سير عمل التصوير والتحليل عالي الإنتاجية لتقييم الأنماط الظاهرية لخلايا الجلد وحالات التكاثر في عينات الأنسجة

Summary

يتيح الجمع بين التبييض التكراري والتمديد والتعددية (IBEX) ومقايسة وضع العلامات التجارية على النوكليوتيدات (Click-iT EdU) اكتشاف وتصنيف أنواع الخلايا المنقسمة في عمليات ديناميكية للغاية في أقسام أنسجة الفئران المجمدة الثابتة. علاوة على ذلك ، يوفر خط أنابيب معالجة الصور مفتوح المصدر الجديد الحصول على الصور وتحليلها عالي الإنتاجية.

Abstract

تبدأ إصابات الجلد سلسلة متجددة معقدة تشرك أنواعا مختلفة من الخلايا. من بين هؤلاء ، تلعب الخلايا الدبقية الطرفية دورا مهما في ضمان نجاح عملية الإصلاح. ومع ذلك ، لا يزال فهمنا لهذه العمليات غير مكتمل بسبب القيود المفروضة على التقنيات الحالية. لذلك ، تم استخدام طريقة التبييض التكراري - التمديد - تعدد الإرسال (IBEX) لتوصيف التغييرات في التركيب الخلوي للجلد باستخدام الأجسام المضادة الموجهة ضد البروتينات التي يتم التعبير عنها بواسطة أنواع الخلايا والهياكل الرئيسية المشاركة في تجديد الأنسجة. الأهم من ذلك ، أن الأجسام المضادة الموجهة ضد علامات تكاثر الخلايا غالبا ما تقلل من عدد الخلايا المنقسمة في الجلد. للتغلب على هذا القيد ، تم دمج كيمياء Click-iT EdU مع طريقة IBEX ، مما يسمح بالتوصيف التفصيلي لأنواع الخلايا المتكاثرة. باستخدام مجهر متحد البؤر للقرص الدوار الآلي بالكامل ، تم تطوير سير عمل عالي الإنتاجية للتصوير التكراري للعينات المقسمة إلى ألواح 24 بئرا. بالإضافة إلى توسيع طريقة IBEX لتقييم حالات الخلايا في الموقع باستخدام Click-iT EdU ، تم أيضا تقديم خط أنابيب جديد لمعالجة الصور مفتوحة المصدر لإجراء تصحيح الصور والخياطة والتسجيل ، ويمكن استخدامه من قبل الباحثين الذين ليس لديهم خبرة واسعة في البرمجة. علاوة على ذلك ، يتم أيضا توفير وثائق مفصلة حول معالجة وتصور بيانات التصوير المتعددة الإرسال (باستخدام برامج تحليل الصور التقليدية ، بما في ذلك فيجي و QuPath). باختصار ، يسلط هذا البروتوكول الضوء على تعدد استخدامات بروتوكول IBEX ويوضح تكيفه مع منصة تصوير تقليدية راسخة. والجدير بالذكر أن الجمع بين IBEX ووضع العلامات Click-iT EdU يتيح اكتشاف وتصنيف أنواع الخلايا المنقسمة بنشاط في الأنسجة السليمة وأثناء العمليات الديناميكية للغاية عند الدقة المكانية.

Introduction

الجلد هو أكبر عضو في جسم الإنسان والحاجز البدائي لحماية الجسم من البيئة الخارجية¹. وبالتالي ، فإنه يتعرض لعدد كبير من التحديات الخارجية التي تضر بوظيفة الحاجز الخاصة به. لذلك ، طور الجلد آليات معقدة لاستعادة سلامة الأنسجة ووظائفها بعد التلف. يتم التئام جروح الجلد في ثلاث مراحل متداخلة: الالتهاب والتكاثر والنضج / إعادة التشكيل. تتضمن هذه المراحل الثلاث عدة أنواع مختلفة من الخلايا ، مثل الخلايا الليفية الجلدية والخلايا المناعية ، التي تعمل معا لاستعادة الخصائص البيولوجية الأولية لأنسجة الجلد المصابة^1،2،3.

الجلد هو عضو متعصيب بكثافة ، ومن المعروف أن تعصيب الأعصاب أمر بالغ الأهمية لعملية إصلاح ناجحة^4،5،6. بصرف النظر عن الإشارات المحورية^4،7،8 ، فإن الخلايا الدبقية المحيطية ، التي عادة ما تغلف المحاور ، تشارك في تجديد الأنسجة^{الناجح 9،10،11}. ومع ذلك ، فإن دور أنواع الخلايا الممثلة تمثيلا ناقصا ، مثل الخلايا الدبقية الطرفية ، لا يزال غير مفهوم جيدا في العمليات الديناميكية مثل تجديد أنسجة الجلد. لتحديد وظيفة هذه الخلايا بشكل أفضل ، من الأهمية بمكان تحليل البيئة المكروية الخلوية وأنواع الخلايا المجاورة التي قد تتفاعل معها أثناء عملية التجديد. علاوة على ذلك ، نظرا لأن تكاثر الخلايا هو مرحلة أساسية لتجديد الأنسجة ، فمن المهم اكتشاف وتصنيف أنواع الخلايا المتكاثرة بدقة طوال عملية الإصلاح.

