يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

التشريح بالتبريد والتلوين المناعي لشبكية العين في الفأر

3K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/67622

⸱

فبراير 28, 2025

 ,  ,  ,  , 
1The Key Laboratory for Human Disease Gene Study of Sichuan Province and Department of Laboratory Medicine, Sichuan Provincial People's Hospital, School of Medicine, University of Electronic Science and Technology of China, 2Research Unit for Blindness Prevention of Chinese Academy of Medical Sciences (2019RU026), Sichuan Academy of Medical Sciences & Sichuan Provincial People's Hospital

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

يتم وصف بروتوكول لإعداد استئصال شبكية الفئران بالتبريد وإجراء التلوين المناعي على المستقبلات الضوئية. تمكن هذه المقالة الباحثين من إنتاج أقسام مجمدة لشبكية العين باستمرار مع مورفولوجيا محفوظة جيدا ونتائج تلطيخ مناعي عالية الجودة.

الملخص

يعد تقطيع الأنسجة والكيمياء المناعية من التقنيات الأساسية في الدراسات النسيجية والمرضية لأمراض الشبكية باستخدام النماذج الحيوانية. تتيح هذه الطرق إجراء فحوصات مفصلة لأشكال الأنسجة وتوطين بروتينات معينة داخل الأنسجة ، والتي توفر رؤى قيمة حول عمليات وآليات المرض. الفئران هي النموذج الأكثر استخداما لهذا الغرض. ومع ذلك ، نظرا لأن مقل عيون الفأر صغيرة وشبكية العين الفئرانية هي أنسجة حساسة للغاية ، فإن الحصول على أقسام شبكية عالية الجودة وصور تلطيخ مناعي من مقل عيون الفأر عادة ما يكون أمرا صعبا. تصف هذه الدراسة بروتوكولا محسنا لاستئصال شبكية الفئران بالتبريد وإجراء الكيمياء المناعية. تتضمن النقطة الأساسية في هذا البروتوكول طلاء مقلة العين بطبقة من الغراء الفائق ، مما يمنع تشوه مقل العيون أثناء عمليات إزالة القرنية واستخراج العدسة وتضمينها. تضمن هذه الخطوة الحفاظ على سلامة أشكال الشبكية بشكل جيد. يسلط هذا البروتوكول الضوء على الاعتبارات الفنية الهامة واستراتيجيات التحسين لإنتاج أقسام الشبكية عالية الجودة باستمرار وتحقيق نتائج ممتازة في التلوين المناعي.

المقدمة

يعد التشريح بالتبريد والكيمياء المناعية (IHC) من التقنيات التي لا غنى عنها في البحوث الطبية الحيوية ، خاصة لدراسة الهياكل البيولوجية المعقدة مثل شبكيةالعين 1. هذه المنهجيات المتقدمة جزء لا يتجزأ من فهم التركيب الخلوي المعقد والتنظيم الجزيئي لشبكية العين. إنها توفر للباحثين القدرة على التحقيق في وظائف الشبكية وعلم الأمراض على مستوى مفصل ، مما يوفر رؤى ضرورية لتطوير المعرفة في هذا المجال.

يلعب التشريح بالتبريد دورا حيويا في الحفاظ على السلامة المورفولوجية لأنسجة الشبكية. يضمن بقاء البنية الدقيقة لشبكية العين سليمة ، مما يسمح باستخدام الأقسام في دراسات الفلورسنت المناعي اللاحقة بدقة وموثوقية عالية. بالمقارنة مع الطرق الأخرى ، مثل تضمين البارافين ، فإن القطع بالتبريد له مزايا كبيرة لأنه يحافظ بشكل أفضل على كل من مورفولوجيا الأنسجة والمستضدية ، مما يجعله مناسبا بشكل خاص للتلوين الكيميائي المناعي2. تم اعتماد تقنية القسم المجمد على نطاق واسع لدراسة مجموعة من الأنسجة المعقدة وحتى الهياكل الخلوية الدقيقة3 ، مما يتيح إجراء تحليلات دقيقة لبنيتها.

IHC هي تقنية معملية قوية ومتعددة الاستخدامات تسمح بتصور توطين بروتينات معينة داخل الأنسجة. أصبحت هذه التقنية حجر الزاوية في كل من الإعدادات السريرية والبحثية ، حيث يتم استخدامها على نطاق واسع للتشخيص ومراقبة الأمراض والتحقيقات البيولوجية. يعتمد نجاح تجربة IHC بشكل كبير على التحضير الدقيق للعينة ، والتعامل الدقيق مع الأنسجة ، والتحكم الدقيق في حالات التلوين المناعي. يمكن أن تؤثر الاختلافات الصغيرة في البروتوكول بشكل كبير على جودة النتائج ، مما يؤكد أهمية التوحيد القياسي والتحسين1.

