يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

وضع العلامات على النظائر المستقرة في الجسم الحي لتحديد قياس الطيف الكتلي للمستقلبات الأبوية المنقولة من المنوية إلى البويضة أثناء الإخصاب

1.1K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/67765

⸱

يونيو 17, 2025

 ,  ,  ,  , 
1Biogem Scarl, Institute of Molecular Biology and Genetics Research, 2Department of Experimental Medicine, University della Campania Luigi Vanvitelli, 3Department of Biology, University of Naples "Federico II ", 4Department of Pharmacy, School of Pharmacy, University of Salerno, 5Department of Pharmacy, University of Naples "Federico II "

في هذه المقالة

ملخص

يهدف هذا الإجراء إلى تحديد المستقلبات المنقولة من المنوية إلى البويضات أثناء الإخصاب باستخدام وضع العلامات على النظائر المستقرة مع 2H2O أو U13C Glucose متبوعا بتحليل الأيض. تتزاوج الأبناء المسماة بالديوتيريوم مع سدود غير مصنفة. يتم تحليل الأجنة التي تم جمعها قبل الزرع بواسطة قياس الطيف الكتلي لفرز مستقلبات الأب (الديوتيريتد) من الأم (غير الديوتريتد).

الملخص

اقتصرت مساهمة الأب في علم الوراثة الجنينية حتى الآن على التسلسلات الأليلية لعقود. يشير عقد من النتائج ، بدلا من ذلك ، إلى أن العوامل اللاجينية - مثيلة الحمض النووي ، وتعديلات الهيستون ، وتنظيم الكروموسومات ، والحمض النووي الريبي التنظيمي - تلعب أدوارا حاسمة في وراثة الأب وتؤثر على التطور الجنيني والتعبير الجيني للزيجوت. جنبا إلى جنب مع الأحماض النووية ، قد يعمل استقلاب المنوية (الدهون والكربوهيدرات والأحماض الأمينية الحرة) كإشارة جينية. يهدف هذا البروتوكول إلى تحديد المستقلبات المنقولة من المنوية إلى البويضات عن طريق قياس الطيف الكتلي. يتضمن الإجراء وضع العلامات على النظائر المستقرة لخلايا المنوية مع 2H2O أو U13C Glucose لتتبع مستقلبات الأب المنقولة إلى البويضة أثناء الإخصاب. الهدف العام للبروتوكول هو الكشف عن دور استقلاب المنوية الأبوية في قابلية النسل لسوء التمثيل الغذائي ، ويمكن تكييفه لتقديم رؤى حول كيفية تغيير الظروف البيئية ، مثل النظام الغذائي والتعرض للملوثات ، لرسائل التمثيل الغذائي للأب ، مما قد يؤثر على صحة النسل واستعداده لمرض السكري والسمنة وأمراض القلب والأوعية الدموية.

المقدمة

يؤثر epigenome الأبوي على قابلية النسل لخلل التمثيل الغذائي
بشكل مختلف عن عدد كبير من الأدوار قبل وبعد الحمل التي تستغلها الأمهات أثناء نمو الجنين ، كان يعتقد منذ عقود أن مساهمة خلايا المنوية وراثية حصرية. وفقا لنظرية الوراثة الجينية ، يجب أن تعزى مساهمة الأب في تباين النمط الظاهري للفرد (بما في ذلك قابليته للإصابة بالأمراض) حصريا إلى التسلسل الجيني للمتغيرات الأليلية الموروثة من الأب وتفاعلاتها مع تلك الموروثةالأم 1. في الوقت الحاضر ، من الواضح أن الأليلات ليست هي الرسائل الجينية الوحيدة التي ينقلها الأب إلى نسله أثناء الإخصاب ، وبدلا من ذلك ، تساهم العديد من الإشارات اللاجينية في وراثة الأب2،3،4. تشمل الإشارات اللجينية التي تم تحديدها حتى الآن ما يلي: (1) مجموعات الميثيل المضافة تساهميا إلى السيتوزين في الجينوم الأبوي5،6،7 ، (2) تعديلات ما بعد الترجمة (الأستلة ، الميثيلة) من الهستونات المرتبطة بكروموسومات المنوية وتسليمها إلى البويضات8 ، (3) التنظيم ثلاثي الأبعاد للكروموسومات الأبوية مما يؤدي إلى التفاعل داخل الكروموسومات (المعروف أيضا باسم مجالات الارتباط الطوبولوجي ، TAD) المستمر في البيضت9، 10 و (4) جزيئات الحمض النووي الريبي التنظيمية (miRNAs ، والشظايا المشتقة من الحمض النووي الريبي ، والحمض النووي الريبي المتفاعل مع piwi) 11،12 بالإضافة إلى rRNAs13 و tRNAs14 التي تم إطلاقها من المنوية إلى البويضة أثناء الإخصاب.

