مقالة منهجية

نموذج إعادة برمجة البلاعم المشتقة من الخلايا الأحادية البشرية للمقايسات في المختبر

DOI:

10.3791/67651

⸱

أبريل 18, 2025

 , 
1Instituto de Medicina Experimental (IMEX), Academia Nacional de Medicina-CONICET, 2Instituto de Farmacología, Facultad de Medicina, Universidad de Buenos Aires

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الخلايا الوحيدة والضامة هي خلايا مناعية بلاستيكية للغاية وقابلة لإعادة البرمجة ضرورية للصحة والمرض. إنهم يشعرون ويستجيبون لمجموعة واسعة من المحفزات من خلال اعتماد برامج تمايز وأنماط ظاهرية محددة. لقد قمنا بتوحيد نموذج في المختبر لدراسة استقطاب البلاعم وإعادة البرمجة ، مما يوفر أداة قيمة للبحث.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
< p class = "jove_content" >خلايا سلالة الخلية الأحادية والبلاعم متعددة الوظائف وتوجد في جميع أنسجة الجسم تقريبا. إنهم ينسقون مراحل بدء المناعة الفطرية والتكيفية وحلها ، مما يؤثر بشكل كبير على المناعة الوقائية والإصابة المرضية بوساطة المناعة. في حين أن البلاعم المقيمة في الأنسجة هي لاعب رئيسي في الحفاظ على التوازن في حالة مستقرة ، يتم تجنيد كميات كبيرة من الخلايا الوحيدة من الدم المحيطي إلى الأنسجة بعد التلف أو الإهانات الالتهابية. يمكن أن تتمايز البلاعم المشتقة من الخلايا الوحيدة (M-DM) إلى العديد من الأنواع الفرعية الديناميكية ، وتعتمد أنماطها الظاهرية ووظائفها على بيئة الأنسجة المحلية.

لمقارنة المحفزات المختلفة أو الظروف البيئية أثناء تمايز واستقطاب M-DM ، قمنا بتوحيد نموذج في المختبر ل M-DM M0 البشري غير المستقطب وبعض البلاعم المستقطبة بالسيتوكين الكاردينالية ، و M1 المشتق من IFNγ / LPS ، و M2a المشتق من IL-4 ، و IL-10 أو M2c المشتق من الديكساميثازون ، لتحليل إعادة البرمجة المنحرفة ل M-DM عن طريق قياس التدفق الخلوي و PCR في الوقت الفعلي. وجدنا أن CD64 و CD206 و CD163 و CD14 و MERTK يمكنهم التمييز بوضوح بين M0 غير المستقطب و M1 و M2a و M2c المستقطبة عن طريق قياس التدفق الخلوي. علاوة على ذلك ، حددنا IRF1 و CXCL10 كجينات محددة للنصوص الكلاسيكية المشتقة من IFNγ / LPS M1- و IRF4- و CCL22- و TGM2 الخاصة ب M2a المشتقة من IL-4 ، وجين MERTK ل M2c المشتق من الديكساميثازون. للتلخيص ، يمكن أن يعطي بروتوكول M-DM القياسي الخاص بنا خريطة المختبر الأساسية لتحليل تمايز واستقطاب M-DM البشري تحت محفزات متنوعة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

البلاعم ، التي تم تحديدها لأول مرة من قبل Metchnikoff لقدرتها على البلعمة ، هي خلايا قديمة أساسية لحياة Metazoan. توجد في كل مكان في الثدييات البالغة ، وتظهر تنوعا تشريحيا ووظيفيا ملحوظا. كجزء من نظام البلعمة أحادية النواة ، جنبا إلى جنب مع الخلايا المتغصنة والخلايا الوحيدة ، تلعب البلاعم أدوارا حاسمة في العمليات البيولوجية المختلفة ، من التطور والتوازن إلى الاستجابات المناعية ضد مسببات الأمراض< فئة الدعم = "xref">1،< sup class = "xref">2. تعمل البلاعم المقيمة ، المتخصصة في بيئاتها الدقيقة للأنسجة ، كحراس ، تراقب صحة الأنسجة وتستجيب للتغيرات الفسيولوجية والتهديدات الخارجية. يعتقد أن اللدونة المحدودة هي تكيف تطوري للحفاظ على توازن الأنسجة. في المقابل ، تكون الخلايا الوحيدة المجندة أكثر مرونة ويمكن أن تتمايز إلى أنماط ظاهرية متنوعة من البلاعم أثناء الالتهاب. يشكل هذا التأثير المزدوج للالتهاب ومكانة الأنسجة التنوع الوظيفي للبلاعم < فئة الرفع = "xref" >3. وبالتالي ، اعتمادا على بيئة الأنسجة المحلية ، يمكن أن تتمايز البلاعم المشتقة من الخلايا الأحادية (M-DM) إلى العديد من الأنواع الفرعية. تحدد المستقلبات المحلية ، وعوامل النمو ، والسيتوكينات ، والتفاعل بين الخلية والخلية < فئة sup = "xref" >4 ، < sup class = "xref" >5 ، < sup class = "xref" >6 أنماطها الظاهرية ووظائفها. علاوة على ذلك ، تعد البلاعم منتجا رئيسيا للعوامل التي تثبط الالتهاب وتدفع إعادة الأوعية الدموية وإصلاح الأنسجة< فئة sup = "xref">7،8.

بالنظر إلى أن ثلاثة استقطاب رئيسي على الأقل للحد من التسلح (ظروف خارجية وجوهرية وبيئة نسيجية) ، يجب النظر إلى استقطاب البلاعم على أنه متعدد الأبعاد < فئة الدعم = "xref">2. تتمثل العقبات والمزالق الرئيسية في وصف تمايز البلاعم والاستقطاب في الظروف التجريبية غير المتجانسة عبر الأدبيات وعدم وجود توافق في الآراء حول تحديد مصطلحات البلاعم في المختبر وفي الجسم الحي التجارب < فئة الرافعة = "xref" >9. ومع ذلك ، فقد بدأ بعض توحيد المعايير التجريبية لسيناريوهات تجريبية متنوعة.

