مقالة منهجية

بروتوكول فعال لتقييم تعديل نشاط ERK في نماذج متلازمة نونان المبكرة لأسماك الزرد عبر الفحص المجهري الحي FRET والتألق المناعي

DOI:

10.3791/67831

⸱

مايو 2, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Research laboratories, Ospedale Pediatrico Bambino Gesù, IRCCS, 2Molecular Genetics and Functional Genomics, Ospedale Pediatrico Bambino Gesù, IRCCS, 3Microscopy facility, Research laboratories, Ospedale Pediatrico Bambino Gesù, IRCCS

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

اعتلالات RASopathies هي متلازمات وراثية متعددة الأجهزة ناتجة عن فرط تنشيط مسار RAS-MAPK. تظهر المتغيرات المسببة للأمراض التي يحتمل أن تنتظر التحقق من الصحة باستمرار بينما تحد البينات قبل السريرية الضعيفة من العلاج. هنا ، نصف بروتوكولنا في الجسم الحي لاختبار مستويات تنشيط ERK المرتبطة ب RASopathy والتحقق من صحتها وتعديلها الدوائي أثناء التطور الجنيني عن طريق التصوير الحي FRET في أسماك الزرد الصحفية في سن المراهقة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

RASopathies هي متلازمات وراثية ناتجة عن فرط نشاط ERK وتؤدي إلى أمراض متعددة الأجهزة يمكن أن تؤدي أيضا إلى الاستعداد للإصابة بالسرطان. على الرغم من عدم التجانس الجيني الواسع ، فإن طفرات اكتساب الوظيفة الجرثومية في المنظمين الرئيسيين لمسار RAS-MAPK تكمن وراء غالبية الحالات ، وبفضل تقنيات التسلسل المتقدمة ، يستمر تحديد المتغيرات المسببة للأمراض المحتملة التي تؤثر على مسار RAS-MAPK. يتطلب التحقق الوظيفي من إمراضية هذه المتغيرات ، وهو أمر ضروري للتشخيص الدقيق ، بروتوكولات سريعة وموثوقة ، ويفضل أن يكون ذلك في الجسم الحي. نظرا لندرة العلاجات الفعالة في مرحلة الطفولة المبكرة ، فإن مثل هذه البروتوكولات ، خاصة إذا كانت قابلة للتطوير في النماذج الحيوانية الفعالة من حيث التكلفة ، يمكن أن تكون مفيدة في توفير أرضية قبل السريرية لإعادة وضع الأدوية / إعادة استخدامها.

نصف هنا خطوة بخطوة بروتوكول التوليد السريع لنماذج RASopathy العابرة في أجنة أسماك الزرد والفحص المباشر لتغيرات نشاط ERK الحية المرتبطة بالأمراض التي تحدث بالفعل أثناء المعدة من خلال التصوير متعدد الأطياف لنقل طاقة فورستر (FRET) في الوقت الفعلي. يستخدم البروتوكول مراسل ERK المعدد وراثيا تم إنشاؤه مؤخرا ودمجه مع أجهزة المجاهر التجارية. نقدم مثالا على تطبيق لنماذج أسماك الزرد المتلازمة نونان (NS) التي تم الحصول عليها عن طريق التعبير عن Shp2D61G. نصف طريقة مباشرة تتيح تسجيل تغيير إشارة ERK في نموذج أسماك NS قبل وبعد تعديل الإشارة الدوائية بواسطة مثبطات MEK المتاحة بجرعة منخفضة من الجرعة. نحن بالتفصيل كيفية إنشاء واسترداد وتقييم إشارات FRET النسبية من عمليات الاستحواذ متعددة الأطياف قبل العلاج وبعده وكيفية التحقق من صحة النتائج عبر التألق المناعي الكلاسيكي على الأجنة الكاملة في المراحل المبكرة. ثم نصف كيف ، من خلال فحص المعلمات المورفومترية القياسية ، للاستعلام عن التغييرات المتأخرة في شكل الجنين ، مما يدل على ضعف ناتج في المعدة ، في نفس الأجنة التي يتم تقييم نشاط ERK الخاص بها بواسطة FRET الحي بعد 6 ساعات من الإخصاب.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

RASopathies هي متلازمات وراثية تضعف النمو الطبيعي وتؤثر على الأعضاء والأنسجة المختلفة. غالبا ما تحدث هذه الحالات بسبب طفرات اكتساب الوظيفة الجرثومية (GoF) في الجينات الرئيسية واللاعبين المشاركين في إشارات RAS / MAK ، مما يؤدي إلى فرط النشاط (زيادة الفسفرة) للكيناز المنظم للإشارة خارج الخلية (ERK). ينظم ERK بعض العمليات الأساسية المهمة أثناء نمو الأنسجة - عن طريق الانتقال إلى النواة1،2. الطفرات الجسدية في الجينات المشاركة في مسار RAS-MAPK هي أكثر الأحداث شيوعا التي تؤدي إلى الإصابة بالسرطان3. وبالتالي ، ليس من المستغرب أن يلاحظ الاستعداد للسرطان أيضا في RASopathies. متلازمة نونان (NS) ، التي تتميز بتأخر النمو ، وقصر القامة ، والعجز المعرفي مع شدة متغيرة ، واعتلال عضلة القلب ، هي الشكل الأكثر شيوعا لاعتلال عضلةالقلب 2. في معظم الحالات ، يحدث المرض بسبب طفرات GoF في PTPN11 ، وهو أول جين RASopathy يتم اكتشافه في أوائل عام 20004 ترميز لبروتين التيروزين فوسفاتيز SHP2 ، والذي يعمل كمنظم إيجابي للمسار.

منذ ذلك الحين ، وبفضل الاستخدام الأسي لنهج تسلسل الإكسوم في المرضى غير المشخصين ، يستمر اكتشاف المتغيرات المسببة للأمراض المحتملة التي تؤثر على العوامل المشاركة في RAS-MAPK ، والتي من المحتمل أن تكون مرتبطة بأشكال مختلفة من اعتلال RASopathies ، وتنتظر التوصيف الوظيفي للتقسيم الطبقي الفعالللمرضى 2. لتحقيق هذا الهدف ، يلزم وجود بروتوكولات تجريبية تضمن التحقق الوظيفي السريع والغني بالمعلومات على مستوى الكائنات الحية. إن استخدام نماذج الثدييات الكلاسيكية والموحدة لاختبار المتغيرات ذات الأهمية غير المعروفة سيكون مكلفا ويستغرق وقتا طويلا للغاية ويتطلب طرقا غازية في الكبيرة غير الشفافة. من الواضح أن مثل هذه الاستراتيجية لا تتوافق مع متطلبات الاختبار السريع ، نظرا للعبء المجتمعي الذي يمثله مرضى اعتلال RASopathy الفقراء أو غير المشخصين ، الذين لا يتلقون حاليا إدارة أو علاج. ستعمل بروتوكولات التقييم الكمي لسمات النمط الظاهري الرئيسية والارتباطات الجزيئية في الكائنات الحية بأكملها أيضا على تسريع الترجمة السريرية المحتملة للأدوية التي يحتمل أن تكون متاحة لمرضى RASopathy عن طريق إعادة الاستخدام / إعادة التوضع.

يعتبر الزرد نموذجا مثاليا للفقاريات لدراسة الأمراض التي تؤثر على التطور المبكر. كبداية ، تشترك أسماك الزرد في مستوى عال من التماثل الجيني مع البشر. ينتج عن الخصوبة العالية للأسماك البالغة إنتاج كبير من الأجنة الصغيرة وسريعة النمو. تكون الأجنة شفافة في المراحل المبكرة ، بحيث يمكن تصور العمليات التنموية الرئيسية - epiboly ، والمعدة ، والمحاور ، وتشكيل خطة الجسم - دون عناء باستخدام الفحص المجهري القياسي. بالإضافة إلى ذلك ، فإن توافر الخطوط المعدلة وراثيا التي يمكن استخدامها لتتبع سلوك خلوي معين وأحداث جزيئية ديناميكية في المكان والزمان أثناء التطور ، جنبا إلى جنب مع التقنيات المتقدمة لتوليد نماذج جينية ، أمر لا يهزم. علاوة على ذلك ، يمكن تقييم قراءات النمط الظاهري على مستويات متعددة في أسماك الزرد (من العيوب العضوية إلى العيوب الخلوية) ، وقد تم بالفعل إنشاء فحوصات مخصصة للعديد من الأمراض ، بما في ذلك RASopathies5. علاوة على ذلك ، فإن طرق الغمر بالحمام البسيطة نسبيا لإدارة الدواء خلال المراحل المبكرة ، على الأقل بالنسبة للمركبات القابلة للذوبان في الماء ، تسمح بفحص الأدوية عالي الإنتاجية في الجسم الحي بتنسيق 96 بئرا.

من وجهة نظر جزيئية ، توضح الدراسات التي تستخدم الأساليب القياسية ، مثل الكيمياء المناعية واللطخة المناعية ، بقوة العلاقة بين تنشيط ERK والعيوب التنموية المرتبطة باعتلال RASopathy في أجنة الأسماك6،7. يوفر المستشعر الحيوي FRET من نوع EKAR الذي تم تطويره مؤخرا في أسماك الزرد (Tg [ef1a: ERK biosensor-nes] ، Teen) أداة موثوقة في الجسم الحي لتسجيل تنشيط ERK أثناء التطور الجنيني بطريقة محلية وزمانيا. وبالتالي ، يمكن أن يكون مفيدا لتقييم أفضل للتغيرات الديناميكية في ERK والتعديلات الدوائية في نماذج أسماك RASopathy.

في مستشعر Teen ، يتم فسفرة ركيزة ERK محددة في المراسل عند تنشيط ERK ، مما يؤدي إلى تغيير توافقي يجلب في المنطقة المجاورة مانح CFP الفلوري (D) ومتقبل Ypet الفلوري (YFP المحسن) (A). وإذا تداخل طيف الانبعاث D إلى حد كبير مع طيف امتصاص A، يمكن أن يحدث FRET (امتصاص الطاقة من D إلى A). هذا يتناسب مع المسافة بين D و A ، وبالتالي ، في Teen ، مع حالة تنشيط ERK. يمكن إعداد بروتوكولات تصوير مختلفة باستخدام وحدات التصوير القياسية والمتقدمة للمجاهر القياسية أو متحدة البؤر في كل من العينات الحية والثابتة. عند الإثارة D ، يعد الحصول على عمليات مسح متعددة الأطياف على طول طيف محدد من الانبعاث (λ) من CFP إلى YFP متبوعا بخوارزميات "فك الخلط" الطيفية من بين أكثر الطرق موثوقية لتسجيل وقياس بيانات FRET8. يمكن تطبيقه أيضا على عينات الزرد الحية لتسجيل ديناميكيات الأنسجة في الجسم الحي .

