مقالة منهجية

عزل وتوصيف العدلات منخفضة الكثافة والطبيعية من الدم الكامل

DOI:

10.3791/67805

⸱

فبراير 7, 2025

 ,  , 
1TB Immunology Group, Department of Clinical Medicine, Trinity Translational Medicine Institute, St James's Hospital, Trinity College Dublin, The University of Dublin

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا ، نقدم نهجا موثوقا به لعزل العدلات منخفضة الكثافة وطبيعية عن الدم الكامل باستخدام العزل المغناطيسي (الاختيار السلبي) ووسط تدرج الكثافة المتقطع. إنه يضمن عزلا لم يمسها أحد للخلايا عالية النقاء (≥93٪) ، مما يسهل التحليل الدقيق للمصب للمجموعات السكانية الفرعية للعدلات ، وهو أمر بالغ الأهمية لفهم أدوارها في الصحة والمرض.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تظهر الأبحاث الناشئة أن مجموعة العدلات المنتشرة في البشر تتكون من أنواع فرعية متنوعة ولا ينبغي دراستها كمجموعة واحدة ، كما حدث تاريخيا. على وجه الخصوص ، ثبت أن العدلات منخفضة الكثافة والكثافة الطبيعية (LDNs ، NDNs) لها ملامح متميزة وظيفيا وأيضيا ، وهو عامل يجب مراعاته عند نشر أبحاث العدلات. هنا ، نقدم طريقة معدلة لعزل وفصل LDNs و NDNs عن الدم الكامل.

يتم دمج وسط تدرج الكثافة (1.135 جم / مل) عند 9:10 مع 10x PBS. يتم بعد ذلك إجراء تدرجات كثافة محددة بنسبة 55٪ و 70٪ و 81٪ من خلال الجمع بين وسط التدرج الكثافة بنسبة 100٪ مع محلول ملحي مخزن بالفوسفات 1x (PBS). يتم إعادة تعليق العدلات المعزولة من 12 مل من الدم الكامل المحيطي الذي تم الحصول عليه من المتبرعين الموافقين باستخدام مجموعة العزل المغناطيسي القائم على الانتقاء السلبي في جزء 55٪. يتم وضع حجم 3 مل من الكسور 81٪ و 70٪ في أنبوب سعة 15 مل ، متبوعا بجزء 55٪ يحتوي على العدلات الكلية. ثم يتم طرد تدرجات الكثافة عند 720 × جم لمدة 30 دقيقة. يتم الحصول على نطاقين متميزين عند واجهة 55٪ / 70٪ (LDNs) وواجهة 70٪ / 81٪ (NDNs). يتم سحب الخلايا بعناية في أنابيب منفصلة وغسلها باستخدام PBS. يتم تحديد نقاء الكسور المعزولة باستخدام قياس التدفق الخلوي. تم تعريف كل من LDNs و NDNs على أنها CD14lo CD15 + SSChi عن طريق قياس التدفق الخلوي. تم حساب نقاء العزل عند ≥93٪ من الخلايا القابلة للحياة لكلا النوعين.

توفر هذه الطريقة نهجا موثوقا وفعالا لفصل LDN و NDNs عن الدم المحيطي ، مما يضمن نقاء عاليا وقابلية للحياة للخلايا المعزولة. يسهل تعزيز دقة عزل العدلات إجراء تحليلات أكثر دقة لهذه المجموعات السكانية الفرعية للعدلات المتميزة. هذه ضرورية لتعزيز فهمنا لعدم تجانس العدلات وآثارها في مختلف السياقات الفسيولوجية والمرضية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

