يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

مجموعة من الإكسوسومات التي يتم إطلاقها بشكل طبيعي من أنسجة الورم

597 مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/67739

⸱

يونيو 10, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Medicine and Engineering Interdisciplinary Research Laboratory of Nursing & Materials, West China Hospital, Sichuan University/West China School of Nursing, Sichuan University, 2Department of Occupational Diseases, The Second Affiliated Hospital of Chengdu Medical College Nuclear Industry 416 Hospital, 3Department of Plastic and Burn Surgery, West China School of Medicine, West China Hospital, Sichuan University

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

يوضح هذا البروتوكول طريقة جديدة لاستخراج الإكسوسومات من أنسجة الورم عن طريق إطلاقها بشكل طبيعي وجمعها بشكل متكرر لتوفير أساس تجريبي لدراسة وظيفة الإكسوسومات في تطور الورم.

الملخص

كحويصلات تفرزها الخلايا ، تحيط الإكسوسومات وتنقل العديد من الأحماض النووية والبروتينات والدهون ، وتشارك في التواصل بين الخلايا المختلفة. تلعب الإكسوسومات في البيئة المكروية للورم دورا مهما في الخصائص البيولوجية للخلايا السرطانية ويمكن أن تؤثر بشدة على حالات الخلايا الأخرى. لذلك ، لمزيد من الدراسة للوظائف المحددة للإكسوسومات في تطور الأورام ، من الضروري بلا شك استخراج وعزل الإكسوسومات من أنسجة الورم. يقلل الاستخراج المباشر للإكسوسومات من أنسجة الورم من الحاجة إلى زراعة الخلايا في المختبر ، وقد تكون الإكسوسومات من أنسجة الورم أكثر تشابها مع تلك الموجودة في الحالة الطبيعية. لذلك ، فإن الحفاظ على الحالة الطبيعية للإكسوسومات في أنسجة الورم هو مفتاح عملية الاستخراج. غالبا ما يتم الجمع بين الهضم الأنزيمي والطرد المركزي الفائق لاستخراج الإكسوسومات من أنسجة الورم. هنا ، نقدم طريقة جديدة لاستخراج الإكسوسومات من أنسجة الورم. استخدمنا وسيطا خاليا من المصل لاحتضان قطع الأنسجة السرطانية الصغيرة على طاولة اهتزاز ، وقمنا بجمع واستخلاص الإكسوسومات التي يتم إطلاقها بشكل طبيعي من أنسجة الورم بشكل متكرر ، وحددنا بنية الإكسوسوم المستخرجة وتركيزها وخصائصها ، مما يوفر طريقة جديدة للباحثين الذين يدرسون وظيفة الإكسوسومات في تطور الورم.

المقدمة

الإكسوسومات هي نوع فرعي من الحويصلات خارج الخلية التي تفرزها الخلايا ، وعادة ما يتراوح حجمها من 30 نانومتر إلى 200 نانومتر1،2. يشاركون في الاتصال بين الخلايا ويقدمون جزيئات إشارات مختلفة ، بما في ذلك الأحماض النووية (على سبيل المثال ، الحمض النووي الريبي منقوص الأكسجين (DNA) ، الحمض النووي الريبي المرسال (mRNA) ، الحمض النووي الريبي الصغير (miRNA) ، الحمض النووي الريبي الطويل غير المشفر (lncRNA) ، الحمض النووي الريبي الدائري (circRNA)) ، البروتينات ، والدهون1،3،4،5 ، للخلايا المتلقية للتأثير على وظائفها الفسيولوجية6،7. تم تحديدها في البداية في الخلايا الشبكية للأغنام8 ، ومنذ ذلك الحين تم التعرف على الإكسوسومات في سوائل الجسم المختلفة ، بما في ذلك الدم واللعاب والبول والسائل النخاعي والاستسقاء والسائل الأمنيوسي وحليب الثدي9،10،11،12،13،14،15،16. علاوة على ذلك ، يمكن إفراز الإكسوسومات بواسطة العديد من أنواع الخلايا ، بما في ذلك الخلايا الليمفاوية والضامة والخلايا البدينة والخلايا الدهنية والخلاياالسرطانية 17. مع توزيعها الواسع ، تلعب الإكسوسومات دورا مهما في العمليات المرضية المختلفة ، وخاصة السرطان ، وفي العمليات الفسيولوجية المختلفة ، بما في ذلك التطور الجيني ، وإصلاح الأنسجة وتجديدها ، وتنظيم المناعة18،19،20.

