول التحلل بالإضافة إلى 12.5 ميكرولتر من بروتيناز K لكل عينة.
    3. تابع كما هو موضح في القسم 3.
    4. أخيرا ، قم بإذابة حبيبات الحمض النووي في 50 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكلياز.
  13. قم بإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل لإنشاء قالب لتسلسل Sanger كما هو موضح في الخطوة 4.1. كعنصر تحكم ، استخدم الحمض النووي من حالة gLACZ والبادئات التي تستهدف الجين المعني (نفس البادئات المستخدمة في القسم 4). استخرج العصابات المناسبة من الرحلان الكهربائي لجل الاغاروز ، وقم بتنقيتها على عمود ، وأرسلها لتسلسل سانجر.
  14. محاذاة نتائج تسلسل Sanger باستخدام محاذاة زوجية عالمية.
    ملاحظة: يمكن تحديد الاستهداف الناجح من خلال الإشارات المتراكبة أو التسلسلات غير المكتملة الناتجة عن عمليات الإدخال/الحذف العشوائية حول موقع ربط الحمض النووي الريبي (الشكل 1 د).

6. توليد شرائح العضيات القشرية البشرية

ملاحظة: يتم إنشاء العضيات القشرية البشرية (hCO) وفقا لطريقة العضوية القشرية الحديثة (SNO) ، كما هو موضح سابقا بالتفصيل15،60.

  1. افصل مستعمرات hiPSC الصغيرة من بئر واحد من صفيحة 6 آبار مع 1 مجم / مل كولاجيناز عن طريق الحضانة لمدة 30-40 دقيقة عند 37 درجة مئوية في حاضنة. في غضون ذلك ، قم بتغطية صفيحة جديدة مكونة من 6 آبار بمصفوفة الغشاء القاعدية.
    1. أوقف الإنزيم ب 1 مل من وسط الخلايا الجذعية واجمع المستعمرات بطرف عريض في 5 مل من وسط الخلايا الجذعية في أنبوب مخروطي سعة 15 مل.
      ملاحظة: يمكن أيضا تنفيذ أي خطوات تذكر "أطراف ماصة عريضة التجويف" باستخدام أطراف مقطوعة إلى فتحة قطرها 2 مم على الأقل.
    2. بمجرد أن تستقر المستعمرات في القاع ، قم بإزالة الوسط القديم واستبدله بوسط الخلايا الجذعية الطازجة.
    3. باستخدام طرف واسع التجويف ، قم بتوزيع المستعمرات بالتساوي على الصفيحة المطلية المكونة من 6 آبار مع 1.5 مل من وسط الخلايا الجذعية لكل بئر.
    4. استزراع hiPSC لمدة 2-3 أيام في ظل الظروف القياسية.
  2. بمجرد أن يصل قطر مستعمرات hiPSC إلى حوالي 1.5 مم ، افصل جميع المستعمرات مرة أخرى باستخدام 1 مجم / مل من الكولاجيناز عن طريق الحضانة لمدة تصل إلى ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية.
    1. أوقف الإنزيم ب 6 مل من وسط الدماغ الأمامي 115 واجمع المستعمرات المنفصلة في أنبوب مخروطي سعة 15 مل باستخدام أطراف عريضة التجويف.
    2. بمجرد أن تستقر المستعمرات ، قم بإزالة الوسط القديم واغسله ب 5 مل من وسط الدماغ الأمامي 1.
    3. أخيرا ، انقل المستعمرات إلى صفيحة 6 آبار منخفضة للغاية تحتوي على 3 مل من وسط الدماغ الأمامي 1 لكل بئر مع أطراف واسعة التجويف واتركها تشكل أجساما جنينية (EBs). تشير هذه الخطوة إلى اليوم 0 من بروتوكول العضوية القشرية البشرية. من الآن فصاعدا ، اتبع البروتوكول كما هو منشور15.
  3. في اليوم 7 ، قم بتضمين EBs في مصفوفة الغشاء القاعدي ، مع حوالي 20 EBs لكل "ملف تعريف ارتباط" وثقافة لمدة أسبوع واحد في وسط الدماغ الأمامي 2 15. في اليوم 14 ، حرر العضيات ميكانيكيا من المصفوفة واستمر في الزراعة في 6 ألواح مرفقة منخفضة للغاية في وسط الدماغ الأمامي 315 على شاكر مداري عند 120 دورة في الدقيقة.
  4. من اليوم 35 ، يتم استكمال مصفوفة الغشاء القاعدي بنسبة 1٪ v / v إلى الوسط.
  5. في الأسبوع 6 ، قم بتضمين العضيات في 3٪ من الاغاروز ذات نقطة الانصهار المنخفضة وقم بتقطيع الاهتزاز إلى شرائح بسمك 500 ميكرومتر (الشكل 2 أ ، ب) ، مما يدعم إمدادات الأكسجين والمغذيات في جميع أنحاء العضيات. إذا لزم الأمر ، كرر تقطيع العضيات كل 4 أسابيع.
  6. من اليوم 70 ، عضيات الثقافة في وسط الدماغ الأمامي 415.

7. التثقيب الكهربائي للعضيات القشرية البشرية المقطعة

ملاحظة: يمكن حقن العضيات القشرية البشرية وتحويلها بالكهرباء بمجرد ظهور الهياكل الشبيهة بالبطين ، تقريبا من الأسبوع 2 فصاعدا. بالنسبة للعضيات في المرحلة اللاحقة (الأسبوع 5 وما فوق) ، يكون التثقيب الكهربائي أكثر كفاءة وتكون صلاحية الخلايا أفضل عندما يتم تنفيذ الإجراء بعد يومين من تقطيع العضيات26،55. بعد التقطيع ، من السهل تحديد الهياكل الشبيهة بالبطين ، مما يساعد في إجراء الحقن (الشكل 2 ج ، د). علاوة على ذلك ، تظل الهياكل الشبيهة بالبطين مفتوحة جزئيا لبعض الوقت بعد التقطيع ، مما يسمح لمحلول الحقن الزائد بالخروج ، مما يحمي سلامة حزام التوصيل الملتصق المبطن للبطينين. يمكن تغيير جدول التقطيع لمطابقة المخطط الزمني التجريبي. يجب تكرار التقطيع كل 3-4 أسابيع للثقافات طويلة المدى.

