توصيف الميوسين بيرميثيل O-glycans باستخدام الامتصاص بالليزر بمساعدة المصفوفة / قياس الطيف الكتلي لوقت الرحلة

Dimitrios Latousakis; Nathalie Juge

doi:10.3791/67751

مقالة منهجية

توصيف الميوسين بيرميثيل O-glycans باستخدام الامتصاص بالليزر بمساعدة المصفوفة / قياس الطيف الكتلي لوقت الرحلة

DOI:

10.3791/67751

⸱

يونيو 20, 2025

Dimitrios Latousakis¹ , Nathalie Juge¹

¹Quadram Institute Bioscience

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا ، نقدم بروتوكولا مفصلا لإطلاق O-glycans من الميوسين ، وإزالة التحلية اللاحقة ، والبيرميلیشن ، والتحليل باستخدام قياس الطيف الكتلي MALDI-TOF.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعد قياس الطيف الكتلي للامتصاص / التأين بالليزر بمساعدة المصفوفة (MALDI-TOF MS) أداة قوية لتنميط جليكان الميوسين الذي يوفر حساسية وإنتاجية عالية. هنا ، نقدم بروتوكولا مفصلا لتحليل الجليكان المرتبط ب O من الميوسين باستخدام MALDI-TOF MS ، بما في ذلك إطلاق الجليكان ، وتحلية المياه ، وبيرميثيلاسیون ، والحصول على البيانات وتحليلها. تظهر هذه الدراسة أن التحلية على أساس كروماتوغرافيا التبادل الأيوني تؤدي إلى تحسين استعادة الجليكان الأكبر حجما وجودة أفضل للأطياف المنتجة مقارنة باستخراج الطور الصلب باستخدام الكربون الجرافيتي المسامي (PGC). بالإضافة إلى ذلك ، يشير هذا العمل إلى أن وقت تفاعل بيرميثيل أطول مما هو مستخدم حاليا قد يكون ضروريا للتعديل الفعال للهياكل السياليلة. نوضح أيضا أهمية وضرورة بيانات التجزئة والمعرفة المسبقة لمسارات التخليق الحيوي O-glycan من أجل التحديد الدقيق لتكوين الجليكان وهيكله ومناقشة الفوائد والقيود المتأصلة التي يقدمها MALDI-TOF في تحليل الميوسين O-glycans.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الميوسين عبارة عن بروتينات سكرية كبيرة تشكل معظم المكونات الهيكلية في المخاط. يتم إنتاجها بواسطة خلايا ظهارية متخصصة تسمى خلايا الكأس وتخضع لغليكوزيلاسیون O-glycosylation واسع النطاق قبل إفرازها على سطح الغشاء المخاطي. يحدث الارتباط بالجليكوزيل في الميوسين في جهاز جولجي ، حيث تبدأ عائلة من الجليكوزيل ترانسفيراز المتخصص ، بولي ببتيد-N-أسيتيل غالاكتوزامين ترانسفيراز (ppGalNAc-T) العملية عن طريق ربط بقايا GalNAc بسيرين (Ser) أو ثريونين (Thr) ¹. بعد ذلك ، تعمل ترسانة من الجليكوزيل ترانسفيراز على توسيع هياكل الجليكان عن طريق إضافة الجالاكتوز (Gal) و N-acetylglucosamine (GlcNAc) و GalNAc و N-acetylneuraminic acid (Neu5Ac) وبقايا الفوكوز (Fuc) ، بينما يمكن للإنزيمات الأخرى المعدلة للكربوهيدرات إجراء تفاعلات مثل كبريتات الجليكان¹. تم العثور على الجليكان التي تزين العمود الفقري لبروتين الميوسين بشكل أساسي في مجموعات في مناطق البروتين الغنية ببقايا Ser و Thr ، حيث تعمل مجموعات الهيدروكسيل الموجودة على السلسلة الجانبية لهذه المخلفات كمواقع O-glycosylation. يعطي هذا الارتباط بالجليكوزيل الكثيف الميوسين مظهر "فرشاة الزجاجة" وهو مسؤول عن خصائصه الفيزيائية ، مثل القدرة على الاحتفاظ بكميات كبيرة من الماء ، وقدرته على تكوين الهلام ، والمرونة العالية^{للزوجة 2}^،³. بسبب هذه الخصائص ، توفر الميوسين التشحيم ، وتحمي الظهارة من الجفاف والإصابة الجسدية ، وتشكل حاجزا ماديا بين الظهارة وبيئتها الدقيقة⁴^،⁵. يمكن أن تعمل جليكان الميوسين أيضا كمواقع ربط ومصدر كربون للبكتيريا المتعايشة أو المسببة^{للأمراض 6}^،⁷^،⁸. يعد تنظيم وتكوين المخاط مفيدا في حماية الظهارة عن طريق إبقاء الميكروبات قريبة ولكن بعيدا عن سطح الظهارة. تشارك جليكان الميوسين أيضا في التواصل بين الخلية والالتصاق⁹.

تلعب جليكان الميوسين دورا محوريا في الحفاظ على التوازن المخاطي ، وترتبط ملامح الجليكوزيل المخاطية الشاذة بضعف وظيفة الحاجز ، وتغير تكوين الجراثيم ، وزيادة ورم خبيث الورم ، ومرض التهاب الأمعاء (IBD) ، وأمراض أخرى¹⁰^،¹¹^،¹². لذلك ، فإن دراسة الارتباط بالجليكوزيل في الميوسين مهمة في فهم دور المخاط والميوسين في صحة الإنسان ويمكن أن تؤدي إلى مناهج جديدة لإدارة الأمراض أو علاجها.