تم تطوير طرق التصوير البصري متعددة الإرسال وعالية المحتوى ، مثل IBEX¹² ، لتوصيف التركيب الخلوي ، وتصور وقياس تفاعلات الخلية والخلية ، وتشريح أنماط البيئة الدقيقة داخل الأنسجة المعقدة بدقة مكانية. في حين أن طرق تعدد الإرسال الأخرى تتطلب أدوات متخصصة وكواشف خاصة ، فإن الميزة الخاصة ل IBEX هي أنه يمكن إنشاؤه بتكاليف منخفضة نسبيا باستخدام الأجسام المضادة والكواشف والمجاهر المتاحة تجاريا التي يمكن الوصول إليها في بيئة بحثية قياسية. في حين أن الأجسام المضادة المضادة ل Ki-67 ، والتي غالبا ما تستخدم في لوحات IBEX ، تصنف بشكل موثوق أنواع الخلايا المتكاثرة في العديد من الأنسجة^13،14 ، تم العثور على عدد خلايا Ki-67 الإيجابية (Ki-67 +) للتقليل من شأنه مقارنة بالمنهجيات الأخرى في أقسام الأنسجة المجمدة الثابتة من جروح جلد الفئران الحادة. لذلك ، قمنا بدمج كيمياء Click-iT EdU مع IBEX ووجدنا أن عدد خلايا EdU ⁺ يمثل بشكل أكثر دقة العدد الإجمالي للخلايا المتكاثرة التي تم الحصول عليها بواسطة منهجيات أخرى.

علاوة على ذلك ، من خلال استخدام مجهر متحد البؤر للقرص الدوار الآلي بالكامل ، تم إنشاء سير عمل عالي الإنتاجية للتصوير التكراري لأقسام الأنسجة الموضوعة في صفيحة مكونة من 24 بئرا. تتم معالجة الصور الناتجة بعد ذلك من خلال الجمع بين أدوات Python متعددة مفتوحة المصدر في خط أنابيب جديد لمعالجة الصور يصحح الصور للإضاءة غير المتساوية ، ويقوم بخياطة البلاط الفردي ، وفي النهاية تسجيل الصور. بالتفصيل ، تم استخدام مكتبة BaSiCPy¹⁵ لتصحيح الإضاءة ، ومكتبة m2stitch لخياطة الصور ، والارتباط المتقاطع للطور لتسجيل الدورة. يتم حفظ الصور المسجلة على شكل OME-TIFFs ويمكن بعد ذلك تحميلها في برامج تحليل الصور التقليدية ، مثل Fiji¹⁷ و QuPath¹⁸ ، حيث تتم معالجة الصور بعد ذلك بشكل أكبر ، ويمكن إجراء تصنيف نوع الخلية والقياسات الأخرى ، مثل حسابات الشدة والمسافة. مجتمعة ، سمح لنا البروتوكول الحالي بإجراء توصيف مفصل وعالي الكفاءة لأنواع الخلايا الرئيسية للجلد المتجدد ، مع التركيز بشكل خاص على البيئة المكروية الخلوية المحيطة بمجموعة الخلايا الدبقية المحيطية.

Protocol

تم إجراء جميع تربية والإسكان والتجريب وفقا لإرشادات المكتب البيطري لكانتون زيورخ ، سويسرا.

1. جروح جلدية كاملة السماكة (اليوم 0)

1. تحفيز الفئران البالغة من العمر 8-10 أسابيع مع 5٪ إيزوفلوران في 70٪ O₂ والحفاظ عليها باستخدام 2.5٪ إيزوفلوران.
2. حلق جلد الظهر ونظفه جيدا.
3. تطهير قبل الجراحة باستخدام الصابون المضاد للبكتيريا ومحلول 70٪ EtOH.
4. يتم تطبيق تسكين الألم قبل الجراحة باستخدام حقنة تحت الجلد من البوبرينورفين (30 ميكروغرام∙ملغ∙كغ⁻¹).
5. قم بإنشاء أربعة جروح استئصالية دائرية كاملة السماكة بقطر 5 مم على جلد أسفل الظهر لكل ، واثنان على كل جانب ، 1 سم من خط الوسط للحيوان ، وحوالي 2 سم على بعد بعضهما البعض¹⁹.
6. إجراء تسكين ما بعد الجراحة مع علاج البوبرينورفين لمدة 3 أيام من خلال مياه الشرب (9 ميكروغرام / مل مع 2٪ سكروز).
7. دع الجروح تلتئم بدون ضمادات.
8. اجمع الجروح في نقاط زمنية محددة للفحص النسيجي وتحليل قياس التدفق الخلوي.
9. بالنسبة لبروتوكول IBEX ، قم بتشريح أنسجة الجلد وتثبيتها بمحلول بارافورمالديهايد 4٪ (PFA) عند 4 درجات مئوية طوال الليل. استخدم كبسولة خزعة متوفرة تجاريا لمنع تجعد العينات أثناء التثبيت. Cryoprotect الأنسجة الثابتة 4٪ PFA في 30٪ سكروز في PBS بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية. انقل الأنسجة إلى خليط 1: 1 من السكروز بنسبة 30٪ مع مركب O.C.T لمدة ساعتين في RT وأخيرا قم بتضمينها في O.C.T قبل التجميد المفاجئ في الأيزوبنتان.