عند الجمع بين التشريح بالتبريد و IHC يوفر مزايا لا مثيل لها للباحثين الذين يسعون إلى استكشاف التوزيع المكاني ومستويات التعبير والتفاعلات الخلوية للبروتينات المختلفة داخل شبكية العين. تسمح هذه المنهجيات بإجراء تحقيقات مفصلة في الآليات الجزيئية التكمن وراء تطور الشبكية ووظيفتها ومرضها. هذه الأفكار ذات قيمة خاصة في دراسة اضطرابات الشبكية ، بما في ذلك الضمور البقعي المرتبط بالعمر ، واعتلال الشبكية السكري ، والتهاب الشبكية الصباغي. من خلال توضيح الفيزيولوجيا المرضية لهذه الحالات ، يساهم التشريح بالتبريد و IHC في تحديد المؤشرات الحيوية المحتملة وتطوير استراتيجيات علاجية جديدة.

على الرغم من فائدته ، فإن العمل مع شبكية العين يمثل تحديات فريدة. تستخدم الفئران على نطاق واسع كنماذج حيوانية في أبحاث طب العيون نظرا لتشابهها الجيني مع البشر وبنية شبكية العين المميزة جيدا. ومع ذلك ، فإن الحصول على عمليات الاستئصال بالتبريد عالية الجودة أمر صعب بطبيعته بسبب صغر حجم أنسجة شبكية الفأر وطبيعتها الحساسة. توفر هذه الدراسة منهجية مفصلة للتقطيع بالتبريد وإجراء IHC على شبكية العين ، مع تسليط الضوء على الاعتبارات الفنية الهامة وتقديم استراتيجيات التحسين لمواجهة هذه التحديات. من خلال تحسين هذه التقنيات ، يمكن للباحثين تحقيق نتائج متسقة وعالية الجودة ، وتعزيز دراسة بيولوجيا الشبكية وعلم الأمراض.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

التزم الإجراء بالمبادئ التوجيهية التي وضعتها جمعية أبحاث الرؤية وطب العيون لاستخدام في البحث. تم الحصول على الموافقة من اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدامه (IACUC) التابعة للمستشفى الشعبي لمقاطعة سيتشوان. تم استخدام ذكور الفئران C57Bl / 6J ، الذين تتراوح أعمارهم بين شهرين وثلاثة أشهر ووزنهم 25-30 جراما ، لهذا البروتوكول. وترد قائمة شاملة بالكواشف والمعدات المستخدمة في هذه الدراسة في جدول المواد.

1. إعداد الكاشف

  1. 1x PBS المخزن المؤقت
    1. تزن 8 جم من كلوريد الصوديوم ، و 1.42 جم من Na2HPO4 ، و 0.42 جم من KH2PO4 ، و 0.2 جم من KCl باستخدام مقياس. انقلها إلى دورق وأضف كمية مناسبة من الماء المقطر المزدوج (ddH2O) لإذابة المكونات. صب المحلول في قارورة حجمية سعة 1 لتر واضبط مستوى الصوت على 1 لتر مع ddH2O.
  2. محلول بارافورمالدهايد (PFA) بنسبة 4٪
    1. أضف 0.4 جم من مسحوق PFA و 15 ميكرولتر من 1 M هيدروكسيد الصوديوم إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل يحتوي على 8 مل من 1x PBS عازلة. ضع الأنبوب في حمام مائي مضبوطة على 60 درجة مئوية لإذابة مسحوق PFA تماما. اضبط مستوى الصوت النهائي إلى 10 مل باستخدام 1x PBS.
  3. حل حجب IHC
    1. اجمع بين 1 مل من مصل الحمير العادي ، و 20 ميكرولتر من 20٪ NaN3 ، و 200 ميكرولتر من 20٪ Triton X-100 ، و 18.78 مل من 1x PBS المخزن المؤقت. تخلط جيدا.
  4. محلول السكروز 30٪
    1. قم بإذابة 15 جم من السكروز في 40 مل من 1x PBS المخزن المؤقت. اضبط مستوى الصوت على 50 مل باستخدام 1x PBS المؤقت واخلطه حتى يذوب تماما.
  5. محلول الأجسام المضادة الثانوية IHC
    1. تمييع الجسم المضاد للماعز المترافق Alexa Fluor 488 بنسبة 1: 300 و DAPI بنسبة 1: 2,000 باستخدام المخزن المؤقت للحجب المعد.