  1. اسحب الشعيرات الدموية الزجاجية البورسليكات للحقن في مجتذب الشعيرات الدموية الدقيقة بالإعدادات التالية: P 500 ، الحرارة 600 ، السحب 30 ، السرعة 40 ، الوقت 1. قم بتخزين الشعيرات الدموية في طبق بتري كبير باستخدام شريط لاصق للتثبيت.
  2. في يوم التثقيب الكهربائي ، قم بإعداد مركب CRISPRR / Cas9 RNP حديثا كما هو موضح في الخطوة 5.4 بتركيز نهائي يبلغ 24 ميكرومتر RNP. يدعم التثقيب الكهربائي المشترك ل 0.1 ميكروغرام / ميكرولتر pCAG-GFP البلازميد (أو أي مراسل فلوري آخر) تحديد الخلايا الكهربائية. بالإضافة إلى ذلك ، أضف محلول Fast Green بنسبة 0.1٪ في الماء إلى مزيج الحقن النهائي ، مما يتيح تأكيد التسليم الناجح للمزيج.
    ملاحظة: قم بعمل خلطات منفصلة لكل جين محل اهتمام وتحكم gLACZ .
  3. محلول Tyrode Prewarm (عبوة واحدة من ملح Tyrode ، 1 جم من NaHCO3 ، 13 مل من 1 M HEPES درجة الحموضة 7.25 في 1 لتر من dH2O) إلى 37 درجة مئوية. قم بتخزين محلول Tyrode المتبقي على حرارة 4 درجات مئوية لعدة أشهر.
  4. حدد hCO بهياكل شبيهة بالبطين متطورة (الشكل 2E) وتخلص من أي عضيات لا تظهر هياكل تشبه البطين (الشكل 2F). انقل ما يصل إلى 10 عضيات إلى طبق بتري مقاس 6 سم يحتوي على محلول Tyrode واحتفظ ب hCOs المتبقية في الحاضنة.
  5. املأ الشعيرات الدموية الدقيقة الزجاجية ب 10 ميكرولتر من محلول الحقن بمساعدة طرف ماصة اللودر الدقيق وافتح الشعيرات الدموية عن طريق الضغط على الطرف الرفيع بالملاقط. تحقق مما إذا كانت الشعيرات الدموية مفتوحة عن طريق إطلاق بعض مزيج الحقن في محلول Tyrode. قم بإجراء الحقن باستخدام حاقن دقيق في بيئة مستمرة مع بوابات متحكم فيها عبر مفتاح القدم.
  6. أدخل الشعيرات الدموية في وسط الهياكل الشبيهة بالبطين (الشكل 2C) وحقن 0.2-0.5 ميكرولتر من المزيج بالضغط على مفتاح القدم.
    ملاحظة: يمكن حقن ما يصل إلى 5 بطينات لكل hCO بإجمالي 7-8 hCOs تتم معالجتها لكل تكرار. من الناحية المثالية ، يجب استهداف البطينين اللذين يواجهان الجزء الخارجي من hCO لأن هذه هي الأكثر تطورا بشكل عام (الشكل 2G ، H).
  7. استخدم ملقطا دقيقا لدفع العضوية لتقييد الحركة. لا تمسك العضيات في الواقع (الشكل 2 ج).
  8. بعد الحقن ، استخدم طرف ماصة عريض التجويف لنقل 1-2 من العضيات إلى غرفة التثقيب الكهربائي التي تحتوي على محلول Tyrode (الشكل 2C ، D).
  9. قم بتوجيه العضيات المحقونة نحو الأقطاب الكهربائية بحيث يتم استهداف الخلايا الدبقية الشعاعية القمية في المناطق الشبيهة بالبطين التي تواجه الجزء الخارجي من العضوية.
  10. قم بتوصيل الكابلات بغرفة التثقيب الكهربائي مع الجانب المحقون من العضوية في مواجهة القطب الموجب (الأنود. الشكل 2 د).
  11. اضغط على زر النبض الخاص بآلة المثق الكهربائي للتثقيب الكهربائي بخمس نبضات من 38 فولت لمدة 50 مللي ثانية لكل منها على فترات 1 ثانية.
    ملاحظة: قد تعتمد إعدادات التثقيب الكهربائي على المثقب الكهربائي المتاح وقد تحتاج إلى تحسينها.
  12. كرر خطوات الحقن والتثقيب الكهربائي حتى تتم معالجة العدد المطلوب من العضيات.
  13. اجمع العضيات المكهربة في وسط في RT حتى تتم معالجة جميع العينات لنفس الحالة. تأكد من عدم وجودهم خارج الحاضنة لأكثر من 30 دقيقة في المجموع.
  14. بعد ذلك ، أعد hCOs المثقب كهربائيا إلى وسط الاستزراع المناسب وزرعها دون اهتزاز لمدة 24 ساعة الأولى.
    ملاحظة: بعد 2-3 أيام ، يجب أن تكون إشارة GFP مرئية في hCOs المثقف بالكهرباء تحت مجسم فلوري (الشكل 2H). يجب اختيار النقطة الزمنية للتحليل بعد التثقيب الكهربائي اعتمادا على السؤال البيولوجي المراد الإجابة عليه. بعد 3-7 أيام ، توجد الخلايا الإيجابية ل GFP عبر VZ و SVZ و CP15،60.

8. تثبيت وتقطيع العضيات القشرية البشرية المثقلة بالكهرباء

  1. قم بتثبيت العضيات الكهربائية في 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) لمدة 30 دقيقة في RT في أنبوب تفاعل سعة 2 مل.
    تنبيه: PFA سام ومسرطن. قم بتنفيذ أي خطوات تنطوي على PFA تحت غطاء الدخان. يوصى بشدة باستخدام قفازات النتريل ونظارات السلامة.
  2. يغسل مرة واحدة في PBS لمدة 5 دقائق ويخزن في سكروز معقم 30٪ في PBS عند 4 درجات مئوية حتى تشبع الأنسجة بالكامل بالسكروز.
  3. قم بتضمين العضيات الثابتة في وسط تضمين لعينة الأنسجة المجمدة بالإضافة إلى 15٪ سكروز في PBS في كتل على الجليد الجاف.
  4. قم بإعداد أقسام 20-30 ميكرومتر في ناظم البرد واجمع الأنسجة على شرائح لاصقة26،64.
    ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا إما بمجرد أن تكون العضيات الثابتة في السكروز (مستقرة عند 4 درجات مئوية لعدة أشهر) أو مدمجة في وسط تضمين (يمكن تخزين الكتل المجمدة في أكياس محكمة الغلق عند -20 درجة مئوية لعدة أشهر إلى سنوات).

9. التحليل الكيميائي المناعي للعضيات القشرية البشرية المثقلة بالكهرباء

  1. للتحليل الكيميائي الهيستولوجي المناعي26،64 ، قم بإجراء استرجاع المستضد في مخزن السترات (10 ملي مولار سترات الصوديوم ، 0.05٪ بولي سوربات 20 في ديسيمو2O ، درجة الحموضة 6.0) لمدة ساعة واحدة عند 70 درجة مئوية في حمام مائي.
  2. اغسل مرة واحدة في PBS لمدة 5 دقائق ، ثم جفف الشرائح لفترة وجيزة وقم بوضع دائرة حول الأقسام بقلم شمع.
  3. اروي باستخدام 0.1 م جلايسين في PBS (درجة الحموضة 7.4) لمدة 30 دقيقة في RT ثم اغسله مرتين باستخدام PBS لمدة 5 دقائق لكل منهما.
  4. قم بتغطية الأقسام في المخزن المؤقت المانع (10٪ مصل الحصان ، 0.1٪ أوتوكسينول 9 في PBS) واحتضانه لمدة 30 دقيقة في RT.
  5. تحضير الأجسام المضادة الأولية في المخزن المؤقت الحجب واحتضانها على الأقسام طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
  6. في اليوم التالي ، اغسل ثلاث مرات باستخدام PBS لمدة 5 دقائق لكل منها ، واحتضن بالأجسام المضادة الثانوية و DAPI في حجب المخزن المؤقت لمدة ساعة واحدة في RT ، واغسلها ثلاث مرات مرة أخرى باستخدام PBS لمدة 5 دقائق لكل منهما.
  7. قم بتركيب الشرائح في وسط التركيب والصورة في مجهر الفلورسنت (الشكل 3).
    ملاحظة: يوصى بتضمين جسم مضاد ضد الفلوروفور المستخدم في مزيج الحقن لتحديد الخلايا المستهدفة حيث غالبا ما يتم إخماد الإشارة الأصلية بعد التثبيت. الأجسام المضادة والأصباغ المستخدمة في تلطيخ التألق المناعي ، كما هو موضح في الشكل 3 ، مدرجة في الجدول 1.

10. التحقق من الضربة القاضية بوساطة CRISPR / Cas9 على مستوى البروتين

  1. للتحقق من الضربة القاضية على مستوى البروتين ، قم بإجراء الكيمياء النسيجية المناعية للبروتين المستهدف على العضيات الكهربائية (الشكل 3I).
  2. قم بتصوير كل من عنصر التحكم gLACZ والعضويات المستهدفة باستخدام نفس الإعدادات للسماح بمقارنة شدة التألق (الشكل 3I ، J). افعل ذلك بطريقة خاصة بالمنطقة لمقارنة التأثير على أنواع الخلايا المختلفة للقشرة المخية الحديثة النامية. عد الخلايا في ImageJ / Fiji (عداد خلايا المكون الإضافي) أو عن طريق التقسيم باستخدام المكون الإضافي StarDist 65.