2. تحضير العينة (اليوم 1)

1. قم بتغطية اللوحة المكونة من 24 بئرا ب 200 ميكرولتر من جيلاتين شب الكروم لمدة 15 دقيقة على شاكر هزاز. ثم قم بإزالة الجيلاتين تماما وجفف الآبار المطلية لمدة 60 دقيقة في فرن 40 درجة مئوية. قم بمعطف ضعف الآبار اللازمة كنسخة احتياطية. أضف 2 مل من PBS لكل بئر.
   ملاحظة: تأكد من جفاف الطلاء تماما قبل وضع المنديل. يمكن أيضا طلاء الآبار قبل يوم واحد وتجفيفها طوال الليل في RT. بمجرد الطلاء ، لا تقم بتخزين الآبار المطلية في الثلاجة أو الفريزر ، وللحصول على أفضل النتائج ، استخدم الطبق المطلي المكون من 24 بئرا في غضون 1-2 أيام.
2. قم بقص الأنسجة المضمنة في O.C.T إلى سمك 15-30 ميكرومتر في التبريد ونقلها بسرعة إلى بئر مطلي يحتوي على 2 مل من PBS.
   ملاحظة: يمكن نقل الأنسجة باستخدام ملعقة معدنية أو ملقط.
3. قم بإزالة PBS بعناية باستخدام ماصة سعة 1 مل ، بهدف الحفاظ على قسم الأنسجة في منتصف البئر. للقيام بذلك بشكل فعال ، قم بشفط PBS ببطء من حواف البئر ، واضبط موضع الماصة حسب الحاجة لمنع الأنسجة من التحول.
   ملاحظة: يعد الوضع الدقيق للأنسجة أمرا ضروريا لنجاح البروتوكول. بمجرد أن تلتصق الأنسجة بالسطح المطلي ، لا يمكن إعادة وضعها.
4. جفف أقسام المناديل لمدة 1 ساعة في فرن 37 درجة مئوية.

3. حجب الأنسجة ، تفاعل EdU Click-iT ، ووضع العلامات المناعية للأجسام المضادة ، دورة IBEX 1 (اليوم 1)

1. أعد ترطيبه ب 1 مل من PBS لمدة 5 دقائق.
2. نفاذ الأنسجة ب 500 ميكرولتر من 0.5٪ تريتون في برنامج تلفزيوني لمدة 30 دقيقة في RT.
3. اغسل المناديل لفترة وجيزة 2x باستخدام PBS.
4. قم بإجراء تفاعل Click-iT ، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة ، لمدة 30 دقيقة في RT.
   ملاحظة: حافظ على العينات محمية من الضوء.
5. اغسل المناديل لفترة وجيزة 2x باستخدام PBS.
6. سد الأنسجة لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة (RT) باستخدام مخزن مؤقت حجب
   ملاحظة: هنا ، تم استخدام مصل الحمير بنسبة 10٪ في برنامج تلفزيوني في هذه التجربة ، ولكن يمكن تعديل ذلك حسب الحاجة. أي مخزن مؤقت للحظر متوافق مع بروتوكولات الملصقات المناعية القياسية مناسب.
7. تطبيق الأجسام المضادة الأولية (المخففة في المخزن المؤقت مانع ؛ انظر جدول المواد) للدورة الأولى بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية.
   ملاحظة: يمكن أيضا إجراء الحجب ووضع العلامات المناعية لمدة ~ 1 ساعة باستخدام ميكروويف غير مسخن ، كما هو موضح في Radtke et ^al.12. ومع ذلك ، بالنسبة للجروح الجلدية ، يتم الحصول على أفضل نسبة إشارة إلى ضوضاء عندما يتم تحضين الأجسام المضادة الأولية بين عشية وضحاها. يمكن تخزين أقسام الأنسجة ذات العلامات المناعية في برنامج تلفزيوني لعدة أيام قبل التصوير. يوصى بالتصوير في اليوم التالي للحصول على جودة إشارة مثالية.

4. وضع العلامات المناعية للأجسام المضادة الثانوية والبقع المضادة النووية (اليوم 2)

1. اغسل الآبار ب 3 × 1 مل من PBS.
2. احتضان قسم الأنسجة مع تلطيخ الأجسام المضادة الثانوية المضادة للأرانب (1: 300) في محلول حجب ، جنبا إلى جنب مع البقع المضادة النووية Hoechst 1: 1,000 ، لمدة ساعة واحدة في RT في الظلام.
3. اغسل 3 × 5 دقائق مع 1 مل من PBS في RT.
4. اترك ~ 500 ميكرولتر من PBS في كل بئر وأحضر اللوحة إلى المجهر.
   ملاحظة: يمكن أن تكون هذه نقطة توقف: تكون العينات مستقرة لعدة أيام عند 4 درجات مئوية ، لكن نسبة الإشارة إلى الضوضاء هي الأفضل عند تصويرها في غضون 24 ساعة من وضع العلامات المناعية.

5. إعداد المجهر وتصويره لدورة IBEX الأولى (اليوم 2)