بعد التقارير السابقة6،9 وتطبيقنا الأخير7 ، هنا ، نقوم بتفصيل سير العمل خطوة بخطوة باستخدام أسماك المراهقة لتقييم تنشيط ERK في الخلايا على هامش القطب الحيواني لنماذج NS في بداية المعدة وربطها بعيوب محاور الجسم المميزة التي لا تظهر إلا في وقت لاحق من التطور. نوضح كيفية الحصول على بيانات FRET الكمية وفحصها من معدية NS الحية قبل وبعد العلاج باستخدام MEKi متاح وكيفية التحقق من صحة النتائج عبر الكيمياء المناعية القياسية ضد ERK الفسفرة (النشطة) أو إجراء تحليل مورفومتري مترابط لعيوب استطالة الجنين.

يمكن تطبيق سير العمل لتعزيز الاختبار الوظيفي للمتغيرات الناشئة وجينات المرض المرتبطة باعتلال RASopathies والحصول على رؤى حول الارتباط بين ديناميكيات تنشيط ERK مكانيا وزمانيا أثناء تطور الفقاريات والعيوب المورفولوجية في الأجنة. نوضح أنه يمكن أيضا استخدام هذا البروتوكول لاختبار فعالية الأدوية المرشحة التي تعمل على تعديل تنشيط ERK.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم إجراء جميع الإجراءات التجريبية التي تنطوي على إسكان وتربيتها وفقا لإرشادات ARRIVE لاستخدام أسماك الزرد في البحوث الحيوانية ومرخصة من قبل وزارة الصحة الإيطالية (Direzione Generale della Sanità Animale e dei Farmaci veterinari - DGSAF). يمكن توسيع نطاق جميع تفاعلات الحمض النووي / الحمض النووي الريبي وجلسات التصوير حسب الرغبة ، اعتمادا على المادة النهائية المطلوبة أو عدد الجينات والمتغيرات التي تم اختبارها.

1. توليد وعلاج الدواء لنماذج RASopathy العابرة لأسماك الزرد العابرة

ملاحظة: لمراقبة التعبير عن المتغيرات المرتبطة ب RASopathy ، يمكن استخدام تركيبات محددة تحتوي على تسلسل الترميز المطلوب (cds) للبروتين ذي الأهمية في الإطار مع الأقراص المضغوطة للعلامات الصغيرة غير الفلورية (مثل myc أو ما شابه ذلك). بهذه الطريقة ، يمكن تقييم مستويات التعبير عن البروتين المتحور بواسطة اللطخة الغربية القياسية مقابل العلامة. إذا كانت الأجسام المضادة ضد البروتين المحدد محل الاهتمام متوفرة ، فيمكن تجنب العلامات. يمكن أيضا استخدام التألق المناعي لتقييم تعبير البروتين داخل أنسجة الجنين باتباع البروتوكولات القياسية. يمكن أن يكون هذا النوع من تجارب التحكم مفيدا لربط التعبير عن البروتين المتحور بمستويات تنشيط ERK المستحثة. لا ينصح باستخدام علامات الفلورسنت في تركيبة من تصوير FRET ، نظرا لاحتمال المحادثات المتقاطعة للانبعاث الفلوري أثناء الفحص المجهري.