العدلات هي خلايا مناعية حبيبية وأكثر الكريات البيض وفرة في الدم المحيطي ، وتشكل حوالي 50٪ -70٪ من الكريات البيض في المتوسط. تتطور في نخاع العظام من سلائف الخلايا الحبيبية وحيدة الخلايا (GMPs) ، والتي بدورها تتطور من الخلايا السلفية المكونة للدم (HPCs) في وجود عامل تحفيز مستعمرة الخلايا المحببة (G-CSF). في التوازن ، يبلغ عمرها الافتراضي ~ 24 ساعة ، لكن الدراسات أظهرت أنه يمكن إطالة عمرها في ظل ظروف فسيولوجية محددة والبيئات الدقيقة المرتبطة بها مثل التنشيط المناعيالمزمن 1 ، والالتهاب1 ، وحتى إقامة الأنسجة في حالةمستقرة 2. لطالما اعتبرت العدلات خط الدفاع الأول ضد مسببات الأمراض وتثير آثارها المضادة للميكروبات من خلال 3 وظائف مستجيب رئيسية - التحلل ، والبلعمة ، وتنشيط وإطلاق مصيدة العدلات خارج الخلية (NET).

تفحص معظم الدراسات حول وظيفة العدلات والبيولوجيا نتائج إجمالي العدلات. ومع ذلك ، من الدراسات التي أجريت على إعدادات السرطان التي تحدد الأنواع الفرعية N1 (المضادة للورم) / N2 (المؤيدة للورم) إلى تصنيف العدلات بناء على النضج والمرض والحالة الفسيولوجية ، وحتى الكثافة الخلوية (العدلات منخفضة الكثافة والكثافة الطبيعية) ، أصبح من الواضح بشكل متزايد أن مجموعة العدلات البشرية تشكل أنواعا فرعية متنوعة ظاهريا. سواء كان وجود هذه الأنواع الفرعية للعدلات يمكن أن يعزى إلى كونها أنواعا متميزة تماما من الخلايا أو بسبب الطبيعة المعقدة للدونة ، فهناك مجموعة متزايدة من الأدبيات حول العدلات غير النمطية وتقدم فرصة مقنعة لدراسة العدلات منخفضة الكثافة المنفصلة عن العدلات ذات الكثافةالطبيعية 3.

تم وصفها لأول مرة في مرضى الذئبة الحمراء على أنها مجموعة فرعية من العدلاتالمؤيدة للالتهابات 4 ، وقد تم تحديدها منذ ذلك الحين في الأمراض المزمنة والحمل وحتى في الدورة الدموية الصحية ، في القدرات المؤيدة للالتهابات وكذلك القمعية5،6،7،8. تم العثور على LDNs بالتزامن مع خلايا الدم المحيطية أحادية النواة (PBMCs) عندما يتم طرد الدم الكامل فوق وسائط متدرجة الكثافة. تتوافق كثافتها النوعية مع حوالي 1.077 جم / مل ، مقارنة ب NDNs عند 1.083 جم / مل9. في حين أنه لا يزال هناك جدل كبير حول هذا الموضوع ، إلا أن هناك تكهنات بأن LDNs تشبه نمطا ظاهريا للخلايا الحبيبية غير الناضجة (على غرار الخلايا النخاعية والخلايا النخاعية ، بكثافة أقل من 1.080 جم / مل) 9،10. لا يزال آخرون يتكهنون بوجود أنماط ظاهرية LDN ناضجة وغير ناضجة اعتمادا على وجود أو عدم وجود المرض11،12،13. ومع ذلك ، فقد تم الكشف عن LDNs أيضا في الأفراد الأصحاء. ومع ذلك ، فإن إدراجها في بعض الدراسات محدود بسبب صعوبة عزلها بأعداد كافية5.

تهدف هذه الدراسة إلى عزل هاتين المجموعتين بكميات تسمح لنا بإجراء تجارب التمثيل الغذائي في الموقع (0.5 × 106 خلايا / مل). عند القيام بذلك ، تم تحسين البروتوكولالحالي 5 باستخدام علامات النمط الظاهري المبلغ عنها بشكل شائع13،14 والتي توفر أفضل نتيجة لعزل وتوصيف LDNs و NDNs من الدم الكامل (الشكل 1 أ).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم جمع عينات الدم بموافقة مستنيرة من المشاركين الأصحاء. حصلت الدراسة على موافقة لجنة أخلاقيات البحث في كل من مستشفى سانت جيمس ومستشفى جامعة تالاغت.