1. قم بتسجيل الدخول إلى المجهر وقم بتحميل البرنامج ، وقم بتسجيل الدخول إلى ملف تعريف المستخدم.
2. أدخل إعداد الاستحواذ (مفتوح عبر الفرز | إعداد الاستحواذ) لتكوين البروتوكول والحصول على الصور.
3. استخدم زر الإخراج لتحميل اللوحة في المجهر.
4. نظف الجزء السفلي من اللوحة المكونة من 24 بئرا بنسبة 70٪ من الإيثانول قبل وضع اللوحة في المجهر. انقر فوق الزر Load Plate لتحميل اللوحة في المجهر.
5. حدد وضع التكبير والاكتساب المطلوب ضمن الهدف والكاميرا. كوضع الاستحواذ ، حدد وضع الشق متحد البؤر 51 ميكرومتر .
   ملاحظة: هنا ، تم استخدام هدف غمر في الماء 20x بفتحة عدسة عددية تبلغ 0.95 ، وقرص دوار بثقوب 50 ميكرومتر ، متباعدة عند 250 ميكرومتر للتجربة.
6. ضمن علامة التبويب لوحة ، حدد طراز اللوحة المستخدمة.
7. انتقل إلى لوحة / مواقع لزيارة التبويب. ضمن خيارات الموقع، انقر فوق عدد ثابت من المواقع. اختر عدد الأعمدة والصفوف بحيث يتم تغطية البئر بأكمله تقريبا. انقر على تداخل المواقع بنسبة 10٪.
   ملاحظة: يجب تنشيط هذا الزر لضمان خياطة البلاط الفردي.
8. حدد فقط البئر الأول المملوء للاستحواذ عن طريق النقر بزر الماوس الأيمن فوق البئر المقابل على خريطة البئر. الآبار المختارة خضراء والآبار غير المختارة رمادية.
9. انقل المرحلة إلى الموضع الذي يجب أن تكون فيه الأنسجة عن طريق النقر بزر الماوس الأيسر على البئر المملوء الأول في خريطة اللوحة وعلى موقع بالقرب من المركز في خريطة الموقع. ابحث عن لون أغمق للبئر والموقع يشير إلى الموضع الحالي.
10. انتقل إلى علامة التبويب الاكتساب . حدد الخيارين تمكين التركيز البؤري المستند إلى الليزر والحصول على سلسلة Z.
11. انتقل إلى علامة التبويب اكتساب/التركيز البؤري التلقائي . بالنسبة للتركيز البؤري التلقائي جيدا ، حدد خيار التركيز على اللوحة وأسفل البئر ، وبالنسبة للتركيز البؤري التلقائي للموقع ، حدد خيار جميع المواقع .
12. انتقل إلى علامة التبويب الأطوال الموجية واختر عدد الأصباغ المراد تصويرها في الدورة الحالية. ابحث عن العدد المقابل لعلامات التبويب الجديدة التي تفتح أسفل علامة التبويب الأطوال الموجية .
13. انتقل إلى علامة التبويب الطول الموجي الأولى. ضمن الإضاءة، حدد إعدادات المرشح الأنسب للفلوروفور محل الاهتمام (على سبيل المثال، اختر DAPI إذا تم استخدام Hoechst).
14. اختر Laser with z-offset لتحديد موضع z وانقر فوق الزر Calculate Offset لتعيين ارتفاع التصوير الصحيح. سيتم الحصول على سلسلة من الصور في مواضع z مختلفة. اختر النموذج الذي تكون فيه العينة أفضل تركيزا.
    ملاحظة: تأكد من ضبط موضع المرحلة على موقع به منديل. إذا لم يكن هناك نسيج مرئي في هذا الموضع، فحدد موقعا مختلفا وحاول مرة أخرى (انظر الخطوة 4.9).
15. اضغط على زر التركيز وانتظر حتى تظهر صورة قيد التركيز للمنديل.
16. للحصول على طاقة الإضاءة ، اختر 50٪. أدخل 2000 للاستهداف الحد الأقصى للكثافة واضغط على التعريض التلقائي لضبط وقت التعريض الضوئي تلقائيا.
    ملاحظة: لتسريع الاستحواذ ، يمكن زيادة طاقة الليزر ، مما يقلل من وقت التعرض. ومع ذلك ، قد يؤدي هذا إلى مزيد من تبييض الصور ، مما سيؤدي إلى الحصول على قطع أثرية للصور حيث تتداخل المربعات الفردية.
17. بالنسبة إلى الفئة Z، اختر Z-Series و2D Projection Image، وبالنسبة إلى تصحيح التظليل، اختر FL Shading فقط.
18. كرر الخطوات 5.13-5.17 للأطوال الموجية الأخرى ، ولكن بدلا من الليزر مع z-offset ، اختر Z-offset من W1 واختر 0.
19. انتقل إلى علامة التبويب Z Series . أدخل حجم الخطوة المطلوب (بالنسبة للهدف 20x ، استخدم حجم خطوة 0.5 ميكرومتر).
    ملاحظة: يمكن زيادة سرعة الاكتساب باستخدام حجم خطوة يتراوح بين 2 و3 أضعاف القيمة الموصى بها.
20. انقر فوق الزر تركيز وانتظر حتى يظهر سهم يسمى الموضع الحالي .
21. انقر فوق Start Live وانتظر ظهور نافذة جديدة بها صور حية. اسحب سهم الموضع الحالي حتى يتم الوصول إلى الجزء السفلي من الأنسجة وانقر فوق الزر Set B . اسحب سهم الموضع الحالي حتى يتم الوصول إلى الجزء العلوي من الأنسجة وانقر فوق الزر Set T . انقر فوق F2: إيقاف.
    ملاحظة: يمكن للمرء اختيار الطول الموجي المستخدم للتصوير المباشر تحت الطول الموجي النشط.
22. حدد المواقع المراد الحصول عليها؛ أولا ، تأكد من أن المرحلة في البئر الأول بالنقر بزر الماوس الأيسر عليها والضغط على Start Live مرة أخرى. انتقل إلى مواضع مختلفة داخل البئر عن طريق النقر بزر الماوس الأيسر على مواقع مختلفة في خريطة الموقع. ابحث عن حدود الأنسجة وحدد جميع المواقع التي تحتوي على الأنسجة للحصول عليها بالنقر بزر الماوس الأيمن. ستكون المواقع المحددة خضراء والمواقع التي تم إلغاء تحديدها باللون الرمادي.
    ملاحظة: في الوقت الحالي ، افعل ذلك فقط للبئر الأول وتأكد من اختيار البئر الأول فقط للاستحواذ.
23. انتقل إلى علامة التبويب تشغيل . بالنسبة لاسم اللوحة ، قم بتسميتها "Cycle{i}_Well{w}_{description}" ؛ استبدل {i} و {w} و {description} بالقيم / الوصف المقابل.
24. انقر فوق حفظ البروتوكول واحفظه ، بما في ذلك مرة أخرى "Cycle{i}_Well{w}" في الاسم.
25. قم بإعداد مناطق الاستحواذ لجميع الآبار الأخرى. لهذا ، كرر الخطوات 5.22-5.24.
    ملاحظة: لكي يتم الحصول على كل بئر ، يجب حفظ ملف بروتوكول فردي. تأكد من تنشيط البئر الصحيح قبل رسم عائد الاستثمار الجديد. يجب أن تكون النتيجة بروتوكولا واحدا محفوظا لكل بئر للحصول عليه. هذا ضروري لأن الأنسجة لها أشكال مختلفة من البئر إلى البئر. في حالة تطابق عائد الاستثمار والمكدس z بين الآبار ، يمكن تخطي الخطوات المتكررة 5.22-5.24 ، ويمكن أيضا تخطي الخطوات 5.26-5.29. في هذه الحالة ، ما عليك سوى تحديد جميع الآبار المراد تصويرها (انظر الخطوة 5.22) ، والانتقال إلى علامة التبويب "تشغيل" والضغط على "الحصول على لوحة".
26. انقر فوق التحكم | مجلة | ابدأ التسجيل ثم التحكم على الفور | مجلة | إيقاف التسجيل. احفظ دفتر اليومية الذي تم إنشاؤه وافتحه مرة أخرى عبر Control | مجلة | تحرير المجلة.
27. في اللوحة اليمنى ، ابحث عن Plate Acquisition - Load Protocol From File وعلى Plate Acquisition وانقر نقرا مزدوجا فوقه لإضافة هذه الخطوات إلى دفتر اليومية. ابحث عنها في اللوحة اليمنى. انقر نقرا مزدوجا فوق Plate Acquisition - Load Protocol From File المضاف واختر البروتوكول المحفوظ للبئر الأول (انظر الخطوة 5.24).
28. كرر الخطوة 5.27 لكل بئر يتم الحصول عليه ، مع تحميل البروتوكول المعني دائما.
29. انقر فوق حفظ وأخيرا على Run Journal لبدء الاستحواذ (يتطلب حوالي 3 ساعات للحصول على 180 بلاطة مع مكدس z يبلغ 15 ميكرومتر).