النتائج

يتطلب الاستئصال الجيني بوساطة CRISPR / Cas9 تصميم gRNAs. بشكل عام ، فإن استهداف أحد الإكسونات الأولى للجين ذي الأهمية بزوج من gRNAs متباعدة 7-11 نقطة أساس (تجنب مضاعفات 3 نقاط أساس) يعمل بشكل جيد (الشكل 1 أ). كاختبار أول ، يمكن استجواب كفاءة التعرف على القالب بواسطة gRNAs في المختبر باستخدام قالب PCR26،40،62. يظهر الاستهداف الفعال والقطع بوساطة Cas9 في تقليل الحمض النووي للقالب وظهور منتجات الحمض النووي المشقوقة على هلام الاغاروز (الشكل 1 ب). يمكن إجراء مزيد من اختبار gRNA في خط iPSC المستخدم لتوليد العضوية القشرية. وهذا يتطلب نواة iPSCs, والتي يمكن تصورها من خلال تعبير مراسل الفلورسنت الناجح (الشكل 1C). يمكن التحقق من الاستهداف الفعال لموضع الاهتمام عن طريق تسلسل Sanger ، مما ينتج عنه مخطط كروماتوغرامي ينتهي فجأة أو يصبح متراكبا حول موقع الاستهداف (الشكل 1D) ، ناتج عن طيف من indels من إصلاح كسر الخيط المزدوج عن طريق نهاية غير متجانسة تنضمإلى 66. دليل اختبارات كفاءة الحمض النووي الريبي في المختبر وفي خلايا iPSC تساعد على اختيار أزواج gRNA فعالة للاستئصال الجيني في العضيات القشرية.

قبل التثقيب الكهربائي ، يتم تقطيع العضيات القشرية إلى شرائح ، مما يدعم تحديد تجويف البطين لحقن مزيج التثقيب الكهربائي (الشكل 2A-C). ثم يتم نقل العضيات المحقونة إلى غرفة التثقيب الكهربائي (الشكل 2 د). بالنسبة للتثقيب الكهربائي ، يجب استخدام العضيات القشرية ذات الهياكل الشبيهة بالبطين المتطورة (الشكل 2 ه) ، بينما يجب التخلص من العضيات القشرية التي تفتقر إلى الهياكل المرئية (الشكل 2F). يحتوي مزيج التثقيب الكهربائي على صبغة تسمح بتصور البطينين المحقونين أثناء الإجراء (الشكل 2G). بعد 1-3 أيام في المزرعة ، يمكن رؤية البطينين المستهدفين بنجاح بواسطة إشارة GFP الأصلية تحت المجهر الفلوري (الشكل 2H).

للتحليل النسيجي المتعمق ، يمكن إجراء الكيمياء النسيجية المناعية للعمليات التبريدية. من الناحية المثالية ، توجد بطينات مستهدفة متعددة داخل عضوية قشرية كهربائية (الشكل 3 أ ، ب). تستهدف التثقيمات الكهربائية المثلى الهياكل الشبيهة بالبطين في المنطقة الخارجية من العضوية التي تواجه الخارج (الشكل 3C) ، حيث أن هذه عادة ما تكون البطينين الأكثر توسعا. في بعض الحالات ، قد يؤدي التثقيب الكهربائي إلى موت الخلايا المفرط (الشكل 3D ، E) ، على سبيل المثال ، عندما تكون تركيزات البلازميد عالية جدا أو تكون إعدادات التثقيب الكهربائي دون المستوى الأمثل. غالبا ما تتضمن التثقيب الكهربائي الذي يواجه الجزء الداخلي من العضوية (الشكل 3F) مناطق أقل توسعا من الهياكل الشبيهة بالبطين مقارنة بالخارج. في تجربتنا ، من المفيد تركيز التحليل الكمي على مناطق محددة من العضوية لتقليل التباين. في بعض الأحيان ، قد يتسبب التثقيب الكهربائي في اضطراب السطح القمي (الشكل 3G) ، على سبيل المثال ، عندما يكون حجم الحقن مرتفعا جدا ، مما يتسبب في تمزق البطينين ، أو عندما تكون النبضات الكهربائية قوية جدا ، مما يؤدي إلى تفريغ الخلايا. أخيرا ، عندما يتم استهداف بطين متجاورين (الشكل 3H) ، قد يصبح من الصعب تعيين حدود المناطق القشرية وأصل الخلايا المستهدفة.

يمكن استخدام الكيمياء النسيجية المناعية للتحقق من الضربة القاضية الناجحة بوساطة CRISPR / Cas9 على مستوى البروتين في الخلايا ذات الأهمية (الشكل 3I) ، كما يتضح هنا من خلال استهداف بروتين Polycomb Repressive Complex 1 (PRC1) PCGF467. يمكن تحليل شدة الإشارة في الخلايا الإيجابية ل GFP في الظروف التجريبية مقابل الظروف التجريبية (الشكل 3J). بدلا من ذلك ، إذا لم يكن هناك جسم مضاد مناسب متاح ، فقد يتم عزل الخلايا المستهدفة بواسطة FACS من العضيات القشرية60 وتحليلها بشكل أكبر بواسطة Sanger أو Next Generation Sequencing36. علاوة على ذلك ، يمكن أيضا تحليل انخفاض مستويات البروتين باستخدام النشاف الغربي.

figure-results-1
الشكل 1: دليل تصميم الحمض النووي الريبي والتحقق من صحته للضربة القاضية الجينية الحادة بوساطة CRISPR / Cas9. (أ) توضيح تخطيطي لاستراتيجية تصميم دليل الحمض النووي الريبي (gRNA) ، مع اثنين من gRNAs يستهدفان exon من الجين ذي الأهمية. تشير الأسهم السوداء إلى بادئات PCR لإعداد القالب المستخدم للتحقق من صحة gRNA. (ب) التحقق من كفاءة الحمض النووي الريبي في المختبر. تم استيعاب القوالب المضخمة بتفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام مجمعات RNP. عند الانقسام الناجح ، يظهر شريطان بأحجام مختلفة بعد الرحلان الكهربائي للهلام (يسار) ، بينما يظل القالب غير مقطوع ل gRNAs منخفضة الكفاءة (يمين). (ج) صورة المجال الساطع (يسار) ، مضان GFP (وسط) ، وصور مدمجة (يمين) للخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة البشرية (hiPSCs) بعد 3 أيام من النواة مع مركب RNP وبلازميد GFP. أشرطة المقياس: 350 ميكرومتر. (د) التحقق من كفاءة الحمض النووي الريبي المرسال في hiPSCs عن طريق تسلسل سانجر للحمض النووي المضخم من الخلايا الإيجابية ل GFP. عند الانقسام الناجح للحمض النووي مزدوج الشريطة ، تظهر مسارات التسلسل إشارات متراكبة تبدأ من الموقع المستهدف gRNA (أعلى ، KO1). في حالة الاستهداف غير الناجح ، يظل مسار تسلسل الحمض النووي دون تغيير (أسفل ، KO2) مقارنة بعنصر تحكم LACZ . الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: التثقيب الكهربائي للعضيات القشرية البشرية المقطعة. (أ) رسم تخطيطي يوضح سير العمل للتثقيب الكهربائي للعضيات القشرية البشرية (hCOs). أولا ، يتم تقسيم hCOs إلى شرائح بسمك 500 ميكرومتر. بعد يومين ، يتم حقن مزيج RNP الذي يحتوي على بلازميد تعبير GFP و Fast Green في لومن من الهياكل الشبيهة بالبطين ، بشكل تفضيلي في المنطقة الخارجية من hCOs. للتثقيب الكهربائي ، يتم وضع hCOs في غرفة التثقيب الكهربائي. بعد عدة أيام من الثقافة ، يمكن اكتشاف إشارة GFP في المناطق المثقبة بالكهرباء. (ب) صور لتقسيم الاهتزاز ل hCOs. يتم تضمين العضيات في 3٪ من الاغاروز ذات نقطة الانصهار المنخفضة في وسط في كتلة (يسار). يتم تقسيم الكتلة إلى شرائح بسمك 500 ميكرومتر (وسط). يتم نقل العضيات المقطعة مرة أخرى إلى طبق الاستزراع بطرف ماصة عريض التجويف (على اليمين). (ج) صور توضح حقن المزيج الذي يحتوي على RNP و pCAG-GFP و 0.1٪ Fast Green في الهياكل الشبيهة بالبطين للعضيات. يتم غمر العضيات في محلول Tyrode ويتم إدخال الشعيرات الدموية الزجاجية الرقيقة في تجويف مركز الهياكل الشبيهة بالبطين (على اليسار). تستخدم الملقط لتثبيت العضيات (اليسرى والوسطى). يتم استهداف البطينين الموجودين على السطح الخارجي للعضيات (في الوسط). يتم نقل العضيات المحقونة إلى غرفة التثقيب الكهربائي ، أو لاحقا إلى طبق الثقافة ، مع أطراف ماصة واسعة التجويف (يمين). (د) صور لغرفة التثقيب الكهربائي ، والتي تتكون من طبق بتري زجاجي وشفرتين معدنيتين ملتصقتين بالزجاج. تعمل الشفرات المعدنية كأقطاب كهربائية وتحتوي على فتحات لتوصيل الكابلات للاتصال بالمثقب الكهربائي. يجب أن يواجه الجانب المحقون من hCO ، المرئي من خلال الظل الأخضر ، الأنود (القطب الموجب ، الكبل الأحمر) (يمين). (ه) صور تمثيلية لمركبات الكربون عالية التردد تظهر هياكل شبيهة بالبطين متطورة. تمثل الحلقة الأخف المنطقة الشبيهة بالمنطقة البطينية. تمثل الدائرة الداكنة في وسط الهيكل الشبيه بالبطين التجويف ويجب استهدافها للحقن. (و) صور تمثيلية لمركبات الكربون عالية الارتفاع تفتقر إلى هياكل شبيهة بالبطين متطورة ، والتي نوصي بعدم تضمينها لمزيد من التجارب. (G) صور تمثيلية لمركبات الكربون عالية السر بعد حقن مزيج التثقيب الكهربائي ، حيث يمكن رؤية المناطق المستهدفة بواسطة Fast Green (الأسهم البرتقالية). (ح) صورة تمثيلية ل hCO تظهر إشارة GFP الأصلية بعد 24 ساعة من التثقيب الكهربائي. أشرطة المقياس: 100 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-3
الشكل 3: التحليل الكيميائي المناعي للعضيات القشرية البشرية المقطعة بالكهرباء. (أ) تخطيطي يمثل عضوية قشرية بشرية مثقلة بالكهرباء (hCO) مع إشارة فلورية خضراء. (ب) تلطيخ DAPI (رمادي) والتألق المناعي ل GFP (أخضر) لثاني أكسيد الكربون المقطوع بالتبريد مع البطينين الكهربائيين المتعدد ، بعد 7 أيام من التثقيب الكهربائي. (C-H) أمثلة على الصور لنتائج التثقيب الكهربائي المختلفة ، ملطخة ب GFP (أخضر) والنوى (DAPI ، رمادي). (ج) التثقيب الكهربائي الأمثل مع النوى السليمة (انظر الإدخال 1 ، د) ، وبنية تشبه البطين غير المنقطعة ، وخلايا كهربائية في المنطقة المواجهة نحو خارج العضوية ، والتي عادة ما تكون أكثر توسعا. (ه) مثال على hCO الذي يعرض الموت الهائل للخلايا في المنطقة المثقبة بالكهرباء (انظر أيضا إدراج 2 ، D) ، يتميز بنوى صغيرة كثيفة ومشوهة ب DAPI. (و) التثقيب الكهربائي الناجح الموجه نحو داخل العضوية ، والذي غالبا ما يكون من الصعب تفسيره بسبب اندماج المناطق الشبيهة بالصفيحة القشرية مع البطينين المجاورين. (ز) تعطل الهياكل الشبيهة بالبطين في وسط المنطقة المثقبة بالكهرباء (السهم البرتقالي). (ح) مثال على HC يحتوي على العديد من البطينين الأصغر المدمجين جزئيا ، وبالتالي يصعب تحديدها. (I) تلطيخ DAPI (رمادي) والتألق المناعي ل GFP (أخضر) و PCGF4 (أرجواني) بعد 7 أيام من التثقيب الكهربائي لمركب RNP الذي يستهدف LACZ (gLACZ KO ، يسار) أو PCGF4 (gPCGF4 KO ، يمين) للضربة القاضية بوساطة CRISPR / Cas9. تسلط الخلايا المحاطة بدائرة الضوء على انخفاض شدة PCGF4 ، مما يشير إلى نجاح الاستئصال الجيني. يمكن رؤية إشارة موحدة في وحدة تحكم LACZ (على اليسار). (ي) يوضح الرسم البياني شدة PCGF4 الكمية بعد التألق المناعي في الخلايا الإيجابية ل GFP للتحكم (gLACZ KO) و KO ل PCGF4 (gPCGF4 KO) بالنسبة إلى متوسط تعبير PCGF4 في حالة gLACZ. تمثل كل نقطة خلية. بيانات من 3-4 عضيات من دفعتين مختلفتين (رمادي وأسود) من نفس خط hiPSC. ص < 0.0001 ، اختبار مان ويتني. تم التقاط جميع الصور باستخدام مجهر متحد البؤر للمسح الضوئي بالليزر (B ، C) أو الفلورسنت (E-I). تمثل الصور إسقاطات كثافة قصوى لمكدسات z بسمك 10-15 ميكرومتر. تشير الخطوط البيضاء المتقطعة إلى السطح القمي المواجه لتجويف البطين والأسطح الخارجية ل hCOs. تشير الخطوط المتقطعة البرتقالية إلى حدود VZ / SVZ في البطينين المدمجين. أشرطة المقياس: 100 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الأجسام المضادة / الصبغةالتخفيف
دجاج مضاد لل GFP1:2,000
ماوس مضاد ل PCGF41:300
أليكسا فلور 488 حمار مضاد للدجاج1:1,000
أليكسا فلور 555 حمار مضاد للأرانب1:1,000
دابي1 مجم / مل مخزون ؛ 1:1,000

الجدول 1: قائمة الأجسام المضادة والأصباغ وتخفيفها المستخدمة في تلطيخ التألق المناعي.

المناقشة

أصبحت العضيات الدماغية والقشرية البشرية نماذج رئيسية للتحقيق في تطور القشرة المخية الحديثة البشرية7،16،17. لنمذجة الاضطرابات البشرية ، أصبحت خطوط والعضيات hiPSC متساوية الجين هي المعيار الذهبي68. ومع ذلك, نظرا لأن توليد خطوط iPSC الجديدة تستغرق وقتا طويلا ومكلفة, تم تطبيق التلاعب الحاد بالنماذج العضوية القشرية لدراسات وظيفة الجينات على نطاق واسع.