تعد التقنيات القائمة على قياس الطيف الكتلي من بين أكثر الخيارات شيوعا لدراسة جليكان الميوسين. MALDI-TOF MS هي تقنية تأين ناعمة تمكن من تحليل الجزيئات الحيوية الكبيرة غير المتطايرة مثل الجليكان والبروتينات السكرية¹³. يوفر هذا النهج حساسية عالية ونطاق كتلة واسع ، مما يسمح باكتشاف وتحديد مخاليط الجليكان منخفضة الوفرة والمتنوعة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن توفر أنماط التجزئة التي تم الحصول عليها من تجارب قياس الطيف الكتلي الترادفي (MS / MS) معلومات هيكلية قيمة حول تكوين الجليكان^{وتسلسله 13}.

عادة ما يتضمن تحليل الجليكان المرتبط ب O من الميوسين بواسطة MALDI-TOF MS سير عمل متعدد الخطوات ، حيث يتم إطلاق O-glycans أولا كيميائيا من العمود الفقري للبروتين باستخدام طرق مثل التخلص β المختزل ، ثم تحلية لإزالة الأملاح من الإطلاق الكيميائي واشتقاقها لتعزيز التأين والكشف. ثم يتم بلورة الجليكانات المنقاة والمشتقة بشكل مشترك مع مصفوفة MALDI مناسبة على لوحة مستهدفة MALDI ويتم الحصول على أطياف الكتلة التي توفر معلومات عن كتل أيونات الجليكان السليمة. بعد ذلك ، يتم تجزئة الجليكان في تجارب MS / MS للحصول على معلومات عن بنية الجليكان¹⁴. نقدم هنا بروتوكولا مفصلا لإطلاق الجليكان وتحميته وبيرميثيلات وتحليلها بواسطة MALDI-TOF MS.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: انظر الشكل 1 للحصول على تمثيل تخطيطي لسير العمل.

figure-protocol-1
الشكل 1: التمثيل التخطيطي لسير العمل التجريبي. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

1. إطلاق الجليكان

تحضير المخزن المؤقت للتخلص من β
ملاحظة: يجب تحضير هذا طازجا قبل كل استخدام.
1. قم بوزن حبة من هيدروكسيد الصوديوم (NaOH) وقم بإذابتها بكمية مناسبة من H₂O في أنبوب 50 مل للحصول على محلول 0.1 M.
2. في أنبوب سعة 5 مل ، قم بإذابة 189 مجم من بوروهيدريد الصوديوم (NaBH₄) في 5 مل من المحلول القلوي المحضر أعلاه في الخطوة 1.1.1.
  تنبيه: هيدروكسيد الصوديوم مادة أكالة و NaBH₄ مادة أكالة وسامة وقابلة للاشتعال وتشكل خطرا على الصحة. يجب التعامل مع كلتا المادتين الكيميائيتين تحت خزانة الدخان باستخدام معدات الحماية الشخصية المناسبة. لا تذوب NaBH₄ مباشرة في H₂O ، لأنه يتحلل ويطلق الهيدروجين الذي يمكن أن يشتعل ذاتيا.
إعداد تفاعل β الإزالة
1. في قارورة زجاجية سعة 4 مل ، قم بإذابة ما يصل إلى 100 ميكروغرام من الميوسين المنقى في 250 ميكرولتر من H₂O.
  ملاحظة: قد لا تذوب بعض الميوسين تماما وبدلا من ذلك تشكل تعليقا من جزيئات صغيرة جدا.
2. أضف 250 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتخلص من β وأغلق القارورة بإحكام بغطاء مبطن ب PTFE. احتضان التفاعل عند 45 ^درجةمئوية لمدة 16 ساعة.
إيقاف رد الفعل
1. في زجاجة زجاجية سعة 100 مل ، أضف 5 مل من حمض الخليك الجليدي إلى 95 مل من H₂O (تركيز 5٪ (حجم / حجم)).
  ملاحظة: يمكن تخزينها في درجة حرارة الغرفة وإعادة استخدامها. تنبيه: حمض الخليك قابل للاشتعال والتآكل ويجب استخدامه في خزانة الدخان مع معدات الحماية الشخصية اللازمة.
2. على الجليد ، أضف 1 مل من محلول حمض الأسيتيك بنسبة 5٪ لكل تفاعل (الخطوة 1.2.3) بطريقة قطرية. في هذه المرحلة ، ابحث عن الفوران الناتج عن إطلاق الهيدروجين من فائض NaBH₄. إذا لم يتوقف الفوران بعد إضافة 1 مل من حمض الأسيتيك 5٪ ، كرر هذه الخطوة.
  ملاحظة: إذا لم يكن هناك فوران عند إضافة 5٪ من حمض الأسيتيك ، فقد يكون تفاعل التخلص β غير مكتمل أو غير ناجح.
تحلية العينات
1. في زجاجة زجاجية سعة 100 مل ، قم بإعداد تعليق كثيف من راتنج التبادل الكاتيوني ، شكل H ⁺ ، 200-400 شبكة في 5٪ (v / v) حمض الخليك.
2. قم بتوصيل ماصة زجاجية بكمية صغيرة من الصوف الزجاجي. أضف 1.5 مل من تعليق الراتنج على الماصة الزجاجية من الأعلى واتركها تستقر وتجف. هذا سيجعل عمود تحلية المياه.
3. اغسل الراتنج ب 2 مل من حمض الأسيتيك 5٪. تجاهل التدفق.
4. أضف عينة الميوسين إلى عمود التحلي. اجمع التدفق في أنبوب سعة 5 مل.
5. اشطف قوارير العينة ب 1 مل من حمض الأسيتيك 5٪ وقم بتحميلها على عمود التحية. اجمع التدفق في نفس الأنبوب.
6. اغسل العمود 2x ب 1 مل من حمض الأسيتيك 5٪. اجمع التدفق في نفس الأنبوب.
7. استخدم مبخر الطرد المركزي لإزالة حمض الخليك وتركيز العينات (5 ملي بار ، 30 ^درجةمئوية ، 2 ساعة).
8. قم بتجميد العينات عند -80 ^درجةمئوية وجففها طوال الليل على مجفف التجميد.
  ملاحظة: بدلا من ذلك ، يمكن أن يستمر التبخر بالطرد المركزي في الجفاف ، ولكنه سيجعل إعادة إذابة العينات أكثر صعوبة.
9. في زجاجة زجاجية سعة 100 مل ، أضف 5 مل من حمض الأسيتيك إلى 95 مل من الميثانول (تركيز 5٪ (حجم / حجم)).
  تنبيه: الميثانول قابل للاشتعال وسام. يجب استخدامه في خزانة الدخان مع معدات الحماية الشخصية اللازمة.
10. قم بإذابة العينات في 0.5 مل من حمض الميثانوليك الخليك وجفف العينات تحت تيار من النيتروجين. كرر هذه الخطوة 3-5x. قم بتخزين العينات المجففة في درجة حرارة 4 ^درجاتمئوية.
بيرمثيل الجليكان
1. في قارورة زجاجية سعة 8 مل ، اخلطي محلول هيدروكسيد الصوديوم بنسبة 50٪ (0.2 مل) مع 0.4 مل من الميثانول والدوامة جيدا. سوف يتشكل راسب أبيض يذوب بسرعة مرة أخرى.
2. باستخدام حقنة زجاجية ، أضف 4 مل من ثنائي ميثيل سلفوكسيد اللامائي (DMSO) والدوامة جيدا.
3. جهاز الطرد المركزي المحلول لمدة دقيقتين عند 2,000 × جم. سيشكل هذا هلام في الجزء السفلي من الأنبوب ، ومرحلة سائلة في المنتصف ، وأملاح متراكمة في الأعلى.
4. صب بعناية المادة الطافية والأملاح ، دون إزعاج الجل.
5. كرر الخطوات 1.5.2-1.5.4 5x حتى لا تتشكل المزيد من الأملاح. إذا التصقت الأملاح بجدران الأنبوب، فقم بتدوير الأنبوب برفق لتعليق الأملاح، دون إزعاج الجل الموجود في الأسفل، أو قم بإزالتها باستخدام ماصة باستور زجاجية.
6. بعد عدم تكوين المزيد من الأملاح ، أعد تعليق الجل في 4 مل من DMSO اللامائي هذا التعليق هو قاعدة الميثيل.
  ملاحظة: هذه الكمية من قاعدة بيرميثيل تكفي ل ~ 25 عينة. يمكن تعديل الكميات وفقا لذلك.
7. أضف إلى العينات المجففة 100 ميكرولتر من DMSO اللامائي و 150 ميكرولتر من قاعدة الميثيل. باستخدام ماصة زجاجية، أضف 80 ميكرولتر من اليودوميثان في أسرع وقت ممكن، لتجنب امتصاص الرطوبة من البيئة.
  تنبيه: اليودوميثان سام ويشكل خطرا على الصحة والبيئة. يجب استخدامه في خزانة الدخان مع معدات الحماية الشخصية اللازمة.
8. احتضان تفاعلات بيرميلیشن لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع الاهتزاز القوي.
9. أضف 0.5 مل من H₂O لإنهاء التفاعل. سوف تتحول العينات إلى غائمة.
  ملاحظة: إذا لم تصبح العينات غائمة ، فمن المحتمل أن يكون تفاعل البيرميكل غير مكتمل.
10. اغسل العينات بالنيتروجين حتى تصبح واضحة.
11. قم بتحميل العينات على لوحة استخراج 96 بئر (60 مجم) أو خراطيش HLB. قم بالضغط الإيجابي لدفع العينات عبر المرحلة الصلبة بمعدل تدفق ~ 1 مل / دقيقة. في حالة استخدام خراطيش HLB ، استخدم حلمة مطاطية أو مشعب فراغ للضغط على العينات. تجاهل التدفق.
12. اغسل الآبار ب 2 × 1 مل من H₂O. ضع ضغطا إيجابيا وتخلص من التدفق.
13. قم بإزالة الجليكان من لوحة HLB باستخدام 1 مل من الميثانول. اضغط فقط حتى يبدأ الميثانول في الخروج من اللوحة. بعد ذلك ، يكون تدفق الجاذبية كافيا لإعطاء معدل التدفق المطلوب. اجمع التدفق.
14. كرر خطوة الشطف مرة أخرى.
15. تجفيف العينات باستخدام مبخر الطرد المركزي
16. في قارورة زجاجية سعة 4 مل ، قم بإعداد المخزن المؤقت TA50 عن طريق خلط 1 مل من الأسيتونيتريل ، و 998 ميكرولتر من H₂O ، و 2 ميكرولتر من حمض ثلاثي فلورو أسيتيك.
  تنبيه: الأسيتونيتريل قابل للاشتعال وحمض ثلاثي فلورو أسيتيك مادة أكالة. يجب استخدام كلاهما في خزانة الدخان ، باستخدام معدات الحماية الشخصية المناسبة.
17. في أنبوب الطرد المركزي الدقيق ، قم بإعداد محلول المصفوفة عن طريق إذابة 10 مجم من خليط سوبر DHB [9: 1 (وزن / وزن) من حمض 2،5-ثنائي هيدروكسي البنزويك وحمض 2-هيدروكسي -5-ميثوكسي بنزويك] في 1 مل من TA50.
18. قم بإذابة العينات المجففة في 10 ميكرولتر من TA50.
19. امزج 1 ميكرولتر من العينة مع 1 ميكرولتر من محلول المصفوفة ، وقم بوضعها على لوحة مستهدفة فولاذية من MALDI ، واتركها تجف.