لفهم مجال البلاعم البشري بشكل أفضل ، نحتاج إلى نماذج موحدة ومحددة جيدا في المختبر ل M-DM للربط والتمايز والاستقطاب والنمط الظاهري وإعادة البرمجة ، بالإضافة إلى وظائف محددة. كان هدفنا هو وضع نموذج موحد في المختبر ل M-DM M0 البشري غير المستقطب والضامة المستقطبة بالسيتوكين لدراسة إعادة برمجة M-DM عن طريق قياس التدفق الخلوي وتفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي. على الرغم من أن استقطاب البلاعم هو عملية ديناميكية بسبب اللدونة العالية وقدرتها على دمج إشارات متعددة من بيئتها ، فقد وصفنا هنا M-DM غير المستقطب (M0) وبعض حالات الاستقطاب في المختبر ، باعتبارها المؤيدة للالتهابات الكلاسيكية ، المعترف بها أيضا باسم M1 ، المستحثة مع IFNγ و LPS. وبالمثل ، يمكن تعريف إصلاح الأنسجة والضامة M2 التنظيمية على أنها M2a عند تحفيزها باستخدام IL-4 و M2c عند تحفيزها باستخدام ديكساميثازون أو IL-10. تلتقط هذه الحالات المستقطبة لقطة من طيف بيئة M-DM الواسع في الزمان والمكان ولكنها تعطينا بعض النقاط الأساسية لتعيين الخريطة التحليلية لتحديد مكان تحديد ظروف الاختبار.

على الرغم من المزيج المعقد والديناميكي لعلامات السطح وبرامج النسخ ، عند التحليل في المختبر M-DM ، حددنا أن CD64 و CD206 و CD163 و CD14 و MERTK يمكنهم فصل حالة M0 غير المستقطبة ، من M1 المستحثة عن IFNγ / LPS ، و M2a المستحثة ب IL-4 ، و IL-10 أو ديكساميثازون الناجم عن قياس التدفق الخلوي. علاوة على ذلك ، تم تعريف التعبير الجيني IRF1 و CXCL10 على أنه محدد ل IFNγ / LPS M1 الناجم عن ذلك. نصوص IRF4- و CCL22- و TGM2 الخاصة ب M2a المشتقة من IL-4 ؛ وجين MERTK ل M2c المشتق من ديكساميثازون ، وتحديد نقاط أساسية إضافية لمقارنة إعادة برمجة الانحراف ل M-DM التي تم تحديها بمحفزات مختلفة أو حتى مزروعة مشتركة مع أنواع أخرى من الخلايا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

قدم جميع المتبرعين بالدم المتطوعين الأصحاء موافقة خطية مستنيرة ، وتمت الموافقة على الدراسة من قبل لجنة الأخلاقيات المؤسسية التابعة للأكاديمية الوطنية للطب (IMEX-CONICET-ANM) الأرجنتين. راجع جدول المواد للحصول على تفاصيل حول جميع المواد والكواشف المستخدمة في هذا البروتوكول.

< p class = "jove_title" >1. عزل خلايا الدم المحيطية أحادية النواة (PBMCs)

< p class = "jove_content" >ملاحظة: يتم عزل PBMCs من 40 مل من الدم المحيطي المضاد للتخثر مع سترات الصوديوم بنسبة 3.8٪ وباستخدام تدرج كثافة Ficoll-Hypaque (1077) الطرد المركزي. يتم تنفيذ هذا البروتوكول في ظل ظروف معقمة في خزانة السلامة البيولوجية BSL2.