من السهل تنفيذ التثقيب الكهربائي للعضيات الدماغية والقشرية14،22،26،46،47،48،49،50،51،55 ، والعديد من المختبرات التي استخدمت تقليديا نماذج حيوانية للدراسات الوظيفية مجهزة بالأدوات المطلوبة. بالنسبة للحقن في الجسم الحي ، عادة ما يتم استهداف البطينين الجانبيين34،36،37،39،40،41،42. يتم تصميمها في العضيات القشرية بواسطة هياكل تشبه البطين تتميز بالتجويف المركزي الذي يمكن حقنه أيضا. يستهدف التثقيب الكهربائي للعضيات القشرية في المقام الأول القدمين النهائيتين للخلايا المبطنة للبطينين ، وعادة ما تكون الخلايا الدبقية القمية الشعاعية69. تختلف كفاءة الاستهداف بين التجارب ، ولكن عادة ، يمكن الحصول على عدد قليل من 100 إلى 1,000 خلية إيجابية GFP لكل عضوي بعد 3-7 أيام من التثقيب الكهربائي. تبلغ مدة دورة الخلية في الخلايا السلفية العصبية البشرية ضعف المدة تقريبا مقارنة بالفأر ، حيث يبلغ طول دورة الخلايا الدبقية الشعاعية القمية 14 ساعة والخلايا السلفية القاعدية 23 ساعةو 70. لذلك ، بعد 3 أيام ، تكون الخلايا الدبقية القمية القمية والخلايا السلفية الوسيطة إيجابية GFP ، بينما يتم توزيع الخلايا الإيجابية ل GFP في جميع المناطق بعد 7 أيام. لا يزال من الممكن ملاحظة إشارة GFP بعد عدة أشهر من التثقيب الكهربائي ، حيث تمثل الخلايا الإيجابية ل GFP بشكل أساسي الخلايا العصبية المنتشرة في جميع أنحاء العضوية ، مما يسمح لنا بتحليل مورفولوجيا الخلايا الفردية. يمكن استهداف الخلايا السلفية العصبية المبطنة للبطين خلال المراحل التي يمكن فيها تحديد المناطق الشبيهة بالبطين تحت مجهر المجال الساطع. في البروتوكولالحالي 15 ، يكون هذا ممكنا من الأسبوع 2 إلى الأسبوع 12 من تطور العضوية القشرية ، وبعد ذلك يتقلص البطينان ويعودان مرئيين. بالنسبة للمجرب المتمرس ، من الممكن حقن 50-80 عضوا في جلسة واحدة.

في حين أن ذرية الخلايا الدبقية القمية الشعاعية ترث كواشف التلاعب الجيني أثناء انقسام الخلية ، فإن الاستهداف المباشر للخلايا الناضجة ، مثل الخلايا العصبية والخلايا النجمية ، غير ممكن من خلال نهج التثقيب الكهربائي القياسي. بدلا من ذلك ، تم تطبيق طرق الاستهداف الفيروسي على خلايا ما بعد الانقسام في الجهاز العصبي33،71. على وجه الخصوص ، تستخدم الفيروسات المرتبطة بالغدة المؤتلفة (AAVs) على نطاق واسع لنقل الجينات في الجهاز العصبي حيث يسهل إنتاجها ونقلها الخلايا المتمايزة نهائيا بكفاءة عالية71. علاوة على ذلك ، يمكن استهداف AAVs لمجموعات عصبية فرعية محددة. تم بالفعل تطبيق طرق مختلفة للاستهداف الفيروسي ، بما في ذلك استخدام الفيروسات الغدية والسينداي والعدسات ، في العضيات الدماغية والقشرية15،25،29،30،32،47،72،73،74.

أحد القيود في بروتوكولات العضوية الدماغية هو تطوير نواة نخرية بسبب محدودية إمدادات الأكسجين والمغذيات. تم تنفيذ العديد من الاستراتيجيات لتحسين بقاء الخلية في المركز العضوي ، بما في ذلك زراعة العضيات في المفاعلات الحيوية الدوارة14،54 ، والزراعة المشتركة للخلايا البطانية أو مناهج الهندسة الحيوية لنمذجة الأوعية الدموية75،76 ، وزرع العضوية في نماذج القوارض18،77 وتقطيع العضيات15،47. هنا ، استخدمنا بروتوكول العضوية القشرية البشرية المقطعة ، والذي ثبت أنه يظهر نقص الأكسجة المنخفض في اللب العضوي ويدعم توسع الهياكل الشبيهة بالبطين والمنطقة الشبيهة بالصفيحةالقشرية 15. بالإضافة إلى ذلك ، فإن تقطيع العضيات الدماغية مفيد أيضا للتصوير الحي للخلايا الدبقية الشعاعية القاعدية ، والتي تقع في المنطقة تحت البطينية ، مما يسمح بإنشاء خرائط قرار مصير الخلية72. وبالمثل ، تم استخدام التصوير الحي لدراسة قطع العضيات الدماغية المزروعة في واجهة الهواء والسائل ، والتي تدعم بقاء الخلايا العصبية والنمو المحوري47. وجدنا أن تقطيع العضيات القشرية البشرية يجعل هذه النماذج العضوية قابلة بشكل خاص للتثقيب الكهربائي ، حيث يمكن بسهولة تحديد الهياكل الشبيهة بالبطين بعد التقطيع. يتيح التثقيب الكهربائي للعضيات القشرية إدخال بلازميدات الحمض النووي ، المستخدمة بشكل كلاسيكي للإفراط في التعبير الجيني ، ومؤخرا ، لتسليم مكتبات البلازميد بأكملها55 ، وأدوات تحرير الجينات CRISPR / Cas9 لتعطيل وظيفة الجينات26.

أحدثت تقنية CRISPR / Cas9 ثورة في التحقيق في وظيفة الجينات56،57،58،63،66. في هذا البروتوكول ، حددنا تطبيق مجمعات البروتين النووي الريبي gRNA / Cas936 لتعطيل الجينات الحاد في العضيات القشرية البشرية. تم إجراء التحقق الأولي من كفاءة الحمض النووي الريبي في المختبر, أولا في أنبوب اختبار والثاني في iPSCs. نجد أن هذه الاختبارات الأولية المباشرة تساعد في اختيار أزواج gRNA الواعدة ، لا سيما في حالة عدم وجود أجسام مضادة عاملة. نظرا لتوصيف المزيد والمزيد من الأدوات الخاصة بالضربة القاضية الجينية بوساطة CRISPR / Cas9 ، فقد يتم حذف خطوات التحقق الأولية في المستقبل. في حين أن تسلسل الجيل التالي لمناطق الحمض النووي المستهدفة المعزولة من iPSCs أكثر كمية ويحتوي على محتوى معلومات أعلى, نجد أن تسلسل سانجر يمكن أن تقدم في كثير من الأحيان نتائج أسرع بكثير أثناء الفحص المسبق للحمض النووي الريبي المرسال. في النهاية ، يعد التحقق من صحة التحرير الفعال ل CRISPR / Cas9 في العضيات القشرية وتقليل مستويات البروتين في الخلايا ذات الأهمية هو الدليل الأكثر تحديدا على نجاح الاستئصال الجيني بوساطة CRISPR / Cas9.

يتيح التثقيب الكهربائي للعضيات القشرية البشرية المقطعة التلاعب الجيني الحاد لدراسات الكسب وفقدان الوظيفة ، وتصور مورفولوجيا الخلية والمحاور العصبية ، وتسليم مكتبات البلازميد لأساليب الفحص وفحوصات المراسل المتوازي الضخمة ، ووضع العلامات على الخلايا للتصوير الحي وتسليم أدوات تحرير الإبيجينوم. على هذا النحو ، فإن التثقيب الكهربائي للعضيات القشرية البشرية المقطعة هو طريقة قوية يمكن أن تكشف عن رؤى ميكانيكية في التطور القشري البشري ، واضطرابات النمو العصبي ، والتطور القشري.