2. تحليل MALDI TOF للعينات

الإعداد للحصول على بيانات الأيونات الأصلية
1. أطلق 1,000 طلقة من الليزر بكثافة 50٪.
  ملاحظة: يمكن أن تختلف هذه الإعدادات وفقا لإعدادات الجهاز العامة ويمكن تعديلها حسب الحاجة.
2. ضمن علامة التبويب حامل الليزر ، اضبط إعداد المشي العشوائي لإكمال العينة.
3. ضمن علامة التبويب الكشف ، اضبط نطاق الكتلة على 500 - 3,000 ؛ قم بزيادة هذا النطاق إذا لوحظت قمم قوية عند 2,500-3,000 م / تز. اضبط كسب الكاشف على 20x.
  ملاحظة: يمكن أن يختلف الكسب بناء على الإعدادات العامة للأداة ويمكن تعديله حسب الحاجة.
4. ضمن علامة التبويب مقياس الطيف ، اضبط القطبية على موجب وقمع المصفوفة على الانحراف ، 300 د.
5. انقر فوق ابدأ | بمجرد انتهاء الحصول على البيانات، حفظ باسم لحفظ البيانات في دليل مناسب.
فتح الأطياف الأصلية لاكتساب أطياف التجزئة
1. بعد النقر بزر الماوس الأيمن على الأطياف ، حدد قائمة البحث عن الكتلة.
2. من القائمة التي تم إنشاؤها ، حدد الأيونات ذات الصلة للتجزئة وانقر فوق إضافة إلى قائمة MS / MS بعد النقر بزر الماوس الأيمن على القمم المحددة.
3. انقر بزر الماوس الأيمن مرة أخرى على القائمة الجماعية وحدد قائمة MS / MS.
4. انقر فوق إرسال إلى flexControl.
5. في flexControl، قم بتحميل طريقة LIFT وانتقل إلى علامة التبويب LIFT .
6. حدد كل ذروة محملة واحدة تلو الأخرى واحصل على كل من الأيونات الأصلية والشظائع عن طريق التبديل بين وضعي الأصل والشظايا. اضبط شدة الليزر وعدد اللقطات حسب الحاجة. انقر فوق حفظ لحفظ البيانات بعد تجزئة كل أيون أصلي.
7. تصدير الأطياف بتنسيق ".ascII".
  ملاحظة: يمكن استيراد هذا لاحقا إلى Glycoworkbench لمزيد من التحليل.
تحليل البيانات باستخدام منضدة الجليكووركبونش
1. في Glycoworkbench ، قم بتحميل ملف .ascII المصدر للطيف الكتلي وقم بإجراء تصحيح خط الأساس وتصفية الضوضاء باستخدام الأزرار ذات الصلة في الجزء السفلي من النافذة ، قبل حساب ذروة الوسط. في النافذة المنبثقة، اختر نطاق الكتلة المناسب، والحد الأدنى لنسبة الإشارة/الضوضاء، والحد الأدنى لشدة ذروة MS.
2. بمجرد حساب النقاط الوسطى الذروة ، استخدم أداة Glyco-Peakfinder للعثور على تركيبات البنية المطابقة لقائمة الذروة. حدد perMe كمشتق ، و redEnd كنهاية مختزلة ، والحد الأدنى والحد الأقصى لعدد المخلفات المتوقعة.
  1. بالنسبة إلى الميوسينات، حدد Hexose و N-Acetyl-Hexodamin و Deoxy-Hexose وحمض N-Acetyl-Neuraminic. بالنسبة للجليكان الكبريتات ، استخدم خيار البقايا الآخر بكتلة 87.9. بالنسبة لبيانات MALDI-TOF ، اضبط الحد الأقصى لأيونات # Na و Max # على 1 والدقة على 0.5 Da.
    ملاحظة: قد تحتاج الدقة إلى مزيد من الزيادة، اعتمادا على معايرة مطياف الكتلة.
3. حدد جميع التعليقات التوضيحية الصحيحة عن طريق الضغط باستمرار على مفتاح التحكم والنقر فوق كل تعليق توضيحي ؛ ثم انقر بزر الماوس الأيمن فوق التعليق التوضيحي وانقر فوق إضافة إلى قائمة الذروة المشروحة.
4. لإنشاء تقرير يقارن بين أطياف متعددة مشروحة، في علامة التبويب الأدوات ، ضمن إعداد التقارير، حدد إنشاء تقرير يقارن بين ملفات تعريف مختلفة. اطبع التقرير كملف PDF لحفظه.
5. بعد تحديد قمم الجليكان ، احسب الوفرة النسبية لكل هيكل فردي كنسبة مئوية من المساحة الإجمالية تحت منحنى جميع قمم الجليكان.
6. لتحليل أطياف التجزئة ، قم بتحميل الأطياف على Glycoworkbench وقم بإنشاء قائمة الذروة كما في الخطوة 2.3.1.
7. ارسم هياكل الجليكان المفترضة التي تتوافق مع تركيبات الجليكان المشروحة. قم بإنشاء أجزاء لكل بنية مرسومة عن طريق تحديد خيار أجزاء الحساب ذات الصلة ضمن أداة الأجزاء . ثم حدد جميع الأجزاء ، وانقر بزر الماوس الأيمن عليها ، وانقر فوق نسخ الأجزاء إلى قماش.
8. لمزيد من الدعم لتحليل التجزئة ، حدد ذروة الاهتمام بالنقر فوقها في عارض الطيف. بعد ذلك ، بالنقر بزر الماوس الأيمن وتحديد البحث عن جميع الهياكل المطابقة للقمم ، استجواب m / z للذروة المحددة مقابل قواعد البيانات عبر الإنترنت لهياكل الجليكان المفترضة.
9. حدد الهياكل المفترضة ذات الأهمية وانسخها إلى نافذة اللوحة القماشية للبرنامج بعد النقر بزر الماوس الأيمن وتحديد الخيار المناسب.
10. لحساب الأجزاء المحتملة التي يمكن إنشاؤها من كل بنية جليكان، حدد بنية اللوحة المعنية، ثم ضمن علامة التبويب أدوات ، اختر الأجزاء وحساب الأجزاء للبنية الحالية.
11. إذا تم حساب أجزاء لأكثر من بنية جليكان واحدة، فقم بعرض جدول المقارنة في علامة تبويب الملخص، ضمن عرض جدول الأجزاء.
12. حدد الأجزاء التي تطابق قائمة الذروة لكل بنية جليكان محتملة وحدد نسخ الأجزاء إلى اللوحة القماشية من القائمة المنسدلة بالنقر بزر الماوس الأيمن.
13. في علامة التبويب "أدوات " ، ضمن محلل ملفات التعريف ، حدد إضافة تعليق توضيحي إلى القمم مع جميع الهياكل ثم انقر فوق أدوات | إعداد التقارير | قم بإنشاء تقرير عن التعليقات التوضيحية. اطبع التقرير كملف PDF لحفظه.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في النتائج التالية ، تم استخدام موسين المعدة الخنازير (PGM) لتحسين خطوات تحلية المياه وبيرميثيل. لمقارنة طريقتين شائعة الاستخدام لإزالة التحلية ، بعد إطلاق الجليكان ، تم تحلية العينات إما عن طريق التبادل الكاتيوني (كما هو موضح في البروتوكول أعلاه) والتبخر المشترك للبورات مع الميثانول أو عن طريق استخراج الطور الصلب باستخدام خراطيش الكربون الجرافيتي المسامية (PGC). يتطلب ذلك التكييف المسبق للخرطوشة بنسبة 80٪ أسيتونيتريل و 100٪ H₂O ، وخطوة غسيل مع 0.1٪ (v / v) حمض ثلاثي فلورو أسيتيك (TFA) ، وشطف الجليكان ب 2 مل من 25٪ أسيتونيتريل في 0.1٪ TFA ، و 2 مل من 50٪ أسيتونيتريل في 0.1٪ TFA ، و 2 مل من 80٪ أسيتونيتريل في 0.1٪ TFA.