6. تبييض الفلوروفور (اليوم 2)

1. قبل حوالي 30 دقيقة من نهاية المجلة ، قم بإعداد كاشف التبييض. قم بإذابة 10 مجم من بوروهيدريد الليثيوم في 10 مل من ddH₂O وقم بالمرور عبر مرشح 0.22 ميكرومتر. اتركيه لمدة 10 دقائق ، في انتظار تكوين الفقاعات. لضمان التبييض الفعال ، استخدم كاشف التبييض في غضون 4 ساعات بعد التحضير.
   تنبيه: اعمل تحت غطاء كيميائي عند التعامل مع بوروهيدريد الليثيوم ، حيث يمكن أن يتفاعل مع الهواء وقد ينتج غاز الهيدروجين القابل للاشتعال.
2. قم بتبييض الفلوروفورات ب 1 مل من 1 مجم / مل من الليثيوم بوروهيدريد لمدة 15 دقيقة أثناء تعرضها للإضاءة المحيطة القياسية. ابحث عن فقاعات صغيرة على الأنسجة أثناء إجراء التبييض.
   ملاحظة: عند العمل تحت غطاء كيميائي ، تأكد من عدم إيقاف تشغيل الإضاءة تلقائيا أثناء إجراء التبييض.
3. كرر التبييض مع 1 مل أخرى من 1 مجم / مل من بوروهيدريد الليثيوم (محضر من نفس المحلول) لمدة 15 دقيقة.
4. اغسل البئر لمدة 3 × 5 دقائق مع 1 مل من PBS.
   ملاحظة: لا تقصر أوقات الغسيل، لأن الإزالة غير الكاملة لكاشف التبييض قد تتلف اللوحة التالية من الأجسام المضادة.

7. دورات IBEX (اليوم 2)

1. يتم تطبيق الأجسام المضادة الأولية لدورة الوسم المناعي التالية (الخطوة 3.7) واحتضان عند 4 درجات مئوية طوال الليل. كرر الخطوات 4.4-5.4.
   ملاحظة: لا تتكرر الخطوات 4.2-4.3 حيث يتم استخدام الجسم المضاد للأرانب غير المقترن فقط في دورة IBEX الأولى. ومع ذلك ، يمكن أيضا استخدام الأجسام المضادة غير المقترنة التي يتم تربيتها في الأنواع الأقل شيوعا مثل الدجاج أو خنزير غينيا في دورات لاحقة ، حيث لن يتفاعل جسمها المضاد الثانوي مع الأجسام المضادة الأولية المقترنة. يمكن العثور على التفاصيل الدقيقة للأجسام المضادة المستخدمة في كل دورة في جدول المواد.
2. على المجهر ، قم بتحميل إعدادات البروتوكول من دورة IBEX السابقة للبئر المقابل بالنقر فوق بروتوكول التحميل ، المحفوظ على جهاز الكمبيوتر المحلي ك Cycle{i}_Well{w} (الخطوة 5.24). ستحتوي إعدادات البروتوكول على عائد الاستثمار (المربعات المحددة للحصول عليها) والتكبير وإعدادات التركيز البؤري التلقائي وأي إعدادات اكتساب إضافية محفوظة من دورة IBEX السابقة (الخطوات 5.5-5.25).
3. حدد علامات تبويب الطول الموجي واضبط قوة التعريض الضوئي والإضاءة للوحة الأجسام المضادة الجديدة (الخطوات 5.12-5.18). تأكد من تصوير علامة واحدة (عادة DAPI أو Hoechst) طوال جميع الدورات لمحاذاة الدورات بعد ذلك.
   ملاحظة: كما ورد في Radtke et ^al.18 ، فإن البروتينات الفلورية شائعة الاستخدام ، مثل GFP و tdTomato ، ليست حساسة لتبييض بوروهيدريد الليثيوم. عند العمل مع الأنسجة التي تحتوي على بروتينات الفلورسنت الداخلية مثل tdTomato ، يمكن حذف الطول الموجي المقابل من الاكتساب بعد الدورة 1 ، إذا لم تكن هناك حاجة لتسجيل الصورة - فسيؤدي ذلك إلى تسريع التصوير. يمكن إزالة الأطوال الموجية في علامة التبويب الطول الموجي الكلي عن طريق تقليل عدد قنوات الاستحواذ. علاوة على ذلك ، لم يلاحظ زيادة ثابتة في التألق الذاتي للأنسجة خلال دورات التصوير. ومع ذلك ، من المحتمل أن يختلف هذا اعتمادا على نوع الأنسجة¹⁸.
4. تحقق مما إذا كانت إعدادات z-Stack لا تزال معقولة واضبطها وفقا لذلك (الخطوات 5.19-5.21).
   ملاحظة: تأكد من أن حجم خطوة z-stack هو نفسه لجميع الدورات.
5. قم بتحديث اسم اللوحة في علامة التبويب تشغيل وأعد حفظ البروتوكول.
6. كرر الخطوات 7.2-7.5 حتى تحصل جميع الآبار.
   ملاحظة: يوصى بتدوين إعداد التعريض الضوئي لجميع الأطوال الموجية المستخدمة في البئر الأول واستخدام نفس الإعداد في جميع الآبار اللاحقة.
7. قم بتحرير دفتر اليومية، وحدد ملفات البروتوكول الجديدة، واحفظ دفتر اليومية لهذه الدورة.
8. قم بتشغيل دفتر اليومية.
9. كرر الخطوات 6.1-6.4 لتبييض الفلوروفورات.
10. كرر الخطوات 7.1-7.9 حتى يتم تحقيق الكمية المطلوبة من الملصقات المناعية.

8. معالجة الصور (اليوم 2)

1. بعد الانتهاء من الحصول على الصور لدورات IBEX ، قم بتصدير بيانات الصورة:
   1. حدد الفحص | أدوات بيانات اللوحة | تصدير الصور.
   2. انقر فوق تحديد اللوحة (اللوحات) واختر جميع اللوحات المكتسبة لكل دورة وبئر.
   3. اختر All Z Planes ، وحدد دليل الإخراج ، واضغط على OK لتصدير البيانات.
      ملاحظة: سيتم تصدير البيانات كملفات tiff فردية لكل لوحة ومستوى. للجمع بين جميع المربعات والدورات، تم تنفيذ خطوات المعالجة التالية.
2. رتب البيانات المصدرة في مجلدات وفقا للمخطط التالي: تأكد من أن كل دورة عبارة عن مجلد واحد ، يحتوي كل منها مرة أخرى على مجلد واحد لكل بئر. الاسم على النحو التالي: "\cycle{i}\{well}\*_Plate_*" ، حيث {i} و {well} هما الدورة المقابلة وبئر ، و * هو أي حرف. على سبيل المثال: "\cycle1\A01\some_name_Plate_8654"
   ملاحظة: يلزم وجود تسمية صحيحة وبنية مجلد لخطوات المعالجة اللاحقة.
3. تثبيت حزم python الضرورية: استخدم Miniforge لإدارة بيئة Python. راجع https://github.com/conda-forge/miniforge للحصول على إرشادات التثبيت.
   ملاحظة: يتم توفير رمز خطوات المعالجة في شكل Jupyter Notebooks. يمكن العثور عليها في https://github.com/ZMB-UZH/zmb-ibex-jove أو كملفات تكميلية (الملف التكميلي 1 ، الملف التكميلي 2 ، الملف التكميلي 3 ، الملف التكميلي 4 ، والملف التكميلي 5).
4. عند تنزيل الكود من Github ، قم بتنزيل جميع الملفات بالنقر فوق Code | قم بتنزيل ZIP واتبع تعليمات التثبيت في ملف README.md.
5. ابدأ مختبر Jupyter-Lab (الملف التكميلي 2):
   1. قم بتنشيط بيئة conda المثبتة عن طريق إدخال conda تنشيط zmb-ibex-jove في محطة طرفية.
   2. في المحطة الطرفية، قم بالتغيير إلى الدليل الذي تم تنزيله عن طريق إدخال، على سبيل المثال، cd C:\path\to\zmb-ibex-jove.
   3. ابدأ Jupyter-Lab بالدخول إلى مختبر jupyter-lab في المحطة. سيتم فتح نافذة متصفح مع jupyter-lab.
6. احسب تصحيح الإضاءة:
   1. في علامة التبويب اليسرى ، انتقل إلى دفتر الملاحظات " examples/01_get_flatfield_BaSiC.ipynb" وافتحه بالنقر المزدوج فوقه. سيحسب هذا الكمبيوتر الدفتري صور تصحيح الإضاءة باستخدام مكتبة BaSiCPy (الملف التكميلي 3).
   2. قم بتغيير "base_dir" و "save_dir" إلى المسارات الصحيحة ، ومكان وجود البيانات ، وحيث يجب حفظ صور تصحيح الإضاءة.
   3. لتشغيل التعليمات البرمجية داخل دفتر الملاحظات، حدد كل خلية واضغط على Shift+Enter لتنفيذها. قم بتشغيل دفتر الملاحظات من أعلى إلى أسفل.
7. قم بإجراء الخياطة لكل دورة فردية (الملف التكميلي 4):
   1. في علامة التبويب اليمنى ، انتقل إلى دفتر الملاحظات التالي وافتحه : "02_stitching_MD.ipynb". في هذا الكمبيوتر المحمول ، لكل دورة ، يتم تحميل البلاط الفردي وتصحيح الإضاءة وخياطته معا ، مما ينتج عنه ملف صورة واحد لكل بئر ودورة. استخدم مكتبة m2stitch (https://github.com/yfukai/m2stitch) للخياطة.
   2. قم بتغيير المدخلات في الخلية الأولى إلى مسارات الملف الصحيحة. قم بتنفيذ دفتر الملاحظات مرة أخرى من أعلى إلى أسفل.
8. قم بتسجيل الصور بين الدورات (الملف التكميلي 5):
   1. في علامة التبويب اليمنى ، انتقل إلى دفتر الملاحظات التالي وافتحه : "03_registration_pcc.ipynb". في هذا الكمبيوتر المحمول ، تتم محاذاة الدورات الفردية مع بعضها البعض باستخدام التحويلات الانتقالية فقط ، والتي يتم حسابها باستخدام خوارزمية الارتباط المتقاطع للطور من مكتبة صور scikit ذات الوصول المفتوح (https://scikit-image.org/).
   2. قم بتغيير المدخلات في الخلية الأولى إلى مسارات الملف الصحيحة. اختر دورة مرجعية وقناة مرجعية لاستخدامها (عادة DAPI). قم بتنفيذ دفتر الملاحظات مرة أخرى من أعلى إلى أسفل.
      ملاحظة: يجب تنفيذ فصل واحد فقط من "الخيار 1: تحميل جميع القنوات وحفظها معا" و "الخيار 2: تحميل القنوات وحفظها كملفات فردية". سيقوم الفصل الأول بإنشاء ملف واحد كبير يحتوي على جميع القنوات من جميع الدورات. سيقوم الفصل الثاني بإنشاء ملف فردي لكل قناة. سيتطلب الخيار الثاني ذاكرة أقل للمعالجة.