في السنوات الأخيرة ، ثبت أن الإكسوسومات تعزز حدوث الورم ، والغزو ، والورم الخبيث ، ومقاومة العلاج الكيميائي ، والمناعة المضادة للورم أو المؤيدةله 20،21،22. يمكن للإكسوسومات المشتقة من السرطان تنشيط التعبير الجيني في المستقبلات أو الخلايا السرطانية المجاورة لتغيير أنماطها الظاهرية البيولوجية ، ويمكن للخلايا السرطانية أن تتفاعل مع الخلايا اللحمية في البيئة المكروية للورم لتعزيز تكاثر الخلايا السرطانية والغزو وتكوين الأوعيةالدموية 23،24،25. يمكن أن تساعدها الإكسوسومات التي تطلقها الخلايا السرطانية على إفراز الأدوية السامة ، ويمكن أن تعزز الإكسوسومات المشتقة من الخلايا اللحمية تكوين الخلاياالسرطانية 20. تشارك الإكسوسومات المشتقة من السرطان في مراحل مختلفة من ورم خبيث للخلايا السرطانية ، بما في ذلك غزو الأنسجة المجاورة ، والانتقال عبر الدورة الدموية ، والانتشار إلى الأعضاءالبعيدة 20. أخيرا ، تؤدي الإكسوسومات وظائف التنشيط المناعي والكبت المناعي في السرطان ، اعتمادا على الروابط والبروتينات والميرنا التي تحملها20. نظرا للوظائف المهمة للإكسوسومات المشتقة من أنسجة الورم ، فإنها تظهر قيمة تطبيق محتملة في التشخيص المبكر والعلاج الدقيق والمراقبة التنبؤية للأورام21،22.

نظرا لأهمية الإكسوسومات المشتقة من أنسجة الورم ، حاول العديد من الباحثين استخراجها لمزيد من دراسة خصائصها ووظائفها. لا يقلل الاستخراج المباشر للإكسوسومات من أنسجة الورم من الحاجة إلى زراعة الخلايا في المختبر فحسب ، بل يشبه أيضا الحالة الطبيعية للإكسوسومات. لذلك ، فإن الحفاظ على الحالة الطبيعية للإكسوسومات في أنسجة الورم هو مفتاح عملية الاستخراج. الخصائص الفيزيائية للإكسوسومات هي أساس طرق الاستخراج الشائعة ، ونادرا ما يتم النظر في التغييرات في مكونات الإكسوسوم الناتجة عن التحفيز أثناء عملية الاستخراج. في الواقع ، تتأثر جودة الإكسوسومات بشدة بإجراءات استخراج الإكسوسوم المختلفة26،27. حاليا ، يتم هضم أنسجة الورم بواسطة الإنزيمات وتخضع لطرق مثل الطرد المركزي المتدرج للكثافة ، والطرد المركزي الفائق ، والترشيح الفائق ، وكروماتوغرافيا استبعاد الحجم (SEC) ، وهطول الأمطار البوليمرية ، وكروماتوغرافيا التقارب المناعي ، وطرق الموائع الدقيقة ، قبل الفصل2،21،28،29. هنا ، نقدم طريقة لاستخراج الإكسوسومات من أنسجة الورم. استخدمنا وسيطا خاليا من المصل لزراعة كتل الأنسجة السرطانية الصغيرة في شاكر ، ثم قمنا بجمع واستخلاص الإكسوسومات المنبعثة بشكل طبيعي من أنسجة الورم وحددنا تركيز وخصائص الإكسوسومات المستخرجة ، وتوفير المواد الأساسية والأدلة التجريبية لدراسة وظيفة الإكسوسومات في تطور الورم.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تم إجراء جميع التجارب المتعلقة بالإكسوسوم في أنسجة الورم وفقا للإرشادات واللوائح ذات الصلة. تمت الموافقة على هذه الدراسة وإجراء من خلال المبادئ التوجيهية للجنة الأخلاقيات في مستشفى غرب الصين بجامعة سيتشوان (20220301101). بعد أربعة أسابيع من التلقيح بخلايا SGC-7901 ، تم القتل الرحيم لفأر واحد عاري (BALB / c ، ذكر ، عمره 8 أسابيع ، 26 جم) عن طريق خلع عنق الرحم.