  1. خطية البلازميد (الأيام 1-2) (الشكل 1 أ)
    ملاحظة: عند إنشاء نموذج مرض عابر في أسماك الزرد (RAsopathy هنا) الناجم عن طفرة GoF التي تؤثر على جين معين ، فإن النهج السريع هو تحضير mRNA الذي يشفر النوع البري (WT) والبروتين المتحور المعني ، والذي يجب بعد ذلك حقنه في أجنة أسماك الزرد باتباع الخطوات أدناه. يجب أن يحتوي البلازميد المستخدم كقالب لنسخ mRNA على CDS كامل الطول المطلوب (تسلسل الترميز) للجين ذي الأهمية المستنسخ في اتجاه مجرى مجرى المحفز للبوليميراز T7 أو Sp6 أو T3 وإشارة المنبع من بولي الأدينيل (polyA). إذا لم يكن متاحا ، فإن الخطوة الأولى هي إنتاجه عن طريق استنساخ أسماك الزرد أو CDS المطلوب من الإنسان في متجهمناسب 10 والتحقق من صحته عن طريق تسلسل SANGER. للاستنساخ ، ضع في اعتبارك وقتا إضافيا (في المتوسط أسبوع واحد بما في ذلك الاستنساخ وفحص المستعمرات وعزل وتوسيع المستنسخة الصحيحة).
    1. خطي البلازميد مع مناسبة تقييد إنزيمات يقطع فقط مرة واحدة في اتجاه مجرى النهر [بولي] إشارة (هنا [كبني]). لتحقيق خطية البلازميد الفعالة ، امزج 3 γ (ميكروغرام / ميكرولتر) من الحمض النووي البلازميد ، و 2 ميكرولتر من إنزيم التقييد (20،000 وحدة / مل) ، و 10 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتفاعل 10x في حجم نهائي قدره 100 ميكرولتر في الماء الخالي من النوكلياز. امزج المكونات جيدا عن طريق سحب العينة عدة مرات واحتضان مزيج التفاعل عند 37 درجة مئوية لمدة 2-4 ساعات.
    2. تحقق من نتيجة الخطية عن طريق الرحلان الكهربائي على هلام الاغاروز بنسبة 1.5٪.
      1. خفف محلول مخزون 10x من TBE (48.5 جم من تريس ، 11.4 مل من حمض الخليك الجليدي ، 20 مل من 0.5 م EDTA [درجة الحموضة 8.0]) بماء خال من النوكلياز.
      2. تحضير جل الاغاروز عن طريق إذابة 1.5 غرام من الاغاروز في الميكروويف في حجم نهائي 100 مل من محلول 1x TBE. ثم أضف 3.5 ميكرولتر من صبغة هلام الصبغة.
      3. صب الجل عن طريق صب محلول الاغاروز في غرف ذات حجم مناسب ، اعتمادا على عدد الحالات / البلازميدات. اضبط الأمشاط وانتظر حوالي 1 ساعة حتى يتجمد الجل ؛ بعد ذلك ، قم بإزالة الأمشاط وضع الجل المبلمر في صينية الجل المناسبة للرحلان الكهربائي.
      4. امزج بضعة ميكرولتر من البلازميد المهضوم ("المقطوعة") و 1.5 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحميل 6x (الذي يحتوي على صبغة لمراقبة الرحلان الكهربائي) في حجم نهائي قدره 10 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكلياز. يعد بنفس الطريقة أيضا عينة تحكم منفصلة مع البلازميد غير المهضوم ("غير مقطوع"). قم بتحميل العينات في ممرات الاغاروز ، وفي الممر الأول ، قم بتحميل سلم الحمض النووي 1 كيلو بايت. قم بإجراء الرحلان الكهربائي للحمض النووي عند 100 فولت لمدة 30 دقيقة.
      5. تصور وتوثيق نطاقات الحمض النووي الناتجة عن التشغيل على مصباح إضاءة قياسي للأشعة فوق البنفسجية. تحقق من كفاءة خطية البلازميد من خلال فحص نمط نطاقات الحمض النووي التي تقارن بين "القطع" و "غير المصقول".
        ملاحظة: يجب أن تعمل البلازميدات الخطية بشكل كاف بشكل أسرع كشريط حاد واحد. تأكد من اكتمال انقسام الحمض النووي لأن بدء تفاعل النسخ هو خطوة محددة رئيسية يمكن إعاقتها بسبب وجود أشكال البلازميد الدائرية ، مما يؤدي إلى ضعف إنتاجية mRNA.
    3. استمر في تنقية البلازميد الخطي باستخدام مجموعات تنقية الحمض النووي القائمة على عمود الدوران المتوفرة تجاريا وتخزين مستحضر الحمض النووي المنقى عند -20 درجة مئوية حتى الحاجة.
      ملاحظة: بدلا من الخطية ، من الممكن استخدام منتج PCR كقالب لنسخ mRNA ، بشرط أن يتضمن تسلسل محفز البوليميراز في المنبع وتسلسل إشارة polyA في اتجاه مجرى كودون التوقف. يجب أيضا تنقية منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل وفحصها على هلام الاغاروز قبل المتابعة.
  2. In vitro نسخ mRNA وتنقيتها ومراقبة الجودة (الأيام 2-3) (الشكل 1 أ)
    ملاحظة: نظف منطقة العمل والماصات بعناية باستخدام محاليل إزالة التلوث RNAse. استخدام المواد والكواشف الخالية من النوكلياز. ارتداء القفازات. سيؤدي ذلك إلى تقليل تلوث RNase والسماح بإنتاجية أفضل من mRNA كامل الطول.
    نسخ mRNAs المغطاة ومتعددة الأدينيل التي تشفر WT والبروتينات الطافرة من البلازميدات الخطية باستخدام مجموعات قياسية لنسخ mRNA في المختبر واتباع تعليمات الشركة المصنعة.
    1. الطرد المركزي البلازميد الخطي المنقى لبضع ثوان عند 17,949 × جم لضمان جمع الحطام في قاع الأنبوب وعدم نقله إلى تفاعل النسخ.
    2. قم بإذابة جميع المكونات في درجة حرارة الغرفة (RT) باستثناء خليط نظائر NTP و CAP ، والتي يتم الاحتفاظ بها على الجليد. احتفظ بالبوليميراز عند -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
    3. جهاز الطرد المركزي بإيجاز جميع الكواشف عند 17,949 × جم قبل الاستخدام لمنع فقدان الكاشف أو التلوث العرضي ودوامة المخزن المؤقت للتفاعل 10x والخليط التناظري NTP / CAP الجاهز للاستخدام حتى يصبحوا في المحلول تماما. احتفظ بالمخزن المؤقت للتفاعل 10x عند RT.
    4. قم بإعداد تفاعل النسخ عند RT عن طريق إضافة 600-800 نانوغرام من البلازميد الخطي والنقي إلى محلول يحتوي على 10 ميكرولتر من خليط تناظري 2x NTP / CAP ، 2 ميكرولتر من محلول تفاعل 10x ، 2 ميكرولتر من إنزيم SP6 أو T7 أو T3 (اعتمادا على المحفز المحدد في المنبع من CDS في البلازميد) في حجم نهائي يبلغ 20 ميكرولتر مكون من ماء خال من النوكلياز. تخلط جيدا عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل عدة مرات.
    5. احتضان تفاعل النسخ عند 37 درجة مئوية في جهاز التدوير الحراري. تأكد أيضا من ضبط درجة حرارة الغطاء على 37 درجة مئوية وتشغيل التفاعل لمدة ساعتين.
    6. لإزالة البلازميد المتبقي الذي لم يتم نسخه أثناء التفاعل ، أضف 1 ميكرولتر من محلول DNAse القياسي (2 وحدة / ميكرولتر). امزج التفاعل جيدا عن طريق سحب العينة عدة مرات واحتضانه عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة إضافية.
    7. قبل المتابعة ، تحقق من جودة وسلامة الرنا المرسال المركب في المختبر بواسطة الرحلان الكهربائي للأغروز TBE / فورماميد. قم بإذابة 1.0 جم من الاغاروز في 50 مل من محلول 1x TBE ، وأضف 5.5 مل من 37٪ فورماميد و 3.5 ميكرولتر من صبغة هلام الصبغة ، واخلط ، وصب الجل كما هو موضح أعلاه.
      تنبيه: عند التعامل مع الفورماميد، ارتد معدات الحماية الشخصية (PPE) واستخدم غطاء كيماويا.
    8. امزج 1 ميكرولتر من الرنا المرسال المنسوخ مع 2.5 ميكرولتر من 2x Formamide Dye Loading Buffer في ماء خال من النوكلياز بحجم إجمالي قدره 5 ميكرولتر. قم بتشغيل الجل عند 100 مللي فولت لمدة 10-15 دقيقة في مخزن مؤقت 1x TBE مبرد مسبقا. قم أيضا بتشغيل سلم الحمض النووي و/أو الحمض النووي الريبي بسعة 1 كيلو بايت.
    9. اختياري: قم بتغيير طبيعة السلم والحمض النووي الريبي المرسال عند 70 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
    10. تصور وتوثيق نطاقات mRNA الناتجة على مصباح إضاءة قياسي للأشعة فوق البنفسجية.
      ملاحظة: تزيد المدى الطويل ودرجات الحرارة المرتفعة من احتمالية تدهور الحمض النووي الريبي.
    11. إذا كانت سلامة وحجم الحمض النووي الريبي المغطى المركب هي الأمثل ، فاستمر في بولي الأدينيل للطرف C عن طريق الإضافة إلى التفاعل: 36 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكلياز ، و 20 ميكرولتر من 5x التحميل المخزن المؤقت لتغيير الطبيعة ، و 10 ميكرولتر من 25 ملي مولار MnCl2 ، و 10 ميكرولتر من 10 ملي مولار ATP ، و 4 ميكرولتر من إنزيم البولي أدينيل (مثل الإشريكية القولونية المنقى بولي (أ) البوليميراز). امزج التفاعل جيدا عن طريق سحب العينات عدة مرات واحتضان 100 ميكرولتر من التفاعل النهائي عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة إضافية.
      ملاحظة: لا ينصح بالتحقق من جودة الحمض النووي الريبي عن طريق الرحلان الكهربائي للهلام بعد تفاعل polyA لأن الحمض النووي الريبي سيظهر ملطخا بسبب ذيول polyA.
    12. قم بترسيب واستعادة mRNA المغطى ومتعدد الأدينيل المركب باستخدام الأملاح المناسبة مثل LiCl. باختصار ، امزج كميات متساوية من الماء الخالي من النوكلياز ومحلول LiCl القياسي 2.5 M (30 ميكرولتر) واحتضنه لمدة >30 دقيقة عند -20 درجة مئوية.
      ملاحظة: يمكن الحصول على هطول الأمطار الفعال بعد ساعتين ، ولكن الحضانة بين عشية وضحاها عادة ما تزيد من العائد النهائي ل mRNA.
    13. لتكبيل mRNA المنقى ، قم بالطرد المركزي للتفاعل لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية عند 17,949 × جم وقم بإزالة المادة الطافية. الآن ، اغسل الحبيبات ب ~ 1 مل من 70٪ إيثانول (EtOH) ، وجهاز طرد مركزي لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية عند 17,949 × جم لإزالة الملوثات والنيوكليوتيدات المتبقية من التفاعل.
    14. جفف الحبيبات في الهواء ثم أعد تعليقها في 20 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكلياز. قم بإذابة الحمض النووي الريبي جيدا عن طريق سحب العينات برفق وبشكل متكرر في RT واحتضانه في 10 دقائق.
      ملاحظة: افحص الحبيبات كل 5 دقائق للتأكد من تبخر EtOH. عند إعادة التعليق ، نظرا لالتصاق الحمض النووي الريبي ، قم بتثبيتها حتى تذوب بشكل صحيح في الماء.
    15. قم بتقييم تركيز ونقاء mRNA المحضر عن طريق قياس الامتصاص عند 260 نانومتر و 280 نانومتر (نسبة 260/280) في مقياس الطيف الضوئي. قم بقياس التخفيفات العددية المختلفة لمستحضر الحمض النووي الريبي لضمان تقدير التركيز الصحيح.