2. التشريح بالتبريد مقلة العين

  1. تشريح مقلة العين
    1. تخدير فأر C57Bl / 6 البالغ من العمر 3 أشهر (حوالي 25 جم) عن طريق الحقن داخل الصفاق من 2٪ ثلاثي البروم الإيثانول بجرعة 15 ميكرولتر / غرام من وزن الجسم. التضحية بالفأر باستخدام خلع عنق الرحم (باتباع البروتوكولات المعتمدة مؤسسيا).
    2. ضع علامة على الجانب العلوي من مقلة العين بعلامة زرقاء على الصلبة (الشكل 1 أ). قم بإزالة مقل العيون باستخدام المقص.
    3. في حالة وجود أي دم على سطح مقلة العين ، امسحه برفق باستخدام منديل خال من النسالة. تحت مجهر تشريح ، قم بإزالة العضلات خارج العين المرتبطة بمقل العيون بعناية.
  2. تثبيت
    1. انقل مقل العيون المقطوعة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق دائري القاع سعة 2 مل يحتوي على 1 مل من 4٪ PFA. إصلاح مقل العيون لمدة 10 دقائق. بعد ذلك ، انقل مقل العيون إلى طبق بتري مقلوب مقاس 3 أو 6 سم.
    2. تحت مجهر تشريح ، قم بعمل شق صغير (حوالي 1-2 مم) على القرنية باستخدام ملقط دقيق ومقص للعيون. ضع مقل العيون مرة أخرى في محلول PFA بنسبة 4٪ لمدة ساعتين إضافيتين من التثبيت على الجليد (الشكل 1 ب).
  3. الحماية بالتبريد
    1. قم بإزالة المثبت وغسل مقل العيون ثلاث مرات باستخدام محلول عازلة 1x PBS. انقل مقل العيون إلى أنبوب طرد مركزي دقيق دائري القاع سعة 2 مل يحتوي على 1 مل من محلول السكروز بنسبة 30٪ للحماية بالتبريد عند 4 درجات مئوية. اسمح لمقل العيون بالاستقرار في قاع الأنبوب أو اتركها طوال الليل.
  4. طلاء مقلة العين
    1. انقلي مقلة العين إلى طبق بتري مقلوب بحيث يكون جانب القرنية متجها لأعلى. امسح المحلول الزائد من القرنية باستخدام منديل خال من النسالة. اغمس قطعة 2-3 سم من خيط التنس في الغراء (المكون من سيانواكريلات) الموجود في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 0.2 مل ، ثم قم بإزالته بسرعة.
    2. تحت مجهر تشريح ، قم بإرفاق أحد طرفي خيط التنس بالغراء الفائق المتبقي في وسط القرنية الرطبة. اترك الغراء يتجمد لمدة 10-20 ثانية. أمسك الطرف الآخر من خيط التنس واغمس مقلة العين في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 200 ميكرولتر مملوء بالغراء الفائق ، مما يضمن غمر الصلبة بالكامل لمدة 1 ثانية تقريبا.
    3. قم بإزالة مقلة العين بسرعة واغمرها في PBS (الشكل 1C). سوف يتجمد الغراء الموجود على سطح الصلبة على الفور.
  5. إزالة القرنية
    1. امسح PBS الزائد على سطح الغراء المتصلب باستخدام منديل خال من النسالة. تحت مجهر تشريح ، قم بإزالة القرنية بمقص العين أثناء الإمساك بخيط التنس المرفق.
  6. تضمين
    1. باستخدام الملقط ، قم باستخراج العدسة بعناية من واقية العين. امتص أي محلول سكروز زائد محاصر داخل منظار العين بشريط من المناديل الخالية من النسالة. انقل واقية العين إلى قالب تضمين مملوء بمركب درجة حرارة القطع المثلى (OCT).
    2. املأ واقية العين بالكامل ب OCT. ضع واقية العين بحيث تواجه الجدار الجانبي لقالب التضمين ، مع التأكد من أن المستوى السهمي مواز لأسفل القالب. استخدم العلامة الزرقاء على الصلبة كمرجع. انقل قالب التضمين الذي يحتوي على واقية العين إلى فريزر -80 درجة مئوية (الشكل 1 د). سيتم تجميد كوب العين في غضون خمس دقائق.
  7. التقطيع بالتبريد
    1. انقل كوب العين المجمد إلى ناظم البرد على -20 درجة مئوية واتركه يتوازن داخل الغرفة لمدة 30 دقيقة. قسم كوب العين بسمك 12 ميكرومتر. قم بتركيب الأقسام على شرائح زجاجية موجبة الشحنة للاستخدام اللاحق.