1. اكتساب أنسجة الورم

  1. نقع في 75٪ كحول لمدة 5 دقائق.
  2. انتقل إلى طاولة عمليات معقمة ، واستخدم مقصا جراحيا معقما لفتح الجلد الخارجي للورم خارج الرحم.
  3. انزع أنسجة الورم خارج الرحم ، ثم اقطعها ووزنها للحصول على قطعتين متساويتين في الوزن.
    ملاحظة: يتم استخدام قطعة واحدة من أنسجة الورم لاستخراج الإكسوسوم بموجب هذا البروتوكول ، ويتم استخدام قطعة أخرى من أنسجة الورم متساوية الوزن لاستخراج الإكسوسوم عن طريق هضم الإنزيم30.

2. التكييف المسبق للأنسجة الورمية

ملاحظة: قم بتنفيذ هذه الخطوات على الجليد وفي بيئة معقمة.

  1. ماصة 10 مل من محلول ملحي عازل للفوسفات المبرد مسبقا (0.01 م) لغسل أنسجة الورم لإزالة الدم السطحي والدهون.
  2. قطع أنسجة الورم (~ 400 مم3) إلى قطع 1-2 مم باستخدام مقص العيون في 20 مل من PBS مع 2 ملي مولار حمض رباعي أسيتيك الإيثيلين ثنائي الأمين (EDTA) في طبق بتري معقم مقاس 10 سم. انقل الخليط أعلاه إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مل.

3. إطلاق الإكسوسومات

  1. قم بالطرد المركزي للأنبوب من الخطوة 1.2 عند 200 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  2. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات ب 20 مل من الحد الأدنى من α المتوسط الأساسي (α-MEM) المتوسط. احتضن عند 37 درجة مئوية عند 100 دورة في الدقيقة لمدة 1 ساعة في شاكر درجة حرارة ثابتة.
  3. جهاز طرد مركزي عند 200 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  4. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات ب 10 مل من وسط α-MEM. احتضن عند 37 درجة مئوية عند 100 دورة في الدقيقة لمدة 6 ساعات في شاكر درجة حرارة ثابتة.
    ملاحظة: كن لطيفا مع جميع الخطوات. تكفي حضانة قصيرة وغسل واحد بوسط α-MEM لإزالة المكونات داخل الخلايا التي تتسرب بسبب القطع ، بما في ذلك الحويصلات العضية داخل الخلايا.
  5. جهاز طرد مركزي عند 200 × جم لمدة 5 دقائق ، 4 درجات مئوية وجمع المادة الطافية في أنبوب جديد.
  6. أعد تعليق أنسجة الورم ب 10 مل من وسط α-MEM.
  7. كرر الحضانة من الخطوة 2.4 متبوعة بالخطوة 2.5.
  8. امزج المواد الطافية المتوسطة التي تم جمعها في الخطوتين 2.5 و 2.7.
    ملاحظة: كن لطيفا مع جميع الخطوات. تسببت حضانان لمدة 6 ساعات في إطلاق الإكسوسومات بشكل طبيعي من قطع أنسجة الورم.

4. الطرد المركزي الفائق

  1. قم بتصفية المادة الطافية من خلال مرشح صغير يسهل اختراقه 0.45 ميكرومتر.
  2. جهاز الطرد المركزي للطافي عند 12,000 × جم لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية لإزالة الحويصلات الكبيرة.
  3. انقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد وجهاز طرد مركزي عند 120,000 × جم لمدة 90 دقيقة عند 4 درجات مئوية لتجميع الإكسوسومات.
  4. اغسل راسب الإكسوسوم باستخدام PBS (0.01 M) وجهاز الطرد المركزي مرة أخرى عند 140,000 × جم لمدة 60 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
  5. قم بتعليق الإكسوسومات المترسبة في PBS (0.01 M) للاستخدام الفوري أو التخزين عند -80 درجة مئوية.
    ملاحظة: كن لطيفا مع جميع الخطوات. قم بتنفيذ كل خطوة بأصغر قوة طرد مركزي ممكنة وأقصر وقت للطرد المركزي.