1. إعداد وسط تدرج الكثافة ، وكسور حلول العمل متساوية التوتر ومخزن لفصل الخلايا

  1. تحضير محاليل العمل متساوية التوتر من وسط تدرج الكثافة
    1. تحضير محلول عمل متساوي التوتر بنسبة 100٪ (~ 1.123 جم / مل)
      1. لتحضير محلول العمل متساوي التوتر بنسبة 100٪ ، اجمع بين 27 مل من وسط تدرج الكثافة مع 3 مل من 10x PBS. ينتج عن هذا محلول متساوي التوتر مناسب لمزيد من التخفيفات.
    2. تحضير محلول عمل متساوي التوتر بنسبة 81٪ (~ 1.0996 جم / مل)
      1. قم بإعداد محلول العمل متساوي التوتر بنسبة 81٪ عن طريق خلط 8.1 مل من محلول العمل متساوي التوتر بنسبة 100٪ (المحضر في الخطوة 1.1.1) مع 1.9 مل من 1x PBS. تخلط جيدا لضمان التجانس.
    3. تحضير محلول عمل متساوي التوتر بنسبة 70٪ (~ 1.0861 جم / مل)
      1. لتحضير محلول العمل متساوي التوتر بنسبة 70٪ ، امزج 7 مل من محلول العمل متساوي التوتر بنسبة 100٪ مع 3 مل من 1x PBS. تأكد من خلط المحلول جيدا.
    4. تحضير محلول عمل متساوي التوتر بنسبة 55٪ (1.0676 جم / مل)
      1. اصنع محلول العمل متساوي التوتر بنسبة 55٪ عن طريق خلط 5.5 مل من محلول العمل متساوي التوتر بنسبة 100٪ مع 4.5 مل من 1x PBS. تخلط جيدا.
  2. طبقات الكسور المتدرجة
    1. طبقات كسر التدرج
      1. باستخدام أنبوب مخروطي سعة 15 مل ، ضع طبقة بعناية 3 مل من محلول العمل متساوي التوتر بنسبة 81٪ في الأسفل. بعد ذلك ، ضع ببطء ورفق 3 مل من محلول العمل متساوي التوتر بنسبة 70٪ في الأعلى ، مع تجنب خلط الطبقات. سيتم استخدام هذا التدرج لفصل الخلايا.
  3. تحضير المخزن المؤقت لفصل الخلايا
    1. تحضير 500 مل من المخزن المؤقت لفصل الخلايا
      1. لتحضير المخزن المؤقت لفصل الخلايا ، امزج 2٪ مصل بقري الجنين (FBS) و 1 ملي مولار حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA) مع 1x PBS بحجم إجمالي قدره 500 مل. استخدم هذا المخزن المؤقت لغسل الخلايا وإعادة تعليقها أثناء عملية العزل.
        ملاحظة: تأكد من أن الطبقات مفصولة جيدا وغير مضطربة. في هذا البروتوكول ، يشار إلى محاليل العمل متساوية التوتر باسم "100٪" و "81٪" و "70٪" و "55٪" بناء على طريقة التحضير ، بما يتفق مع الدراسات السابقة5. ومع ذلك ، من المهم توضيح أن هذه الملصقات لا تمثل التركيزات النهائية الفعلية لحلول العمل. على سبيل المثال ، يتم تحضير وسط التدرج الكثافة "100٪" عن طريق خلط 27 مل من وسط التدرج النقي الكثافة مع 3 مل من 10x PBS ، مما ينتج عنه تركيز نهائي بنسبة 90٪ محلول عمل متساوي التوتر. وتعكس التخفيفات اللاحقة (على سبيل المثال، "81٪" و"70٪" و"55٪") بالمثل نسب التحضير بدلا من تركيزات النسبة المئوية الحقيقية. تم الاحتفاظ بهذه التسمية للحفاظ على الاتساق مع المصطلحات المستخدمة في الأدبيات السابقة حول هذا الموضوع.