      ملاحظة: عادة ما يتراوح تركيز الحمض النووي الريبي المركب من 1 إلى 2 ميكروغرام / مل ، ولكن يمكن أن تختلف الكمية النهائية اعتمادا على طول CDS وكمية المادة الأولية.
    16. أثناء تقييم الجودة ، احتفظ بمخزون mRNA في الجليد ، ثم قم بتقسيسه إلى 5 ميكرولتر وتخزينه عند -80 درجة مئوية حتى يكون مطلوبا للحقن.
  3. تحضير المحاليل والمواد القياسية لحقن الأجنة والعلاج بالعقاقير (الأيام 2-3 ، الشكل 1 ب)
    1. اسحب إبر الحقن المجهري لأجنة الزرد باستخدام الشعيرات الدموية المعقمة (الأبعاد الشعرية القياسية: 1.0 OD × 0.58 ID × 100 L مم). استخدم جهاز مجتذب متاح تجاريا وقم بتطبيق الإعدادات المطلوبة ، من حيث جهد الخرج ، ووضع السحب (خطوة واحدة أو خطوتين) ، وقوة السحب للحصول على طول طرف متغير وقطر وشكل إبرة. للحصول على ميزات الإبرة شائعة الاستخدام لأسماك الزرد ، راجع عبد الرحمنوزملاؤه 11.
      ملاحظة: قد تختلف الإعدادات المثلى باختلاف المختبرات لأن الظروف البيئية (مثل الرطوبة أو درجة حرارة الغرفة) يمكن أن تؤثر على نتائج سحب الإبرة. يجب إعادة اختبار الإعدادات ومعايرتها بانتظام. يمكن تخزين الإبر المسحوبة في RT في حاويات نظيفة لعدة أشهر.
    2. قم بإعداد محلول مخزون "Danieau" 30x عند درجة الحموضة 7.6 عن طريق إذابة 101.7 جم من كلوريد الصوديوم ، و 1.56 جم من KCl ، و 2.96 جم من MgSO4 × 7H2O ، و 4.25 جم من Ca (NO3) 2 ، و 35.75 جم من HEPES في 1 لتر من الماء المقطر المزدوج (DD) لتحضير محلول الحقن المجهري. قم أيضا بإعداد محلول مخزون من الفينول الأحمر بنسبة 5٪ في ماء DD لاستخدامه كمتتبع مرئي لخليط الحقن.
    3. قم بإعداد محلول متوسط E3 لنمو الأجنة عن طريق تخفيف 4 مل من كلوريد الصوديوم (5 م) ، و 680 ميكرولتر من كلوريد الصوديوم (1 م) ، و 1.32 مل من كلوريد الكالسيوم2 × 2 ساعة2O (1 م) ، و 1.32 مل من MgSO4 (1 م) في حجم نهائي قدره 4 لتر من ماء التناضح العكسي.
    4. قم بإعداد محاليل مخزون الأدوية المرغوبة (في هذا المثال: مثبط مجاهدي خلق [MEKi] PD032590) كمحال مخزون وفقا لورقة بيانات المنتج والذوبان (10 ملي مولار من MEKi المفضل عن طريق إذابة 5 مجم في 1.036 مل من DMSO). تخلط جيدا وتنتج كميات صغيرة لتخزينها في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
      ملاحظة: DMSO هو مذيب شائع يستخدم لإذابة كل من المركبات القطبية وغير القطبية ويظهر قابلية للذوبان في مجموعة واسعة من المذيبات العضوية وكذلك الماء.
    5. قم بإعداد معلق الروبيان الحي عن طريق السماح لأكياس أرتيميا سالينا بالفقس في محلول الفقس (2 جم / لتر من أكياس أرتيميا سالينا في 30 جم / لتر من ملح المحيط المذاب مسبقا في ماء التناضح العكسي) عند 28-30 درجة مئوية لمدة 18 ساعة على الأقل ، مما يوفر تهوية مستمرة.
      ملاحظة: قد تتأثر ظروف الاستزراع ووقت الفقس بالظروف البيئية للمنشأة والكثير من الخراجات ويجب إعادة اختبارها بانتظام وإعادة ضبطها إذا لزم الأمر.
  4. تحضير أزواج التكاثر لأسماك Tg [ef1α: ERK biosensor-nes] (المراهقة) (اليوم 3)
    1. في يوم التزاوج ، قم بإطعام الأزواج البالغة بانتظام وفقا لبروتوكول مرفق المعتمد.
      1. تنظيف المستزرعة التي تحتوي على الجمبري الملحي المفرغ عن طريق تصفية الأكياس غير المفرغة أو الفارغة بمصفاتين بأحجام مختلفة من المرشح (الخطوة الأولى: 180 ميكرومتر، الخطوة الثانية: 112 ميكرومتر).
      2. اجمع وغسل الجمبري المالح المصفى في 200 مل من ماء التناضح العكسي لإطعام 10-15 سمكة بالغة بحوالي 5-10 مل من محلول الجمبري المالح.
        ملاحظة: تحقق من جودة محلول الجمبري المالح المفرغ بالنظر إلى حيويته وحركته وحجمه ولونه وتأكد من إزالة الأكياس غير المفرغة أو الفارغة ، والتي تكون غير قابلة للهضم للأسماك ويمكن أن تسبب ضررا للجهاز الهضمي للأسماك. بالنسبة لأزواج التكاثر ، يفضل تقديم الوجبة الأخيرة في اليوم قبل 3 ساعات على الأقل من عزل الأزواج في خزان التكاثر للسماح بهضم الطعام والحفاظ على مستويات عالية من جودة المياه.
    2. حدد أزواج الأسماك التي لم يتم إقرانها للتزاوج في (على الأقل) الأسبوعين الماضيين ، لتقليل الضيق والسماح بتطور الأمشاج. التأقلم مع أزواج الأسماك البالغة المختارة (عادة مع هذه التركيبة: 1 ♂: 2 ♀) في أحواض التكاثر المناسبة. افصل الإناث عن الذكور باستخدام مقسم الخزان حتى صباح اليوم التالي. تأكد من دورة إضاءة/ظلام قياسية تبلغ 14/10 ساعات.
      ملاحظة: يمكن أيضا ترتيب الصلبان الجماعية. ومع ذلك ، في هذه الحالة ، يمكن أن يحدث التفريخ في أوقات مختلفة ويصبح اختيار الأجنة في نفس المرحلة من القوابض المختلطة أكثر صعوبة. يعد الانتقال من الظلام إلى الضوء أمرا بالغ الأهمية للتزاوج الناجح.
  5. جمع الأجنة والحقن المجهري ل WT و mRNAs الطافرة (اليوم 4)
    1. بمجرد تشغيل المصباح في المنشأة ، قم بإزالة مقسم الخزان الذي يفصل بين الذكور والإناث ، وإذا لزم الأمر ، قم بتغيير ما يقرب من 20٪ من مياه الخزان بالمياه العذبة من نظام الاستزراع المائي المعاد تدويره للحفاظ على جودة المياه عالية دون تخفيف الهرمونات التي تفرزها الأسماك بشكل مفرط.
    2. اترك السمكة دون إزعاج وتحقق بانتظام من وضع البيض (عادة في أول 30 دقيقة إلى 1 ساعة من ضوء النهار). يتم وضع البيض (2-3 مم) ويسقط في قاع الخزان مفصولا بشبكة بحيث لا يستطيع البالغون أكله. اعزل البالغين الذين نجحوا في تربية مياه الخزان التي تحتوي على البيض وتصفيتها من خلال مصفاة قياسية (مثل مصفاة الشاي) للاحتفاظ بالبيض.
      ملاحظة: من الممكن إعادة نفس السمكة إلى حوض التكاثر لجولة تزاوج أخرى أو إعادة السمكة إلى أحواض الإسكان الأصلية ، وتسجيل زوج التزاوج والتاريخ والأداء.
    3. اغسل الأجنة المجمعة بوسط E3 طازج وقم بإزالة البيض غير المخصب والمتحلل والبراز وأنواع أخرى من الحطام من الأزواج باستخدام ماصة باستور.
      ملاحظة: اجمع ~ ن = 100 بيضة مخصبة في سن المراهقة في طبق بتري بقطر 90 مم لتجنب الاكتظاظ السكاني للأجنة.
    4. قم بترتيب ومحاذاة بويضات المراهقين المخصبة في لوحة حقن دقيق مخصصة تم الحصول عليها عن طريق صب 2٪ agarose في وسط E3 لإنشاء ممرات مناسبة يجب أن تحتوي على البيض وتقيده أثناء الحقن المجهري.
      ملاحظة: لتحقيق هذا الهدف ، يمكن استخدام قوالب مخصصة أو تجارية.
    5. قم بإعداد مزيج الحقن الدقيق الطازج لتوليد أجنة متحولة على النحو التالي: 30-60 بيكوغرام من الرنا المرسال المغطى ومتعدد الأدينيل (هنا shp2) المذاب في محلول 0.3x Danieau (مخفف من محلول المخزون) لحجم نهائي يبلغ 20 ميكرولتر. أضف 0.2 ميكرولتر (0.05٪) من محلول مخزون الفينول الأحمر كمتتبع للحقن المجهري.
    6. قم بتحميل الإبرة بسعة 2 ميكرولتر من مادة الحقن باستخدام ماصة اللودر الصغير. حقن المحلول في مرحلة خلية واحدة من أجنة أسماك الزرد المراهقة باستخدام جهاز حقن دقيق بالضغط متاح تجاريا ، وضبط إعدادات الضغط والوقت يدويا لمعايرة كل حقنة بناء على جودة الإبرة والجنين. راجع بروتوكولات الحقن المجهري القياسية لسمك الزرد المتوفرة في الأدبيات11،12.
    7. قم بتربية أجنة المراهقين المحقونة الدقيقة في ظل ظروف تربية خاضعة للرقابة (درجة الحرارة: 28 درجة مئوية ، الرطوبة: 70٪ ، دورة الضوء / الظلام: 14/10 ساعة) من أجل التطور الأمثل وتنظيف أي بيض يبدو غائما أو متدهورا في الساعات الثلاث القادمة بعد الترسيب.
    8. في ~ 4 ساعات بعد الإخصاب (HPF) ، قم بفحص الأجنة بحثا عن التألق (تعبير المراسل) باستخدام مجهر مجسم مضان قياسي مع إعدادات المصباح والمرشح المناسبة (465-500 نانومتر). استخدم الأسماك الإيجابية للمراهقين لتصوير FRET والأشقاء السلبيين لتقييمات الكيمياء المناعية (IHC) (انظر أدناه).
      ملاحظة: بالنظر إلى التباين المعروف في التعبير عن الجينات المعدلة وراثيا المستندة إلى Tol213 ، يمكن أن تظهر الأجنة مستويات متغيرة من تألق المراهقين . يوصى بفحص الأشقاء غير المحقونين للتحكم في التباين بين الأفراد في التألق داخل دفعة ، وبالنظر إلى النطاق الديناميكي المنخفض لتصوير FRET ، يتم التخلص من الأجنة ذات المستويات المنخفضة للغاية من التألق القاعدي.
  6. علاج أجنة أسماك الزرد بمثبط مجاهدي خلق (MEKi) (اليوم 4)
    1. تحضير محلول وسيط من MEKi PD0325901 (1 ملليمتر) عن طريق تخفيف 1 ميكرولتر من محلول مخزون 10 ملي مع 9 ميكرولتر مع وسط E3. استخدم المحلول الوسيط للحصول على محاليل نهائية منخفضة الجرعة. تحضير جرعة منخفضة (0.25 ميكرومتر) من PD0325901 MEKi بحجم إجمالي قدره 3 مل عن طريق خلط 0.75 ميكرولتر من المحلول الوسيط 1 ملي مع 2.25 ميكرولتر من وسط E3. قم بتخفيف 0.75 ميكرولتر من 10٪ DMSO مع 2.25 مل من وسط E3 للحصول على محلول التحكم (Ctrl).
    2. ضع أحواض الأجنة بأعداد متساوية في آبار مختلفة من صفيحة مكونة من 6 آبار وابدأ العلاج بالغمر في الحمام: لكل بئر ، استبدل وسط E3 مع وسيط E3 الذي يحتوي على التحكم في السيارة (0.0025٪ DMSO) أو الأدوية المخففة بالتركيز المطلوب (0.25 ميكرومتر ، 0.0025٪ DMSO) كما ذكرنا سابقا. استخدم 3 مل من محلول الدواء لكل بئر.
      ملاحظة: للتخلص من أي تأثيرات ناتجة عن تركيزات متفاوتة من الناقل (DMSO) ، من المهم التأكد من أن كل من حلول التحكم والمعالجة لها نفس تركيز DMSO النهائي.
    3. احتفظ بالأجنة المعالجة عند 28 درجة مئوية قبل جمعها حتى المرحلة التنموية المطلوبة لمقايسات المتابعة (هنا: التحليل المورفومتري والتحقق من صحة IHC).