تم تحليل الأطياف الناتجة بعد البيريثيل في نطاق m / z 500 إلى m / z 2,500. تم تحديد ما مجموعه 33 بنية جليكان في العينة المحلية عن طريق التبادل الأيوني وإزالة البورات بينما تم تحديد 32 بنية في العينة المحلية عن طريق استخراج PGC (الشكل 2 أ). لم يتم تحديد بنية جليكان واحدة في عينة PGC المحلية (المميزة بعلامة النجمة في الشكل 2 أ). أظهر هذا التحليل المقارن أن استعادة الجليكان الأكبر حجما لم يكن بنفس الكفاءة بعد استخراج PGC ، مقارنة بالتبادل الأيوني. يتضح هذا أيضا من خلال الوفرة النسبية للجليكانات الأكبر حجما ، والتي تمثل 21٪ من إجمالي الجليكان بعد استخراج PGC ، مقابل 31٪ للتبادل الأيوني. علاوة على ذلك ، أدى تحلية المياه عن طريق التبادل الأيوني وإزالة البورات إلى زيادة نسب الإشارة إلى الضوضاء مقارنة بتلك الناتجة بعد التحلية عن طريق استخراج الطور الصلب باستخدام PGC (الشكل 2 ب).

لتحسين وقت تفاعل البيرميثيلیشن ، تم إخماد حصص نفس تفاعل البيرميثيلاسیون عن طريق إضافة H₂O في نقاط زمنية مختلفة ، (أي 5 دقائق أو 30 دقيقة أو 90 دقيقة). أظهرت النتائج أنه يمكن تحديد 33 قمة جليكان في نطاق m / z 500 إلى m / z 2,500 ، في العينات الميثيلة لمدة 30 أو 90 دقيقة ، مع تشابه الأطياف الناتجة. في المقابل ، يمكن تحديد 31 قمة جليكان فقط عند إجراء بيرميلیشن لمدة 5 دقائق (الشكل 3). ومن المثير للاهتمام ، أن الهيكلين اللذين لم يتم تحديدهما في وقت التفاعل الأقصر هذا (المميزان بعلامة النجمة في الشكل 3) هما الهيكلان السياليلان، مما يشير إلى أن تعديل أحماض السياليك ليس فعالا في 5 دقائق ، في ظل الظروف التي تم اختبارها.

تم استخدام التجزئة لكل ذروة جليكان PGM لتأكيد تكوين الجليكان وتحديد بنية الجليكان. يتم تقديم مثالين هنا (الشكل 4). في الشكل 4 أ ، يتم تقديم طيف تجزئة الذروة عند 983 م / ز. يتم تعيين تركيبة الجليكان على أنها HexNAc 2 Hex₂. هناك نوعان من الهياكل المحتملة لتركيبة الجليكان هذه ، إما Gal- (Gal-GlcNAc-Gal-) -GalNAc (جليكان 1) أو Gal-GlcNAc-Gal-GalNAc (جليكان 2). أنتج تجزئة هذا المركب طيفا كتليا مع قمم يمكن تخصيصها لأجزاء مختلفة من الجليكان. الذروة عند m / z 529 والذروة عند m / z 708 هي سمة من سمات الهيكلين 1 و 2 ، على التوالي ، ويمكننا أن نستنتج أن كلا من الجليكان 1 و 2 موجودان في مزيج PGM glycan.

في الشكل 4 ب ، يتم عرض طيف تجزئة الذروة عند m / z 2,026. قام Glycoworkbench بحساب تركيبتين محتملتين من الجليكان لهذه الذروة ، Hex₃HexNAc₁Neu5Ac₃ و Hex₃HexNAc₄dHex₂. تتميز التركيبة ذات التركيبة ذات الدقة المنخفضة (~ 160 جزء في المليون و 178 جزء في المليون ، على التوالي) ، مما يشير إلى أن الأول يجب أن يكون الخيار الصحيح. ومع ذلك ، يشير ملف تعريف التجزئة إلى وجود Fuc ، وليس Neu5Ac. لذلك ، فإن التكوين الثاني هو التكوين الصحيح. هنا ، يتم تقديم أربعة هياكل جليكان مفترضة ، وتم شرح الطيف بالأجزاء المحسوبة من كل بنية جليكان مفترضة. في الطيف المشروح ، يمكننا أن نرى أن القمم المميزة للجليكان 4 و 6 فقط موجودة ، بينما لم يتم تحديد قمم مميزة للجليكان 3 و 5. بناء على هذه البيانات ، يمكننا أن نستنتج أن الجليكان 4 و 6 موجودة.

figure-results-1
الشكل 2: مقارنة قمم الجليكان وفقا لتحلية المياه واستخراج المرحلة الصلبة. (أ) مقارنة ملف تعريف الجليكان PGM بعد التحلية إما عن طريق كروماتوغرافيا التبادل الكاتيوني وإزالة البورات أو عن طريق استخراج الطور الصلب PGC. (ب) مقارنة نهجي التحلية في نسبة الإشارة إلى الضوضاء الناتجة لكل ذروة جليكان محددة. تحدد العلامة النجمية الجليكان الذي تم تحديده فقط في العينات المحلية عن طريق تبادل الكاتيون وإزالة البورات. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 3: مقارنة ملف تعريف PGM glycan بعد permethylation لمدة 5 أو 30 أو 90 دقيقة. تشير العلامات النجمية إلى الجليكان السياليلاتي الذي تم تحديده فقط بعد 30 أو 90 دقيقة من البيرميثيل. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 4: أمثلة على أطياف التجزئة من جليكان PGM. (أ) تجزئة ذروة الجليكان عند m / z 983. (ب) تجزئة ذروة الجليكان عند m/z 2026. تشير المربعات إلى هياكل الجليكان المحتملة. تشير الأرقام الموجودة على الأجزاء إلى بنية الجليكان التي يمكن اشتقاقها منها. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لدراسة الجليكان ، يستخدم الباحثون مجموعة متنوعة من المنهجيات ، بدءا من استخدام الليكتين لتحديد حواتم معينة إلى قياس الطيف الكتلي الترادفي للكروماتوغرافيا السائلة الأكثر تعقيدا (LC-MS) والرنين المغناطيسي النووي (NMR) للحصول على توصيف مفصل لهياكل الجليكان. تتمثل المزايا الرئيسية ل MALDI-TOF MS على الأساليب البديلة في الحساسية والطبيعة العالية للطريقة¹³. ومع ذلك ، نظرا لعدم وجود قدرة على فصل المركبات متساوية الضغط ، فإن هياكل الجليكان المختلفة بنفس قيمة m / z تنتج مزيجا من الشظايا تحت MS / MS يصعب بعد ذلك فك الالتواء¹³. إذا كان تحديد التركيب الدقيق لجليكان الميوسين مطلوبا ، فيجب أن يكون LC-MS هو الطريقة المفضلة.

هنا ، نقدم بروتوكولا لتحليل جليكان الميوسين بواسطة MALDI-TOF MS يتضمن جميع الخطوات الحاسمة في العملية ، من إطلاق الجليكان ، وتحلية المياه ، وبيرميكل ، إلى الحصول على البيانات وتحليلها. من المهم الاعتراف بأن كل خطوة من هذه الخطوات يمكن تنفيذها باستخدام مناهج مختلفة ، وكلها تأتي مع فوائد وقيود مرتبطة بها.

في هذا البروتوكول ، استخدمنا التخلص β المختزل لإطلاق الجليكانات. يحدث التفاعل في ظل الظروف الأساسية. إذا كانت عينات الميوسين معلقة بالفعل ولم يتم تنقيتها مسبقا ، فيجب فحص الرقم الهيدروجيني باستخدام ورقة مؤشر الأس الهيدروجيني. إذا كانت حمضية ، فيجب زيادتها إلى درجة حموضة ~ 8-9. يتمثل أحد قيود هذا النهج في أن الشروط الأساسية المطلوبة لإطلاق الجليكان تؤدي أيضا إلى التحلل المائي ، وبالتالي فقدان مجموعات O-acetyl الموجودة غالبا على أحماض السياليك ، في تفاعل يعرف باسم التصبن.

في حين تم وصف طرق أخرى في الأدبيات لإطلاق الجليكان¹⁵^،¹⁶^،¹⁷^،¹⁸ ، والتي يمكن أن يحافظ بعضها على مجموعات O-acetyl المتقابلة ، يظل التخلص β المختزل هو المعيار الذهبي في هذا المجال. يتطلب هذا النهج تركيزا عاليا من الأملاح. يجب بعد ذلك إزالة الأملاح والملوثات الأخرى المثبطة للأيونات قبل تحليل MALDI-TOF¹⁹ ، لأنها يمكن أن تؤثر على كفاءة التأين وتحديد كمية الجليكانات. هنا ، تبين أن كروماتوغرافيا التبادل الكاتيوني ، متبوعة بإزالة البورات عن طريق تبخر الميثانول هي الطريقة الأكثر فاعلية لتحلية الجليكان المنبعثة من الميوسين. في هذه الحالة ، لا تتفاعل الجليكان مع الراتنج وبدلا من ذلك تتدفق عبره ، بينما يتم احتجاز أيونات الصوديوم على الراتنج. ومع ذلك ، فإن إعداد أعمدة التبادل الأيوني شاق ويجعل هذا النهج غير فعال للتجارب واسعة النطاق مع العديد من العينات. في مثل هذه الحالات ، قد يفضل تحلية PGC ، حيث يتوفر هذا الراتنج أيضا في شكل لوحة 96 بئرا. ومع ذلك ، كما هو موضح أعلاه ، يمكن أن يؤدي التحلية عن طريق استخراج PGC إلى شطف غير فعال ، خاصة للجليكانات الكبيرة ، ويجب مراعاة ذلك عند تفسير النتائج.