يعد epigenome الأبوي وسيلة مهمة للمعلومات للذرية. ستؤثر المعلومات الأبوية على البيضة الملقحة ، والجنين أثناء نموه ، وبعد الولادة ، ميل النسل إلى خلل التمثيل الغذائي والأمراض. يعتبر العديد من المؤلفين هذا الميراث غير المندلي (المشار إليه باسم الأجيال أو عبر الأجيال اعتمادا على ما إذا كان يؤثر على جيلا واحدا أو عدة أجيال متتالية) ، أحد العوامل المساهمة السرية المسؤولة عن الزيادة الحادة في أمراض خلل التمثيل الغذائي التي تحدث في البلدان الغربية المتقدمة15. في الواقع ، وفقا لنظريات PoHaD (الأصل الأبوي للصحة والمرض) و DoHaD (الأصل التنموي للصحة والمرض) ، فإن المساهمة اللاجينية الأبوية هي أحد العوامل التي تؤهب النسل للإصابة بمرض السكري والسمنة وأمراض القلب والأوعية الدموية في مرحلة البلوغ16،17. ومن المثير للاهتمام أن الإبيجينوم الأبوي عرضة بشكل استثنائي للمحفزات البيئية ويمكن أن يتأثر بظروف التمثيل الغذائي (مثل تعاطي المخدرات والعادات الغذائية واللياقة التمثيل الغذائي)18 بالإضافة إلى المعايير البيئية الصارمة (مثل التعرض للملوثات والعلاقات الاجتماعية والإجهاد العقلي والعلائقي)5،11. وبالتالي ، يمكن لكل من المحفزات المذكورة أعلاه تغيير epigenomes للخلايا الجرثومية (المنوية والبويضات) والتأثير على الأجيال القادمة.

يمثل استهلاك النظام الغذائي الغني بالدهون (HFD) أحد أكثر المحفزات البيئية التي تمت دراستها على نطاق واسع والقادرة على تغيير الإبيجينوم الأبوي وتؤدي إلى رسائل ضارة يتم تسليمها إلى النسل19. يؤثر هذا الحافز على النمط الظاهري للنسل (حتى الجيل الثالث) ، الذين غالبا ما يظهرون ميلا أكبر لتطوير خلل التمثيل الغذائي ، بغض النظر عن السعرات الحرارية التي يتناولونها. يظهر ذرية الأب الذي يستهلك HFD تأخر النمو وعدم تحمل الجلوكوز ومقاومة الأنسولين في كل من الفئران والجرذان20،21. في البشر ، تمت دراسة الوراثة اللاجينية بشكل أساسي في الأجيال التي ولدت أثناء فترات المجاعة أو الإفراط في التغذية وبعدهامباشرة. في مجموعة Överkalix ، ارتبط توافر الغذاء للأجداد من الأب خلال فترة نموهم البطيء بمخاطر الوفاة الإجمالية ، وأمراض القلب والأوعية الدموية ، ومؤشر كتلة الجسم ، ومحيط الخصر ، وكتلة الدهون لأحفادهم23. في الآونة الأخيرة ، تم تأكيد الأدلة على انتقال الأب بين الأجيال في الأترابالأخرى 24.

مستقلبات الأب المشاركة في الوراثة بين الأجيال
على الرغم من الأدلة السريرية والوبائية ، لا تزال التفاصيل الجزيئية للوراثة بين الأجيال غير واضحة. في البداية ، لم يكتمل بعد تحديد جميع محولات الطاقة الجزيئية للمعلومات اللاجينية تشير الأدلة العلمية إلى أن المكون النووي للحيوانات المنوية ، في حد ذاته ، لا يمكن أن يفسر تعقيد الوراثة بين الأجيال. تم بالفعل قياس الاختلافات في مثيلة الحمض النووي في المنوية للفئران والجرذان التي تغذت على HFD ، ولكن في مثل هذه النسبة المنخفضة من المنوية بحيث لا يمكن أن يفسر هذا الاختراق العالي للنمط الظاهري خلل التمثيل الغذائي الذي لوحظ في النسل25. من ناحية أخرى ، فإن مجموعة الحمض النووي الريبي الإشارات المنقولة من المنوية إلى البويضات لها عمر نصف قصير جدا ، وعلى الرغم من قدرتها على التأثير على التعبير الجيني الزيجوتي ، إلا أنه من غير المرجح أن يتم الحفاظ عليها بتركيزات فعالة بعد الإخصاب ، في البيضة في اليوم 2 ، أجنة اليوم 3 ، في المورولا والكيسات الأريمية. وبالتالي ، يبدو من الواضح أنه يجب إشراك محددات جزيئية جديدة في آلية الوراثة بين الأجيال.

إلى جانب الأحماض النووية ، تساهم المنوية أيضا في مكونات الأيض في البيضت البيضة الملقحة ، مثل الدهون والكربوهيدرات والأحماض الأمينية26،27،28،29. يمكن أن تؤثر هذه المستقلبات ، خاصة تلك التي تتمتع بأنشطة تعديلية ، على التعبير الجيني الزيجوتي والتطور الجنيني ، وبالتالي قد تعمل كإشارات جينية30. علاوة على ذلك ، على غرار الأحماض النووية ، يمكن أن يتأثر تركيز هذه المستقلبات ووفرة نسبية لها في المنوية بالظروف البيئية التي يعاني منها الأب ، وبالتالي تمثل مركبات المعلومات للنسل28،30،31،32،33،34. في الواقع ، ثبت أن استقلاب المنوية للحيوانات المنوية الناضجة يعتمد على الحالة الصحية للأب ويتأثر بالعوامل البيئية مثل النظام الغذائي والتمارين البدنية والمواد السامة واضطرابات الغدد الصماء.