الإفصاحات

ويعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهم تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

نحن ممتنون لمرافق CRTD وشركاء Dresden Concept على الدعم المتميز المقدم ، ولا سيما K. Neumann وفريقها في مرفق هندسة الخلايا الجذعية ، و H. Hartmann وفريقها في مرفق الفحص المجهري الخفيف ، و A. Gompf وفريقها في مرفق قياس التدفق الخلوي و Hartmut Wolf من ورشة MPI-CBG لبناء غرف التثقيب الكهربائي. نشكر جوشوا شميدت على ملاحظاته على المخطوطة. يقر MA بالتمويل المقدم من مركز العلاجات التجديدية TU Dresden و DFG (Emmy Noether ، AL 2231 / 1-1) ، ومؤسسة Schram.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
15 مل PP أنابيب الطرد المركزي ،Corning430791
4D-Nucleofector الوحدة الأساسيةLonza
4D-Nucleofector X UnitLonza
5 مل أنبوب البوليسترين المستدير السفلي مع غطاء مصفاة الخليةCorningFalcon 352235
لوحة 6 آبار ، معالج nunclonThermo Fisher140675ل hiPSC ثقافة
6 آبار ، ملحق منخفض للغايةCorning3471للثقافة العضوية
A83-01STEMCELL Technologies72022وسط الدماغ الأمامي 1 (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002) 15< / sup>
ضاغط الهواءAerotec
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Chicken IgY (IgG) (H + L) JacksonImmunoResearch 703-545-155الجسم المضاد الثانوي ، RRID: AB_2340375 ؛ التخفيف 1: 1000
Alexa Fluor 555 Donkey Anti-Rabbit IgG (H + L)InvitrogenA-31572الجسم المضاد الثانوي ، RRID: AB_162543 ؛ التخفيف 1: 1000
Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA ، 2 نانومولالحمض النووي المتكاملةتصميم مخصص (طلب ك 2 نانومول)
Alt-R CRISPR-Cas9 tracrRNAتقنيات الحمض النووي المتكاملة10725325 نانومول
Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3تقنيات الحمض النووي المتكاملة1081060100 & ز ، من Streptococcus pyogenes
Amphotericin B (Fungizone)Gibco15290018Forebrain medium 2 و 3 و 4   ؛ (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002) 15< / sup>
الأجسام المضادة الأولية المضادة ل GFP (الدجاج ، متعدد النسيلة)Abcamab13970RRID: AB_300798 ؛ التخفيف 1: 2000
الجسم المضاد الأولي المضاد PCGF4 (الفأر ، أحادي النسيلة)Millipore05-637   ؛RRID: AB_309865 ؛ التخفيف 1:300
مجهر الفلورسنت ApoTomeZeiss
Ascorbic AcidSigma Aldrich1043003Forebrain medium 4  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002) 15< / sup>
B27-supplement (+ فيتامين أ)Gibco17504044وسط الدماغ الأمامي 3 ، 4 & nbsp ؛   (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002) 15< / sup>
طقم كابل الموز إلى Micrograbberهارفارد BTX45-0216
Biometra TRIO-Thermocycler (آلة PCR)Analytik Jena846-2-070-723
الشعيرات الدموية ، زجاج البورسليكات مع خيوط ، OD 1.2 مم ؛ معرف 0.69 مم ؛ 10 سم طولالمنتجات العلميةBF120-69-10تحتاج إلى سحبها إلى سمك معين
CHIR-99021STEMCELL Technologies72052Forebrain medium 2 & nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002) 15< / sup>
منشأة هندسة الخلايا الجذعيةCRTDi004-Aخط hiPSC أحادي الخلية من متبرع سليم
DAPIRoche10236276001مخزون 1 مجم / مل ، استخدم 1: 1000 مخفف ل IF
STEMCELL Technologies73884Forebrain medium 4  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002) 15< / sup>
ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)سيجما ألدريتشD2650
DMEM / F-12 ، HEPESفيشر العلمي31330095وسط الدماغ الأمامي 1 و 2 و 3 & nbsp ؛ (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
DorsomorphinSTEMCELL Technologies72102Forebrain medium 1  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002) 15< / sup>
Dumont # 55 ملقط ، straigth ، 11 سمأدوات العلوم الدقيقة11295-51
ECM 830 نظام التثقيب الكهربائي بالموجة المربعةجهاز هارفارد BTX45-2052
الإيثانولسيجما ألدريتش32205-1L-M
حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA)سيجما ألدريتشEDS-500G
مصل الأبقار الجنيني Fast FCFSigma AldrichF7252
(FBS)GEHealthcare SH30070.03 
المشتعلة / براون مجتذب الماصةالصغيرة Sutter Instrument Co.P-97لسحب الشعيرات الدموية
الدقيقة Geneious PrimeGraphPad Software LLC d.b.a GeneiousSoftware الإصدار 2024.0.5
gLACZKalebic et al., 2016; Platt et al., 20145'-TGCGAATACGCCCACGCGATCGG; النيوكليوتيدات المسطرة = PAM
GlutaMAXGibco 35050038وسط الدماغ الأمامي 1 و 2 و 3 و 4 (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002) 15
GlycineSigma AldrichG8898
gPCGF4 < / em>KO1هذه الورقة5'-TGAACTTGGACATCACAAATAGG (تتوافق مع صور KO في الشكل 3I + J)
gPCGF4 < / em>KO2هذه الورقة5'-ACAAATAGGACAATACTTGCTGG (تتوافق مع KO الصور في الشكل 3I + J)
HEPESالمصنوع في المنزل1 M
مخزون مصل الحصان ،Gibco26050088
بروتين مؤتلف GDNFالبشري Thermo Fisher450-10Forebrain medium 4 & nbsp ؛ (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002) 15< / sup>
الإنسان / الفأر / الفئران BDNF بروتين مؤتلفثيرمو فيشر450-02وسط الدماغ الأمامي 4 & nbsp ؛ (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002) 15< / sup>
حمض الهيدروكلوريك (HCl)Sigma Aldrich258148لصنع TrisHCl
ImmEdge (الشمع)مختبراتH-4000
محلول الأنسولين البشريSigma Aldrich& nbsp ؛ I9278الدماغ الأمامي المتوسطة 3  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002) 15< / sup>
IsopropanolFisher ScientificBP2618-1
Knockout Serum ReplacementGibco & nbsp ؛10828-010وسط الدماغ الأمامي 1  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002) 15< / sup>
المسح الضوئي بالليزر متحد البؤر 980 مجهرZeiss
نقطة انصهار منخفضة Agarose ،16520100Thermo Fisherالنقاء لتضمين hCOs أثناء تقسيم الاهتزاز
مصفوفة الغشاء القاعدي لعامل نمو Matrigel المخفض (GFR) ،Corning354230للثقافة
العضويةمصفوفة Matrigel hESC المؤهلة ، 354277 Corning الخالية من LDEVلثقافة hiPSC
MgCl2 ، 1 مترThermo FisherAM9530G
Microinjector PicoPump + Foot SwitchWorld Precision InstrumentsSYS-PV820
Microloader أطراف ماصة 0.5 إلى 20 & micro ؛ LEppendorf5242956003لتحميل الشعيرات الدموية الزجاجية
Mowiol 4-88Sigma Aldrich81381
mTeSR 1STEMCELL Technologies85850Stem Stem Medium
N-2 supplementGibco17502048Forebrain medium 2 و 3 & nbsp ؛ (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
NaClSigma AldrichS5886
NaHCO3Sigma AldrichS5761
NEB Next High Fidelity 2x PCR Mastermix نيو إنجلاند بيولابزM0541S
غرفة العد نيوباورالعلامة التجارية718605
الوسط العصبيالعصبي جيبكو21103049وسط الدماغ الأمامي 4 & nbsp ؛ (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002) 15< / sup>
الأحماض الأمينية غير الأساسيةgibco & nbsp ؛11140050وسط الدماغ الأمامي 1 و 2 و 3 و 4 (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002) 15< / sup>
المزدوجة الخالية من Nucleaseالحمض النووي المتكاملة1072570
O. C. T. CompoundTissue-Tek4583التضمين لعينة الأنسجة المجمدة
P3 الخلية الأولية 4D-Nucleofector X Kit S LonzaV4XP-3032
بارافورمالدهايدفيشر كيميكالP / 0840/53
pCAG-GFPAddgene11150
Peel-A-Way تضمين القالب المقتطع T12Polysciences Inc.18986-1لتضمين hCOs للاهتزاز والمقطع بالتبريد
البنسلين - الستربتومايسين (10,000 وحدة / مل)   ؛Gibco15140122Forebrain medium 1 و 2 و 3 و 4   ؛ (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002) 15< / sup> ولوسط الخلايا الجذعية بعد النوة
طبق بتري 60 مم × 15 مم ، بدون تنفيس ،معقمة CorningBP50-02
، فجوة 5 ممHarvard Apparatus BTX45-0504
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)مصنوع في المنزل
Proteinase KSigma AldrichP2308من ألبوم Titrachium ؛ 10 مجم / مل من
QIAquick Gel Extraction KitQiagen28706
RHO / ROCK مثبط المسار (Y-27632)STEMCELL Technologies72308
SB-431542STEMCELL Technologies72232Forebrain medium 2 & nbsp ؛ (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002) 15< / sup>
سترات الصوديوم ثنائي هيدراتسيجما ألدريتشW302600-1KG-K
كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS)سيجما ألدريتشL3771
السكروز   ؛شرائح التصاق Sigma AldrichS7903
SuperFrost PlusFisher Scientific10149870
SZX10 مع KL 300 LEDOlympusSZX10أو مجسم بديل
Thermo ShakerGrant bioPSC24N
Triton-XSigma AldrichT9284المعروف أيضا باسم Octoxinol 9
Trizma baseSigma AldrichT1503لصنع TrisHCl
Trypan Blue Solution ، 0.4٪Thermo Fisher15250061
TrypLE Express Enzyme (1x)Thermo Fisher12604021enzmye لصنع معلقات أحادية الخلية
Tween 20Sigma AldrichP1379المعروف أيضا باسم Polysorbate 20
ملح TyrodeSigma AldrichT2145-10x1l
تهتز ميكروتوم (اهتزاز) لايكاVT1200 S
عريض التجويف 1000 & مايكرو; L نصائح تصفية صالحعالمي CorningTF-1005-WB-R-S
&b;-MercaptoethanolGibco 21985-023وسط الدماغ الأمامي 1 و 3 و 4   (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
مخروطية تقنيات جهاز من النوع الرابع Gibco 17104019 في CMCB DD https://hpscreg.eu/cell-line/CRTDi004-A Dibutyryl-cAMP المعطل بالحرارة القلم فائقة الخالي من LDEV تقنيات الحمض النووي المتكاملة تقنيات وسيط غرفة قطب كهربائي بلاتيني مخزون تفكك