5. عرض نتائج تحديد الإكسوسوم

  1. تحديد مورفولوجيا الإكسوسومات من أنسجة الورم عبر المجهر الإلكتروني الناقل (TEM) 30.
  2. تحديد حجم وتركيز الإكسوسومات من أنسجة الورم عن طريق تحليل تتبع الجسيمات النانوية (NTA) 30.
  3. تحديد علامات البروتين الخارجية CD9 و CD63 عبر اللطخة الغربية (WB) 30.
    ملاحظة: المبادئ التوجيهية الحديثة لأبحاث الإكسوسوم ، بما في ذلك استخدام CD63 ، CD9 ، كمعايير لعلامات الإكسوسوم31.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

كشف TEM أن الإكسوسومات المشتقة من أنسجة الورم عبر هذه الطريقة لها هياكل نموذجية تشبه الكوب (الشكل 1 أ) ، ولم يكن هناك فرق كبير بين شكل الإكسوسومات المستخرجة بهذه الطريقة وهضم الإنزيم (الشكل 1 ب). كشفت نتائج NTA أن متوسط قطر الإكسوسوم كان 172.8 نانومتر ، وهو في حدود 30-200 نانومتر وكان متسقا مع حجم الإكسوسوم. كان تركيز الجسيمات 5.9 × 106 / مل (الشكل 1 ج) ؛ كان متوسط قطر الإكسوسومات المستخرجة عن طريق هضم الإنزيم 175.5 نانوم...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

في هذه الطريقة ، تم استخراج الإكسوسومات المشتقة من أنسجة سرطان المعدة خارج الرحم للفئران العارية ، وكانت الخطوات الرئيسية هي إطلاق الإكسوسومات ونضحها وفصلها وتنقيتها. تم تصميم طرق مختلفة لفصل الإكسوسوم والتحقق منها وفقا للخصائص الفيزيائية وتكوين الإكسوسومات2،21،28،29 ، ولكل منها مزايا وعيوب ، ولكن الغرض من ذلك هو تقليل تأثير إجراءات استخراج الإكسوسوم المختلفة ع...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإعلان عنه.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل من قبل برنامج دعم العلوم والتكنولوجيا في مقاطعة سيتشوان (2024NSFSC0592 ، 2023YFS0064).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
α-MEMHyCloneSH30265.01B
الأجسام المضادة المضادة CD63Biossbsm-43117M
الأجسام المضادة المضادة ل CD9Biossbs-2489R
أنبوب الطرد المركزيThermo339650
شاكر درجة حرارةMAXQ4450ثابتة ماصة معقمة
يمكن التخلص منها - 10 ملJETGSP01001
EDTABiosharpBS107
ماصة كهربائيةThermo9501
جهاز طرد مركزي أفقي يتم التحكم فيه في درجة الحرارةThermoSorvall ST1R بالإضافة إلى
محلل تتبع الجسيمات النانويةMalvinNanoSight Pro
مقص العيونJinzhongY3D010
PBSHyCloneSH30256.01B
حمض الفوسفوتونغستيك    Sigma455970-10G
مقص جراحيJinzhongJ21010
الجسم المضاد الثانويBiossBs-0295Gالماعز المضاد للأرانب IgG H& L / FITC
نقل المجهر الإلكترونينيكونخطة أبو WF
أنبوب الطرد المركزي الفائقبيكمان355618