3. تلطيخ كيميائي مناعي

  1. الخبز
    1. ضع الأجزاء المجمدة على شرائح واخبزها في فرن 37 درجة مئوية لمدة 30-60 دقيقة لضمان التصاق الأنسجة بشكل صحيح بالشريحة.
  2. غسل
    1. باستخدام قلم PAP ، ارسم دائرة حول الأقسام الموجودة على الشريحة. اغمر الشريحة في جرة Coplin تحتوي على 1x PBS buffer. ضع برطمان كوبلن على شاكر بطيء واغسل الأقسام لمدة 2 × 10 دقائق لإزالة مركب OCT.
  3. الحجب والنفاذية
    1. ضع الشريحة أفقيا في غرفة الرطوبة. أضف محلول الحجب إلى الأقسام المحاطة بدائرة واسمح بالحظر والنفاذية في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
  4. حضانة الأجسام المضادة الأولية
    1. استنشق محلول الحظر بعناية من الشريحة. أضف الجسم المضاد الأساسي المخفف في محلول المانع إلى الأقسام. احتضان الأقسام في غرفة الرطوبة عند 4 درجات مئوية طوال الليل لضمان الارتباط الأمثل للجسم المضاد بالمستضد المستهدف.
  5. حضانة الأجسام المضادة الثانوية
    1. استنشق محلول الأجسام المضادة الأساسي واغسل الشريحة مرتين باستخدام 1x PBS لمدة 2 × 10 دقائق. أضف الجسم المضاد الثانوي المناسب ، الممزوج ب DAPI ، ومخفف في محلول الحظر.
    2. احتضان الأقسام في غرفة رطوبة داكنة في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة للسماح بربط الأجسام المضادة الثانوية والتلوين المضاد باستخدام DAPI.
  6. تصاعد
    1. قم بشفط محلول الأجسام المضادة الثانوية واشطف الشريحة باستخدام 1x PBS لمدة 2 × 10 دقائق. استخدم Kimwipe لمسح أي PBS متبقي على الشريحة.
    2. ضع كمية مناسبة من وسيط التثبيت المضاد للبهتان على الأقسام وقم بتغطيتها بغطاء غطاء. قم بتخزين العينات المركبة عند 4 درجات مئوية في الظلام للحفاظ على التألق ومنع التبييض الضوئي.

4. التصوير

  1. احصل على إشارات مضان من أقسام الشبكية الملطخة بالمناعة باستخدام مجهر متحد البؤر بالمسح بالليزر. اضبط الإعدادات للحصول على الدقة والحساسية المثلى لالتقاط إشارات مضان واضحة ومميزة.
  2. تأكد من استخدام المرشحات المناسبة للكشف عن الأطوال الموجية المحددة للفلوروفورات المستخدمة في التجربة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

باتباع البروتوكول الموضح أعلاه ، تم تثبيت عيون الفئران البرية C57Bl / 6J البالغة من العمر شهرا واحدا في 4٪ PFA. ثم تم تضمين العينات الثابتة في OCT وقطعها بالتبريد. تم تلطيخ الأقسام بجسم مضاد مضاد ل PDE6B وتم تلطيخها باستخدام DAPI لتسمية النوى. PDE6B هو بروتين نقل ضوئي يتم التعبير عنه على وجه التحديد في خلايا المستقبلات الضوئية للقضيب4. بالمقارنة مع البروتوكولات التقليدية ، يعمل هذا البروتوكول على تحسين كل من مورفولوجيا شبكية العين وجودة الصور المناعية الفلورية بشكل كبير ، مما يوفر تناسقا كبيرا. تو...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يؤثر عدد من العوامل على جودة أقسام الأنسجة ، بما في ذلك تكوين محلول التثبيت ، ووقت التثبيت والحماية من التبريد ، وطرق التضمين5. عند استئصال مقلة العين من الفأر ، من الضروري إزالة العضلات خارج العين والأنسجة الضامة الأخرى المرتبطة بمقلة العين. إذا لم تتم إزالتها بشكل صحيح ، يمكن أن تسبب هذه الأنسجة تشوه مقلة العين أثناء الاستخراج من محجر العين ، مما قد يؤدي إلى انفصال الشبكية. أثناء عملية التثبيت ، يجب إجراء شق في القرنية لتحرير ضغط العين (IOP). بدون هذا الشق ، قد ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين أي تعارض للإفصاح عنه.