2. عزل العدلات عن الدم الكامل باستخدام الانتقاء السلبي

  1. تحضير الخرز المغناطيسي
    1. قم بتدوير الخرزات المغناطيسية جيدا لمدة 30 ثانية لضمان إعادة تعليقها بالكامل قبل الاستخدام.
  2. تحضير الدم
    1. لكل متبرع ، تناول 4 مل من الدم الكامل في ثلاثة أنابيب منفصلة 14 مل مستديرة القاع.
  3. إضافة كوكتيل عزل العدلات والخرز المغناطيسي
    1. أضف 50 ميكرولتر من كوكتيل عزل العدلات و 50 ميكرولتر من الخرز المغناطيسي لكل مل من الدم إلى كل أنبوب. للحصول على 4 مل من الدم ، أضف 200 ميكرولتر من كل كاشف.
    2. أعد تعليق الخليط جيدا عن طريق الماصة برفق واحتضانه في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 5 دقائق للسماح للكواشف بالارتباط بالخلايا غير المرغوب فيها.
  4. الغسيل والفصل المغناطيسي - الجولة الأولى
    1. قم بتعبئة كل أنبوب إلى 12 مل باستخدام المخزن المؤقت لفصل الخلايا واخلطه جيدا.
    2. ضع الأنابيب بدون أغطية على مغناطيس واتركها تحتضن في RT لمدة 10 دقائق للسماح بسحب الخرزات المغناطيسية المرتبطة بالخلايا غير المرغوب فيها إلى جدار الأنبوب.
  5. مجموعة من الخلايا غير المنضمة
    1. انقل معلق الخلية الشفافة الذي يحتوي على عدلات بعناية من كل أنبوب إلى أنبوب جديد ونظيف باستخدام ماصة نقل. قم بإزالة الأنبوب الأصلي من المغناطيس.
  6. إعادة تطبيق الحبة المغناطيسية وحضانة - الجولة الثانية
    1. دوامة الخرز المغناطيسي مرة أخرى لمدة 30 ثانية. أضف نفس حجم الخرزات المغناطيسية إلى تعليق الخلية المنقول حديثا كما في الخطوة 2.3. قم بالتعليق جيدا واحتضانه في RT لمدة 5 دقائق أخرى.
  7. الفصل المغناطيسي النهائي والتجميع
    1. ضع الأنابيب مرة أخرى على المغناطيس بدون أغطية واحتضنها في RT لمدة 10 دقائق أخرى.
    2. انقل تعليق الخلية الشفافة بعناية إلى أنبوب جديد. يمثل هذا المعلق النهائي إجمالي عدد العدلات المعزولة.

3. فصل العدلات منخفضة الكثافة (LDNs) والعدلات ذات الكثافة الطبيعية (NDNs) عن إجمالي عدد العدلات