إن فهم دور مستقلبات المنوية في التطور الجنيني معقد بسبب العديد من القيود التقنية: (1) فرق الحجم بين المنوية والبويضة ، مما يؤدي إلى الحد الأدنى من مساهمة كتلة التمثيل الغذائي للحيوانات المنوية للزيجوت ، و (2) العديد من الاختلافات الأيضية التي تمر بها المنوية خلال مراحل إنتاجها (تكوين المنوية) ، نضوج البربخ ، القذف والاندماج مع البويضة.

تذبذب استقلاب المنوية أثناء نضوج المنوية
في الثدييات ، يتم إنتاج المنوية في الخصية من خلال تكوين المنوية ، وهي عملية تعتمد على الخلايا الجذعية المنوية والتي تتطور من خلالها المنوية الملتزمة إلى خلايا منوية أولية تدخل الانقسام الاختزالي وتنتج المنوية أحادية الصيغة الصبغية المستديرة. يحدث تكوين هذه الخلايا إلى المنوية من خلال تكوين المنوية ، وهو إعادة تشكيل وظيفية شكلية ضخمة للحيوانات المنوية ، من الخلايا المستديرة إلى الخلايا الممدودة / المكثفة / عالية التخصص ، المقابلة للمرحلة الأخيرة من تكوين المنوية. ومع ذلك ، فإن المنوية الناتجة غير متحركة وغير قادرة بعد على الإخصاب35. بعد النطاف ، عندما يتم إطلاق المنوية من الخصية الشبكية إلى البربخ ، تتفاعل خلايا المنوية مع الخلايا البربخية الظهارية وتتفاعل مع البروتينات والحويصلات الخارجية التي تفرزها هذه الخلايا (البربخ ، الغني بالسفينجوميلين وحمض الأراكيدونيك). يمكن المرور عبر البربخ المنوية من الوصول إلى مرحلة النضج الكامل ، وحتى لو تم الحفاظ عليها في حالة ما قبل القدرة ، فإنها تكتسب الكفاءة في الحركة36. أثناء عبور البربخ ، يصبح غشاء المنوية أكثر شحنة سالبا وإثرائه في السفنجوميلين. يصبح غشاء المنوية أكثر مرونة بسبب الانخفاض التدريجي في الكوليسترول وزيادة مصاحبة في الأحماض الدهنية المتعددة غير المشبعة (بشكل أساسي أحماض الأراكيدونيك ، الدوكوسابنتانويك ، والدوكوساهيكسانويك). بعد القذف ، في الجهاز التناسلي الأنثوي ، تعزز بروتينات السائل المنوي والألبومين سعة المنوية من خلال تعزيز فرط الاستقطاب وتدفق الكالسيوم لتنشيط حركة المنوية. يقدم غشاء البلازما للحيوانات المنوية المقدرة مزيدا من السيولة ، وانخفاض نسبة الكوليسترول إلى الدهون الفوسفورية ، وانخفاض حمض السياليك ، والعقد GM1 ، ومحتوى الدهون الثلاثية31،37.

قبل مواجهة البويضة ، تخضع المنوية لتفاعل الجسيم الأخرمي ، وهو اندماج الجسيم الأكرومي (عضية غشائية مشتقة من جولجي تغطي الجزء الأمامي من نواة المنوية وتتشكل أثناء داء المنوية) مع غشاء بلازما المنوية ، مما يسهل إعادة تنظيم غشاء بلازما المنوية وكفاءة اختراق المنطقة الشفافة (ZP) ، وهي مصفوفة من البروتينات السكرية المحيطة بالبويضة35 ، 38. كخطوة أخيرة ، يؤدي الاندماج النصفي بين المنوية وغشاء البويضة ، الذي يتم تعزيزه بواسطة بروتينات المنوية IZUMO1 و SPACA6 و TMEM9539 ، إلى دمج دهون المنوية في أغشية البويضات ونقل المحتوى النووي والتمثيل الغذائي إلى البويضة.

الأساس المنطقي للإجراء
الهدف من هذا الإجراء هو تحديد المستقلبات التي تنقلها المنوية وتنقلها إلى البويضة عند الإخصاب (الشكل 1). للتمييز بين المستقلبات المشتقة من المنوية والبويضات في البيضة الملقحة ، يتم تصنيف المنوية بالديوتيريوم (2H ، نظير الهيدروجين) أو 13C (نظير الكربون) باستخدام وضع العلامات الأيضية في الجسم الحي باستخدام أكسيد الديوتيريوم ، 2H2O40 ، أو المسمى بشكل موحد U13C Glucose41. ثم يتم تزاوج ذكور الفئران المسماة بالنظائر مع إناث غير مسماة لجمع البيضة الملقحة والمورولا والكيسات الأريمية في النهاية. تتم معالجة الأجنة في المراحل المبكرة لاستخراج (1) مستقلبات قطبية ، (2) مستقلبات غير قطبية ، و (3) ستيرولات. ثم يتم تحليل التمثيل الغذائي باستخدام تقنيات قياس الطيف الكتلي. سيتم تحديد مستقلبات الأب (الأبوية) ذات العلامات النظيرية وتمييزها عن المستقلبات غير المصنفة (الأمومة) ، مما يدل بشكل لا لبس فيه على أصلها الأبوي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تمت الموافقة على جميع التجارب على من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدامه في جامعة نابولي فيديريكو الثاني ، إيطاليا. الكواشف والمعدات المستخدمة في هذه الدراسة مدرجة في جدول المواد.