2. التصوير الحي متعدد الأطياف FRET لنماذج أسماك الزرد RASopathy في مرحلة المعدة وتحليل البيانات

  1. تركيب gastrulae للتصوير المباشر (اليوم 4) (الشكل 2 أ)
    1. قم بإعداد وسط التركيب للأجنة الحية عن طريق إذابة 1.5 جم من الاغاروز منخفض الذوبان (LMA) في 1x PBS لصنع 1.5٪ LMA / E3.
      ملاحظة: اختر تركيز الاغاروز من 0.8 إلى 1.5٪ اعتمادا على مرحلة النمو والحاجة المحددة لكبح جماح الأسماك. قم بتوزيع محلول LMA الطازج في حصص بالتنسيق المطلوب وتخزين LMA في حالة بلمرة في RT (مستقر لبضعة أشهر). هذا يقلل من التلوث البكتيري والفطري ولكن تحقق من جودة LMA بانتظام قبل الاستخدام.
    2. قبل تركيب العينة ، قم بإذابة 1.5٪ LMA في خلاط حراري أو حمام مائي معقم عند 50 درجة مئوية. بمجرد الذوبان ، قم بخفض درجة حرارة الخلاط الحراري إلى حوالي 30 درجة مئوية.
    3. ضع جنينا واحدا محقون في سن المراهقة + (هنا معد يعبر عن ShpD61G) في وسط طبق زجاجي بقطر 35 مم للتصوير المباشر وتوجيهه باستخدام شعر رقيق. قم بإزالة وسط E3 الزائد وشل حركة الجنين عن طريق وضع قطرة من LMA في الأعلى وتركه لبلمرة في RT.
      ملاحظة: في بداية عملية البلمرة ، يمكن توجيه الأسماك إلى الموضع المطلوب. يوصى بشدة باستخدام LMA عند درجة حرارة لا تزيد عن 35 درجة مئوية لتجنب تلف الأنسجة.
  2. تحديد معلمات الفحص المجهري وإجراء تصوير FRET متعدد الأطياف للمعدة (اليوم 4) (الشكل 2 ب)
    ملاحظة: ينطبق البروتوكول على استخدام أي منصات للفحص المجهري متحد البؤر مزودة بجميع الأجهزة والبرامج اللازمة لإجراء تصوير FRET. استخدمنا هنا مجهر متحد البؤر مزودا بليزر أيون الأرجون بخطوط الطول الموجي 458-476-488-496-514 نانومتر ، ومقسم شعاع صوتي بصري قابل للبرمجة (AOBS) يفصل بين ضوء الإثارة والانبعاث ، وكاشفين هجين طيفيين (HyD) ، وحاضنة مرحلية للحفاظ على ظروف مستقرة لدرجة الحرارة (عند 28 درجة مئوية) والرطوبة أثناء التصوير المباشر للعينات.
    يمكن تطبيق بروتوكول التصوير الحي متعدد الأطياف FRET كما هو موضح على الأجنة في مراحل نمو مختلفة بعد المعدة المبكرة ، كما هو موضح من قبل Fasano et al.7. يجب النظر في مكدس z أكبر لمراحل التطور اللاحقة (على سبيل المثال ، 24 hpf) بالإضافة إلى إعدادات الفواصل الزمنية z و t المناسبة للسماح بخطوات الكشف متعددة الأطياف أثناء الحصول على صور FRET الطيفية.
    1. قم بتشغيل وحدة التحكم في الحاضنة قبل ساعة واحدة على الأقل من بدء الاستحواذ واضبط درجة الحرارة على 28 درجة مئوية للحفاظ على أجنة الزرد في حالة صحية. بمجرد استقرار درجة حرارة الحاضنة ، ضع طبق التصوير مع الجنين على حامل العينة واستخدم هدفا 10x / جافا (فتحة عددية 0.4) لتصور العينة بسرعة.
    2. في تكوين الليزر للبرنامج المشار إليه ، قم بتشغيل ليزر أيون الأرجون واستخدم شريط التمرير لضبط طاقة الليزر إلى 50٪. في إعدادات الأجهزة ، اختر دقة عمق 8 بت التي سيتم بها الحصول على الصور.
    3. حدد وضع مسح XYλZ للكشف الطيفي في لوحة الاقتناء وقم بتعيين معلمات الاستحواذ التالية: تنسيق الصورة: 512 × 512 بكسل ؛ سرعة المسح 400 هرتز ؛ تقريب بصري 0.75.
    4. قم بتنشيط خط الليزر 458 نانومتر لليزر أيون الأرجون واضبط قيمة شدته ، عادة <10٪ (هنا 8.5٪).
    5. حدد كاشف HyD واضبط حساسية الكاشف (الكسب) عن طريق إدخال القيمة المطلوبة (هنا 500).
      ملاحظة: بالنسبة للعينات الحية الفلورية الضعيفة ولتراكم ضوضاء أقل في الخلفية ، ينصح باستخدام أجهزة الكشف الهجينة بدلا من أنابيب المضاعف الضوئي (PMTs).
      في البرنامج المشار إليه ، يتطلب عرض طيف انبعاث الصبغة تنشيط الكاشف.
    6. للبدء ، قم بتنشيط الكاشف الأول (HyD) وحدد بروتين التألق السماوي (CFP) لعرض منحنى الانبعاث الخاص به. افتح القائمة المنسدلة لشريط الكاشف الخاص بالبرنامج لفتح قائمة التحديد لمنحنى انبعاث CFP. الآن ، قم بتنشيط كاشف ثان لعرض منحنى الانبعاث للصبغة الثانية من بروتين التألق الأصفر (YFP). لعرض منحنى انبعاث Ypet أيضا ، قم بتنشيط كاشف ثان ، ثم حدد منحنى انبعاث YFP الذي سيظهر في صورة الطيف ، بعد إيقاف تشغيل الكاشف الثاني.
      ملاحظة: بمجرد اكتمال هذه الخطوة ، يجب إلغاء تنشيط الكاشف الثاني ، حيث يتم استخدام كاشف واحد فقط في وضع الاستحواذ الطيفي.
    7. لبدء عمليات الاستحواذ المباشرة ، ضع مؤشر الكشف في نطاق انبعاث الإشارة الأكثر كثافة (في هذه الحالة ، YFP) لتصور العينة وتحديد مواضع البداية والنهاية لسمك العينة في نافذة z-stack LAS X.
    8. بالنسبة لخصائص نطاق المسح λ ، قم بتعيين المعلمات التالية: البداية (460 نانومتر) والنهاية (570 نانومتر) من نطاق الكشف ؛ عرض نطاق الكشف: 5 نانومتر ؛ λ مسح ضوئي Stepsize: 5 نانومتر. ابدأ الاستحواذ على z-stack.
      ملاحظة: تسمح المعلمات المشار إليها للمستخدمين بالحصول على تصوير سريع نسبيا بدقة مقبولة، ولكن يمكن استخدام إعدادات مختلفة. في إعدادات قرص الفلورة، يمكن إلغاء تحديد مرشح NOTCH الذي يتم إدخاله تلقائيا لتجنب فقدان الشدة الفردية.
    9. لتقييم تغيرات الإشارة في الوقت الفعلي عند التعرض ل MEKi ، قم بتركيب جنين متحور واحد (هنا Shp2D61G) في طبق زجاجي وصورة قبل العلاج بالعقاقير وبعده. بالنسبة لهذه التجارب الحية ، قم بإجراء العلاج الدوائي مباشرة عن طريق الغمر في الحمام أثناء جلسة التصوير بحد أقصى 2 مل من المحلول الذي يحتوي على الدواء المذاب.
  3. المعالجة اللاحقة للصور وفصل الصبغة متعددة الأطياف للحصول على صور FRET النسبية (اليوم 5) (الشكل 2 ج)
    1. لفصل انبعاث المانح (CFP) والمتقبل (Ypet) ، تأكد من التخلص من مساهمة انبعاث التألق لكلا الجزيئين في قناة FRET ، والتي تسمى النزيف الطيفي (SBT).
      1. ارجع إلى قواعد بيانات بروتينات الصبغة / الفلورسنت المتاحة للجمهور لعرض وتنزيل ملف .cvs بالنسبة إلى طيف انبعاث CFP القياسي (أطياف الإثارة والانبعاث).
      2. في لوحة البيانات لملف .cvs، اختر الخيار نص إلى أعمدة وقسم البيانات إلى أعمدة باستخدام فاصلة كمحدد. سيتضمن الملف الناتج معلومات إضافية (على سبيل المثال ، إثارة CFP ، CFP 2P) التي يجب إزالتها. احتفظ فقط ببيانات العمود المتعلقة بالطول الموجي والإرسال.
      3. في عمود انبعاث CFP ، قم بإزالة جميع بيانات الشدة من 501 نانومتر فصاعدا.
      4. احفظ ملف طيف انبعاث CFP المعدل من 460 إلى 500 نانومتر بنسق .xls (يسمى "eCFP المعدل" في الشكل 2C).
      5. كرر نفس الإجراء لتنزيل طيف انبعاث البروتين YFP ومعالجته والاحتفاظ فقط ببيانات العمود المتعلقة بالطول الموجي والانبعاث. قم بإزالة جميع قيم الانبعاثات حتى 524 نانومتر. احفظ ملف طيف انبعاث YFP المعدل من 525 إلى 650 نانومتر بتنسيق in.xls (يسمى "Ypet من 525 نانومتر" في الشكل 2C).
      6. للسماح باستبعاد النزيف الطيفي (SBT) في قاعدة بيانات الصبغة المتاحة في نافذة التكوين الخاصة بالبرمجية، قم بإدراج وحفظ طيفين مرجعيين معدلين للبث المرجعي ل CFP وYFP.
    2. حدد ملف الصورة الطيفية الناتج من جلسة التصوير، وافتح نافذة العملية ، وحدد فصل الصبغة الطيفية في أداة فصل الصبغة. قم بتكوين إعدادات فصل الصبغة على النحو التالي: في القوائم المنسدلة على الجانب الأيسر من مربع الحوار، حدد طيف بث CFP الجديد (معدل eCFP) في الموضع الأول وطيف بث YFP الجديد (Ypet من 525 نانومتر) من قاعدة بيانات الطيف.
    3. ضمن إعادة القياس ، حدد لكل قناة لقياس القنوات بشكل فردي ، ثم ، في مسح λ للصور ، اختر القناة ذات أكبر كثافة إشارة (المقابلة للخطوة 14 من المسح الطيفي على مستوى ذروة انبعاث قناة FRET ، المشار إليها بسهم أبيض في اللوحة يوضح خطوات الكشف على يمين الشكل 2 ب). بعد ذلك، تحرك على طول المسح الضوئي Z للعينة، واختر القسم البصري الذي يسلط الضوء على منطقة الاهتمام في منطقة الهامش.
    4. استخدم وضع تحديد عائد الاستثمار في منطقة الهامش لعمود لتحديد المنطقة ذات الطيف. انقر فوق ROICrosshair المشار إليه في الجزء العلوي في نافذة العرض لاستدعاء علامة التصويب وضبط حجم عائد الاستثمار المرجعي عن طريق إدخال قيمة 40 فوكسل في منطقة القياسات. حدد بدقة مجال الاهتمام من قبل ROICrosshair. في الرسم التخطيطي للصورة، اختر تسوية البيانات، ثم انقر فوق تطبيق لإجراء فصل الصبغة باستخدام الإعدادات التي تم تكوينها.
    5. افتح هذا الملف الذي تم إنشاؤه حديثا والذي تم الحصول عليه مع فصل القناتين وأنتج صورة إسقاط ثنائية الأبعاد من سلسلة الصور ثلاثية الأبعاد (الإسقاط الأقصى للكثافة) لتصور البيانات.
    6. في نافذة المعالجة ، حدد اقتصاص لفصل القنوات إلى ملفين منفصلين، قناتي CH1 وCH2 (أو FRET).
    7. في نافذة العملية ، حدد دمج الصور ، وحدد ملف CH2 وأدخله في الخيار الأول ، ثم حدد ملف CH1 وأدخله في الخيار الثاني. قم بتعيين إعادة قياس باستخدام العامل 5 واختر عملية النسبة. ثم انقر فوق تطبيق لإنشاء الملف الجديد الذي يحتوي على الصورة النسبية (YFP / CFP). احفظ الملف لتحليل بيانات المتابعة.
  4. التحليل الكمي لإشارات FRET وعرض الصور (الأيام 5-6) (الشكل 2 د)
    1. للقياسات الكمية لإشارات FRET من الصور النسبية FRET / CFP ، قم بإجراء التجربة على أجنة N>2 (تتكرر) ، اعتمادا على تقييم إحصائي مسبق بناء على التأثير المتوقع. استخدم حزمة معالجة الصور مثل برنامج فيجي مفتوح المصدر. استيراد ملفات الصور التي تم الحصول عليها من التصوير الطيفي وفصل الصبغة إلى حزمة تحليل الصور مثل فيجي مفتوحة المصدر.
    2. قبل البدء بتحديد عائد الاستثمار على صور gastrulae ، قم بتعيين المعلمات كقياسات قراءات باستخدام وظيفة التحليل | تعيين القياسات | حدد المعلمات ذات الأهمية مثل المنطقة والكثافة المتكاملة ومتوسط القيمة الرمادية.
    3. حدد منطقة الاهتمام (في هذه الدراسة المحددة: هامش المضلع) باستخدام أداة تحديد المضلع من شريط الأدوات. احفظ مواصفات عائد الاستثمار x,y بالنقر فوق تحليل | أدوات | مدير العائد على الاستثمار.
    4. لإجراء القياسات في عائد استثمار محدد ، انقر فوق تحليل | قياس. كرر هذه الخطوات لكل عائد استثمار وصورة/شرط.
      ملاحظة: إذا لزم الأمر، احفظ الصورة ك . تنسيق TIFF. من الممكن حفظ جميع قياسات عائد الاستثمار المستمدة من صور متعددة كملف عائد استثمار واحد. أعد تسمية كل مقياس في قائمة مدير عائد الاستثمار بالاسم الصحيح بالنسبة لكل عينة/صورة.
    5. لكل حالة (متحولة وطافرة + معالجة هنا) ، استخرج جميع قيم نسبة FRET / CFP لكل عائد استثمار محدد تم الحصول عليه وتنظيمها في ورقة عمل عن طريق تنظيم ، على سبيل المثال ، المجموعات التجريبية في الأعمدة وكل قيمة أولية في صفوف.
    6. استخدم أي برنامج مناسب لتقييم الاختلافات الإحصائية لإشارات FRET بين الظروف التجريبية المختلفة ولتوليد الرسم البياني وتصور البيانات.
      ملاحظة: تتوفر برامج مفتوحة المصدر ومرخصة لتحليل البيانات وحلول الرسوم البيانية.
    7. تنظيم مشروع محدد للتقييم الإحصائي مع مراعاة جميع القياسات الأولية وعدد التكرارات لكل حالة تجريبية. للتحليل الإحصائي لنسخة مكررة بيولوجية واحدة ، قم بإنشاء جدول عمودي يحتوي على متغير تجميع واحد ، مع تحديد كل مجموعة بواسطة عمود. للتحليل الإحصائي لأكثر من تكرار بيولوجي واحد ، قم بإنشاء جداول مجمعة تحتوي على متغيري تجميع على الأقل ، أحدهما محدد بأعمدة (على سبيل المثال ، الظروف التجريبية) والآخر محدد بواسطة الصفوف (على سبيل المثال ، متوسط قيم التكرارات).
    8. بعد ترتيب المجموعات التجريبية بشكل مناسب في ورقة العمل ، قم بتقييم توزيع البيانات (اختبار الوضع الطبيعي ، على سبيل المثال ، D'Agostino-Pearson ، Anderson-Darling) وبناء على النتيجة ، اختر الاختبار الإحصائي الأنسب.
      1. قم بإجراء ANOVA أحادي الاتجاه للبيانات البارامترية (بعد التوزيع الغوسي) واختبار Kruskal-Wallis للبيانات غير المعلمية. في حالة وجود المزيد من العوامل (التركيزات الجينية والدوائية) ، ففكر في إجراء ANOVA ثنائي الاتجاه. قارن متوسط قيمة FRET لكل حالة مقابل بعضها البعض (مقارنات متعددة) وصحح المقارنات المتعددة باستخدام اختبار لاحق (على سبيل المثال ، اختبار Tukey و Dunn's للبيانات البارامترية وغير المعلمية ، على التوالي).