المراجع

  1. Yáñez-Mó, M., et al. Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions. J Extracell Vesicles. 4, 27066(2015).
  2. Zhou, B., et al. Application of exosomes as liquid biopsy in clinical diagnosis. Signal Transduct Target Ther. 5, 144(2020).
  3. Rani, S., O'Brien, K., Kelleher, F., Corcoran, C., Germano, S., Radomski, M., et al. Isolation of exosomes for subsequent mRNA, MicroRNA, and protein profiling. Methods Mol Biol. 784, 181-195 (2011).
  4. Zhou, L., et al. The biology, function and clinical implications of exosomes in lung cancer. Cancer Lett. 407, 84-92 (2017).
  5. D'Agostino, E., et al. Exosomal microRNAs: Comprehensive methods from exosome isolation to miRNA extraction and purity Analysis. MicroRNA Profiling. 2595, 75-92 (2022).
  6. Whiteside, T. Tumor-derived exosomes and their role in cancer progression. Adv Clin Chem. 74, 103-141 (2016).
  7. Ludwig, N., Whiteside, T., Reichert, T. Challenges in exosome isolation and analysis in health and disease. Int J Mol Sci. 20 (19), 4684(2019).
  8. Johnstone, R., Adam, M., Hammond, J., Orr, L., Turbide, C. Vesicle formation during reticulocyte maturation. Association of plasma membrane activities with released vesicles (exosomes). J Biol Chem. 262, 9412-9420 (1987).
  9. Li, B., Cao, Y., Sun, M., Feng, H. Expression, regulation, and of exosome-derived miRNAs in cancer progression and therapy. FASEB J. 35 (10), e21916(2021).
  10. Caby, M., Lankar, D., Vincendeau-Scherrer, C., Raposo, G., Bonnerot, C. Exosomal-like vesicles are present in human blood plasma. Int Immunol. 17, 879-887 (2015).
  11. Pisitkun, T., Shen, R. F., Knepper, M. A. Identification and proteomic profiling of exosomes in human urine. Proc Natl Acad Sci USA. 101 (36), 13368-13373 (2004).
  12. Street, J., et al. Identification and proteomic profiling of exosomes in human cerebrospinal fluid. J Transl Med. 10, 5(2012).
  13. Palanisamy, V., et al. Nanostructural and transcriptomic analyses of human saliva derived exosomes. PLoS ONE. 5, e8577(2010).
  14. Runz, S., et al. Malignant ascites-derived exosomes of ovarian carcinoma patients contain CD24 and EpCAM. Gynecol Oncol. 107, 563-571 (2007).
  15. Keller, S., et al. CD24 is a marker of exosomes secreted into urine and amniotic fluid. Kidney Int. 72, 1095-1102 (2007).
  16. Admyre, C., et al. Exosomes with immune modulatory features are present in human breast milk. J Immunol. 179, 1969-1978 (2007).
  17. Simpson, R., Lim, J., Moritz, R., Mathivanan, S. Exosomes: proteomic insights and diagnostic potential. Expert Rev Proteomics. 6 (3), 267-283 (2009).
  18. Sung, B. H., Parent, C. A. Extracellular vesicles: Critical players during cell migration. Dev Cell. 56, 1861-1874 (2021).
  19. Xie, Q., et al. Exosome-mediated immunosuppression in tumor microenvironments. Cells. 11 (12), 1946(1946).
  20. Zhang, L., Yu, D. Exosomes in cancer development, metastasis, and immunity. Biochim Biophys Acta Rev Cancer. 1871 (2), 455-468 (2019).
  21. Jiang, Z., Wang, H., Mou, Y., Li, L., Jin, W. Functions and clinical applications of exosomes in pancreatic cancer. Mol Biol Rep. 49 (11), 11037-11048 (2022).
  22. Pegtel, D. M., Gould, S. J. Exosomes. Annu Rev Biochem. 88 (1), 487-514 (2019).
  23. Al-Nedawi, K., et al. Intercellular transfer of the oncogenic receptor EGFR VIII by microvesicles derived from tumour cells. Nat Cell Biol. 10, 619-624 (2008).
  24. Nazarenko, I., et al. Cell surface tetraspanin Tspan8 contributes to molecular pathways of exosome-induced endothelial cell activation. Cancer Res. 70, 1668-1678 (2010).
  25. Skog, J., et al. Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and provide diagnostic biomarkers. Nat Cell Biol. 10, 1470-1476 (2008).
  26. Macias, M., et al. Liquid biopsy: from basic research to clinical practice. Adv Clin Chem. 83, 73-119 (2018).
  27. Brennan, K., et al. A comparison of methods for the isolation and separation of extracellular vesicles from protein and lipid particles in human serum. Sci Rep. 10, 1039(2020).
  28. Hu, J., et al. Application exosomes as nanocarriers in cancer therapy. J Mater Chem B. 11 (44), 10595-10612 (2023).
  29. Wang, C., et al. A light-activated magnetic bead strategy utilized in spatio-temporal controllable exosomes isolation. Front Bioeng Biotechnol. 10, 1006374(2022).
  30. Crescitelli, R., et al. Subpopulations of extracellular vesicles from human metastatic melanoma tissue identified by quantitative proteomics after optimized isolation. J Extracell Vesicles. 9 (1), 1722433(2020).
  31. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. J Extracell Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
  32. Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. 3 (Unit 3.22), (2006).
  33. Gardiner, C., et al. Techniques used for the isolation and characterization of extracellular vesicles: results of a worldwide survey. J Extracell Vesicles. 5, 32945(2016).
  34. Li, W., et al. Comparison of the yield and purity of plasma exosomes extracted by ultracentrifugation, precipitation, and membrane-based approaches. Open Chem. 20, 182-191 (2022).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

الإكسوسومات الورميةعزل الإكسوسوماتاستخلاص الإكسوسوماتالبيئة الدقيقة للورمالطرد المركزي الفائقالهضم الإنزيميالتواصل الخلويتوصيف الإكسوسوماتوسط خالٍ من المصل

تم نشر هذه المقالة

الفيديو قريباً

تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.