9. تحليل الصور (اليوم 2)

1. قم بتنزيل وفتح فيجي (https://imagej.net/software/fiji/downloads).
   ملاحظة: ستكون الصور الناتجة عبارة عن صور متعددة المستويات ومتعددة القنوات ، والتي يمكن تحليلها كصور ثلاثية الأبعاد. هنا ، يتم عرض مثال على سير عمل التحليل للبيانات ثنائية الأبعاد فقط ، حيث يتم حساب إسقاط الحد الأقصى للكثافة لأول مرة.
2. افتح الملف في فيجي عن طريق سحب الملف إلى نافذة فيجي.
3. احسب الحد الأقصى للإسقاط الشدة عن طريق تحديد صورة | مداخن | Z Project...، اختر Max Intensity، واضغط على موافق. أعد حفظ الصورة عبر ملف | حفظ باسم | أومي-تيف".
4. لتحليل الخلايا ، استخدم البرنامج مفتوح المصدر QuPath ؛ قم بتنزيله وتثبيته من https://qupath.github.io/.
5. افتح QuPath وأنشئ مشروعا جديدا عن طريق سحب مجلد فارغ إلى النافذة.
6. قم باستيراد جميع الملفات إلى المشروع عن طريق سحبها إلى نافذة QuPath والضغط على استيراد باستخدام الإعدادات القياسية.
7. انقر نقرا مزدوجا فوق صورة على اللوحة اليسرى لفتحها. حدده على أنه مضان عند مطالبتك بذلك.
8. افتح نافذة السطوع/التباين بالضغط على Shift+C.
   ملاحظة: هنا ، يمكن للمرء تحديد القنوات المعروضة وضبط السطوع والتباين. يمكن للمرء أيضا تغيير أسماء القنوات وألوانها عن طريق النقر المزدوج على الأسماء.
9. حدد الأدوات | أداة المضلع والتعليق على منطقة الأنسجة. ابحث عن تعليق توضيحي جديد ضمن علامة التبويب التعليقات التوضيحية . قم بتعيينه على فئة معينة عن طريق تحديد التعليق التوضيحي وتحديد فئة (على سبيل المثال ، أخرى) والضغط على تعيين الفئة.
10. اكتشاف الخلايا: انتقل إلى التحليل | كشف الخلايا | الكشف عن الخلايا.
    1. اختر قناة نووية.
    2. اترك معظم الإعدادات كما هي ، ولكن اضبط العتبة عن طريق التمرير فوق نواة بالماوس وملاحظة الشدة المعروضة في الزاوية اليمنى السفلية. مرر مؤشر الماوس فوق منطقة الخلفية ولاحظ الكثافة مرة أخرى. اختر قيمة في منتصف الطريق بين الخلفية والمقدمة كعتبة.
    3. انقر فوق تشغيل.
11. فحص الخلايا والقياسات:
12. بالنقر المزدوج على خلية أو عن طريق تحديدها في علامة التبويب التسلسل الهرمي ، افحص قياساتها في اللوحة السفلية اليسرى. يجب إضافة قياسات مختلفة للشكل والشدة للخلية والنواة والسيتوبلازم.
13. تصنيف الخلايا:
    1. لتصنيف الخلايا المكتشفة وفقا للشدة في القناة ، انتقل إلى تصنيف | تصنيف الكائن | إنشاء مصنف قياس واحد.
    2. حدد القناة المطلوبة ضمن مرشح القناة والقياس المناسب ضمن القياس (على سبيل المثال، الخلية: متوسط القناة).
    3. اضبط العتبة عن طريق التمرير مرة أخرى فوق خلية موجبة وفوق خلية سالبة واختيار قيمة بين الاثنين.
    4. اختر على سبيل المثال، إيجابي للإعداد أعلى من الحد الأدنى وسالب للتعبير عن الحد الأدنى دون الحد الأدنى. تحقق من النتيجة عن طريق التحقق من المعاينة المباشرة.
    5. اضغط على تطبيق لتصنيف الخلايا.
14. قياس المسافة إلى الأشياء المشروحة (على سبيل المثال ، حزم الأعصاب):
    1. حدد الأدوات | أداة الفرشاة .
    2. ارسم مناطق الاهتمام (على سبيل المثال ، حزم الأعصاب).
    3. انتقل إلى علامة التبويب التعليقات التوضيحية . حدد جميع التعليقات التوضيحية الجديدة ، وحدد الفئة المقابلة ، واضغط على تعيين الفئة.
       ملاحظة: يمكن للمرء إنشاء فصل جديد عن طريق النقر بزر الماوس الأيمن في نافذة الفصل وتحديد إضافة / إزالة | إضافة فئة.
    4. انتقل إلى تحليل التحليل المكاني | المسافة الموقعة إلى التعليقات التوضيحية 2D واضغط على نعم عندما يطلب منك ذلك.
    5. أضف قياسا جديدا إلى كل خلية ، مع الإشارة إلى المسافة إلى أقرب تعليق توضيحي لفئة معينة.
15. قياسات التصدير:
    1. اذهب إلى القياس | اعرض قياسات الاكتشاف وانتظر حتى تظهر قائمة بجميع قياسات جميع الاكتشافات.
    2. قم بتصدير الجدول ك.txt عبر الزر حفظ .
    3. قم باستيراد البيانات إلى برنامج معالجة البيانات الذي تختاره ليتم تحليله بشكل أكبر.