3. التحقق من صحة IHC لنتائج FRET والتحليل المورفومتري المترابط لعيوب المعدة

  1. تحضير المحاليل وتثبيت الأجنة وتركيبها ل IHC ضد tERK و pERK (اليوم 7) (الشكل 3 أ)
    1. إعداد حلول العمل المطلوبة للخدمات الصحية الإنسانية.
      1. قم بإعداد محلول مخزون من 10x PBS عن طريق إذابة 80 جم من كلوريد الصوديوم ، و 2 جم من KCl ، و 14.4 جم من Na2HPO4 ، و 2.4 جم من KH2PO4 في 1 لتر من ماء DD. الأوتوكلاف الحل لإبقائه معقما.
      2. قم بإعداد محلول 0.8٪ PBS-Triton (PBSTr) عن طريق إذابة 8 مل من 10٪ Triton X-100 في حجم نهائي قدره 100 مل من 1x PBS.
      3. قم بإعداد محاليل الجلسرين بنسبة 20٪ و 50٪ و 80٪ عن طريق تخفيف 3 مل و 7.5 مل و 12 مل من الجلسرين بنسبة 100٪ ، على التوالي ، في حجم نهائي قدره 15 مل من 1x PBS.
    2. قم بإعداد 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) / 0.25٪ PBSTr (محلول مثبت) عن طريق خلط 2.5 مل من 16٪ PFA في 250 ميكرولتر من 10٪ Triton X-100 مذاب مسبقا في حجم نهائي قدره 10 مل من 1x PBS. استخدم هذا المحلول لإصلاح الأجنة عند 6 HPF بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية. استخدم أنابيب 2 مل وخمسة أجنة كحد أقصى لكل أنبوب للسماح بالتثبيت والغسيل بكفاءة.
      ملاحظة: يوصى بإعداد مثبت جديد لكل جولة تثبيت. تنبيه: عند التعامل مع الفورمالديهايد بنسبة 16٪ ، ارتد معدات الحماية الشخصية (PPE) وتحت غطاء كيماوي.
    3. اغسل الأجنة في أنابيب سعة 2 مل عن طريق ملء الأنابيب ب 1.5 مل من 0.8٪ PBSTr لعدة مرات. انقل الأجنة إلى أنابيب جديدة سعة 2 مل وقم بتخزين الأجنة في 1x PBS حتى الاستخدام.
      ملاحظة: إذا لم تكن على دراية بالتعامل مع أجنة الزرد المبكرة ، فاعمل تحت مجهر مجسم لتجنب فقدان الأجنة أثناء سحب العينات. استخدم الأواني البلاستيكية "منخفضة الارتباط" لتقليل الالتصاق المحتمل للأجنة بجدار الأنبوب.
  2. نفاذية الأنسجة و IHC ضد pERK و tERK (الأيام 7-9)
    ملاحظة: تعتمد نتائج IHC على متغيرات متعددة يمكن أن تختلف عبر المختبرات وقد يكون من الضروري تحسين محدد للبروتوكولات.
    1. اغسل أجنة الزرد الثابتة في 1 مل من 0.8٪ PBSTr لمدة 3 × 10 دقائق في RT.
    2. تخلل العينات ب 2 ميكرولتر من البروتيناز K المخفف في 0.8٪ PBSTr (1: 1,000) لمدة دقيقتين في RT.
    3. أوقف نفاذية الأنسجة عن طريق غسل العينات في 1 مل من 0.8٪ PBSTr لمدة 3 × 10 دقائق ، وقم بتثبيت العينات في 500 ميكرولتر من 4٪ PFA / 1x PBS لمدة 20 دقيقة في RT. ثم اغسل العينات في 1 مل من 0.8٪ PBSTr لمدة 3 × 10 دقائق.
      ملاحظة: تعد الطريقة والوقت المستخدم لنفاذية الأنسجة خطوات حاسمة يمكن أن تتأثر بنوع المستضد وجودة الحفاظ على الأنسجة والعوامل البيئية. قم بتحسين البروتوكول قبل تطبيقه على عينات ثمينة.
    4. احتضان العينات باستخدام 1x مانع مانع (BB) يحتوي على 5٪ مصل الماعز العادي (NGS) ، 1٪ ألبومين مصل البقر (BSA) ، 1٪ DMSO ، محضر على النحو التالي: 75 ميكرولتر من 100٪ NGS ، 150 ميكرولتر من 10٪ BSA ، و 15 ميكرولتر من 100٪ DMSO في حجم نهائي قدره 1.5 مل من 0.8٪ PBSTr. استخدم 200 ميكرولتر من المحلول لكل أنبوب واحتضان الأجنة لمدة 20-30 دقيقة عند RT في المحلول.
    5. قم بإزالة 1x BB من الخطوة السابقة واحتضان العينات في محلول يحتوي على مزيج من الأجسام المضادة الأولية المرغوبة (هنا: تخفيف 1 ميكرولتر من الجسم المضاد أحادي النسيلة الأولي للفأر p44/42 MAPK ، إجمالي ERK ، tRK ، + 1 ميكرولتر من الأرانب متعددة النسيلة phospho-p44 / 42 MAPK ، ERK الفسفرة ، pERK) في 250 ميكرولتر من محلول BB 1x المحضر حديثا. استخدم 200 ميكرولتر من المحلول لكل أنبوب واحتضان الأجنة في المحلول طوال الليل عند 20 درجة مئوية.
    6. للتخلص من الارتباط غير المحدد ، اغسل العينات ب 1 مل من 0.8٪ PBSTr عدة مرات (اغسل أولا كل 10 دقائق ثم كل 30 دقيقة).
    7. احتضان العينات في 1x BB طازج لمدة 20 دقيقة في RT. استخدم 200 ميكرولتر لكل أنبوب.
    8. قم بإزالة 1x BB من الخطوة السابقة واحتضان العينات بمزيج من الأجسام المضادة الثانوية (1 ميكرولتر من 488 مضاد للفأر المترافق من الماعز الفلوري ، + 1 ميكرولتر من 633 مضاد للأرانب المترافق بالفلورسنت في 600 ميكرولتر من محلول 1x BB). اترك الأجنة تهتز برفق طوال الليل عند 20 درجة مئوية.
      ملاحظة: أجرينا IHC على أسماك مراهقة سلبية (غير معدلة وراثيا) من نفس الدفعة المستخدمة في تصوير FRET. بدلا من ذلك ، يمكن أيضا استخدام أسماك Teen + ، ولكن في هذه الحالة ، يجب استخدام الأجسام المضادة الثانوية المترافقة مع الفلوروفورات التي لا تتداخل مع أطياف الانبعاث ل CFP أو YFP بدلا من ذلك.
    9. تخلص من الربط غير المحدد كما هو موضح أعلاه.
    10. اغسل العينات في تدرج من محاليل الجلسرين / 1x PBS (20٪ ، 50٪ ، 80٪) لمدة 15 دقيقة لكل محلول في RT. قم بتخزين العينات في 90٪ جلسرين / 1x PBS عند 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: لتقليل تسوس التألق المحتمل ، قم بتخزين العينات في الظلام.
  3. الفحص المجهري متحد البؤر للأنسجة الملطخة بالمناعة والتحليل الكمي (الأيام 10-11) (الشكل 3B-E)
    1. قم بتركيب الأجنة كما هو موضح سابقا.
    2. اضبط معلمات اكتساب الفحص المجهري متحد البؤر على النحو التالي: الليزر الأبيض عند 80٪ ، نطاق انبعاث التألق عند 507 - 551 نانومتر للماعز المترافق فلورسنت المضاد للفأر (في هذه الحالة مع طيف انبعاث يبلغ 488 نانومتر ، يستخدم ل tERK) ، 644 - 740 نانومتر للماعز المترافق فلورسنت المضاد للأرانب (في هذه الحالة مع طيف الانبعاث 633 نانومتر ، المستخدم في pERK). حدد وضع الاستحواذ المتسلسل ، ومسح تنسيق 512 × 512 بكسل ، وسرعة 400 هرتز. حدد بداية الفحص ونهايته بسماكة بحجم z-step يتراوح من 4 إلى 5 ميكرومتر وتكبير/تصغير رقمي قياسي يبلغ 1. استخدم الغمر في الماء 25x (بفتحة عددية 0.05) للحصول على المعدة بأكملها بقوة 6 حصان
      تنبيه: يتضمن هذا البروتوكول تطبيق أشعة الليزر التي يمكن أن تكون ضارة. لذلك ، يتطلب تدريب الموظفين وفقا للمتطلبات الوطنية المحددة.
    3. بعد الحصول على الصورة متحد البؤر ، افحص ملف الصورة الأولية الذي تم الحصول عليه باستخدام حزمة معالجة الصور مثل برنامج فيجي مفتوح المصدر.
      1. في فيجي ، استخدم الأمر تقسيم القنوات من القائمة صورة وقائمة فرعية اللون للحصول على صورة قناة واحدة (إجمالي ERK: القناة = 0 ، C = 0 ؛ pERK: القناة = 1 ، C = 1) وإنشاء صورة إسقاط z بأقصى كثافة لكلتا القناتين بالنقر فوق صورة | مكدسات | مشروع Z.
      2. كرر الإجراء الخاص بقياسات شدة عائد الاستثمار كما هو موضح من قبل واستخرج البيانات إلى ورقة عمل.
      3. لاستنتاج تغيرات شدة إشارة p-ERK في عائد الاستثمار المطلوب بين المجموعات التجريبية ، احسب نسبة p-ERK / t-ERK بقسمة قيم الكثافة المتكاملة الخام للتلطيخ p-ERK على الكثافة المتكاملة الخام لإشارة t-ERK. انتقل إلى تقييم الدلالة الإحصائية كما في الخطوة 2.4.
        ملاحظة: يمكن تعديل إعدادات معلمات التصوير بناء على الاحتياجات المحددة ومراعاة المدة الزمنية لكل عينة والجودة المطلوبة للصور وعدد المستويات التي سيتم الحصول عليها.
  4. قياسات المحاور في 11 أجنة HPF (اليوم 4 لتثبيت الجنين ، اليوم 12 للحصول على البيانات وتحليلها) (الشكل 4A-D)
    1. في نهاية المعدة (11 حصان) ، قم بإصلاح الأجنة بنسبة 4٪ PFA في 1x PBS لمدة 20 دقيقة في RT ، واغسلها عدة مرات في 1x PBS ، وخزنها في 4 درجات مئوية حتى الحصول على الصورة.
    2. قم بتوجيه الأجنة بشكل جانبي باستخدام ماصة باستور في بئر واحد من صفيحة مكونة من 12 بئرا تحتوي على 1x PBS طازج.
    3. لتقييم وجود شكل بيضاوي (نسبة محاور الجنين Y / X > 1) ، والنمط الظاهري المميز للاعتلال الرادي في أسماك الزرد ، والإنقاذ المورفولوجي لنسبة محاور الجنين نتيجة لفعالية العلاج ، احصل على صور للأجنة الكاملة باستخدام مجهر استريو مع هدف تكبير 3.4x (هدف مسح 0.63x × عامل تكبير 8.60) ببساطة عن طريق التقاط الصور في وضع المجال الساطع.
    4. قم باستيراد ملف الصورة إلى حزمة تحليل الصور مثل فيجي مفتوحة المصدر.
      1. قم بقياس طول محاور الأجنة (x ، المحور الصغير ؛ y ، المحور الرئيسي) عن طريق تحديد الأداة المستقيمة من شريط الأدوات والنقر فوق تحليل | قياس. بعد إجراء القياسات المحددة ، قم بإضافتها إلى قائمة مدير عائد الاستثمار واحفظ ملف عائد الاستثمار كما هو موضح لتحليل تصوير FRET أعلاه.
        ملاحظة: كرر هذه الخطوات لكل صورة جنين.
    5. تابع تصدير البيانات في ورقة عمل واحسب نسبة المحاور بقسمة طول المحور الرئيسي (y) على طول المحور الثانوي (x). احسب المتوسط أو الانحراف المعياري للمتوسط أو الخطأ المعياري لمتوسط التكرارات المختلفة.
    6. انتقل إلى تحليل البيانات الإحصائية كما في الخطوة 2.4.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوضح هذا البروتوكول سير عمل بسيطا لإنشاء نماذج RASopathy العابرة بسرعة في أجنة أسماك الزرد وتقييم تقلبات ERK في الطفرات المبكرة باستخدام طريقة تصوير FRET الحية القياسية المطبقة على مستشعر أسماك الزرد ERK الذي تم إنشاؤهمؤخرا 6،9. كما هو موضح مؤخرا 6,7 ضمن نفس سير العمل التجريبي ، يمكن التحقق من صحة نتائج FRET بواسطة IHC القياسي مقابل ERK الفسفوري والإجمالي على الأجنة الكام...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

