يتيح الجمع بين التبييض التكراري والتمديد والتعددية (IBEX) ومقايسة وضع العلامات التجارية على النوكليوتيدات (Click-iT EdU) اكتشاف وتصنيف أنواع الخلايا المنقسمة في عمليات ديناميكية للغاية في أقسام أنسجة الفئران المجمدة الثابتة. علاوة على ذلك ، يوفر خط أنابيب معالجة الصور مفتوح المصدر الجديد الحصول على الصور وتحليلها عالي الإنتاجية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
سير عمل التصوير والتحليل عالي الإنتاجية لتقييم الأنماط الظاهرية لخلايا الجلد وحالات التكاثر في عينات الأنسجة
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تبدأ إصابات الجلد سلسلة متجددة معقدة تشرك أنواعا مختلفة من الخلايا. من بين هؤلاء ، تلعب الخلايا الدبقية الطرفية دورا مهما في ضمان نجاح عملية الإصلاح. ومع ذلك ، لا يزال فهمنا لهذه العمليات غير مكتمل بسبب القيود المفروضة على التقنيات الحالية. لذلك ، تم استخدام طريقة التبييض التكراري - التمديد - تعدد الإرسال (IBEX) لتوصيف التغييرات في التركيب الخلوي للجلد باستخدام الأجسام المضادة الموجهة ضد البروتينات التي يتم التعبير عنها بواسطة أنواع الخلايا والهياكل الرئيسية المشاركة في تجديد الأنسجة. الأهم من ذلك ، أن الأجسام المضادة الموجهة ضد علامات تكاثر الخلايا غالبا ما تقلل من عدد الخلايا المنقسمة في الجلد. للتغلب على هذا القيد ، تم دمج كيمياء Click-iT EdU مع طريقة IBEX ، مما يسمح بالتوصيف التفصيلي لأنواع الخلايا المتكاثرة. باستخدام مجهر متحد البؤر للقرص الدوار الآلي بالكامل ، تم تطوير سير عمل عالي الإنتاجية للتصوير التكراري للعينات المقسمة إلى ألواح 24 بئرا. بالإضافة إلى توسيع طريقة IBEX لتقييم حالات الخلايا في الموقع باستخدام Click-iT EdU ، تم أيضا تقديم خط أنابيب جديد لمعالجة الصور مفتوحة المصدر لإجراء تصحيح الصور والخياطة والتسجيل ، ويمكن استخدامه من قبل الباحثين الذين ليس لديهم خبرة واسعة في البرمجة. علاوة على ذلك ، يتم أيضا توفير وثائق مفصلة حول معالجة وتصور بيانات التصوير المتعددة الإرسال (باستخدام برامج تحليل الصور التقليدية ، بما في ذلك فيجي و QuPath). باختصار ، يسلط هذا البروتوكول الضوء على تعدد استخدامات بروتوكول IBEX ويوضح تكيفه مع منصة تصوير تقليدية راسخة. والجدير بالذكر أن الجمع بين IBEX ووضع العلامات Click-iT EdU يتيح اكتشاف وتصنيف أنواع الخلايا المنقسمة بنشاط في الأنسجة السليمة وأثناء العمليات الديناميكية للغاية عند الدقة المكانية.
المقدمة
الجلد هو أكبر عضو في جسم الإنسان والحاجز البدائي لحماية الجسم من البيئة الخارجية1. وبالتالي ، فإنه يتعرض لعدد كبير من التحديات الخارجية التي تضر بوظيفة الحاجز الخاصة به. لذلك ، طور الجلد آليات معقدة لاستعادة سلامة الأنسجة ووظائفها بعد التلف. يتم التئام جروح الجلد في ثلاث مراحل متداخلة: الالتهاب والتكاثر والنضج / إعادة التشكيل. تتضمن هذه المراحل الثلاث عدة أنواع مختلفة من الخلايا ، مثل الخلايا الليفية الجلدية والخلايا المناعية ، التي تعمل معا لاستعادة الخصائص البيولوجية الأولية لأنسجة الجلد المصابة1،2،3.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تم إجراء جميع تربية والإسكان والتجريب وفقا لإرشادات المكتب البيطري لكانتون زيورخ ، سويسرا.
1. جروح جلدية كاملة السماكة (اليوم 0)
- تحفيز الفئران البالغة من العمر 8-10 أسابيع مع 5٪ إيزوفلوران في 70٪ O2 والحفاظ عليها باستخدام 2.5٪ إيزوفلوران.
- حلق جلد الظهر ونظفه جيدا.
- تطهير قبل الجراحة باستخدام الصابون المضاد للبكتيريا ومحلول 70٪ EtOH.
- يتم تطبيق تسكين الألم قبل الجراحة باستخدام حقنة تحت الجلد من البوبرينورفين (30 ميكروغرام∙ملغ∙كغ−1).