  1. نقل عينة الدم المحيطية المضادة للتخثر المستلمة إلى أنابيب مناسبة سعة 15 مل أو 50 مل للطرد المركزي.
  2. عينات دم بأجهزة الطرد المركزي عند 200 × جم لمدة 15 دقيقة (التسارع: 4 تباطؤ: 2 ، عندما يكون الحد الأقصى 5) في درجة حرارة الغرفة للحصول على البلازما الغنية بالصفائح الدموية (PRP) في الأعلى والجزء الخلوي ، بما في ذلك خلايا الدم الحمراء والبيضاء أدناه. انظر <الفئة القوية = "xfig">الشكل 1.
  3. انقل الجزء العلوي (PRP) إلى أنابيب سعة 15 مل (إذا تم تخزين البلازما) ، وجهاز الطرد المركزي عند 600 × جم لمدة 10 دقائق (أقصى تسارع وتباطؤ) للحصول على جزء البلازما النهائي بدون الصفائح الدموية. قم بتخزين البلازما عند -20 درجة مئوية.
  4. قم بتخفيف الجزء الخلوي الذي تم الحصول عليه من الطرد المركزي الأول ، 2x (كحد أدنى) إلى 3x (كحد أقصى) باستخدام محلول ملحي معقم 1x مخزن بالفوسفات (1x PBS) يتم تسخينه مسبقا في درجة حرارة الغرفة. قم بتجانسها برفق واستخدم هذا الجزء المخفف للطرد المركزي لتدرج الكثافة Ficoll-Hypaque.
  5. انقل 15 مل من Ficoll-Hypaque إلى أنبوب معقم سعة 50 مل. ثم أضف 30 مل من الدم المخفف بعناية وببطء فوق Ficoll ، وتجنب خلط المراحل. إذا كنت تعمل مع 10 مل أو أقل من الدم المخفف ، فقم بنقل 4 مل من Ficoll-Hypaque إلى أنبوب 15 مل ثم أضف 10 مل من عينة الدم المخففة.
    ملاحظة: هذه الخطوة ضرورية للحصول على الجزء أحادي النواة.
  6. جهاز الطرد المركزي الأنبوب الذي يحتوي على Ficoll بالإضافة إلى الدم المخفف عند 600 × جم لمدة 25 دقيقة (التسارع: 1 ؛ التباطؤ: 0) في درجة حرارة الغرفة.
  7. قم بإزالة بعض الطبقة العلوية الصفراء باستخدام ماصة باستور معقمة سعة 3 مل. بعد ذلك ، اجمع بعناية الواجهة (جزء "الحلقة" أحادي النواة) المتكون بين الطبقة العليا الصفراء وطبقة Ficoll باستخدام ماصة باستور معقمة. تحتوي هذه "الحلقة" على الخلايا أحادية النواة (PBMC) ذات الأهمية.
    ملاحظة: يمكن جمع بعض مراحل البلازما المتبقية ، ولكن تأكد من تجنب مرحلة Ficoll ، لأنها قد تكون سامة ل PBMCs.
  8. انقل PBMCs التي تم جمعها إلى أنبوب جديد سعة 15 مل يحتوي على ما لا يقل عن 3 مل من 1x PBS المعقم. ثم قم بتعبئة الحجم المقابل من 1x PBS المعقم إلى 12-15 مل. جهاز الطرد المركزي PBMCs عند 600 × جم (أقصى تسارع وتباطؤ) لمدة 10 دقائق.
  9. تخلص من المادة الطافية واغسل PBMCs مرة أخرى. أعد تعليق حبيبات الخلية عن طريق إضافة 1 مل من 1x PBS المعقم ، ثم قم بتعبئة ما يصل إلى 12-14 مل مع 1x PBS معقم إضافي. الطرد المركزي للأنابيب عند 600 × جم (أقصى تسارع وتباطؤ) لمدة 10 دقائق.
  10. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات PBMC في 1x PBS معقم يحتوي على 2٪ من مصل الأبقار الجنيني المعطل (1x PBS-2٪ FBS) ورفع الحجم إلى 10 مل. استخدم عداد خلايا أوتوماتيكي أو عد الخلايا ، وقم بإعداد معلق خلية 1: 5 مخفف في بارد معقم 1x PBS ثم (1: 2) في Trypan Blue للحصول على تخفيف نهائي قدره 1:10. استخدم مجهر ضوئي للعد.
  11. قم بتدوير معلق PBMC عند 300 × جم لمدة 5 دقائق عند 8-10 درجات مئوية. أعد تعليق الخلايا في الحجم المطلوب من المعقم والبارد 1x PBS-2٪ FBS للحصول على تركيز نهائي يبلغ 108 خلايا / مل. اترك هذه الخلايا عند 4 درجات مئوية حتى الخطوة التالية.
    ملاحظة: إذا لم يتم استخدام PBMCs التي تم جمعها في نفس اليوم ، فمن المستحسن تجميدها في قارورة مبردة عند 108 خلايا / مل في وسائط التجميد المناسبة (90٪ من FBS تحتوي على 10٪ من ثنائي ميثيل سلفوكسيد ، DMSO). يحفظ في درجة حرارة -80 درجة مئوية في وعاء من البولي إيثيلين جلايكول طوال الليل للسماح للخلايا بالتجميد ببطء ، وبالتالي تقليل تلف الخلايا. في اليوم التالي ، انقل الخلايا إلى صندوق تخزين واتركها عند -80 درجة مئوية لبضعة أيام أو انقلها إلى خزان النيتروجين السائل لفترة تخزين طويلة.
فئة

2. فرز الخلايا الأحادية CD14 + باستخدام الخرز المغناطيسي

ملاحظة: تختلف كمية الخلايا الوحيدة CD14 الموجودة في PBMCs للمتبرعين الأصحاء اعتمادا على العمر والجنس. عند توفرها ، استخدم عداد الخلايا للحصول على النسبة المئوية للخلايا الوحيدة في كل عينة ثم احسب عدد PBMCs اللازمة لفرز الخلايا الوحيدة CD14 المطلوبة. إذا لم يكن هناك عداد خلوي متاح ، فيمكن اعتبار 10٪ من الخلايا الوحيدة لكل عينة PBMC نهجا واسعا< sup class = "xref" >4،6،7,10,11,12,13.

يتم عزل الخلايا الوحيدة

CD14 + باستخدام مجموعة اختيار CD14 الإيجابية البشرية < فئة الدعم = "xref" >5. لقد قمنا بتوحيد بروتوكول العزل باستخدام 1 إلى 2 × 107 PBMCs في 100 ميكرولتر من التفاعل. استخدم هذه النسبة للأرقام الأعلى. الحد الأدنى لحجم التفاعل المقترح هو 100 ميكرولتر ، حتى مع وجود عدد خلية أقل من 1 × 107 PBMCs.