على الرغم من أنه يمكن أيضا تحليل الجليكان الأصلي بواسطة MALDI-TOF ، إلا أنه عادة ما يتم استخدام البيرميلیشن ، حيث يزيد هذا التفاعل بشكل كبير من حساسية الكشف ، نظرا لأن الجليكان الأصلية لها كفاءة تأين منخفضة²⁰. علاوة على ذلك ، فإن البيرميثيل يجعل الجليكان سالب الشحنة ، مثل الجليكان المكبرات أو السياليلات ، أسهل في الكشف في الوضع الإيجابي ويحافظ على حواتم الجليكان المتحركة ، مثل أحماض السياليك أو الفوكوز²⁰. الأكثر شيوعا ، يسمح لبيرميثيلاسیون بالاستمرار لمدة 5-10 دقائق¹⁴^،²¹ ، مع بعض التقارير التي تسمح للتفاعل بالاستمرار حتى 40 دقيقة²². هنا ، أظهرنا أنه في ظل الظروف التي تم اختبارها ، لم يتم اكتشاف الجليكانات السياليلية بكفاءة بعد 5 دقائق من بيرميلاسیون ، وكانت هناك حاجة إلى حضانة أطول.

بالإضافة إلى وقت التفاعل ، هناك عامل آخر يمكن أن يؤثر على كفاءة البيرميثيلاسیون وهو محتوى الماء في التفاعل. يمكن أن يؤدي وجود الماء إلى نقص المثيلة أو المثيلة الجزئية للجليكان ، حيث لم يتم تحويل جميع مجموعات الهيدروكسيل إلى مجموعات الميثيل²³. يمكن تحديد ذلك بسهولة كما لو حدث نقص المثيل ، ويمكن ملاحظة مجموعات من القمم التي تختلف بمقدار 14 دالتون (فرق الكتلة بين مجموعات الهيدروكسيل والميثيل) في أطياف الكتلة. يمكن معالجة هذه المشكلة عن طريق تكرار تفاعل البيرميثيلاسیون وإعادة تحليل البيانات.

العامل المحدد في تحليل الجليكان هو تفسير الأطياف. على الرغم من التطورات الحديثة ، لا تزال هذه العملية يدوية إلى حد كبير وتتطلب معرفة جيدة وفهما لمسارات التخليق الحيوي للجليكان للتعليق على الأطياف بدقة. يمكن أن تساعد أدوات مثل Glycoworkbench²⁴ من خلال توفير التعليقات التوضيحية المحتملة وهياكل الجليكان والتركيبات ، ولكن نظرا لعدم التجانس المتأصل في مخاليط الجليكان ، لا يزال الباحثون بحاجة إلى اتخاذ قرار بشأن الخيار الصحيح. في المثال المقدم أعلاه باستخدام PGM ، قدم Glycoworkbench تركيبتين محتملتين من الجليكان للذروة عند mz 2،025.7620 ، وبناء على ملف تعريف التجزئة ، خلصنا إلى أن الهيكل الفولوسيلاتي كان موجودا ، بدلا من الهيكل السياليلات. ومع ذلك ، إذا لم يكن طيف التجزئة متاحا (وهو ما يحدث غالبا بالنسبة للجليكانات الوفيرة المنخفضة) ، فيمكن للباحثين أن يبنوا التعليق التوضيحي على معرفة أن الجليكان بتركيبة Hex3HexNAc1Neu5Ac3 توجد على العقد ، بدلا من الميوسين ، وبالتالي لا ينبغي النظر في هذا الخيار في سياق PGM. وبالتالي ، يجب الرجوع إلى هياكل أو تركيبات الجليكان المحددة إلى المنشورات السابقة ويجب أن تتفق مع مبادئ التخليق الحيوي O-glycan. بشكل عام ، يعمل هذا البروتوكول كمورد قيم ، خاصة للباحثين الجدد في مجال علم الأحياء السكرية والمهتمين بدراسة التفاعلات التي تحدث في الواجهة المخاطية.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهم تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يقر المؤلف (المؤلفون) بامتنان بدعم مجلس أبحاث التكنولوجيا الحيوية والعلوم البيولوجية (BBSRC). تم تمويل هذا البحث من قبل البرنامج الاستراتيجي لمعهد BBSRC ميكروبيوم الغذاء والصحة BB / X011054 / 1 ومشروعه المكون BBS / E / F / 000PR13632 (الموضوع 3 ، توضيح كيفية تأثير الأطعمة النباتية على استجابات المضيف).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
ماصات الباستور الزجاجية بقياس 150 مم	فيشر ساينتيفك	15202699	المستهلكات المرجع في النص (إذا كان ذلك مناسبا): ماصة زجاجية
أنابيب 5 مل	إبندورف	30122305	المواد الاستهلاكيه
صفيحة استخراج HLB ذات 96 بئر	فيشر ساينتيفك	16553290	المواد الاستهلاكيه
حمض الخليك	سيغما-ألدرتش	A6283	الكاشف
أسيتونيتريل	فيشر ساينتيفك	15624520	الكاشف
DMSO اللامائي	سيغما-ألدرتش	5.89569	الكاشف
الميثانول اللامائي	سيغما-ألدرتش	5.89596	الكاشف
مطياف الكتلة الذاتي المنعش	بروكر		معدات
راتنج DOWEX 50 واط x8، شكل H+، شبكة 200-400	سيغما-ألدرتش	44519	المرجع المرجعي ><في النص (إذا كان ذلك ينطبق): راتنج تبادل الكاتيونات
سخان الكتلة الجافة	وهب	QBD2	معدات
المبخر/المركز لمدافئ الكتل	كول-بالمر	WZ-36610-99	معدات
تحليل flex	بروكر		Software, proprietary
فليكسيولر	بروكر		Software, proprietary
جنيفاك EZ-2	الأدوية الحيوية	EZ-2	Equipment المرجع في النص (إذا كان ذلك ينطبق): المبخر الطرد المركزي
قوارير زجاجية مع أغطية PTFE متطابقة (4 مل)	ويتون	DWKW224582-144EA	المواد الاستهلاكيه
قوارير زجاجية بأغطية PTFE مطابقة (8 مل)	فيشر ساينتيفك	11587413	المواد الاستهلاكيه
صوف الزجاج	سوبيلكو	1.04086	المواد الاستهلاكيه
جليكوورك بنش	NA		برمجيات; قابل للتحميل من https://glycoworkbench.software.informer.com/
خراطيش HLB SPE	سوبيلكو	57493-U	قابلة للاستهلاك، كبديل للوحة استخراج HLB ذات 96 بئر
يودوميثان	سيغما-ألدرتش	289566	الكاشف
لوحة هدف مالدي	بروكر		معدات
مجفف التجميد ModulyoD	ثيرمو فيشر	مودوليو دي-230	Equipment مرجع في النص (إذا كان ذلك مناسبا): مجفف مجمد
NaBH4	سيغما-ألدرتش	452882	الكاشف
حبيبات NaOH	سيغما-ألدرتش	567530	الكاشف
حل NaOH 50٪	سيغما-ألدرتش	415413	الكاشف
معالج الضغط الإيجابي-96	المياه	186006961	معدات
سوبر DHB	سيغما-ألدرتش	50862	الكاشف
حمض ثلاثي فلورو أسيتيك	سيغما-ألدرتش	T6508	الكاشف