على الرغم من عقود من البحث وعدد لا يحصى من الطفرات التي تؤدي إلى أشكال غير متجانسة للغاية من اعتلال RASopathies التي تم تعيينها الآن ، تستمر المتغيرات الجينية ذات الأهمية غير المعروفة في الظهور من جهود التسلسل على المرضى غير المشخصين. في الواقع ، في كثير من الحالات ، يمكن أن يكون التشخيص القائم على السمات السريرية فقط أمرا صعبا وتظل الأساليب الجينومية الوظيفية للتحقق من صحة نتائج التسلسل أمرا بالغ الأهمية. علاوة على ذلك ، على الرغم من اقتراح بعض الجزيئات المضادة للسرطان المتاحة (مثل مثبط...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر الدكتور جيروين دن هيرتوغ (معهد هوبريخت ، أوتريخت ، هولندا) على التفضل بتقديم pCS2 + _eGFP-2a-Shp2a الذي تم استخراج CDS كامل الطول shp2 منه لإنشاء قالب البلازميد الذي استخدمناه7. نشكر معهد نارا للعلوم والتكنولوجيا (تاكاكي ماتسوي) ، والمعهد الوطني لعلم الوراثة (NIG / ROIS) (Koichi Kawakami) ، على توفير خط مراسل المراهقين المعدلين وراثيا. تم دعم هذا العمل من قبل وزارة الصحة الإيطالية - صناديق البحوث الحالية 2021 وصناديق الأبحاث الحالية 2024 و Ricerca Finalizzata Giovani Ricercatori GR-2019-12368907 إلى AL ؛ صناديق الأبحاث الحالية 2019 ، PNRRMR1-2022-12376811 ، 5x1000 2019 ، AIRC (IG-21614 و IG-28768) و LazioInnova (A0375-2020-36719) إلى MT.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
<القوي>بلاستيك
حوض تربية 1.7 لتر - تصميم على طراز الشاطئتكنيبلاست1.7 لتر مائلحوض التكاثر
الشعيرات الدموية GC100F-10جهاز هارفارد30-0019حقن الجنين في مرحلة الخلية الواحدة
ألواح زراعة الخلايا والأنسجة - 12 بئربيوفيلTCP011012جمع الأجنة وعلاجها
ألواح زراعة الخلايا والأنسجة - 6 بئربيوفيلTCP011006جمع الأجنة وعلاجها
طبق زراعة الخلاياعلوم الحياة SPL20100مجموعة الأجنة 
أطباق زجاجية نونك 12ممثيرمو فيشر150680تصوير الجنين الطيفي بتقنية FRET
بيبيت باستوركورنينغ357524نقل الأجنة
أنابيب بروتينية 2 ملإبندورف30108450اختبار IHC
<قوي>كواشف وغيرها
كافيار 500-800 وميكرو؛ mريتنماير إيطالياBE2269 (500-800)طعام الأسماك الجافة
أكياس الأرتيميا الزرقاء في بحيرة الملح الكبرىساندرز00004727طعام الأسماك الحية
ملح المحيط الفوريتكنيبلاستXPSIO25Rملح البحر المجفف لتحضير الطعام الحي
Tg(EF1a:ERK Biosensor-nes) (مراهق)جهات الاتصال للطلب*:
مشروع الموارد الحيوية الوطني لسمكة الزرد، وحدة الدعم لتطوير الموارد الحيوانية، RRD، مركز RIKEN لعلوم الدماغ، اليابان. https://shigen.nig.ac.jp/zebra/index_en.html *على توقيع MTA.  		-مورد خط سمك الزرد ERK Reporter. يمكن الحصول على أجنة الأسماك بناء على توقيع هيئة النقل من مشروع الموارد الحيوية الوطنية في اليابان لأسماك الزرد (RIKEN، اليابان). تم ترسيب خط سمك الزرد من قبل معهد نارا للعلوم والتكنولوجيا (تاكاكي ماتسوي) والمعهد الوطني لعلم الوراثة (NIG/ROIS) (كويتشي كاواكامي، براءة اختراع لنظام Tol2) (وونغ وآخرون، 2018، أوراساكي وآخرون، 2006، أوكاموتو وإيشيوكا، 2010).
صبغة تحميل 6xالإشارات الخلويةB7024Sهلام الكهروفوريس
سلم الحمض النووي 100 بي بيNEBN3231Sهلام الكهروفوريس
أغاروزسيغما-ألدرتش1,01,236هلام الكهروفوريس
الأجاروز، درجة حرارة الجل المنخفضةسيغما-ألدرتشA9414-10Gتركيب الأجنة للتصوير الطيفي بتقنية FRET واختبار IHC
مصل البقر الألبومين (BSA)سيغما-ألدرتشA8022اختبار IHC
كلوريد الكالسيومسيغما-ألدرتش223506مكون E3 المتوسط
نترات الكالسيومسيغما-ألدرتش237124مكون محلول مخزون دانياو
كبريتات ثنائي الميثيل (DMSO)سيغما-ألدرتشD8418-100MLاختبار IHC
EDTAسيغما-ألدرتشE9884مكون مخزن TBE لتحضير الجل
الإيثانول 99٪+فيشر ساينتيفك10048291تنقية الحمض النووي الريبي في المختبر
الفورمالدايد 16٪ثيرمو فيشر28908تثبيت الجنين
فورمايد سيغما-ألدرتشF9037هلام الكهروفوريس
مخزن تحميل الجل II (تغيير الصفقة)ثيرمو فيشرAM8546Gنسخ RNA في المختبر
حمض الخليك الجليديسيغما-ألدرتش695092مكون مخزن TBE لتحضير الجل
الجلسرول  سيغما-ألدرتشG6279-1Lاختبار IHC
مضاد للفأر للماعز أليكسا فلور 488ثيرمو فيشرA11001اختبار IHC
أليكسا فلور 633 ضد الأرانب الماعزثيرمو فيشرA21070اختبار IHC
هيبسسيغما-ألدرتشH3375مكون محلول مخزون دانياو
KpnI - HF (إنزيم + مخزن rCutSmart)NEBR3142خطية البلازميد 
كبريتات المغنيسيومسيغما-ألدرتش230391مكون E3 المتوسط/مكون محلول دانياو
علامات الألفية RNAثيرمو فيشرAM7150هلام الكهروفوريس
مجموعة تنقية الحمض النووي الجينومية MonarchNEBT3010Lخطية البلازميد 
وايد النسيلة بالفأر p44/42 MAPKالإشارات الخلوية4696Sاختبار IHC
مجموعة النسخ mMACHINE SP6  ثيرمو فيشرAM1340نسخ RNA في المختبر
مصل الماعز العادي (NGS)سيغما-ألدرتشG9023اختبار IHC
أمبيون مياه خالية من النوكليازثيرمو فيشرAM9937نسخ RNA في المختبر
PD0325901سيغما-ألدرتشPZ0162مثبط MEK
محلول الفينول الأحمرسيغما-ألدرتشP0290مكون خليط الحقن الدقيق  
مجموعة تطويل بولي Aثيرمو فيشرAM1350نسخ RNA في المختبر
كلوريد البوتاسيوم بيوكترا  سيغما-ألدرتشP9333مكون E3 المتوسط/مكون محلول مخزون دانياو/مكون محلول PBS
فوسفات البوتاسيوم ثنائي الهيدروجينسيغما-ألدرتشP0662مكون محلول PBS المخزوني
إنزيم البروتيناز Kسيغما-ألدرتشP2308اختبار IHC
فوسفو متعدد النسيال الأرنب p44/42 MAPK الإشارات الخلوية4695Sاختبار IHC
صبغة جل الحمض النووي الآمن من SYBRثيرمو فيشرS33102هلام الكهروفوريس
كلوريد الصوديومسيغما-ألدرتش31434-Mمكون E3 المتوسط/مكون محلول مخزون دانياو/مكون محلول PBS
فوسفات الصوديوم ثنائي القاعديةسيغما-ألدرتش71643مكون محلول PBS المخزوني
قاعدة تريزماسيغما-ألدرتشT1503مكون مخزن TBE لتحضير الجل
ترايتون X-100سيغما-ألدرتشT8787مكون مخزن PBSTr
<قوي>معدات
ألاينس ميني HD9 يوفيتيك-نظام التصوير
الطرد المركزي 5430 Rإبندورف5428000205الطرد المركزي الدقيق
إيبندورف ثيرمو ميكسر سيإبندورف-تركيب الأجنة 
FemtoJet 4xإبندورف-نظام الحقن الدقيق
Infinite M Plex تيك-قارئ الألواح متعدد الأنماط
لايكا M205FAلايكا مايكروسيستمز-المجهر الفلوري المجسم
لايكا TCS-SP8X مجهزة بحاضنة (OkoLab)لايكا مايكروسيستمز-المجهر الكونفوكال
نظام الرحلان الكهربائي الهوريزونتال الخلية الصغيرة تحت الخلية GT بيو-راد1704406هلام الكهروفوريس
جهاز السحب العمودي PC-100ناريشيغي-سحب الإبر
مزود الطاقة الشامل لباور باكبيو-راد1645070هلام الكهروفوريس
ستيلاريس 5 لايكا مايكروسيستمز-المجهر الكونفوكال
فورتكس ميني ستار سيلفرلاينVWR-تحضير البلازميدات
<قوي>برمجيات
بيوريدربيوريدررخصة CC-BY 4.0تفصيل الرسوم المتحركة لشخصيات
إكسلمايكروسوفت أوفيس بروفيشنال بلس 2019-تحليلات البيانات
برمجيات فيجيImageJ15.3 طنتصوير التصوير والتحليلات الكمية (قياسات إشارات FRET، شدة التألق ERK في اختبار IHC، طول محاور الجنين)
GraphPad Prism شركة جراف باد سوفتوير ذ.م.مالمجلد 9تحليلات البيانات الإحصائية
برنامج مقياس الطيف الفوتومتري iControlتيكالإصدار 2.0قياس كمية الحمض النووي الريبي
رسام توضيحيأدوبي26.0.3 (64-بت)تجميع الأشكال
برنامج LASXلايكا مايكروسيستمزالإصدار 4.5 (Stellaris 5)، الإصدار 3.0 (M205FA)، الإصدار 3.5 (TCS-SP8X)اكتساب التصوير لتجارب FRET الطيفية وتصوير الأجنة لقياس طول المحاور
برنامج Q9 Mini 18.02-SNيوفيتيك-اكتساب صورة الجل