  1. قم بإعداد معلق خلية PBMC بتركيز 1-2 × 108 خلايا / مل في 1x PBS-2٪ FBS يحتوي على 1 ملي مولار من حمض الإيثيلين دياأمين تترا أسيتيك (1x PBS-2٪ FBS-1 ملي مولار EDTA) ونقل الكمية المطلوبة من PBMCs إلى أنبوب دائري القاع من البوليسترين سعة 5 مل.
  2. أضف 10 ميكرولتر من كوكتيل الاختيار الإيجابي لكل 100 ميكرولتر من تعليق الخلية ، واخلطه جيدا ، واحتضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
  3. أضف 10 ميكرولتر من الجسيمات النانوية المغناطيسية لكل 100 ميكرولتر من تعليق الخلية ، وقم بتحريك الماصة بقوة لأعلى ولأسفل أكثر من 5 أضعاف لتعليق الجسيمات النانوية المغناطيسية بشكل موحد ، واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق < br / > ملاحظة: لا ينصح بالدوامة.
  4. أضف 1x PBS-2٪ FBS-1 mM EDTA المؤقت لرفع الحجم الإجمالي لتعليق الخلية إلى 2.5 مل. قم بتحريك الخلايا الموجودة في الأنبوب برفق لأعلى ولأسفل 2-3 مرات. أدخل الأنبوب في فارز المغناطيس واتركه بعيدا لمدة 5 دقائق.
  5. خذ المغناطيس واقلبه مع الأنبوب بحركة واحدة مستمرة ، وتخلص من الكسر الطافي. ستبقى الخلايا المصنفة مغناطيسيا داخل الأنبوب. اترك المغناطيس والأنبوب مقلوبين لمدة 2-3 ثوان ، ثم اقلبهما عموديا في وضع مستقيم.
    ملاحظة: اترك أي قطرات معلقة من فم الأنبوب. لا تهزهم أو تلطخهم.
  6. قم بإزالة الأنبوب من المغناطيس وأضف 2.5 مل من 1x PBS-2٪ FBS-1 mM EDTA المؤقت إلى الأنبوب مرة أخرى. قم بتمرير تعليق الخلية برفق لأعلى ولأسفل 2-3 مرات لخلطه. أدخل الأنبوب مرة أخرى في المغناطيس واتركه بعيدا لمدة 5 دقائق.
  7. في حركة واحدة مستمرة ، اقلب كل من المغناطيس والأنبوب ، وتخلص من الكسر الطافي. قم بإزالة الأنبوب من المغناطيس وأعد تعليق الخلايا بكمية مناسبة من 1x PBS-2٪ FBS buffer (بدون EDTA). الخلايا المحددة بشكل إيجابي جاهزة الآن للاستخدام.
    ملاحظة: مطلوب ما مجموعه فصلين لمدة 5 دقائق في المغناطيس.
  8. اغسل خلايا CD14 التي تم فرزها باستخدام 1x PBS-2٪ FBS buffer ، مما يجعل تعليق الخلية يصل إلى 12-14 مل لتخفيف أي EDTA متبقي ، ثم جهاز الطرد المركزي عند 600 × جم (أقصى تسارع وتباطؤ) لمدة 10 دقائق.
  9. تخلص من المادة الطافية وكرر الغسيل عن طريق تعليق حبيبات الخلية ب 1 مل من 1x PBS-2٪ FBS المؤقت أولا ثم قم بزيادة الحجم إلى 12-14 مل. الطرد المركزي للأنابيب عند 600 × جم (أقصى تسارع وتباطؤ) لمدة 10 دقائق.
  10. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا الوحيدة الإيجابية المحددة CD14 في 2 مل من المخزن المؤقت FBS 1x PBS-2٪. استخدم عداد الخلايا الأوتوماتيكي أو عد الخلايا عن طريق تخفيف تعليق الخلية (1: 5) في بارد معقم 1x PBS ثم (1: 2) في Trypan Blue باستخدام مجهر ضوئي. اترك الخلايا على الجليد حتى تحضير الزراعة.
    ملاحظة: يمكن اختبار نقاء الخلية عن طريق قياس التدفق الخلوي ، مع أخذ 50 ميكرولتر من تعليق الخلية وتلطيخه لخلايا CD14 + (استنساخ HCD14). يوصى بأكثر من 90٪ من النقاء.
  11. للاستزراع ، قم بتدوير معلق الخلية عند 300 × جم لمدة 5 دقائق عند 8-10 درجات مئوية. أعد تعليق الحبيبات بتركيز 106 خلايا / مل باستخدام RPMI 1640 مكملا بنسبة 10٪ FBS معطل و 1٪ بنسلين ستربتومايسين (RPMI-10٪ FBS-1٪ P / S).
    ملاحظة: من الأهمية بمكان استخدام FBS عالي الجودة ومنخفض السموم الداخلية ومعطل الحرارة. حافظ دائما على الجليد لتجنب التصاق الخلايا الأحادية بالجدار البلاستيكي قبل الطلاء.
فئة

3. تمايز واستقطاب البلاعم المشتق من الخلايا الأحادية (M-DM)

< p class = "jove_content" >ملاحظة: يتم إجراء استزراع M-DM عن طريق طلاء 2.5 × 105 CD14 + أحادي الخلايا في 48 بئرا تحتوي على 500 ميكرولتر من RPMI-10٪ FBS-1٪ P / S ويتم زراعتها في حاضنة رطبة عند 37 درجة مئوية مع ثاني أكسيد الكربون2 (5٪) لمدة 7 أيام. اختر الألواح المعالجة لتعزيز التصاق الخلايا الأحادية باللوحة.

  1. حدد جميع الظروف التجريبية المراد تشغيلها ، بما في ذلك آبار M-DM القاعدية (M0) ، و M1 الالتهابي ، وإصلاح الأنسجة M2a ، و M2c التنظيمي ، وظروف الاختبار المطلوبة.
  2. الماصة 250 ميكرولتر من معلق الخلية المحضرة في الخطوة 2.11 لبذر 2.5 × 105 CD14 + أحادية الخلايا في كل بئر.
  3. أضف 250 ميكرولتر من RPMI-10٪ FBS-1٪ P / S بالإضافة إلى 50 نانوغرام / مل من M-CSF إلى كل بئر لإكمال 500 ميكرولتر من الحجم الإجمالي.
  4. احتضان لوحة زراعة الخلايا في حاضنة مرطبة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 4 أيام للسماح بالخطوة الأولى من تمايز البلاعم.
    ملاحظة: تحقق بشكل دوري من تمايز ثقافة الخلية لمعرفة ما إذا كانت التغييرات المورفولوجية قد حدثت كما هو متوقع أو إذا كانت هناك خلايا غير متصلة غير مرغوب فيها.
  5. يستبدل نصف وسط الاستزراع (250 ميكرولتر من RPMI-10٪ FBS-1٪ P/S) في اليوم 4 من مزرعة M-DM. أضف السيتوكينات أو الكواشف لظروف الاستقطاب وزرعها لمدة 3 أيام (نقطة النهاية هي اليوم 7): LPS (1 نانوغرام / مل) بالإضافة إلى IFNγ (50 نانوغرام / مل) ل M1 ، IL-4 (40 نانوغرام / مل) ل M2a ، IL-10 (50 نانوغرام / مل) أو ديكساميثازون (0.1 ميكرومتر) ل M2c.
  6. حصاد M-DM في اليوم 7 لإجراء توصيف النمط الظاهري ، أو جمعها لتعبير mRNA كما هو موضح في الخطوتين التاليتين ، أو إجراء فحص وظيفي.
فئة

4. توصيف النمط الظاهري السطحي في M-DM المستقطب عن طريق قياس التدفق الخلوي

  1. تخلص من الحجم المتوسط الكلي للثقافة (500 ميكرولتر من صفيحة 48 بئرا) وأضف 200 ميكرولتر من 1x PBS-2٪ FBS-1 mM EDTA المخزن المؤقت لحصاد الخلايا. احتضن لمدة 20 دقيقة على الثلج ثم أضف 200 ميكرولتر من 1x PBS-2٪ FBS لتخفيف المخزن المؤقت EDTA. اجمع M-DM عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل في أنابيب دقيقة سعة 1.5 مل. اغسل هذه الخلايا المحصودة مرة واحدة باستخدام 1x PBS-2٪ FBS وأجهزة الطرد المركزي عند 800 × جم لمدة 3 دقائق.
  2. أعد تعليق حبيبات M-DM ب 200 ميكرولتر من 1x PBS-5٪ FBS وانقلها إلى صفيحة دقيقة مستديرة القاع ذات 96 بئرا للحجب في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة×.
  3. تحضير التركيبة المناسبة من الأجسام المضادة المترافقة مباشرة في 1x PBS - 2٪ FBS. قم بتلطيخ كل بئر أو حالة (1x) ب 50 ميكرولتر من لوحة الجسم المضاد واحتضانها عند 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة في الظلام.
    ملاحظة: هنا ، تتكون لوحة الأجسام المضادة من CD11b-APC / Cy7 و CD64-APC و CD163-PerCP / Cy5.5 و CD206-AlexaFluor 488 و CD14-PECy7 و MERTK-biotin بالإضافة إلى Streptavidin-PE. يتم سرد تركيز الأجسام المضادة المسبقة في الجدول 1.
  4. اغسل M-DM الملطخ بإضافة 150 ميكرولتر من 1x PBS وجهاز طرد مركزي عند 800 × جم لمدة 3 دقائق.
  5. لقياس صلاحية الخلية ، أضف 100 ميكرولتر من صبغة الجدوى القابلة للإصلاح Zombie Violet (1: 1,000 في 1x PBS) واحتضانها عند 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة في الظلام.
  6. اغسل الخلايا الملطخة بإضافة 100 ميكرولتر من 1x PBS وجهاز طرد مركزي عند 800 × جم لمدة 3 دقائق. كرر إجراء الغسيل باستخدام 200 ميكرولتر من 1x PBS.
  7. قم بالإصلاح عن طريق تعليق حبيبات M-DM ب 100 ميكرولتر من الكاشف المثبت (من مجموعة المثبت / النفاذية) واحتضانها لمدة 20 دقيقة على الجليد وفي الظلام.
    ملاحظة: لتحقيق التثبيت المناسب ، من الضروري تجانس حبيبات الخلية بشكل صحيح.
  8. اغسل M-DM بإضافة 100 ميكرولتر من 1x PBS-2٪ FBS وجهاز طرد مركزي عند 800 × جم لمدة 3 دقائق. كرر إجراء الغسيل باستخدام 200 ميكرولتر من 1x PBS-2٪ FBS.
  9. أعد تعليق حبيبات M-DM في 200 ميكرولتر من 1x PBS وقم بتشغيل الخلايا الملطخة في مقياس التدفق الخلوي.

5. ملف تعريف برنامج الجينات للتمييز بين استقطاب M-DM بواسطة qPCR

ملاحظة: في اليوم 7 من الثقافة ، يمكن حصاد 2.5 × 105 M-DM باستخدام كاشف استخراج الحمض النووي الريبي لعزل الحمض النووي الريبي الكلي عالي الجودة. يمكن أيضا إجراء عزل الحمض النووي الريبي باستخدام طرق بديلة ، مثل استخراج الحمض النووي الريبي المستند إلى العمود ومجموعة الشطف.

  1. تخلص من الحجم المتوسط الكلي للثقافة والتحلل M-DM عن طريق إضافة 350 ميكرولتر مباشرة من كاشف الاستخراج. قم بتجانس ونقل تعليق الخلية هذا إلى أنبوب دقيق خال من RNase / DNase سعة 1.5 مل واستمر في عزل الحمض النووي الريبي.
    ملاحظة: إذا لم يتم إجراء عزل الحمض النووي الريبي في نفس اليوم ، فيمكن تخزين العينة من الخطوة 5.1 عند 4 درجات مئوية طوال الليل أو -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى عام.
  2. للسماح بالتفكك الكامل لمركب البروتينات النووية ، احتضان العينات المتجانسة من الخطوة 5.1 لمدة 5 دقائق عند 25 درجة مئوية
  3. أضف 70 ميكرولتر من الكلوروفورم إلى كل عينة. قم بتغطية كل أنبوب بإحكام لمنع التسرب وخلط المحتويات جيدا عن طريق هز الأنبوب. احتضان العينات لمدة 2-3 دقائق ثم قم بالطرد المركزي للعينات عند 12,000 × جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية. ستفصل هذه الخطوة المراحل بالكامل إلى مرحلة سفلية من الفينول والكلوروفورم ، والطور البيني ، ومرحلة مائية علوية عديمة اللون.
    ملاحظة: يعتمد حجم الكلوروفورم على نسبة 0.2 مل من الكلوروفورم لكل 1 مل من كاشف الاستخراج المستخدم أثناء خطوة التحلل.
  4. انقل المرحلة المائية التي تحتوي على الحمض النووي الريبي إلى أنبوب دقيق جديد 1.5 مل خال من RNase / DNase.
    ملاحظة: اترك وراءك حجما صغيرا عند أخذ المرحلة المائية لتجنب نقل أي من الطور البيني أو الطبقات العضوية.
  5. أضف 175 ميكرولتر من الأيزوبروبانول إلى كل عينة لترسيب الحمض النووي الريبي. احتضن لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية أو بدلا من ذلك طوال الليل عند -20 درجة مئوية
    ملاحظة: يعتمد حجم الأيزوبروبانول على نسبة 0.5 مل من الأيزوبروبانول لكل مل من كاشف الاستخراج الأولي.
  6. الطرد المركزي للعينات عند 12,000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. سوف تترسب حبيبات بيضاء تشبه الهلام من إجمالي الحمض النووي الريبي في قاع الأنبوب. قم بإزالة المادة الطافية والتخلص منها بعناية باستخدام ماصة دقيقة.
  7. اغسل الحمض النووي الريبي عن طريق تعليق الحبيبات البيضاء الشبيهة بالهلام في 350 ميكرولتر من 75٪ إيثانول (1 مل لكل 1 مل من كاشف الاستخراج (v / v) المستخدم للتحلل).
    ملاحظة: يمكن تخزين الحمض النووي الريبي في 75٪ من الإيثانول لمدة تصل إلى عام واحد عند -20 درجة مئوية أو حتى أسبوع واحد عند 4 درجات مئوية.
  8. قم بتدوير الحبيبات المعلقة وجهاز الطرد المركزي لفترة وجيزة عند 7,500 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. جفف حبيبات الحمض النووي الريبي بالهواء أو نظفها بالمكنسة الكهربائية لمدة 5-10 دقائق < / > ملاحظة: لإذابة الحمض النووي الريبي ، تجنب الإفراط في تجفيف حبيبات الحمض النووي الريبي.
  9. أعد تعليق الحبيبات في 20-30 ميكرولتر من الماء الخالي من RNase عن طريق سحب العينة لأعلى ولأسفل. احتضن في حمام مائي أو كتلة حرارية مثبتة على درجة حرارة 55-60 درجة مئوية لمدة 10-15 دقيقة. تابع قياس تركيز الحمض النووي الريبي وتخزين الحمض النووي الريبي عند -70 درجة مئوية.
  10. قم بإجراء النسخ العكسي (نسخة (كدنا) باستخدام 100-500 نانوغرام من الحمض النووي الريبي (الحد الأدنى والحد الأقصى ، على التوالي) في 20 ميكرولتر من حجم التفاعل باستخدام مجموعة توليف (كدنا
    11. ).
  11. قم بتشغيل تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي باستخدام 1 ميكرولتر من (كدنا) (5-25 نانوغرام).
    1. قم بإعداد مزيج التفاعل لكل أنبوب (1x) باستخدام 5 ميكرولتر من خليط SYBR الأخضر (2x) ، و 0.2 ميكرولتر من كل برايمر (للأمام والعكسي) ، و 3.6 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكلياز. قم بقياس جميع المكونات وفقا لرقم العينة. امزج مزيج التفاعل جيدا وقم بتوزيع 9 ميكرولتر في كل أنبوب qPCR وأخيرا 1 ميكرولتر من (كدنا) للوصول إلى الحجم الإجمالي النهائي البالغ 10 ميكرولتر.
    2. قم ببرمجة بروتوكول الدورة الحرارية على جهاز PCR في الوقت الفعلي على النحو التالي: 2-3 دقائق عند 98 درجة مئوية (1x) ؛ 5-15 ثانية عند 98 درجة مئوية بالإضافة إلى 15-30 ثانية عند 60 درجة مئوية (35-40 ضعفا) ؛ وأخيرا قم بتضمين تحليل منحنى الذوبان (65-95 درجة مئوية) بزيادة 0.5 درجة مئوية عند 2-5 ثانية / خطوة أو استخدم الإعداد الافتراضي للأداة.
      ملاحظة: تم توحيد هذا التفاعل باستخدام مزيج SYBR Green العالمي. يتم سرد البادئات الموصى بها لتحليل الاستقطاب M-DM في الجدول 2.
  12. تطبيع النتائج باستخدام عامل استطالة الترجمة حقيقية النواة 1 ألفا 1 (EEF1A1) كجين مرجعي ، وتحقق من خصوصية المنتجات المضخمة من خلال تحليل منحنيات التفكك.
    ملاحظة: يسمح تحليل منحنى التفكك بتأكيد وجود منتج تضخيم qPCR واحد فقط في التفاعل.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بناء على عملنا في توصيف البلاعم لعدة سنوات ، قمنا بتعيين مجموعة دقيقة من العلامات التي تميز بوضوح المجموعات الفرعية المختلفة من M-DM في المختبر. تم اختيار علامات النمط الظاهري بناء على الأدبيات والفحص السابق الواسع الذي أجريناه سابقا< sup class = "xref">9,14,15,16,17. علاوة على ذلك ، قررنا أن CD64 و CD206 و CD163 و CD14 و MERTK يمكن أن تساعد في التمييز بوضوح بين M-DM غ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أصبح تمايز البلاعم وتنشيطها واستقطابها محورا مركزيا في علم المناعة ، وتوازن الأنسجة ، والتسبب في المرض ، وحل الالتهابات. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الصورة الناشئة التي تفيد بأن بلاعم الأنسجة قد تكون مشتقة من الخلايا الوحيدة المنتشرة في ظل ظروف التوازن المعطل تؤكد على ضرورة وجود نماذج دقيقة ل M-DM تتميز بأنماط ظاهرية محددة وبرامج نسخ ومسارات تنشيط.

يجب مناقشة بعض الخطوات الحاسمة في هذا البروتوكول هنا لتنفيذه بنجاح. أولا ، تجدر الإشارة إلى أن عينات الدم التي يتم من خلالها إنشاء مزارع M-DM الأولية قد...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين تضارب في المصالح للإفصاح عنها.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من قبل الوكالة الوطنية لتعزيز العلوم والتكنولوجيا (ANPCyT-FONCYT) من خلال المنح PICT 2018-3070 و 2021-I-A-00807 إلى E.A.C.S. و PICT 2021-I-A-00716 إلى A.E.E ، ومن قبل المجلس الوطني للبحث العلمي والتقني (CONICET) من خلال المنحة PIP 2022-0763 ومن قبل جامعة بوينس آيرس من خلال Proyectos de Investigación y Desarrollo en Áreas Estratégicas con Impacto Social (PIDAE) 2022 إلى A.E.E. E.A.C.S. و A.E.E. هم محققون مهنيون في CONICET.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
Alexa Fluor 488 ماوس مضاد للإنسان   ؛ استنساخ الأجسام المضادة CD206 15-2BioLegend ، سان دييغو ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية.القط # 321113 ؛ RRID: AB_571874
فأر APC مضاد للإنسان CD64 استنساخ الأجسام المضادة 10.1BioLegend ، سان دييغو ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية.القط # 305013 ؛ RRID: AB_1595539
APC / Cy7 الفئران المضادة للفأر / استنساخ الأجسام المضادة البشرية CD11b M1 / 70BioLegend ، سان دييغو ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية.القط # 101226 ؛ RRID: AB_830642
BD Cytofix / CytopermBD Biosciences ، سان خوسيه ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكيةCat # 554714مجموعة المثبت / النفاذية
بيوتين مضاد للإنسان MERTK استنساخ الأجسام المضادة 590H11G1E3BioLegend ، سان دييغو ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية.القط # 367616 ؛ RRID:AB_2721500 
معدات CFX-ConnectBio-Rad ، هرقل ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية
EasySep Human CD14 مجموعة الاختيار الإيجابية ؛ كوكتيل الاختيار الإيجابي EasySep. الجسيمات النانوية المغناطيسية EasySep. Easy Sep MagnetSTEMCELL Technologies ، فانكوفر ، كنداCat # 18058
FACS Canto cytometer بيكتون ديكنسون ، فرانكلين ليكس ، نيو جيرسي ، الولايات المتحدة الأمريكية.
مصل الأبقار الجنين ، مؤهل ، نيوزيلندا   ؛Gibco & trade;   ثيرمو فيشر العلمي
Waltham ، MA USA   ؛		Cat # 10091148
Ficoll-Paque PLUS CytivaGE Healthcare - علوم الحياة ، الولايات المتحدة الأمريكيةCat # 17144003
FlowJoFlowJo LLC.RRID:SCR_008520
GraphPad Prism   شركة GraphPad Software Inc.RRID: SCR_002798
iScript cDNA توليف كيت ، يتضمن مزيج تفاعل النسخ العكسي 5x ، النسخ العكسي iScript ، الماء الخالي من النوكليازBio-Rad ، هرقل ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكيةCat # 1708891
Partec CyFlow مقياس الخلوي الفضائي  Sysmex Partec ، ألمانيا
PE StreptavidinBioLegend ، سان دييغو ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية.Cat # 405203
PE / Cy7 فأر مضاد للإنسان CD14 استنساخ الأجسام المضادة HCD14BioLegend ، سان دييغو ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية.القط # 325618 ؛ RRID: AB_830691
PerCP / Cy5.5 الفأر المضاد للإنسان CD163 استنساخ الأجسام المضادة GHI / 61BioLegend ، سان دييغو ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية.القط # 333607 ؛ RRID:AB_1134006
RPMI 1640 جيبكو متوسطة& تجارة ؛   ثيرمو فيشر العلمي
Waltham ، MA USA   ؛		Cat # 11875119
SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix ، يحتوي على Sso7d fusi & n البوليميراز ، dNTPs ، MgCl2 ، SYBR Green I Dye ، المعززات ، المثبتات ، ومزيج من الأصباغ المرجعية السلبية (بما في ذلك ROX والفلورسين).Bio-Rad ، هرقل ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكيةCat # 1725271
TriZol كاشفThermo Fisher Scientific
Life Sciences Solutions
Carlsbad ، CA ، الولايات المتحدة الأمريكية   ؛		Cat #  كاشفاستخراج الحمض النووي الريبي
15596026 الزومبي البنفسجي Fixable Viability KitBioLegend ، سان دييغو ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية.القط # 423113

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. Macrophage biology in development, homeostasis and disease. Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).
  2. Murray, P. J. Macrophage polarization. Annu Rev Physiol. 79, 541-566 (2017).
  3. Guilliams, M., Svedberg, F. R. Does tissue imprinting restrict macrophage plasticity. Nat Immunol. 22 (2), 118-127 (2021).
  4. Nowak, W., et al. Pro-inflammatory monocyte profile in patients with major depressive disorder and suicide behaviour and how ketamine induces anti-inflammatory m2 macrophages by nmdar and mtor. EBioMedicine. 50, 290-305 (2019).
  5. Carestia, A., et al. Platelets promote macrophage polarization toward pro-inflammatory phenotype and increase survival of septic mice. Cell Rep. 28 (4), 896-908.e5 (2019).
  6. Olexen, C. M., et al. Increased axl(high) myeloid cells as pathognomonic marker in Langerhans cell histiocytosis and langerin expression dependence of mtor inhibition. Clin Immunol. 263, 110203(2024).
  7. Ortiz Wilczynski, J. M., et al. The synthetic phospholipid C8-C1P determines pro-angiogenic and pro-reparative features in human macrophages restraining the proinflammatory M1-like phenotype. Front Immunol. 14, 1162671(2023).
  8. Das, A., et al. Monocyte and macrophage plasticity in tissue repair and regeneration. Am J Pathol. 185 (10), 2596-2606 (2015).
  9. Murray, P. J., et al. Macrophage activation and polarization: Nomenclature and experimental guidelines. Immunity. 41 (1), 14-20 (2014).
  10. Carrera Silva, E. A., et al. CD207(+)CD1a(+) cells circulate in pediatric patients with active Langerhans cell histiocytosis. Blood. 130 (17), 1898-1902 (2017).
  11. Ferrer, M. F., et al. Junin virus triggers macrophage activation and modulates polarization according to viral strain pathogenicity. Front Immunol. 10, 2499(2019).
  12. Gattas, M. J., et al. A heterotypic tridimensional model to study the interaction of macrophages and glioblastoma in vitro. Int J Mol Sci. 22 (10), 5105(2021).
  13. Ortiz Wilczynski, J. M., et al. Gas6 signaling tempers Th17 development in patients with multiple sclerosis and helminth infection. PLoS Pathog. 16 (12), e1009176(2020).
  14. Ambarus, C. A., et al. Systematic validation of specific phenotypic markers for in vitro polarized human macrophages. J Immunol Methods. 375 (1-2), 196-206 (2012).
  15. Martinez, F. O., Gordon, S. The M1 and M2 paradigm of macrophage activation: Time for reassessment. F1000Prime Rep. 6, 13(2014).
  16. Martinez, F. O., et al. Genetic programs expressed in resting and IL-4 alternatively activated mouse and human macrophages: Similarities and differences. Blood. 121 (9), e57-e69 (2013).
  17. Vogel, D. Y., et al. Human macrophage polarization in vitro: Maturation and activation methods compared. Immunobiology. 219 (9), 695-703 (2014).
  18. Tiemessen, M. M., et al. CD4+CD25+FOXP3+ regulatory T cells induce alternative activation of human monocytes/macrophages. Proc Natl Acad Sci USA. 104 (49), 19446-19451 (2007).
  19. Bosurgi, L., et al. Macrophage function in tissue repair and remodeling requires IL-4 or IL-13 with apoptotic cells. Science. 356 (6342), 1072-1076 (2017).
  20. Sanin, D. E., et al. A common framework of monocyte-derived macrophage activation. Sci Immunol. 7 (70), eabl7482(2022).
  21. Rigamonti, E., Chinetti-Gbaguidi, G., Staels, B. Regulation of macrophage functions by PPAR-alpha, PPAR-gamma, and LXRS in mice and men. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 28 (6), 1050-1059 (2008).
  22. Zizzo, G., Hilliard, B. A., Monestier, M., Cohen, P. L. Efficient clearance of early apoptotic cells by human macrophages requires M2c polarization and MerTK induction. J Immunol. 189 (7), 3508-3520 (2012).
  23. Mccoll, A., et al. Glucocorticoids induce protein S-dependent phagocytosis of apoptotic neutrophils by human macrophages. J Immunol. 183 (3), 2167-2175 (2009).
  24. Xue, J., et al. Transcriptome-based network analysis reveals a spectrum model of human macrophage activation. Immunity. 40 (2), 274-288 (2014).
  25. Murray, P. J., et al. Macrophage activation and polarization: Nomenclature and experimental guidelines. Immunity. 41 (1), 14-20 (2014).
  26. Murray, P. J. Macrophage polarization. Annu Rev Physiol. 79, 541-566 (2017).
  27. Gordon, S. Alternative activation of macrophages. Nat Rev Immunol. 3 (1), 23-35 (2003).
  28. Hawley, K. L., et al. IFNgamma enhances CD64-potentiated phagocytosis of Treponema pallidum opsonized with human syphilitic serum by human macrophages. Front Immunol. 8, 1227(2017).
  29. Akinrinmade, O. A., et al. CD64: An attractive immunotherapeutic target for M1-type macrophage mediated chronic inflammatory diseases. Biomedicines. 5 (3), 56(2017).
  30. Martinez, F. O., Gordon, S. The M1 and M2 paradigm of macrophage activation: Time for reassessment. F1000Prime Rep. 6, 13(2014).
  31. Sudan, B., Wacker, M. A., Wilson, M. E., Graff, J. W. A systematic approach to identify markers of distinctly activated human macrophages. Front Immunol. 6, 253(2015).
  32. Martinez, F. O., et al. Genetic programs expressed in resting and IL-4 alternatively activated mouse and human macrophages: Similarities and differences. Blood. 121 (9), e57-e69 (2013).
  33. Platanitis, E., Decker, T. Regulatory networks involving STATs, IRFs, and NFkappab in inflammation. Front Immunol. 9, 2542(2018).
  34. Laplante, M., Sabatini, D. M. mTOR signaling in growth control and disease. Cell. 149 (2), 274-293 (2012).
  35. Covarrubias, A. J., Aksoylar, H. I., Horng, T. Control of macrophage metabolism and activation by mTOR and Akt signaling. Semin Immunol. 27 (4), 286-296 (2015).
  36. Shahbazian, D., Parsyan, A., Petroulakis, E., Hershey, J., Sonenberg, N. Eif4b controls survival and proliferation and is regulated by proto-oncogenic signaling pathways. Cell Cycle. 9 (20), 4106-4109 (2010).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Monocyte Derived MacrophagesMacrophage PolarizationIn Vitro ModelFlow CytometryReal Time PCRCytokine PolarizationPBMC IsolationCD14 MonocytesMacrophage DifferentiationPhenotypic Characterization

مقالات ذات صلة