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bergstrom, K. S. B., Xia, L. Mucin-type O-glycans and their roles in intestinal homeostasis. Glycobiology. 23 (9), 1026-1037 (2013).
Leal, J., Smyth, H. D. C., Ghosh, D. Physicochemical properties of mucus and their impact on transmucosal drug delivery. Int J Pharm. 532 (1), 555-572 (2017).
Ambort, D., Johansson, M. E. V., Gustafsson, J. K., Ermund, A., Hansson, G. C. Perspectives on mucus properties and formation--lessons from the biochemical world. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (11), a014159(2012).
Cone, R. A. Barrier properties of mucus. Adv Drug Deliv Rev. 61 (2), 75-85 (2009).
Kim, Y. S., Ho, S. B. Intestinal goblet cells and mucins in health and disease: recent insights and progress. Curr Gastroenterol Rep. 12 (5), 319-330 (2010).
Bell, A., Severi, E., Owen, C. D., Latousakis, D., Juge, N. Biochemical and structural basis of sialic acid utilization by gut microbes. J Biol Chem. 299 (3), 102989(2023).
Shuoker, B., et al. Sialidases and fucosidases of Akkermansia muciniphila are crucial for growth on mucin and nutrient sharing with mucus-associated gut bacteria. Nat Commun. 14 (1), 1833(2023).
Tailford, L. E., Crost, E. H., Kavanaugh, D., Juge, N. Mucin glycan foraging in the human gut microbiome. Front Genet. 6, 81(2015).
Fukuda, M. Roles of mucin-type O-glycans in cell adhesion. Biochim Biophys Acta. 1573 (3), 394-405 (2002).
Zhang, Y., et al. Mucin-type O-glycans: Barrier, microbiota, and immune anchors in inflammatory bowel disease. J Inflamm Res. 14, 5939-5953 (2021).
Sheng, Y. H., Hasnain, S. Z., Florin, T. H. J., McGuckin, M. A. Mucins in inflammatory bowel diseases and colorectal cancer. J Gastroenterol Hepatol. 27 (1), 28-38 (2012).
Juge, N. Relationship between mucosa-associated gut microbiota and human diseases. Biochem Soc Trans. 50 (5), 1225-1236 (2022).
Wilkinson, H., Saldova, R. Current methods for the characterization of O-glycans. J Proteome Res. 19 (10), 3890-3905 (2020).
Goso, Y., Kurihara, M. MALDI-TOF MS/MS analysis of permethylated O-glycan alditols released from mucins. Methods Mol Biol. 2763, 201-208 (2024).
Kameyama, A., Thet Tin, W. W., Toyoda, M., Sakaguchi, M. A practical method of liberating O-linked glycans from glycoproteins using hydroxylamine and an organic superbase. Biochem and Biophys Res Commun. 513 (1), 186-192 (2019).
Vos, G. M., et al. Oxidative release of O-glycans under neutral conditions for analysis of glycoconjugates having base-sensitive substituents. Anal Chem. 95 (23), 8825-8833 (2023).
Furuki, K., Toyo'oka, T., Ban, K. Highly sensitive glycosylamine labelling of O-glycans using non-reductive β-elimination. Anal Bioanal Chem. 409 (9), 2269-2283 (2017).
Miura, Y., et al. Glycoblotting-assisted O-glycomics: ammonium carbamate allows for highly efficient o-glycan release from glycoproteins. Analy Chemi. 82 (24), 10021-10029 (2010).
Annesley, T. M. Ion suppression in mass spectrometry. Clin Chemi. 49 (7), 1041-1044 (2003).
Harvey, D. J. Derivatization of carbohydrates for analysis by chromatography; electrophoresis and mass spectrometry. J Chromatogr. B, Analyt Technol Biomed Life Sci. 879 (17-18), 1196-1225 (2011).
Jang-Lee, J., et al. Glycomic profiling of cells and tissues by mass spectrometry: fingerprinting and sequencing methodologies. Glycobiology. 415, 59-86 (2006).
Zhou, S., Hu, Y., DeSantos-Garcia, J. L., Mechref, Y. Quantitation of permethylated N-glycans through multiple-reaction monitoring (MRM) LC-MS/MS. J Am Soc Mass Spectrom. 26 (4), 596-603 (2015).
Hu, Y., Borges, C. R. A spin column-free approach to sodium hydroxide-based glycan permethylation. Analyst. 142 (15), 2748-2759 (2017).
Ceroni, A., et al. GlycoWorkbench: a tool for the computer-assisted annotation of mass spectra of glycans. J Proteome Res. 7 (4), 1650-1659 (2008).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

MALDI TOF

توصيف الميوسين بيرميثيل O-glycans باستخدام الامتصاص بالليزر بمساعدة المصفوفة / قياس الطيف الكتلي لوقت الرحلة

في هذه المقالة

ملخص

الملخص

المقدمة

البروتوكول

النتائج

المناقشة

الإفصاحات

شكر وتقدير

المواد

المراجع

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

مقالات ذات صلة