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Iroegbu, J. D., Ijomone, O. K., Femi-Akinlosotu, O. M., Ijomone, O. M. ERK/MAPK signalling in the developing brain: Perturbations and consequences. Neurosci Biobehav Rev. 131, 792-805 (2021).
  2. Tartaglia, M., Aoki, Y., Gelb, B. D. The molecular genetics of RASopathies: An update on novel disease genes and new disorders. Am J Med Genet C Semin Med Genet. 190 (4), 425-439 (2022).
  3. Tate, J. G., et al. COSMIC: the catalogue of somatic mutations in cancer. Nucleic Acids Res. 47 (D1), D941-D947 (2019).
  4. Tartaglia, M., et al. Mutations in PTPN11, encoding the protein tyrosine phosphatase SHP-2, cause Noonan syndrome. Nat Genet. 29 (4), 465-468 (2001).
  5. Jopling, C., van Geemen, D., den Hertog, J. Shp2 knockdown and Noonan/LEOPARD mutant Shp2-induced gastrulation defects. PLoS Genet. 3 (12), e225(2007).
  6. Wong, K. -L., Akiyama, R., Bessho, Y., Matsui, T. ERK activity dynamics during zebrafish embryonic development. Int J Mol Sci. 20 (1), 109(2019).
  7. Fasano, G., et al. Assessment of the FRET-based Teen sensor to monitor ERK activation changes preceding morphological defects in a RASopathy zebrafish model and phenotypic rescue by MEK inhibitor. Mol Med. 30 (1), 47(2024).
  8. Zimmermann, T., Rietdorf, J., Girod, A., Georget, V., Pepperkok, R. Spectral imaging and linear un-mixing enables improved FRET efficiency with a novel GFP2-YFP FRET pair. FEBS Lett. 531 (2), 245-249 (2002).
  9. Sari, D. W. K., et al. Time-lapse observation of stepwise regression of Erk activity in zebrafish presomitic mesoderm. Sci Rep. 8 (1), 4335(2018).
  10. Wang, H., Li, J., Xue, T., Cheng, N., Du, H. Construction of a series of pCS2+ backbone-based Gateway vectors for overexpressing various tagged proteins in vertebrates. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 48 (12), 1128-1134 (2016).
  11. Abdelrahman, D., Hasan, W., Da'as, S. Microinjection quality control in zebrafish model for genetic manipulations. MethodsX. 8, 101418(2021).
  12. Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. J Vis Exp. (27), e1113(2009).
  13. Rossant, J., Nutter, L. M. J., Gertsenstein, M. Engineering the embryo. Proc Natl Acad Sci USA. 108 (19), 7659-7660 (2011).
  14. Jindal, G. A., et al. In vivo severity ranking of Ras pathway mutations associated with developmental disorders. Proc Natl Acad Sci USA. 114 (3), 510-515 (2017).
  15. Leavesley, S. J., Rich, T. C. Overcoming lmitations of FRET measurements. Cytometry A. 89 (4), 325-327 (2016).
  16. Mascha, E., Vetter, T. Significance, errors, power, and sample size: Theblocking and tackling of statistics. Anesth Analg. 126 (2), 691-698 (2018).
  17. Faul, F., Erdfelder, E., Lang, A. -G., Buchner, A. G*Power 3: a flexible statistical power analysis program for the social, behavioral, and biomedical sciences. Behav Res Methods. 39 (2), 175-191 (2007).
  18. Cohen, J. Statistical power analysis for the behavioral sciences. , Routledge. New York. (1988).
  19. Anastasaki, C., Rauen, K. A., Patton, E. E. Continual low-level MEK inhibition ameliorates cardio-facio-cutaneous phenotypes in zebrafish. Dis Model Mech. 5 (4), 546-552 (2012).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

ERK ActivityZebrafish ModelsLive FRET MicroscopyImmunofluorescence AssayRAS MAPK PathwayNoonan SyndromeMEK Inhibitor TestingTransgenic ERK ReporterSpectral Dye SeparationMorphometric Analysis

مقالات ذات صلة