1. اختيار وتجميع ذكور C57BL / 6J

  1. حدد C57BL / 6J الذكور من حوالي 12 أسابيع.
  2. قسم الذكور إلى مجموعتين وقم بتسميتهم LABELED (يخضعون لوضع العلامات على النظائر المستقرة) أو غير المسمى (يستخدم كعنصر تحكم ولقياس فعالية وضع العلامات على النظائر في خلايا المنوية والمورولا).
  3. من أجل إفراغ البربخ من خلايا المنوية غير المسماة ، اسمح للذكور بالتزاوج مع الإناث المزدوجة.

2. وضع العلامات النظيرية المستقرة للذكور C57BL / 6J

  1. في حالة استخدام 2H2O لوضع العلامات في الجسم الحي ، قم بإعداد 10٪ v / v 2H2O ماء مخصب لاستخدامه كمياه شرب عن طريق خلط 100 مل من 2H2O مع 900 مل من ماء الصنبور. في حالة استخدام U13C-Glucose لوضع العلامات في الجسم الحي ، قم بإعداد 5٪ -15٪ U13C-Glucose لاستخدامها كمياه للشرب عن طريق إذابة 50-150 جم من U13C-Glucose في 1 لتر من ماء الصنبور ؛
    تنبيه: الاستهلاك المطول ل 2ساعة2O سام للفئران. قم بتعيين الكمية القصوى لكلسلالة فأر محددة ، وهي 2 ساعة2O لإضافة مياه الشرب لتحقيق أقصى قدر من كفاءة وضع العلامات والحد الأدنى من الآثار الجانبية. يؤدي الاستهلاك المطول للجلوكوز إلى ارتفاع السكر في الدم ومرض السكري في الفئران. اضبط الحد الأقصى لكمية U13C-Glucose لإضافتها إلى مياه الشرب لتحقيق أقصى قدر من كفاءة وضع العلامات والحد الأدنى من الآثار الجانبية.
  2. استبدل زجاجات المياه بتلك التي تحتوي على مياه شرب تحمل علامة النظائر واسمح للفئران بشربها لمدة 2.5-5 أسابيع (تغطي نصف تكوين المنوية على الأقل) ، وتجديد السائل مرتين في الأسبوع.
  3. في نهاية فترة العلاج ، اسمح للذكور المصنفين بالتزاوج مع الإناث المتفوقات في الإباضة.

3. الإباضة الفائقة للإناث C57BL / 6J

  1. اختر الإناث التي يبلغ عمرها حوالي 4 أسابيع ووزنها بين 12.5-14 جم ، في سن ما قبل البلوغ.
  2. تحفيز نضوج البصيلات عن طريق الحقن داخل الصفاق بمقدار 5 وحدة دولية / 50 ميكرولتر / فأر من PMSG (مصل الفرس الحامل).
  3. بعد 47 ساعة, حقن داخل الصفاق من هرمون ملوتن حرس السواحل الهايتية (موجهة الغدد التناسلية المشيمية البشرية, 5 وحدة دولية/50 ميكرولتر/فأر) لتعزيز استكمال نضوج المسام والحث على الإباضة وتشكيل الجسم الأصفر.
  4. بعد حقن قوات حرس السواحل الهايتية ، اسمح للإناث بالتزاوج مع الفئران المصنفة وغير المسماة ، وفقا للخطوة 1 من الشكل 1.
  5. بعد التزاوج ، قم بإجراء التحكم في السدادةالمهبلية 42. افصل الإناث الإيجابية وحبسها.

4. جمع الأجنة قبل الزرع عن طريق التنظيف

  1. التضحية بالإناث المهبليات المصابات بالسدادات المهبلية باتباع البروتوكولات المعتمدة مؤسسيا (2.5 يوم بعد الجماع لجمع المورولا).
  2. ضع في الاستلقاء الظهري على الطاولة. بلل البطن بنسبة 70٪ من الإيثانول ، وقم بإجراء شق البطن على نطاق واسع.
  3. إزالة الرحم من جانب واحد عن طريق الضغط على عنق الرحم وقطع الطرف الذيلي لعنق الرحم. على الجانب الآخر ، عن طريق القطع في نهاية القرن الرحمي (الجزء غير الأساسي).
  4. ضع الرحم في طبق بتري مع PBS لشطفه ثم انقله إلى طبق بتري نظيف آخر لتجنب وجود بقايا.
  5. من أجل شطف الرحم ، قم بتحميل حقنة سعة 2.5 مل بوسط المزرعة وقم بتثبيتها بإبرة هاميلتون ذات طرف حاد 33 جم.
  6. أدخل الإبرة في إنفونديبولوم قناة البيض المحضرة كما هو موضح أعلاه واغسل الرحم بالكامل.
  7. اجمع المورولا في قطرة من وسط المزرعة لغسلها من أي غشاء مخاطي ودم متبقية.
  8. انقل العينات التي تم جمعها في أنابيب تجميع جديدة ، وتجميعها في LABELED MORULAE و MORULAE غير المسمى ، اعتمادا على ما إذا كانت مشتقة من أحداث التزاوج التي تنطوي على مواليد LABELED أو Unlabeled. قم بتجميد العينات في النيتروجين السائل.
  9. التضحية بمجموعة من الإناث غير المتزاوجة (باتباع البروتوكولات المعتمدة مؤسسيا) من أجل جمع البويضات غير المخصبة. انقل العينات التي تم جمعها إلى أنابيب تجميع جديدة ، وقم بتسميتها على أنها بويضات غير مصنفة. قم بتجميد العينات في النيتروجين السائل.

5. جمع المنوية من الذيل البربخي

  1. التضحية بالآباء المصنفين أو غير المسماة.
  2. ضع في الاستلقاء الظهري على الطاولة ، وبلل البطن بنسبة 70٪ من الإيثانول ، وقم بإجراء بضع البطن على نطاق واسع.
  3. قم بإزالة البربخ واغمرها على الفور في 3 مل من PBS (الرقم الهيدروجيني 7.6) وقم بقصها بشكل غير محكم لتصريف المنوية من القنوات.
  4. قم بتصفية عينات المنوية من خلال القماش القطني.
  5. الطرد المركزي لخلايا المنوية عند 800 × جم لمدة 10 دقائق (في درجة حرارة الغرفة).
  6. أعد تعليق الحبيبات في 1 مل من الماء البارد منزوع الأيونات. فقط خلايا المنوية ستقاوم المحلول الناقص التوتر ، بينما تنفجر الخلايا غير المنوية.
  7. خلايا المنوية بالطرد المركزي عند 800 × جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  8. قم بتسمية الأنابيب ، وقم بتجميعها على أنها منوية مصنفة منوية غير مصنفة ، اعتمادا على ما إذا كانت قد تم جمعها من الأبناء المصنفين أو غير المصنفين.
  9. قم بتجميد العينات في النيتروجين السائل وتخزين العينات عند -80 درجة مئوية.

6. استخراج الدهون والمستقلبات القطبية

  1. قم بموازنة العينة من الخطوات 1-5 عند 4 درجات مئوية على الجليد.
  2. أضف 225 ميكرولتر من الميثانول المثلج (MeOH) إلى العينات واحتضنه عند -30 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة ، وبعد ذلك ، ضعها في حمام صوتي لمدة 10 دقائق.
    1. اختياري: أثناء تحديد الشرط التجريبي ، أضف 0.1-2 جزء في المليون من كل من C16-Ceramide-13 C3-15 N و L-Lysine-ε-15N هيدروكلوريد كمعايير داخلية لقياس كفاءة الاستخراج للمستقلبات غير القطبية والقطبية ، على التوالي.
  3. أضف 750 ميكرولتر من ميثيل ثلاثي بوتيل الأثير المثلج (MTBE) في خلاط حراري لمدة ساعة واحدة عند 4 درجات مئوية (550 دورة في الدقيقة).
  4. أضف 188 ميكرولتر من H2O إلى العينات بعد طردها المركزي. افصل المراحل العليا (الدهون) عن المرحلة السفلية (المستقلبات القطبية) وجففها.
    تحذير: يسبب MeOH العمى وتلف الكبد والكلى والقلب إذا ابتلع. التعرض المفرط له تأثير تراكمي على الجهاز العصبي المركزي. قد يسبب MTBE تهيج الجلد والعين والجهاز التنفسي. العمل تحت غطاء الدخان.
  5. جفف العينة باستخدام مكثف فراغ. قم بتخزين العينات المجففة عند -80 درجة مئوية حتى تحليل الكتلة / قياس الطيف.
    ملاحظة: يمكن تخزين العينات المجففة عند -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر ، في انتظار تحليل الكتلة / قياس الطيف. لتحديد المستقلبات الأقل تمثيلا في أجنة ما قبل الزرع ، قد يتطلب تجميع العينات التي تم الحصول عليها من نفس زوج التزاوج وحدث التزاوج.

7. استخراج الستيرولات

ملاحظة: تجنب استخدام الأنابيب والنصائح البلاستيكية [سيتم إذابتها بواسطة المذيب العضوي غير القطبي] ؛ بدلا من ذلك ، استخدم الأنابيب الزجاجية وماصات باستور الزجاجية لتوزيع السوائل.

  1. قم بموازنة العينة من الخطوات 1-5 عند 4 درجات مئوية على الجليد. أعد تعليق العينات المجمعة في 500 ميكرولتر من محلول الميثانول / الارتفاع20 70٪ حجم / حجم ونقل المعلق إلى أنبوب زجاجي.
    1. تجانس عن طريق الدوامة لمدة 30 ثانية. اترك المتجانس لمدة 16 ساعة عند 4 درجات مئوية.
    2. اختياري: أثناء تحديد الحالة التجريبية ، أضف 0.1-2 جزء في المليون من ستيرول النبات Sitostanol-5،6،22،23-d4 كمعايير داخلية لقياس كفاءة استخراج الستيرولات.
      تحذير: يسبب MeOH العمى وتلف الكبد والكلى والقلب إذا ابتلع. التعرض المفرط له تأثير تراكمي على الجهاز العصبي المركزي.
  2. الطرد المركزي العينة عند 3.220 × جم لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. انقل المادة الطافية إلى أنبوب زجاجي نظيف واستكملها ب 500 ميكرولتر من PBS.
  3. أضف 7 مل من ثنائي إيثيل الأثير المثلج والدوامة لمدة 1 دقيقة. دع العينة تقف لمدة 1-2 دقيقة وانتظر فصل الطور. قم بالتجميد عن طريق غمر الأنبوب في حمام ثلج جاف / أسيتون. انقل مرحلة ثنائي إيثيل الأثير غير المجمدة إلى أنبوب زجاجي مسمى حديثا.
    تنبيه: ثنائي إيثيل الأثير هو سائل وبخار شديد الاشتعال ويتحلل إلى بيروكسيدات متفجرة في الهواء والضوء. لا تعمل على اتصال وثيق باللهب. ثنائي إيثيل الأثير خطير إذا ابتلع وضار بالجلد.
  4. قم بإذابة الماء عند 37 درجة مئوية وكرر الخطوة 4.3. اجمع بين مراحل ثنائي إيثيل الأثير التي تم جمعها في الخطوات 4.3-4.4 في أنبوب زجاجي واحد.
  5. جفف العينة باستخدام مكثف فراغ. قم بتخزين العينات المجففة في -80 درجة مئوية حتى تحليل الكتلة / قياس الطيف.

8. اشتقاق العينة

ملاحظة: ستستفيد العينات من اشتقاق TMS لتحليل مستقلبات معينة (الكوليسترول والأحماض الدهنية والأحماض الأمينية).

  1. موازنة العينات في درجة حرارة الغرفة
    تنبيه: قد يتسبب التوازن غير المكتمل في تكثيف المياه في الغلاف الجوي على جدران الأنبوب والعينات. يتنافس الماء بشدة على اشتقاق TMS.
  2. قم بإذابة العينات في 50 ميكرولتر من البيريدين واشتقاقها عن طريق إضافة 25 ميكرولتر من N ، O-Bis (trimethylsilyl (TMS) ثلاثي فلورو أسيتاميد (BSTFA). احتضان العينات لمدة 90 دقيقة عند 60 درجة مئوية. قم بتدوير العينات وتابع على الفور تحليل GC-MS.
    تنبيه: البيريدين قابل للاشتعال ومهيج وسام. BSTFA قابل للاشتعال وتآكل ومهيج. اعمل تحت غطاء الدخان واستخدم قفازات واقية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

من أجل مراقبة انتقال المستقلب من المنوية إلى البويضة ، يتم جمع وتحليل المورولا المعزولة من إناث C57 BL / 6J المتزاوجة مع الأبناء من المجموعات LABELED و Unlabeled بواسطة التمثيل الغذائي القائم على قياس الطيف الكتلي. تم استخراج المستقلبات كما هو موضح في الخطوات 6-7 واشتقاقها باستخدام TMS كما هو موضح في الخطوة 8. تم إجراء التنميط الأيضي والليبيدومي لخلايا المنوية المصنفة ، والمورولا غير المسمى ، والبويضات غير المصنفة ، والخلايا المنوية الموسومة ، وغير المصنفة. تم تحليل الملامح الناتجة إحصائيا ومواءمتها ومقارنتها من أجل تحدي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يسمح البروتوكول الموصوف بتحديد المستقلبات المنقولة من المنوية إلى البويضات أثناء الإخصاب باستخدام وضع العلامات النظيرية المستقرة للفئران الذكور مع 2H2O أو U13C Glucose متبوعا بتحليل الأيض. المستقلبات المصنفة نظائريا الموجودة في morulae هي من أصل أبوي.

على الرغم من أن الهيدروجين والديوتيريوم نظائر ، إلا أنهما ليسا متطابقين تماما من حيث السلوك الكيميائي. نقاط الانصهار والغليان ل 2H2O أعلى من تلك الموجودة في ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ويعلن أصحاب البلاغ عدم وجود مصالح متضاربة.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
2H2O مفلترة, 99.8٪ ذرة٪ 2Hسيجما ألدريتش756822
أسيتونسيجما ألدريتش179124
Agilent  سيل -8أجيلينت (سانتا كلارا ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية)
C16-سيراميد -13C3-15Nمعيار LGCTRC-C342770-25MG
ثنائي كلورو الميثانسيجما ألدريتش34856
ثنائي إيثيل الأثير سيجما ألدريتش673811
ايثانولسيجما ألدريتش1,11,727
قوات حرس السواحل الهايتية (موجهة الغدد التناسلية المشيمية البشرية,سيجما ألدريتشCG5-1VL
L-Lysine-ε-15N هيدروكلوريدسيجما ألدريتش608971
ذكور وإناث  الفئران C57BL / 6JOlaHsdInotiv C57BL / 6JOlaHsd
ميثيل ثلاثي بوتيل الأثير (MTBE)سيجما ألدريتش306975
ميتوهوه.سيجما ألدريتش1,06,035
N ، O-Bis (ثلاثي ميثيل سيليل (TMS)
ثلاثي فلورو أسيتاميد (BSTFA)		سوبيلكو15238
برنامج تلفزيونيتطبيقأ 0965-9010
PMSG (فرس حامل ق مصل)لي بيوسوليوشنز493-10
بيريدينسيجما ألدريتش360570
Shimadzu GCMS 2010plus  شيمادزو
سيتوستانول-5،6،22،23-د4سيجما ألدريتش680028
ثلاثي فلور الراسيتات الصوديومسيجما ألدريتش1615138
SolariX XR 7T  بروكر دالتونيكس
TimsTOF Pro Q-TOF بروكر دالتونيكس
U13C جلوكوز سيجما ألدريتش389374
في نهاية المطاف RS3000 UHPLC  ثيرمو فيشر العلمي
العمود المسبق للطراز VanGuard CSHTM (5.0 × 2.1 مم; 1.7 μ م ، 130 Å ؛)المياه