شكر وتقدير

تم دعم هذا المشروع البحثي من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (82371059 (HZ) ، 82102470 (JW)) ، وبرنامج سيتشوان للعلوم والتكنولوجيا (2023JDZH0002 (HZ)).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
-80 درجة ؛ C الفريزرHaierDW-86L626
شرائح مجهر الالتصاقCITOTEST80312-3161
Alexa488-Goat Anti-RabbitProteintechSA00006-2
C57BL / 6J ماوسمختبر جاكسون664
Cryosection microtomeLeicaN / A
CryostatLEICAN / A
تقنية إشارات الخليةDAPI4083S
مجهر تشريحZEISS3943030830
مصل الحمارSolarbioS9100
قوالب التضمينThermo Fisher Scientific1841
مقص تشريح دقيقRWDS13001-10
ملقط ناعمRWDF11020-11
فلورومانت تصاعد مائي متوسطSigma-AldrichF4680
حاضنةشنغهاي YuejinN / A
KClSigma-Aldrich1049330500
KH2< / sub>PO4< / sub>Sigma-Aldrich1048771000
KimwipesThermo Fisher ScientificFIS-06666
مجهر ليزر متحد البؤرZEISSN / A
غطاء مجهر زجاجيCITOTEST80340-3610
Na 2< / sub >HPO4< / sub>Sigma-Aldrich1065860500
NaClSigma-AldrichS9888
NaOHSigma-Aldrich1091371003
مركب OCTساكورا4583
قلم عنقسيجما ألدريتشZ672548
PFAسيجما ألدريتش441244
أرنب مضاد ل PDE6BProteintech22063-1-AP
شاكرSCILOGEX8042210200
مقص زنبركيRWDS11036-08
السكروزBioFroxx1245GR500
سوبر غراءديلي7147S
سلسلة تنس (1.24 مم)GosenTS761
TribromoethanolMacklinT831042
Triton X-100SolarbioIT9100
الرحم

المراجع

  1. Tokuyasu, K. T. Immunochemistry on ultrathin frozen sections. Histochem J. 12 (4), 381-403 (1980).
  2. Ramos-Vara, J. A., Miller, M. A., et al. When tissue antigens and antibodies get along: Revisiting the technical aspects of immunohistochemistry--the red, brown, and blue technique. Vet Pathol. 51 (1), 42-87 (2014).
  3. Usukura, E., et al. A cryosectioning technique for the observation of intracellular structures and immunocytochemistry of tissues in atomic force microscopy (AFM). Sci Rep. 7 (1), 6462(2017).
  4. Park, P. S. Supramolecular organization of rhodopsin in rod photoreceptor cell membranes. Pflugers Arch. 473 (9), 1361-1376 (2021).
  5. Boonstra, H., Oosterhuis, J. W., Oosterhuis, A. M., Fleuren, G. J. Cervical tissue shrinkage by formaldehyde fixation, paraffin wax embedding, section cutting and mounting. Virchows Arch A Pathol Anat Histopathol. 402 (2), 195-201 (1983).
  6. Stradleigh, T. W., Ishida, A. T. Fixation strategies for retinal immunohistochemistry. Prog Retin Eye Res. 48, 181-202 (2015).
  7. Thavarajah, R., Mudimbaimannar, V. K., Elizabeth, J., Rao, U. K., Ranganathan, K. Chemical and physical basics of routine formaldehyde fixation. J Oral Maxillofac Pathol. 16 (3), 400-405 (2012).
  8. Li, L., et al. An improved method for preparation of mouse retinal cryosections. Eur J Histochem. 64 (3), 3154(2020).
  9. Yang, J., et al. A quick protocol for the preparation of mouse retinal cryosections for immunohistochemistry. Open Biol. 11 (7), 210076(2021).
  10. Szel, A., et al. Unique topographic separation of two spectral classes of cones in the mouse retina. J Comp Neurol. 325 (3), 327-342 (1992).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

التقطيع بالتجميد لشبكية الفأرالتلوين المناعي لمقاطع الشبكيةنماذج أمراض الشبكيةالكيمياء النسيجية المناعية للشبكيةتقطيع الأنسجةمورفولوجيا شبكية الفأرالتموضع البروتيني في الشبكيةالحماية من التجميد للشبكيةوسم الشبكية بالأجسام المضادةالتصوير الفلوري للشبكية
التشريح بالتبريد والتلوين المناعي لشبكية العين في الفأر
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.