- قم بإنشاء أربعة جروح استئصالية دائرية كاملة السماكة بقطر 5 مم على جلد أسفل الظهر لكل ، واثنان على كل جانب ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
تسمح هذه الطريقة بالكشف الكافي عن أنواع الخلايا المتكاثرة من خلال الجمع بين كيمياء EdU Click-iT مع IBEX في أقسام جلد الفئران المجمد الثابتة. تمت مقارنة الكشف عن أنواع الخلايا المتكاثرة باستخدام منهجيات مختلفة ، على وجه الخصوص ، وضع العلامات على أنواع الخلايا المتكاثرة باستخدام الأجسام المضادة Ki-67 والكشف عن تكاثر الخلايا باستخدام نهج الكيمياء EdU Click-iT (الشكل 1). لاحظنا أن تصنيف الأجسام المضادة Ki-67 يقلل من عدد الخلايا المتكاثرة في أقسام جلد الفئران المج.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
يعد تكاثر الخلايا أحد المراحل الأربع الرئيسية لإصلاح الجلد ، والانتقال بين المرحلة الالتهابية ومرحلة التكاثر أمر بالغ الأهمية لعملية إصلاح ناجحة20. تعد الاستجابة المناعية المنظمة جيدا أمرا ضروريا ، حيث يمكن أن يؤدي الالتهاب المطول إلى جروح مزمنة ، وهي مشكلة صحية عالمية كبيرة1،21. التكاثر هو عملية بيولوجية رئيسية ، ليس فقط لإصلاح الأنسجة ولكن أيضا لتطور الكائنات الحية وتقييم الأمراض ، بما في ذلك التسرطن. تو.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين مصالح متنافسة للإعلان.
شكر وتقدير
نود أن نعرب عن تقديرنا لمركز الفحص المجهري وتحليل الصور لدعمهم لمجهر MD ImageXpress ومركز خدمات المختبر لتربية الفئران. تم تمويل LS من منحتين من المؤسسة الوطنية السويسرية للعلوم (310030_192075 و 310030_207801) ، ومنحة المؤسسة السويسرية لأبحاث السرطان (KLS-5391-08-2021) ومن قبل SKINTEGRITY. اتحاد البحوث التعاونية CH. تم تمويل SS من منحة ما بعد الدكتوراه بجامعة زيورخ (FK-22-056).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| الأجسام المضادة والكواشف | مصدر | المعرف | التعليقات |
| <الأجسام المضادة القوية> < قوية> | |||
| CD31 أليكسا فلور 647 (الدورة 2) | بيو ليجند | قط#102516 | 1:100 |
| AB_2161029 | |||
| CD45 أليكسا فلور 488 (الدورة 2) | بيو ليجند | قط#103122 | 1:100 |
| AB_493531 | |||
| Ki-67 FITC (الدورة الأولى) | بيو ليجند | قط#151212 | 1:50 |
| AB_2814055 | |||
| دجاج Ki-67 (ck) | LSBio | قط#LS-C772946 | 1:800 |
| Ki-67 rat (rt) | بيو ليجند | قط#652402 | 1:100 |
| AB_11204254 | |||
| خيوط عصبية H& م (NF-H/NF-M) أليكسا فلور 647 (الدورة 3) | BioLegend | Cat#837710 | 1:300 |
| AB_2734613 | |||
| p75NTR (الدورة الأولى) | تقنية الإشارة الخلوية | Cat#8238 AB_10839265 | 1:1500 |
| فيمنتين أليكسا فلور 488 (الدورة 3) | بيو ليجند | قط#699305 | 1:100 |
| AB_2888889 | |||
| أليكسا فلور 647 ضد الأرنب الحمار | جاكسون إيمينوريسيرش | التصنيف#711-605-152 | |
| <قوة>كواشف | |||
| سيلفيس 24 بئر لوحة زجاجية قاعية | سيلفيس | P24-1.5H-N | |
| جيلاتين الكروم ألوم | مصدر الوافدين الجدد | Cat#1033A | |
| مجموعة Click-iT EdU | ثيرمو فيشر العلمي | C10637 | |
| هوشت 33342 | سيغما-ألدرتش | Cat#14533; CAS# 23491-52-3 | |
| LiBH4، بوروهايدريد الليثيوم، 95٪ | ثيرمو فيشر العلمي | قط#10438443 | |
| مركب ساكورا من Tissue-Tek O.C.T | سويسطور البيوسيستمز | Cat#7109-4583 | |
| برنامج تلفزيوني | ثيرمو فيشر العلمي | Cat#10010-015 | |
| شرائح المجهر الالتصاق من سوبرفروست بلز | إبريديا | قط#J1800AMNZ | |
| ترايتون X-100 | سيغما-ألدريتش | Cat#T8787 | |
| <قوي>معدات | |||
| فرشاة الشعر | فاوست إيه جي | Cat#9172051 و 9172050 | |
| شفرات الميكروتوم | سويسطور البيوسيستمز | قط#207500011 | |
| مجهر | الأجهزة الجزيئية، ImageXpress Confocal HT.ai | ||
| Oven | ثيرمو فيشر العلمي | قط#HBMCR4220 | |
| هزاز الروكر | إدموند بü هيلر جي إم بي إتش | قط#32310015 |
المراجع
- Eming, S. A., Martin, P., Tomic-Canic, M. Wound repair and regeneration: Mechanisms, signaling, and translation. Sci Transl Med. 6 (265), 265sr6(2014).
- Martin, P. Wound healing - aiming for perfect skin regeneration. Science. 276 (5309), 75-81 (1997).
- Gu....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