المراجع

  1. Wang, Y., Liu, H., Sun, Z. Lamarck rises from his grave: Parental environment-induced epigenetic inheritance in model organisms and humans. Biol Rev. 92 (4), 2084-2111 (2017).
  2. Champroux, A., Cocquet, J., Henry-Berger, J., Drevet, J. R., Kocer, A. A decade of exploring the mammalian sperm epigenome: Paternal epigenetic and transgenerational inheritance. Front Cell Dev Biol. 6, 50(2018).
  3. Horsthemke, B. A critical view on transgenerational epigenetic inheritance in humans. Nat Commun. 9 (1), 2973(2018).
  4. Schagdarsurengin, U., Steger, K. Epigenetics in male reproduction: Effect of paternal diet on sperm quality and offspring health. Nat Rev Urol. 13 (10), 584-595 (2016).
  5. Skinner, R. C., Gigliotti, J. C., Ku, K. -M., Tou, J. C. A comprehensive analysis of the composition, health benefits, and safety of apple pomace. Nutr Rev. 76 (12), 896-909 (2018).
  6. King, S. E., Skinner, M. K. Epigenetic transgenerational inheritance of obesity susceptibility. Trends Endocrinol Metab. 31 (7), 478-494 (2020).
  7. Martínez Duncker Rebolledo, E., et al. Sperm DNA methylation defects in a new mouse model of the 5,10-methylenetetrahydrofolate reductase 677C>T variant and correction with moderate dose folic acid supplementation. Mol Hum Reprod. 30 (4), gaae008(2024).
  8. Lismer, A., et al. Histone H3 lysine 4 trimethylation in sperm is transmitted to the embryo and associated with diet-induced phenotypes in the offspring. Dev Cell. 56 (5), 671-686.e6 (2021).
  9. Kimmins, S., Sassone-Corsi, P. Chromatin remodeling and epigenetic features of germ cells. Nature. 434 (7033), 583-589 (2005).
  10. Diaz-Castillo, C., Chamorro-Garcia, R., Shioda, T., Blumberg, B. Transgenerational self-reconstruction of disrupted chromatin organization after exposure to an environmental stressor in mice. Sci Rep. 9 (1), 13057(2019).
  11. Gapp, K., et al. Implication of sperm RNAs in transgenerational inheritance of the effects of early trauma in mice. Nat Neurosci. 17 (5), 667-669 (2014).
  12. Chen, Q., et al. Sperm tsRNAs contribute to intergenerational inheritance of an acquired metabolic disorder. Science. 351 (6271), 397-400 (2016).
  13. Liberman, N., et al. 18S rRNA methyltransferases DIMT1 and BUD23 drive intergenerational hormesis. Mol Cell. 83 (18), 3268-3282.e7 (2023).
  14. Tomar, A., et al. Epigenetic inheritance of diet-induced and sperm-borne mitochondrial RNAs. Nature. 630 (8017), 720-727 (2024).
  15. Pinhas-Hamiel, O., Zeitler, P. The global spread of type 2 diabetes mellitus in children and adolescents. J Pediatr. 146 (5), 693-700 (2005).
  16. Galan, C., Krykbaeva, M., Rando, O. J. Early life lessons: The lasting effects of germline epigenetic information on organismal development. Mol Metab. 38, 100924(2020).
  17. Rando, O. J., Simmons, R. A. I'm eating for two: Parental dietary effects on offspring metabolism. Cell. 161 (1), 93-105 (2015).
  18. Perez, M. F., Lehner, B. Intergenerational and transgenerational epigenetic inheritance in animals. Nat Cell Biol. 21 (2), 143-151 (2019).
  19. Carone, B. R., et al. Paternally induced transgenerational environmental reprogramming of metabolic gene expression in mammals. Cell. 143 (7), 1084-1096 (2010).
  20. Pastore, A., et al. Pre-conceptional paternal diet impacts on offspring testosterone homoeostasis via epigenetic modulation of cyp19a1/aromatase activity. NPJ Metab Health Dis. 2 (1), 8(2024).
  21. Fullston, T., et al. Paternal obesity initiates metabolic disturbances in two generations of mice with incomplete penetrance to the F2 generation and alters the transcriptional profile of testis and sperm microRNA content. FASEB J. 27 (10), 4226-4243 (2013).
  22. Lumey, L., et al. Cohort profile: The Dutch Hunger Winter Families Study. Int J Epidemiol. 36 (6), 1196-1204 (2007).
  23. Pembrey, M. E., et al. Sex-specific, male-line transgenerational responses in humans. Eur J Hum Genet. 14 (2), 159-166 (2006).
  24. Comas-Armangue, G., Makharadze, L., Gomez-Velazquez, M., Teperino, R. The legacy of parental obesity: Mechanisms of non-genetic transmission and reversibility. Biomedicines. 10 (10), 2461(2022).