  1. تجميع وإعداد معلقات الخلايا
    1. لكل متبرع ، قم بتجميع معلقات العدلات المعزولة في أنابيب سعة 50 مل. قم بتعبئة كل أنبوب بحجم إجمالي يبلغ 50 مل باستخدام المخزن المؤقت لفصل الخلية.
  2. الطرد المركزي
    1. قم بالطرد المركزي للأنابيب عند 400 × جم لمدة 5 دقائق في RT مع تشغيل الفرامل.
  3. إعادة التعليق وعد الخلايا
    1. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات العدلات في 1 مل من المخزن المؤقت لفصل الخلايا. قم بإجراء تعداد الخلايا لتحديد العدد الإجمالي للعدلات.
  4. تحضير وسط تدرج الكثافة
    1. قم بالطرد المركزي للأنابيب مرة أخرى عند 400 × جم لمدة 5 دقائق في RT مع تشغيل الفرامل. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات العدلات في 3 مل من وسط التدرج الكثافة 55٪. للحصول على الدقة المثلى ، استخدم 3 مل من وسط التدرج الكثافة 55٪ لكل 5-6× 10 6 عدلات إجمالية.
    2. إذا لزم الأمر ، قم بتقسيم الخلايا المعلقة عبر عدة أنابيب متدرجة كثافة مسبقة الصنع ، مع التأكد من وضع 3 مل من تعليق الخلية في كل أنبوب.
  5. طبقات على أنابيب تدرج الكثافة
    1. ضع طبقة ببطء من معلق الخلية سعة 3 مل الذي يحتوي على وسط تدرج الكثافة بنسبة 55٪ على أنابيب تدرج الكثافة المعدة مسبقا (المعدة كما هو موضح في القسم 1). تأكد من وضع طبقات دقيقة لتجنب إزعاج التدرج.
  6. الطرد المركزي المتدرج الكثافة
    1. قم بالطرد المركزي للأنابيب عند 720 × جم لمدة 30 دقيقة دون استخدام الفرامل. بعد الطرد المركزي ، تعامل مع الأنابيب بعناية لتجنب إزعاج الطبقات.
  7. عزل كسور العدلات
    1. بعد الطرد المركزي ، لاحظ أن العدلات تنفصل إلى طبقتين متميزتين:
      سيتم وضع العدلات منخفضة الكثافة (LDNs) عند واجهة 55٪ / 70٪ ، وتشكل نطاقا علويا عند علامة 3 مل تقريبا ، وستكون العدلات ذات الكثافة العادية (NDNs) عند واجهة 70٪ / 81٪ ، وتظهر كنطاق سفلي حول علامة 6 مل.
    2. باستخدام ماصة النقل ، قم بعزل كل طبقة بعناية ونقلها إلى أنابيب منفصلة سعة 15 مل.
  8. غسل الكسور المعزولة
    1. لغسل أي وسط تدرج كثافة متبقية ، أضف 1x PBS إلى كل أنبوب سعة 15 مل حتى علامة 15 مل.
    2. جهاز طرد مركزي عند 400 × جم لمدة 5 دقائق عند RT مع تشغيل الفرامل. إذا لم تشكل الخلايا حبيبات صلبة وبدلا من ذلك ظلت معلقة ، كرر خطوة الغسيل هذه ، مما يشير إلى وجود وسط تدرج الكثافة المتبقي.
  9. عدد الخلايا والتطبيقات النهائية
    1. عد الخلايا في كل جزء واستمر في التطبيقات النهائية مثل تجارب التمثيل الغذائي أو تلطيخ قياس التدفق الخلوي أو استخراج الحمض النووي الريبي أو تحلل البروتين حسب الحاجة.
      ملاحظة: بعد طلاء الخلايا ، يوصى بتدوير اللوحة عند 210 × جم لمدة دقيقة واحدة (إيقاف تشغيل الفرامل).