المراجع

  1. Rakic, P. Evolution of the neocortex: A perspective from developmental biology. Nat Rev Neurosci. 10 (10), 724-735 (2009).
  2. Pollen, A. A., Kilik, U., Lowe, C. B., Camp, J. G. Human-specific genetics: New tools to explore the molecular and cellular basis of human evolution. Nat Rev Genet. 24, 687-711 (2023).
  3. Llinares-Benadero, C., Borrell, V. Deconstructing cortical folding: Genetic, cellular and mechanical determinants. Nat Rev Neurosci. 20 (3), 161-176 (2019).
  4. Florio, M., Huttner, W. B. Neural progenitors, neurogenesis and the evolution of the neocortex. Development. 141 (11), 2182-2194 (2014).
  5. Lui, J. H., Hansen, D. V., Kriegstein, A. R. Development and evolution of the human neocortex. Cell. 146 (1), 18-36 (2011).
  6. Bölicke, N., Albert, M. Polycomb-mediated gene regulation in human brain development and neurodevelopmental disorders. Dev Neurobiol. 82 (4), 345-363 (2022).
  7. Arlotta, P., Pasca, S. P. Cell diversity in the human cerebral cortex: From the embryo to brain organoids. Curr Opin Neurobiol. 56, 194-198 (2019).
  8. Long, K. R., et al. Extracellular matrix components HAPLN1, lumican, and collagen I cause hyaluronic acid-dependent folding of the developing human neocortex. Neuron. 99 (4), 702-719.e6 (2018).
  9. Namba, T., et al. Human-specific arhgap11b acts in mitochondria to expand neocortical progenitors by glutaminolysis. Neuron. 105 (5), 867-881.e9 (2020).
  10. Hendriks, D., et al. Human fetal brain self-organizes into long-term expanding organoids. Cell. 187 (3), 712-732.e38 (2024).
  11. Voices: The importance of fetal tissue research. Cell Stem Cell. 24 (3), 357-359 (2019).
  12. Temple, S., Goldstein, L. S. B. Why we need fetal tissue research. Science. 363 (6424), 207(2019).
  13. Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).
  14. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
  15. Qian, X., et al. Sliced human cortical organoids for modeling distinct cortical layer formation. Cell Stem Cell. 26 (5), 766-781.e9 (2020).
  16. Kelava, I., Lancaster, M. A. Dishing out mini-brains: Current progress and future prospects in brain organoid research. Dev Biol. 420 (2), 199-209 (2016).
  17. Pasca, S. P. The rise of three-dimensional human brain cultures. Nature. 553 (7689), 437-445 (2018).
  18. Mansour, A. A., et al. An in vivo model of functional and vascularized human brain organoids. Nat Biotechnol. 36 (5), 432-441 (2018).
  19. Andrews, M. G., et al. Lif signaling regulates outer radial glial to interneuron fate during human cortical development. Cell Stem Cell. 30 (10), 1382-1391.e5 (2023).
  20. Velasco, S., et al. Individual brain organoids reproducibly form cell diversity of the human cerebral cortex. Nature. 570 (7762), 523-527 (2019).
  21. Bershteyn, M., et al. Human ipsc-derived cerebral organoids model cellular features of lissencephaly and reveal prolonged mitosis of outer radial glia. Cell Stem Cell. 20 (4), 435-449.e4 (2017).
  22. Klaus, J., et al. Altered neuronal migratory trajectories in human cerebral organoids derived from individuals with neuronal heterotopia. Nat Med. 25 (4), 561-568 (2019).
  23. Qian, X., et al. Loss of non-motor kinesin KIF26A causes congenital brain malformations via dysregulated neuronal migration and axonal growth as well as apoptosis. Dev Cell. 57 (20), 2381-2396.e13 (2022).
  24. Watanabe, M., et al. Self-organized cerebral organoids with human-specific features predict effective drugs to combat zika virus infection. Cell Rep. 21 (2), 517-532 (2017).
  25. Benito-Kwiecinski, S., et al. An early cell shape transition drives evolutionary expansion of the human forebrain. Cell. 184 (8), 2084-2102.e19 (2021).
  26. Cubillos, P., et al. The growth factor epiregulin promotes basal progenitor cell proliferation in the developing neocortex. EMBO J. 43 (8), 1388-1419 (2024).
  27. Kanton, S., et al. Organoid single-cell genomic atlas uncovers human-specific features of brain development. Nature. 574 (7778), 418-422 (2019).
  28. Mora-Bermudez, F., et al. Differences and similarities between human and chimpanzee neural progenitors during cerebral cortex development. Elife. 5, e18683(2016).
  29. Pollen, A. A., et al. Establishing cerebral organoids as models of human-specific brain evolution. Cell. 176 (4), 743-756.e17 (2019).
  30. Esk, C., et al. A human tissue screen identifies a regulator of ER secretion as a brain-size determinant. Science. 370 (6519), 935-941 (2020).
  31. Fleck, J. S., et al. Resolving organoid brain region identities by mapping single-cell genomic data to reference atlases. Cell Stem Cell. 28 (6), 1177-1180 (2021).
  32. Li, C., et al. Single-cell brain organoid screening identifies developmental defects in autism. Nature. 621 (7978), 373-380 (2023).
  33. Janson, C. G., Mcphee, S. W., Leone, P., Freese, A., During, M. J. Viral-based gene transfer to the mammalian CNS for functional genomic studies. Trends Neurosci. 24 (12), 706-712 (2001).
  34. Tabata, H., Nakajima, K. Labeling embryonic mouse central nervous system cells by in utero electroporation. Dev Growth Differ. 50 (6), 507-511 (2008).
  35. Li, S., Li, Y., Li, H., Yang, C., Lin, J. Use of in vitro electroporation and slice culture for gene function analysis in the mouse embryonic spinal cord. Mech Dev. 158, 103558(2019).
  36. Kalebic, N., et al. CRISPR/cas9-induced disruption of gene expression in mouse embryonic brain and single neural stem cells in vivo. EMBO Rep. 17 (3), 338-348 (2016).
  37. Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: Visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).
  38. Walantus, W., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of e16 rat embryos. J Vis Exp. 6, e236(2007).
  39. Takahashi, M., Sato, K., Nomura, T., Osumi, N. Manipulating gene expressions by electroporation in the developing brain of mammalian embryos. Differentiation. 70 (4-5), 155-162 (2002).
  40. Kalebic, N., Langen, B., Helppi, J., Kawasaki, H., Huttner, W. B. In vivo targeting of neural progenitor cells in ferret neocortex by in utero electroporation. J Vis Exp. (159), e61171(2020).
  41. Kawasaki, H., Iwai, L., Tanno, K. Rapid and efficient genetic manipulation of gyrencephalic carnivores using in utero electroporation. Mol Brain. 5, 24(2012).
  42. Kawasaki, H., Toda, T., Tanno, K. In vivo genetic manipulation of cortical progenitors in gyrencephalic carnivores using in utero electroporation. Biol Open. 2 (1), 95-100 (2013).
  43. Reillo, I., De Juan Romero, C., Garcia-Cabezas, M. A., Borrell, V. A role for intermediate radial glia in the tangential expansion of the mammalian cerebral cortex. Cereb Cortex. 21 (7), 1674-1694 (2011).
  44. Kalebic, N., et al. Human-specific ARHGAP11B induces hallmarks of neocortical expansion in developing ferret neocortex. Elife. 7, e41241(2018).
  45. Johnson, M. B., et al. Aspm knockout ferret reveals an evolutionary mechanism governing cerebral cortical size. Nature. 556 (7701), 370-375 (2018).
  46. Fischer, J., Heide, M., Huttner, W. B. Genetic modification of brain organoids. Front Cell Neurosci. 13, 558(2019).
  47. Giandomenico, S. L., et al. Cerebral organoids at the air-liquid interface generate diverse nerve tracts with functional output. Nat Neurosci. 22 (4), 669-679 (2019).
  48. O'neill, A. C., et al. A primate-specific isoform of plekhg6 regulates neurogenesis and neuronal migration. Cell Rep. 25 (10), 2729-2741.e26 (2018).
  49. Buchsbaum, I. Y., et al. Ece2 regulates neurogenesis and neuronal migration during human cortical development. EMBO Rep. 21 (5), e48204(2020).
  50. Fischer, J., et al. Human-specific arhgap11b ensures human-like basal progenitor levels in hominid cerebral organoids. EMBO Rep. 23 (11), e54728(2022).
  51. Tynianskaia, L., Esiyok, N., Huttner, W. B., Heide, M. Targeted microinjection and electroporation of primate cerebral organoids for genetic modification. J Vis Exp. 193, e65176(2023).
  52. Denoth-Lippuner, A., Royall, L. N., Gonzalez-Bohorquez, D., Machado, D., Jessberger, S. Injection and electroporation of plasmid DNA into human cortical organoids. STAR Protoc. 3 (1), 101129(2022).
  53. Qian, X., et al. Generation of human brain region-specific organoids using a miniaturized spinning bioreactor. Nat Protoc. 13 (3), 565-580 (2018).
  54. Qian, X., et al. Brain-region-specific organoids using mini-bioreactors for modeling zikv exposure. Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).
  55. Noack, F., et al. Joint epigenome profiling reveals cell-type-specific gene regulatory programmes in human cortical organoids. Nat Cell Biol. 25 (12), 1873-1883 (2023).
  56. Doudna, J. A., Charpentier, E. Genome editing. The new frontier of genome engineering with crispr-cas9. Science. 346 (6213), 1258096(2014).
  57. Doench, J. G., et al. Rational design of highly active sgrnas for crispr-cas9-mediated gene inactivation. Nat Biotechnol. 32 (12), 1262-1267 (2014).
  58. Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of crispr-cas9 for genome engineering. Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).
  59. Völkner, M., et al. Hbegf-tnf induce a complex outer retinal pathology with photoreceptor cell extrusion in human organoids. Nat Commun. 13 (1), 6183(2022).
  60. Schütze, T. M., Bölicke, N., Sameith, K., Albert, M. Brain Organoid Research. , Springer US. New York, NY. (2022).
  61. ALT-R CRISPR-cas9 system-in vitro. cleavage of target DNA with RNP complex. , At https://eu.idtdna.com/pages/products/crispr-genome-editing/alt-r-crispr-cas9-system#resources (2022).
  62. Albert, M., et al. Epigenome profiling and editing of neocortical progenitor cells during development. EMBO J. 36 (17), 2642-2658 (2017).
  63. Platt, R. J., et al. CRISPR-cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).
  64. Florio, M., et al. Human-specific gene ARHGAP11B promotes basal progenitor amplification and neocortex expansion. Science. 347 (6229), 1465-1470 (2015).
  65. Schmidt, U., Weigert, M., Broaddus, C., Myers, G. Cell Detection with Star-Convex Polygons. , Springer International Pubs. Cham. (2018).
  66. Wang, J. Y., Doudna, J. A. CRISPR technology: A decade of genome editing is only the beginning. Science. 379 (6629), eadd8643(2023).
  67. Hoffmann, J., et al. Canonical and non-canonical PRC1 differentially contribute to the regulation of neural stem cell fate. bioRxiv. , 2024(2024).
  68. Celotti, M., et al. Protocol to create isogenic disease models from adult stem cell-derived organoids using next-generation crispr tools. STAR Protoc. 5 (3), 103189(2024).
  69. Taverna, E., Götz, M., Huttner, W. B. The cell biology of neurogenesis: Toward an understanding of the development and evolution of the neocortex. Annu Rev Cell Dev Biol. 30, 465-502 (2014).
  70. Arai, Y., et al. Neural stem and progenitor cells shorten s-phase on commitment to neuron production. Nat Commun. 2, 154(2011).
  71. Bedbrook, C. N., Deverman, B. E., Gradinaru, V. Viral strategies for targeting the central and peripheral nervous systems. Annu Rev Neurosci. 41, 323-348 (2018).
  72. Coquand, L., et al. A cell fate decision map reveals abundant direct neurogenesis bypassing intermediate progenitors in the human developing neocortex. Nat Cell Biol. 26 (5), 698-709 (2024).
  73. Fleck, J. S., et al. Inferring and perturbing cell fate regulomes in human brain organoids. Nature. 621 (7978), 365-372 (2023).
  74. Andersen, J., et al. Generation of functional human 3D cortico-motor assembloids. Cell. 183 (7), 1913-1929.e26 (2020).
  75. Nwokoye, P. N., Abilez, O. J. Bioengineering methods for vascularizing organoids. Cell Rep Methods. 4 (6), 100779(2024).
  76. Cakir, B., Park, I. H. Getting the right cells. Elife. 11, e80373(2022).
  77. Revah, O., et al. Maturation and circuit integration of transplanted human cortical organoids. Nature. 610 (7931), 319-326 (2022).

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

CRISPR Cas9
التثقيب الكهربائي للعضيات القشرية البشرية المقطعة لدراسات وظيفة الجينات
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.