  25. Shea, J. M., et al. Genetic and epigenetic variation, but not diet, shape the sperm methylome. Dev Cell. 35 (6), 750-758 (2015).
  26. Dupont, J., Bertoldo, M. J., Rak, A. Energy sensors in female and male reproduction and fertility. Int J Endocrinol. 2018, 8285793(2018).
  27. Guiton, R., Henry-Berger, J., Drevet, J. R. The immunobiology of the mammalian epididymis: The black box is now open. Basic Clin Androl. 23 (1), 8(2013).
  28. Jarvis, S., et al. High fat diet causes distinct aberrations in the testicular proteome. Int J Obes. 44 (9), 1958-1969 (2020).
  29. Liu, L. -L., et al. Peroxisome proliferator-activated receptor gamma signaling in human sperm physiology. Asian J Androl. 17 (6), 942(2015).
  30. Masaki, H., et al. Long-chain fatty acid triglyceride metabolism disorder impairs male fertility: A study using adipose triglyceride lipase deficient mice. Mol Hum Reprod. 23 (7), 452-460 (2017).
  31. Cheng, X., et al. Lipidomics profiles of human spermatozoa: Insights into capacitation and acrosome reaction using UPLC-MS-based approach. Front Endocrinol (Lausanne). 14, 1273878(2023).
  32. Collodel, G., Castellini, C., Lee, J. C. -Y., Signorini, C. Relevance of fatty acids to sperm maturation and quality. Oxid Med Cell Longev. 2020, 7038124(2020).
  33. Watkins, A. J., et al. Paternal diet programs offspring health through sperm- and seminal plasma-specific pathways in mice. Proc Natl Acad Sci USA. 115 (40), 10064-10069 (2018).
  34. Darbandi, M., et al. Oxidative stress-induced alterations in seminal plasma antioxidants: Is there any association with keap1 gene methylation in human spermatozoa. Andrologia. 51 (1), e13159(2019).
  35. Deneke, V. E., Pauli, A. The fertilization enigma: How sperm and egg fuse. Annu Rev Cell Dev Biol. 37 (1), 391-414 (2021).
  36. Cobellis, G., et al. A gradient of 2-arachidonoylglycerol regulates mouse epididymal sperm cell start-up. Biol Reprod. 82 (2), 451-458 (2010).
  37. Kawano, N., Yoshida, K., Miyado, K., Yoshida, M. Lipid rafts: Keys to sperm maturation, fertilization, and early embryogenesis. J Lipids. 2011, 264706(2011).
  38. Rubinstein, E., Ziyyat, A., Wolf, J., Lenaour, F., Boucheix, C. The molecular players of sperm-egg fusion in mammals. Semin Cell Dev Biol. 17 (2), 254-263 (2006).
  39. Satouh, Y., Inoue, N., Ikawa, M., Okabe, M. Visualization of the moment of mouse sperm-egg fusion and dynamic localization of IZUMO1. J Cell Sci. 125 (pt 3), 498-506 (2012).
  40. Kim, J., Seo, S., Kim, T. -Y. Metabolic deuterium oxide (D2O) labeling in quantitative omics studies: A tutorial review. Anal Chim Acta. 1242, 340722(2023).
  41. Li, X., et al. Sustained high glucose intake accelerates type 1 diabetes in NOD mice. Front Endocrinol (Lausanne). 13, 1037822(2022).
  42. Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. Mouse estrous cycle identification tool and images. PLoS One. 7 (4), e35538(2012).
  43. Katz, J. J. Chemical and biological studies with deuterium. , Sigma Xi, The Scientific Research Honor Society. (2024).
  44. Oakberg, E. F., Hughes, A. M. Deuterium oxide effect on spermatogenesis in the mouse. Exp Cell Res. 50 (2), 306-314 (1968).
  45. Sumiyoshi, M., Sakanaka, M., Kimura, Y. Chronic intake of high-fat and high-sucrose diets differentially affects glucose intolerance in mice. J Nutr. 136 (3), 582-587 (2006).
  46. Aragno, M., Mastrocola, R. Dietary sugars and endogenous formation of advanced glycation endproducts: Emerging mechanisms of disease. Nutrients. 9 (4), 385(2017).
  47. Wilkinson, D. J., Brook, M. S., Smith, K. Principles of stable isotope research-with special reference to protein metabolism. Clin Nutr Open Sci. 36, 111-125 (2021).
  48. Wilkinson, D. J., et al. A validation of the application of D2O stable isotope tracer techniques for monitoring day-to-day changes in muscle protein subfraction synthesis in humans. Am J Physiol Endocrinol Metab. 306 (5), E571-E579 (2014).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

وضع العلامات على النظائر المستقرة في الجسم الحي لتحديد قياس الطيف الكتلي للمستقلبات الأبوية المنقولة من المنوية إلى البويضة أثناء الإخصاب
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.