4. التنميط الظاهري ل LDN و NDN المعزول

  1. عزل ~ 0.5-1 × 106 LDNs و NDNs. اصنع مزيجا رئيسيا للأجسام المضادة المركزة 2x باستخدام CD14 و CD86 و CD15 و CD16 و CD10 و Fc block وصبغة البقاء.
  2. قم بتلطيخ مجموعات LDN و NDN المعزولة بحجم مكافئ من الأجسام المضادة الرئيسية بحيث يكون التخفيف النهائي للأجسام المضادة التي تلطخ الخلايا 1: 100 (CD14 ، CD86 ، CD15 ، CD16 ، CD10 ، Fc block) و 1:50 (بقعة البقاء) ، على التوالي.
  3. احتضان الخلايا لمدة 10 دقائق في الظلام في RT.
    ملاحظة: تأكد من خلط الخلايا جيدا مع الجسم المضاد mastermix وكتلة Fc.
  4. اغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام PBS ، ثم جهاز الطرد المركزي على حرارة 400 × جم لمدة 5 دقائق. تخلص من المادة الطافية.
  5. قم بإصلاح الخلايا في 1٪ بارافورمالدهيد (PFA) لمدة 15 دقيقة عند RT في الظلام.
  6. اغسل الخلايا مرة أخرى باستخدام PBS ، وجهاز الطرد المركزي على حرارة 400 × جم لمدة 5 دقائق ، وتخلص من المادة الطافية.
  7. أعد تعليق الخلايا في 200 ميكرولتر من PBS أو حسب الحاجة لاستخدامها واحصل على الخلايا على مقياس التدفق الخلوي في أسرع وقت ممكن.
    ملاحظة: يمكن تخزين الخلايا الملطخة والثابتة على المدى القصير عند درجة حرارة 4 درجات مئوية في الظلام لمنع التبييض الضوئي للفلوروفورات. ومع ذلك ، من الناحية المثالية ، يجب تنفيذ إجراء التنميط الظاهري على الفور بعد التلوين والتثبيت لضمان بقاء الخلية المثلى والنتائج الدقيقة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمكن ملاحظة الطبقات الناجحة للعدلات الكلية على وسط تدرج الكثافة في الشكل 1 ب. يجب الحصول على نطاقين متميزين. في حالة حدوث خلط التدرجات ، أو كان عدد العدلات الكلية ذات الطبقات لكل أنبوب مرتفعا (أكبر من 5-6 تقريبا × 106) ، ستبدو النطاقات منتشرة (الشكل 1 ج) ، ويزداد خطر اختلاط النوعين الفرعيين من العدلات بشكل كبير. لتجنب هذا الأخير ، نوصي بوضع طبقات تصل إلى 5-6 × 106 عدلات إجمالية لكل أنبوب متدرج كثافة. على الرغم من التقارير التي تفيد بأن LDNs...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا ، نقدم طريقة محسنة لتقسيم إجمالي عدد العدلات إلى عدلات منخفضة الكثافة وذات كثافة طبيعية ، جنبا إلى جنب مع التوصيف الظاهري لكل نوع من أنواع الخلايا باستخدام قياس التدفق الخلوي المقتبس من الطرق السابقة5.

يعتمد هذا البروتوكول على عزل LDNs و NDNs عن الدم الكامل. الخطوة الحاسمة هي عزل العدلات الكلية من خلال طرق الاختيار السلبية. تتضمن طرق الانتقاء الإيجابية استخدام الأجسام المضادة التي ترتبط بعلامات السطح ، مما قد يؤدي إلى تنشيط العدلات ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لم يكشف المؤلفان عن أي إفصاح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تمويل هذا العمل من قبل مجلس البحوث الصحية EIA-2024-002 وصندوق مستشفى مدينة دبلن الملكية. نود أن نشكر الدكتورة لورين ثونغ والدكتور كيفن براون على مساعدتهم في جمع عينات من متبرعين أصحاء لهذه المخطوطة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
14 مل أنبوب دائري القاع من مادة البولي بروبيلين (17 × 100 مم)Corning Science352059
APC مضاد للإنسان CD14 (63D3)BioLegend367118
Brilliant Violet 421 CD10 مضاد للإنسان (25 اختبار)BioLegend312217
Dulbecco's Salt-Fluid SigmaD8537-1L
EasyEights EasySep Magnetتقنيات الخلايا الجذعية# 18103
EasySep Buffer (المخزن المؤقت لفصل الخلايا)تقنياتالخلايا الجذعية# 20144
EasySep طقم عزل العدلات البشرية المباشرةتقنيات الخلايا الجذعية# 19666
كاشف حجب FcR ، كاشفMiltenyi Biotecالبشري 130-059-901
FITC CD16 المضاد للإنسان (3G8)BioLegend302005
OneComp eBeads تعويض الخرزeBioscience Inc.01-1111-42
PE / Cy7 CD86 المضاد للإنسان (BU63) BioLegend374209
PE / Dazzle 594 CD15 المضاد للإنسان (SSEA-1)BioLegend323037
أقراص ملحية مخزنة بالفوسفات   ؛Gibco18912-014
Zombie NIR Fixable Viability KitBioLegend423105