Results

تسمح هذه الطريقة بالكشف الكافي عن أنواع الخلايا المتكاثرة من خلال الجمع بين كيمياء EdU Click-iT مع IBEX في أقسام جلد الفئران المجمد الثابتة. تمت مقارنة الكشف عن أنواع الخلايا المتكاثرة باستخدام منهجيات مختلفة ، على وجه الخصوص ، وضع العلامات على أنواع الخلايا المتكاثرة باستخدام الأجسام المضادة Ki-67 والكشف عن تكاثر الخلايا باستخدام نهج الكيمياء EdU Click-iT (الشكل 1). لاحظنا أن تصنيف الأجسام المضادة Ki-67 يقلل من عدد الخلايا المتكاثرة في أقسام جلد الفئران المج...

Discussion

يعد تكاثر الخلايا أحد المراحل الأربع الرئيسية لإصلاح الجلد ، والانتقال بين المرحلة الالتهابية ومرحلة التكاثر أمر بالغ الأهمية لعملية إصلاح ناجحة²⁰. تعد الاستجابة المناعية المنظمة جيدا أمرا ضروريا ، حيث يمكن أن يؤدي الالتهاب المطول إلى جروح مزمنة ، وهي مشكلة صحية عالمية كبيرة^1،21. التكاثر هو عملية بيولوجية رئيسية ، ليس فقط لإصلاح الأنسجة ولكن أيضا لتطور الكائنات الحية وتقييم الأمراض ، بما في ذلك التسرطن. تو...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
الأجسام المضادة والكواشف	مصدر	المعرف	التعليقات
<الأجسام المضادة القوية> < قوية>
CD31 أليكسا فلور 647 (الدورة 2)	بيو ليجند	قط#102516	1:100
AB_2161029
CD45 أليكسا فلور 488 (الدورة 2)	بيو ليجند	قط#103122	1:100
AB_493531
Ki-67 FITC (الدورة الأولى)	بيو ليجند	قط#151212	1:50
AB_2814055
دجاج Ki-67 (ck)	LSBio	قط#LS-C772946	1:800
Ki-67 rat (rt)	بيو ليجند	قط#652402	1:100
AB_11204254
خيوط عصبية H& م (NF-H/NF-M) أليكسا فلور 647 (الدورة 3)	BioLegend	Cat#837710	1:300
AB_2734613
p75NTR (الدورة الأولى)	تقنية الإشارة الخلوية	Cat#8238                                            AB_10839265	1:1500
فيمنتين أليكسا فلور 488 (الدورة 3)	بيو ليجند	قط#699305	1:100
AB_2888889
أليكسا فلور 647 ضد الأرنب الحمار	جاكسون إيمينوريسيرش	التصنيف#711-605-152
<قوة>كواشف
سيلفيس 24 بئر لوحة زجاجية قاعية	سيلفيس	P24-1.5H-N
جيلاتين الكروم ألوم	مصدر الوافدين الجدد	Cat#1033A
مجموعة Click-iT EdU	ثيرمو فيشر العلمي	C10637
هوشت 33342	سيغما-ألدرتش	Cat#14533; CAS# 23491-52-3
LiBH4، بوروهايدريد الليثيوم، 95٪	ثيرمو فيشر العلمي	قط#10438443
مركب ساكورا من Tissue-Tek O.C.T	سويسطور البيوسيستمز	Cat#7109-4583
برنامج تلفزيوني	ثيرمو فيشر العلمي	Cat#10010-015
شرائح المجهر الالتصاق من سوبرفروست بلز	إبريديا	قط#J1800AMNZ
ترايتون X-100	سيغما-ألدريتش	Cat#T8787
<قوي>معدات
فرشاة الشعر	فاوست إيه جي	Cat#9172051 و 9172050
شفرات الميكروتوم	سويسطور البيوسيستمز	قط#207500011
مجهر	الأجهزة الجزيئية، ImageXpress Confocal HT.ai
Oven	ثيرمو فيشر العلمي	قط#HBMCR4220
هزاز الروكر	إدموند بü هيلر جي إم بي إتش	قط#32310015