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tracchi, I., et al. Increased neutrophil lifespan in patients with congestive heart failure. Eur J Heart Fail. 11 (4), 378-385 (2009).
  2. Ballesteros, I., et al. Co-option of neutrophil fates by tissue environments. Cell. 183 (5), 1282-1297.e18 (2020).
  3. Mckenna, E., et al. Neutrophils: Need for standardized nomenclature. Front Immunol. 12, 602963(2021).
  4. Hacbarth, E., Kajdacsy-Balla, A. Low density neutrophils in patients with systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, and acute rheumatic fever. Arthritis Rheumatol. 29 (11), 1334-1342 (1986).
  5. Hardisty, G. R., et al. High purity isolation of low density neutrophils casts doubt on their exceptionality in health and disease. Front Immunol. 12, 625922(2021).
  6. Scapini, P., Marini, O., Tecchio, C., Cassatella, M. A. Human neutrophils in the saga of cellular heterogeneity: Insights and open questions. Immunol Rev. 273 (1), 48-60 (2016).
  7. Ssemaganda, A., et al. Characterization of neutrophil subsets in healthy human pregnancies. PLoS One. 9 (2), e85696(2014).
  8. Tay, S. H., Celhar, T., Fairhurst, A. M. Low-density neutrophils in systemic lupus erythematosus. Arthritis Rheumatol. 72 (10), 1587-1595 (2020).
  9. Hassani, M., et al. On the origin of low-density neutrophils. J Leukoc Biol. 107 (5), 809-818 (2020).
  10. Cowland, J. B., Borregaard, N. Isolation of neutrophil precursors from bone marrow for biochemical and transcriptional analysis. J Immunol Methods. 232 (1-2), 191-200 (1999).
  11. Blanco-Camarillo, C., Aleman, O. R., Rosales, C. Low-density neutrophils in healthy individuals display a mature primed phenotype. Front Immunol. 12, 672520(2021).
  12. Park, J., et al. Low-density granulocytes display immature cells with enhanced NET formation in people living with HIV. Sci Rep. 13 (1), 13282(2023).
  13. Denny, M. F., et al. A distinct subset of proinflammatory neutrophils isolated from patients with systemic lupus erythematosus induces vascular damage and synthesizes type I IFNs. J Immunol. 184 (6), 3284-3297 (2010).
  14. Ui Mhaonaigh, A., et al. Low density granulocytes in anca vasculitis are heterogenous and hypo-responsive to anti-myeloperoxidase antibodies. Front Immunol. 10, 2603(2019).
  15. Mosca, T., Forte, W. C. Comparative efficiency and impact on the activity of blood neutrophils isolated by Percoll, Ficoll and spontaneous sedimentation methods. Immunol Invest. 45 (1), 29-37 (2016).
  16. Ren, Y., et al. Increased apoptotic neutrophils and macrophages and impaired macrophage phagocytic clearance of apoptotic neutrophils in systemic lupus erythematosus. Arthritis Rheum. 48 (10), 2888-2897 (2003).
  17. Connelly, A. N., et al. Optimization of methods for the accurate characterization of whole blood neutrophils. Sci Rep. 12 (1), 3667(2022).
  18. Carmona-Rivera, C., Kaplan, M. J. Low-density granulocytes in systemic autoimmunity and autoinflammation. Immunol Rev. 314 (1), 313-325 (2023).
  19. Yennemadi, A. S., Keane, J., Leisching, G. Mitochondrial bioenergetic changes in systemic lupus erythematosus immune cell subsets: Contributions to pathogenesis and clinical applications. Lupus. 32 (5), 603-611 (2023).
  20. Futoh, Y., et al. Peripheral low-density granulocytes after colorectal cancer surgery in predicting recurrence. BJS Open. 7 (1), zrac154(2023).
  21. Dwivedi, A., et al. Emergence of dysfunctional neutrophils with a defect in arginase-1 release in severe COVID-19. JCI Insight. 9 (17), e171659(2024).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة