Method Article

كشف FISH الحساس لتعدد الأشكال أحادي النوكليوتيدات لنسخ الحمض النووي الريبي الريبوزومي الخاص بالموضع في ذبابة الفاكهة السوداء

DOI:

10.3791/67881

⸱

March 28th, 2025

 , 
1Department of Biochemistry and Cell Biology, Stony Brook University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف البروتوكول طريقة التألق الحساس لتعدد الأشكال للنوكليوتيدات المفردة في طريقة التهجين في الموقع (SNP-FISH) لتمييز نصوص الحمض النووي الريبي الريبوسومي المشتقة من موضع الحمض النووي الريبوزومي الكروموسوم X أو Y في ذبابة الفاكهة السوداء.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

من أجل ضمان نسخ الحمض النووي الريبي الريبوسومي الكافي (rRNA) لوظيفة الريبوسوم ، تحتوي الجينومات على مئات الازدواجية الترادفية للتسلسلات التي تشفر الحمض النووي الريبي الريبوزومي ، وتكوين مناطق تسمى مواقع الحمض النووي الريبوسومي (rDNA). تحتوي جينومات العديد من الكائنات الحية على أكثر من موضع rDNA موزع عبر كروموسومات مختلفة ، ويمكن نسخ الرنا المرسال من مواقع متعددة من الحمض النووي الريبي أو موضع واحد فقط. غالبا ما تشير التغييرات في مصادر نسخ الرنا الريبوزي إلى ضائقة ريبوسوماتية. ومع ذلك ، فإن تجانس الحمض النووي الريبي الريبي يعيق التمييز بين ما إذا كان الرنا المرسال قد تم نسخه من موضع rDNA متعدد أو واحد. هنا ، نصف طريقة تستخدم التألق الحساس لتعدد الأشكال أحادي النوكليوتيدات في التهجين الموضعي (SNP-FISH) للتمييز بين نسخ الحمض النووي الريبي بين ذبابة الفاكهة السوداء rDNA مواقع على كروموسومات X و Y. تستفيد هذه الطريقة من متغيرات الحمض النووي الريبي الريبي الخاصة بالموقع لتمكين الكشف السهل عن مصدر نسخ الحمض النووي الريبي بدقة الخلية الواحدة. يمكن تطبيق هذا الاختبار على أي نوع من خلايا ذبابة الفاكهة ويمكن تكييفه للاستخدام في أنظمة أخرى.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم نسخ الحمض النووي الريبوزي الريبوزومي 18S و 5.8S و 28S (rRNAs) المطلوبة لوظيفة الريبوسوم بشكل مشترك في صهريج واحد يسمى 45S pre-rRNA. يتم فصل الرنا الريبي الثلاثة داخل 45S pre-rRNA بواسطة تسلسلين داخليين للفاصل المكتوب (ITS) ويحيط بها تسلسلات فاصلة خارجية منسوخة (ETS) في نهاية 5 و 3. تتم إزالة كل هذه التسلسلات المباعدة من 45S pre-rRNA ليتم دمج rnas الناضجة في الريبوسومات (انظر1). من أجل تلبية الطلب المرتفع على إنتاج الرنا الريبي اللازم لدعم نشاط الريبوسوم ، تحتوي جميع جينومات حقيقية النواة على مئات النسخ من تسلسل 45S. يتم تجميع هذه النسخ معا في تكرارات ترادفية ، وتشكيل مناطق جينومية تسمى مواقع الحمض النووي الريبوسومي (rDNA). تحتوي معظم جينومات حقيقية النواة على العديد من مواقع الحمض النووي الريبوني المنتشرة عبر كروموسومات منفصلة (انظر2). يعني التكرار العالي لنسخ 45S أن هناك عادة العديد من نسخ 45S أكثر من اللازم للنسخ ، وغالبية نسخ 45S صامتة من الناحية النسخية ومدفونة في الكروماتين غير المتجانس3. نشاط النسخ ليس موحدا عبر مواقع الحمض النووي الريبوني ، ويلاحظ التباين في نسخ موضع الحمض النووي الريبوني على نطاق واسع عبر الكائنات الحية4،5،6 ، مما يشير إلى أن نسخ 45S يتم تنظيمه بشكل تفاضلي في مواقع الحمض النووي الفردية. لوحظ إسكات الحمض النووي الريبي على مستوى الموضع في النباتات واللافقاريات والفقاريات7،8،9،10 ، مما يشير إلى أن إسكات الحمض النووي الريبوزي على مستوى الموضع هو آلية رئيسية لتنظيم جرعة الرناالمرسال 11. يعد نسخ الحمض النووي الريبي (rRNA) خطوة تنظيمية رئيسية في إنتاج الريبوسوم ، وتعد التغييرات التي تطرأ على نسخ الرنا الريبي المرسال التي تعدل النشاط الانتقالي سمة مهمة لكل من التمايز الطبيعي وظروف المرض12. ترتبط التغييرات في نسخ موضع الحمض النووي الريبي أيضا بالتخفيضات في إجمالي نسخة الحمض النوويالريبي رقم 13. وبالتالي ، قد يكون نسخ الحمض النووي الريبي المتغير الخاص بالموضع مؤشرا مهما على فسيولوجيا الخلية المعطلة.

في حين أن الإسكات الخاص بالموقع يبدو أنه مصدر رئيسي لتنظيم نسخ الحمض النووي الريبي الريبوزي ، فإن الآليات التي تؤسس هذا الإسكات وتوجه مواقع الحمض النووي الريبوزي النشطة من الناحية النسخية غير معروفة إلى حد كبير. يجعل تجانس تسلسل الحمض النووي الريبوني من الصعب تقييم نسخ موضع الحمض النووي الفردي ، مما يمنع التحليل الواسع النطاق لنشاط نسخ الحمض النووي rDNA الخاص بالموضع. قد يكون من الممكن التغلب على هذا التحدي من خلال الاستفادة من تباين تسلسل النيوكليوتيدات الهيكلية والمفردة بين نسخ الحمض النووي الريبوزي داخل نفس الجينوم4،5،6،13. يمكن مشاركة بعض هذه المتغيرات بين معظم أو كل النسخ في موضع فردي ، مما يؤدي إلى إنشاء أنماط فردانية فريدة من نوعها لموضع rDNA لمتغيرات متعددة تميز موضع rDNA. في الواقع ، كشف رسم الخرائط الحديثة لمتغيرات الحمض النووي الريفي إلى مواقع محددة بواسطة اتحاد التيلومير إلى التيلومير عن متغيرات الحمض النووي الريبوني المشتركة الخاصة بالموقع في الجينوم البشري14. قد تمكن خرائط موضع rDNA هذه من تحديد النسخ الخاص بالموضع من مجموعات بيانات التسلسل. ومع ذلك، لا يزال توافر هذه الخرائط محدودا حاليا وليس من السهل إنتاجه. نظرا لأن مواقع rDNA موجودة فقط على الكروموسومات الجنسية في ذبابة الفاكهة السوداء (موضع واحد على كل كروموسوم X و Y)15 ، فإن موضع rDNA للكروموسوم Y غائب عن الإناث XX. هذه العزلة الطبيعية عن موضع الكروموسوم Y تعني أن متغيرات تعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة (SNP) بين مواقع X و Y rDNA يمكن تحديدها بسهولة في تسلسل القراءة القصيرة مثل أي متغيرات موجودة في الذكور (XY) ولكنها غائبة عن الإناث (XX). يمكن اختبار تعدد الأشكال التي تم تحديدها مسبقا بسرعة في سلالات ذبابة الفاكهة غير المرتبة وراثيا من خلال تسلسل تفاعل البوليميراز المتسلسل البسيط وسانجر للحمض النووي من الذكور والإناث. علاوة على ذلك ، فإن توافر ذبابة الفاكهة سلالات مع كروموسوم X لا يحتوي على موضع rDNA16 يعني أنه يمكن عزل مواقع rDNA الفردية X و Y بشكل فردي لتوصيف rDNA SNP أكثر دقة. هذا التحديد السهل لمتغيرات SNP بين ذبابة الفاكهة rDNA يجعل من الممكن تحديد مواقع X و Y rDNA الفريدة من نوعها الأنماط الفردانية SNP13. عادة ما تكون مواقع rDNA للكروموسوم X صامتة تماما في ذبابة الفاكهة الذكور ، ولكن يتم نسخ كل من مواقع الكروموسوم X في الإناث10،17 ، مما يجعل ذبابة الفاكهة نظاما مفيدا لدراسة إسكات الحمض النووي rDNA على مستوى الموضع.

يعد التهجين الفلوري في الموقع (FISH) أداة قوية لتصور وجود تسلسل محدد من الحمض النووي الريبي أو الحمض النووي داخل الخلايا الفردية للأنسجة. تستهدف ملصقات FISH تسلسل الحمض النووي الريبي أو الحمض النووي من خلال مجسات قليل النوكليوتيدات المضادة للمعنى المقترنة بالفلوروفورات. عادة ما تكون مجسات FISH مطلوبة لتكون ~ 20 نيوكليوتيد من أجل توفير ارتباط مستقر بدرجة كافية ليتم تصورها ، ولكن المجسات التي هذه المدة الطويلة يمكن أن ترتبط بسهولة بالتسلسلات غير المستهدفة التي تختلف بنيوكليوتيد واحد فقط (الشكل 1 أ). على العكس من ذلك ، فإن المجسات القصيرة بما يكفي لمنح خصوصية أحادية النوكليوتيدات لا ترتبط بثبات كاف للتصور. لتحقيق التوازن بين الخصوصية والاستقرار ، تجمع FISH (SNP-FISH) الحساسة ل SNP بين مسبار الفلورسنت المضاد للمعنى الطويل ~ 26 نيوكليوتيدات مع قناع قليل النوكليوتيد غير الفلوري الذي يرتبط بالجميع باستثناء نهاية المسبار18 باستثناء 5. يترك هذا القناع فقط أكثر 10 نيوكليوتيدات من المسبار أحادية الشريطة ومتاحة للربط المستهدف (الشكل 1 ب). يمنح هذا الجزء القصير أحادي الشريطة من المسبار خصوصية للهدف ولكنه يمنع التفاعل المتبادل مع الحمض النووي الريبي الذي يحتوي حتى على عدم تطابق واحد مع هذه النيوكليوتيدات ال 10 (الشكل 1 ب). بمجرد أن تربط نهاية المسبار 5 بوصات هدفها ، فإن إزاحة الخيط السلبي تجرد القناع من المسبار ، مما يسمح للمنطقة 3 بربط الهدف وإنشاء تسمية مستقرة للهدف (الشكل 1 ب) 18. لذلك ، يمكن ل SNP-FISH تصور الحمض النووي الريبي الذي يختلف بشكل تفاضلي بواسطة SNP واحد باستخدام زوج من المجسات التي تحتوي على فلوروفورات مختلفة يكمل كل منها SNP مختلفا ولكنه يشترك في قناع مشترك (الشكل 1 ج). على الرغم من أن هذه الطريقة تجند فقط مسبارا واحدا مترافقا بالفلوروفور إلى SNP المستهدف ، إلا أنه يمكن استخدام تجميع مجموعات أقنعة مسبار متعددة إلى العديد من تعدد الأشكال داخل نمط فراند rDNA مشترك لتضخيم الكشف الحساس ل SNP ل rRNA واحد (الشكل 1 د). علاوة على ذلك ، نظرا لأن الرنا المرسال يتم نسخه بكثرة ، يمكن تصور نصوص الحمض النووي الريبي بسهولة في تجارب FISH باستخدام عدد صغير من ملصقات الفلورسنت لكل حمض النووي الريبي. هذا المطلب المنخفض للفلوروفور لكل RNA يعني أن SNP-FISH يمكنه تصور rRNAs من موضع معين مع عدد قليل من تعدد الأشكال الفريد فقط. يمكن لهذه الطريقة اكتشاف نسخ الحمض النووي الريبي الريبي الخاص بالموضع بسهولة في مجموعة متنوعة من أنسجة ذبابة الفاكهة ومراحل النمو17. إنه فعال بشكل خاص في ذبابة الفاكهة الخلايا الجذعية الجرثومية الذكرية ، والتي تتغير بين نسخ Y-rDNA الحصري والتعبير المشترك عن مواقع rDNA للكروموسوم X و Y أثناء سن13 عاما. هنا ، نقدم بروتوكول SNP-FISH لتصور نصوص X و Y rRNA المميزة في ذبابة الفاكهة الخصية لتحقيق الهدف العام المتمثل في تقييم إسكات الحمض النووي الريبي الريبي الخاص بالموضع. تستخدم هذه الطريقة أربعة تعدد الأشكال التي تم تمييزها سابقا بين مواقع rDNA على الكروموسومات X و Y لسلالة ذبابة الفاكهة المختبرية الشائعةy 1w 1 (الشكل 1 د).

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. تحضير المخازن المؤقتة والكواشف

ملاحظة: يجب استخدام تقنية خالية من RNase خلال الخطوات 1 و 3 و 4 ، ويجب استخدام الكواشف المعتمدة الخالية من RNase.

  1. في غطاء كيميائي ، قم بإعداد 40 مل من الفورمالديهايد بنسبة 4٪ في محلول تثبيت PBS 1x عن طريق إضافة 10 مل من 16٪ فورمالديهايد و 4 مل 10x PBS إلى 26 مل من الماء الخالي من RNase. يوزع على 1 مل ويخزن في -20 درجة مئوية في غضون 30 دقيقة من التحضير. يمكن تخزين محلول التثبيت عند -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر.
    تنبيه: يحتوي المحلول على الفورمالديهايد. تعامل مع القفازات ومعدات الوقاية الشخصية المناسبة وتخلص منها بأمان.
  2. قم بإعداد 10 مل من المخزن المؤقت للتهجين عن طريق خلط 1 مل من سترات الصوديوم المالحة الخالية من RNase 20x (SSC) ، 1 جم كبريتات ديكستران ، 100 ميكرولتر من 100 مجم / مل من Saccharomyces cerevisiae tRNA ، 100 ميكرولتر من مركب ريبونوكليوزيد الفاناديل 200 ملي ، 1 مل من BSA الخالي من RNase بنسبة 5٪ ، 1 مل من الفورماميد منزوع الأيونات مع 6 مل من الماء الخالي من RNase. يوزع إلى 1 مل في أنابيب ميكروفوج سعة 1.5 مل ويخزن في درجة حرارة -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد.
  3. قم بإعداد 50 مل من محلول الغسيل عن طريق إضافة 5 مل من SSC الخالي من RNase 20x ، و 5 مل من الفورماميد منزوع الأيونات ، و 50 ميكرولتر من Triton-X إلى 40 مل من الماء الخالي من RNase. يحفظ في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة تصل إلى 1 شهر.
  4. قم بإعداد 10 مل من المخزن المؤقت لعزل الحمض النووي عن طريق إضافة 100 ميكرولتر من 1M Tris-HCl pH 7.5-8.0 ، و 20 ميكرولتر من 0.5M EDTA ، و 50 ميكرولتر من 5M كلوريد الصوديوم إلى 9.8 مل من الماء.

2. عينة التنميط الجيني ل rRNA SNPs الخاصة ب X و Y

  1. اجمع أنثى وذكر X متماثل اللواقح غير المتزاوجة التي تؤوي نفس الكروموسوم X في أنابيب 0.2 مل وقم بالبرد على الجليد.
  2. اجمع بين 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت لعزل الحمض النووي مع 0.5 ميكرولتر من 20 مجم / مل من البروتيناز K لكل عينة.
  3. أضف 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت لعزل الحمض النووي / البروتيناز K إلى عينة ذبابة الفاكهة وقم بتجانس العينة باستخدام طرف الماصة.
  4. احتضان العينات عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ، متبوعة ب 95 درجة مئوية لمدة دقيقتين. انقل 40 مل من العينة (تجنب بقايا) إلى أنبوب نظيف سعة 1.5 مل.
  5. تضخيم كل منطقة مستهدفة SNP بشكل منفصل من كل عينة من الحمض النووي بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام تركيز 10 ميكرومتر من أزواج التمهيدي التالية: 18S SNP إلى الأمام + عكس ؛ ITS1 SNP إلى الأمام + للخلف ؛ 28S SNP إلى الأمام + العكس. تم العثور على تسلسل التمهيدي وحجم أمبليكون تفاعل البوليميراز المتسلسل المتوقع في الجدول 1.
  6. استخدم الرحلان الكهربائي للهلام لفصل عينة PCR بأكملها على جل 1٪ agarose 1x TAE لتأكيد منتج PCR المتوقع. يتم سرد أحجام المنتجات المتوقعة في الجدول 1.
  7. اعزل منتج PCR عن الجل باستخدام أي مجموعة استخلاص جل متوفرة تجاريا.
  8. تسلسل منتجات PCR بواسطة تسلسل Sanger. تسلسل العينات في كلا الاتجاهين باستخدام تفاعلات فردية منفصلة للتمهيدي F و R لكل هدف.
  9. حدد متغير SNP للكروموسوم X في المواضع الواردة في الجدول 2 في عينة DNA أنثوية غير متزاوجة. النمط الفرداني X المتوقع موصوف في الجدول 2.
  10. راقب مواضع SNP في مخطط كروماتومات تسلسل عينة الحمض النووي للذكور. استنتاج متغير SNP للكروموسوم Y بناء على متغير X SNP المحدد بالفعل في كل موضع SNP. يتم وصف النمط الفرداني المتوقع Y في الجدول 2.
اسم التمهيديتسلسلحجم Amplicon المتوقع
18S SNP FGACTACCATGGTTGCAACGG652 نقطة أساس
18S SNP RTTCACCTCTCGCGTCGTAAT
ITS1 SNP FCTTGCGTGTTACGGTTGTTTC955 نقطة أساس
ITS1 SNP RACAGCATGGACTGCGATATG
28S SNP FATGCGTAGAAGTGTTTGGCG598 نقطة أساس
28S SNP RGCCGACTTCCCTTACCTACTACA

الجدول 1: التسلسلات التمهيدية لتسلسل rDNA SNPs. أزواج التمهيدي لتضخيم مناطق rDNA التي تحتوي على تعدد الأشكال المميزة مسبقا في مناطق 18S و ITS1 و 28S rDNA. يتم سرد تسلسل قليل النوكليوتيدات التمهيدي وحجم أمبليكون تفاعل البوليميراز المتسلسل المتوقع.

النمط الفردانيموقف SNPتسلسل
X rDNA18 ثانية1603-ATTACTTGTATTTTTCATATG-1625
ها1-12873-CGTTAATAAATATTTGTAAT-2895
إنه 1-23115-GAAAATCGAAGAAACAAAAT-3137
28 ثانية5932-AAAAAATGCCTAACTAT-5954
ص rDNA18 ثانية1603-ATTACTTGTATCTTTTCATATG-1624
ها1-12873-CGTTAATAAAجATTTGTAAT-2895
إنه 1-23115-GAAAATCGAAAAAACAAAAT-3137
28 ثانية5932-AAAAAATGgCTAACTAT-5954

الجدول 2: الأنماط الفردانية المتوقعة للحمض النووي الريبي. تعدد الأشكال المتوقعة في مواقع rDNA للكروموسوم X و Y في سلالة ذبابة الفاكهة y 1w 1. يشار إلى SNP بالخط العريض والمسطر. تم إدراج الموضع بناء على تسلسل الإجماع 45S rRNA (الملف التكميلي 1).

3. تشريح الخصية ، والتثبيت ، والنفاذية

  1. تنظيف المجهر المجسم ومحطة العمل وطبق التشريح والملقط التشريح بنسبة 70٪ من الإيثانول (أو أي علاج آخر ب RNase).
  2. تحت المجهر المجسم ، قم بتشريح ذبابة الفاكهة لعزل الخصيتين في 1x PBS الخالي من الحمض النووي الريبي. أمسك منتصف بطن بزوج واحد من الملقط وامسك نهاية البطن بزوج آخر من الملقط لفصل برفق. سوف تنفصل الخصيتان عن ويمكن فصلهما باستخدام الملقط. اجمع 30-40 خصيتين لكل عينة.
  3. باستخدام الملقط ، التقط الخصيتين وانقلهما من طبق التشريح إلى أنبوب ميكرو فوج سعة 1.5 مل يحتوي على 0.5 مل من 1x PBS الخالي من RNase.
  4. استنشق PBS وأضف 1 مل من محلول التثبيت. احتضن في درجة حرارة الغرفة على شاكر الجوز لمدة 30 دقيقة.
  5. اغسل 2x مع 1 مل من 1x PBS الخالي من RNase لمدة 5 دقائق لكل منهما على شاكر العقدة. استنشق 1x PBS وأضف 1 مل من الإيثانول 70٪ الخالي من RNase (EtOH). احتضن عند 4 درجات مئوية طوال الليل على شاكر الجوز.

4. أسماك الحمض النووي الريبي الريبوزومي الحساسة ل SNP

  1. استنشق الإيثانول وأضف 1 مل من محلول الغسيل. احتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 دقائق على شاكر الجوز ، متبوعا ب 2 دقيقة من الأنبوب في وضع مستقيم.
  2. امزج المجسات والأقنعة مع المخزن المؤقت للتهجين ، مما يجعل 100 ميكرولتر من الحجم الكلي لكل عينة. يتم سرد المسبار وتسلسلات القناع وملصقات الفلوروفور في الجدول 3. عند استخدام جميع تعدد الأشكال الأربعة ، قم بإعداد 80 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتهجين ، و 1 ميكرولتر لكل مسبار 10 ميكرومتر Y-SNP (إجمالي 4 ميكرولتر) ، و 1 ميكرولتر لكل مسبار 10 ميكرومتر x-SNP (إجمالي 4 ميكرولتر) ، و 3 ميكرولتر لكل من القناع المشترك 10 ميكرومتر (إجمالي 12 ميكرولتر)
  3. قم بالشفط بالغسيل المؤقت ، ثم أضف 100 ميكرولتر من محلول التهجين. ضع غشاء شفافا على حواف الأنبوب ، ولفه بورق الألمنيوم للحماية من الضوء ، واحتضنه في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة على الأقل.
  4. أضف 1 مل من محلول الغسيل إلى العينة دون شفط محلول التهجين. احتضن في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في الظلام.
  5. قم بالشفط في المخزن المؤقت للغسيل ، ثم أضف 1 مل من محلول الغسيل إلى العينة. احتضن في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في الظلام.
  6. المخزن المؤقت للغسيل وإضافة 50 ميكرولتر من وسائط التثبيت. يمكن تركيب العينات على الفور على الشرائح أو تخزينها لمدة تصل إلى أسبوع واحد عند 4 درجات مئوية قبل التركيب.
موقف SNPقليل النوكليوتيدتسلسل3 'فلوروفور مترافق
18 ثانيةمسبار X SNPAAAAAATACAAGTATTTAATCACATAأليكسا 488
Y مسبار SNPAAAAGATACAAGTATTTAATCACATAاليكسا 647
قناعTATGTGATTAAATACT
ها1-1مسبار X SNPAAATATTTATTAACGGTAAGGATATTأليكسا 488
Y مسبار SNPAAATGTTTATTAACGGTAAGGATATTاليكسا 647
قناعAATATCCTTACCGTTA
إنه 1-2مسبار X SNPGTTTجTTCGATTTTCATGTTCGAAACأليكسا 488
Y مسبار SNPGTTTTTTCGATTTTCATGTTCGAAACاليكسا 647
قناعGTTTCGAACATGAAAAAAA
28 ثانيةمسبار X SNPTTAGGCATTTTTGTTTTACTTGAAAAأليكسا 488
Y مسبار SNPتي تي إيجيكاتتتگتتاكتجاااااليكسا 647
قناعTTTTCAAGTAAAAACA

الجدول 3: تسلسل المسبار والقناع ل rDNA SNP-FISH. يتم تمييز مواقف SNP بالخط العريض. يتم وضع خط على جزء المسبار الذي يرتبط بإخفاء قليل النوكليوتيدات. يتم سرد أمثلة على الفلوروفورات المترافقة المناسبة مقاس 3 بوصات ، ولكن يمكن استخدام أي فلوروفورات متوافقة.

5. تحضير العينات للتصوير

  1. عند العمل تحت مجهر مجسمة تشريح، استخدم ماصة ذات فتحة عريضة لنقل العينة إلى شريحة مجهرية.
  2. باستخدام الملقط ، رتب الخصيتين في خط لسهولة العثور على العينات عند التصوير (لا يلزم توجيه محدد). قم بتغطية العينة بغطاء غطاء. امسح حواف غطاء الغطاء بمنديل مناديل لإزالة وسائط التثبيت الزائدة.
  3. ختم حواف الغطاء مع طلاء الأظافر. اتركيه في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق حتى يجف طلاء الأظافر. يمكن استخدام الشرائح على الفور للتصوير متحد البؤر أو تخزينها لمدة تصل إلى شهر واحد عند 4 درجات مئوية قبل التصوير.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

من المتوقع أن تكتشف نتائج التسلسل من التنميط الجيني SNP اختلافات SNP بين مواقع X و Y rDNA. يتم الكشف عن هذه النيوكلوماتوجرام من خلال التقييم المباشر لمواضع SNP في تسلسل الكروماتوغرامات (الشكل 2). من المتوقع أن يكون لتسلسل عينات الإناث إشارة تسلسل واحدة في موضع SNP ، مما يشير إلى تماثل الزيجوت SNP بين الكروموسومين X (الشكل 2 أ). من المتوقع أن يكون لنتائج تسلسل عينة الذكور ذروة مزدوجة في موضع SNP (الشكل 2 ب). استنادا إلى النمط الجيني للكروموسوم X المحدد من تسلسل العينة الأنثوية ، يتم الاستدلال على أن المتغير غير X هو كروموسوم Y rDNA SNP (على سبيل المثال ، X = T ، Y = C لتسلسل 18S SNP في الشكل 2). بدلا من ذلك ، فإن ذروة التسلسل الفردية في موضع SNP في عينة الذكور تشير إلى تماثل الزيجوت بين مواقع الحمض النووي الريبوزي للذكور والإناث في موضع SNP هذا ، ولن يكون هذا الموضع قابلا للاستخدام ل rRNA SNP-FISH.

باتباع بروتوكول SNP FISH ، يمكن تصور العينات عن طريق التركيب على الشرائح ووضعها تحت زلة غطاء محكمة الغلق ، متبوعا بالفحص المجهري متحد البؤر. باستخدام المجسات المدرجة في الجدول 3 ، يتم اكتشاف إشارة rRNA المشتقة من Y بواسطة انبعاث Alexa Fluor 647 ويتم اكتشاف إشارة rRNA المشتقة من X بواسطة انبعاث Alexa Fluor 488. من المتوقع ملاحظة إشارات الحمض النووي الريبي في النواة ، والتي يمكن تحديدها على أنها ثقب فقير DAPI في النواة (الشكل 3 أ). من السهل التعرف على النواة بشكل خاص في الخلايا الجرثومية بسبب نواتها الكبيرة ونواتها (الشكل 3 أ). يمكن أيضا العثور على الإشارة الخافتة عادة في السيتوبلازم (الشكل 3) ، ولكن هذه إشارة غير محددة يمكن اكتشافها أيضا في عينات بدون rRNA يحتوي على SNP تكميلي (على سبيل المثال ، إشارة Y في الخلايا التي تفتقر إلى Y rDNA أو إشارة X في الخلايا التي تفتقر إلى X rDNA ؛ الشكل 3 ب - ج). علاوة على ذلك ، يمكن أحيانا اكتشاف وضع العلامات المشتركة الاصطناعية ل X و Y rRNA في المحور الجسدي ، حتى في العينات التي تفتقر إلى مواقع X أو Y rDNA (الشكل 3B-C ، الأسهم الصفراء). وبالتالي ، يجب استخدام الإشارات النووية فقط لتقييم النسخ الخاص بالمكان. من المتوقع أن تحتوي معظم الخلايا ، وخاصة الخلايا الجسدية ، على إشارة Y rRNA فقط ، مما يشير إلى أن rRNA يتم نسخه حصريا من موضع Y rDNA (الشكل 3 أ ، الدائرة الصفراء المنقطة ، والسهم الأحمر) 10،17. ومع ذلك ، غالبا ما يتم الكشف عن التعبير المشترك ل X و Y rRNA في الخلايا الجرثومية ، وخاصة الخلايا الجذعية الجرثومية13 (الشكل 3 أ ، دوائر بيضاء منقطة). يمكن أن تكون إشارات X و Y rRNA في الخلايا المشتركة متجاورة وتشكل نواة واحدة (الشكل 3 أ خلية علوية) أو يمكن أن تكون منفصلة ، وتشكل نواتين (الشكل 3 أ الخلية السفلية). يتم توفير الأمثلة الواردة في الشكل 3 من rDNA SNP-FISH باستخدام مجموعات المسبار التي تستهدف اثنين فقط من تعدد الأشكال (الاثنان من ITS1 SNPs) ، مما يدل على أن اثنين فقط من تعدد الأشكال ضروريان ل rDNA SNP-FISH. ومع ذلك ، يتم ملاحظة إشارات أكثر قوة عند استخدام المجسات التي تستهدف جميع تعدد الأشكالالأربعة 13.

تعد عناصر التحكم السلبية إدمانا مهما لهذا الاختبار للتأكد من أن المجسات لا تتفاعل مع هدف SNP الخاطئ ، خاصة عند استكشاف أخطاء الطريقة وإصلاحها لأول مرة. تتضمن عناصر التحكم السلبية في الكروموسوم X أي حالة تفتقر إلى rDNA للكروموسوم X ، مثل الذكور الذين يؤوون كروموسوم X مع حذف rDNA. من المتوقع أن تكتشف عناصر التحكم السلبية في الكروموسوم X إشارة Y rRNA فقط ولا X rRNA (الشكل 3 ب). تتضمن الضوابط السلبية للكروموسوم Y أي حالة تفتقر إلى كروموسوم Y rDNA. بعض الأمثلة على هذه الحالات هي أي أنسجة أنثوية XX ، أو أنسجة من الذكور تفتقر إلى كروموسوم Y ، أو الذكور الذين يؤويون كروموسوم Y مع حذف rDNA15. من المتوقع أن تكتشف عناصر التحكم السلبية للكروموسوم Y إشارة X rRNA فقط وليس لها إشارة Y rRNA يمكن اكتشافها (الشكل 3C). لاحظ أن عناصر التحكم هذه ليست مهمة فقط لتحديد خصوصية المسبار ، ولكن أيضا لتحديد أي خلفية إشارة أو قطع أثرية. يمكن استخدام أي مجسات أو ظروف فحص جديدة توفر خصوصية في مثل هذه الضوابط بدقة للكشف عن نسخ الحمض النووي الريفي الخاص بالمكان.

قد تغير الظروف الجينية أو التنموية أو البيئية المختلفة احتمالية نسخ الحمض النووي الريبوني حصريا من موضع rDNA للكروموسومY 13،17. يمكن قياس تكرار نسخ الحمض النووي الريبوزي من موضع واحد أو مواقع متعددة ومقارنتها مباشرة بين العينات. من أجل مقارنة الاختلافات في نسخ موضع الحمض النووي الريبوسي كميا ، يجب تصنيف كل خلية بشكل فردي على أنها مهيمنة على Y أو مشتركة المهيمنة أو X-dominant. يتم تصنيف الخلايا فقط على أنها سائدة على Y و X إذا تم اكتشاف تلك الإشارة المعنية فقط. تعتبر أي خلية تحتوي على كل من إشارات Y و X rRNA مهيمنة بشكل مشترك ، حتى لو كانت إحدى الإشارات أضعف بكثير من الأخرى. وبالتالي ، فإن الخلايا التي تحتوي على إشارات X و Y قوية جدا تعتبر نوعيا مثل الخلايا ذات الإشارات القوية Y و X الضعيفة أو X القوية وإشارات Y الضعيفة. يمكن مقارنة النسبة المئوية الإجمالية لجميع الخلايا عبر جميع العينات في كل فئة بين العينات عن طريق اختبار مربع كاي. في حين أن هذا الاختبار يعمل بشكل جيد لتحديد ما إذا كان موضع rDNA معين قد تم نسخه نوعيا أم لا ، إلا أننا لم نلاحظ تقييمات متسقة بين العينات عند القياس المباشر لشدة التألق لإشارات SNP-FISH الفردية. وبالتالي ، لا نوصي بإجراء تقييمات كمية لشدة إشارة FISH بين العينات أو الكثافة النسبية لإشارات X و Y rDNA داخل خلية واحدة. مصدر هذا التناقض في شدة التألق غير واضح ، على الرغم من أنه قد يكون بسبب الارتباط غير الفعال للمجسات المقنعة التي لا ترتبط بجميع الحمض النووي الريبي المستهدف.

figure-results-1
الشكل 1: رسم تخطيطي لطريقة SNP-FISH. (أ) تتفاعل مجسات قليل النوكليوتيدات التقليدية المضادة للمعنى FISH مع الحمض النووي الريبي غير المستهدف الذي يختلف بمقدار نيوكليوتيد واحد فقط. (ب) تستخدم طريقة SNP-FISH قناعا تكميليا قليل النوكليوتيد المرتبط بالمنطقة 3 'من مسبار قليل النوكليوتيدات. يترك القناع 10 نيوكليوتيدات فقط خالية من الارتباط بالتسلسل المستهدف. لا ترتبط منطقة المسبار غير المقنعة بثبات بالتسلسلات غير المستهدفة التي تختلف بواحد أو أكثر من النيوكليوتيدات. ينفصل القناع عن المسبار بعد ارتباط المسبار بالهدف ، مما يسمح بالارتباط المستقر بين المسبار والهدف. (ج) تربط مجسات SNP المزدوجة ذات العلامات المختلفة جنبا إلى جنب مع قناع مشترك على وجه التحديد الأهداف التي تختلف بواسطة نيوكليوتيد واحد دون التفاعل المتبادل. (د) يمكن تجميع مجسات متعددة معا لتسمية الأنماط الفردانية المميزة للحمض النووي الريبي الريبي على وجه التحديد. تم تمييز أربعة اختلافات في SNP بين مواقع X و Y rDNA في ذبابة الفاكهةذبابة الفاكهة سلالة ميلانوغاستر y1w 1. SNP واحد في 18S rRNA ، وواحد في 28S rRNA ، واثنان في جزء ITS1 من pre-rRNA. يتم عرض الأنماط الفردانية للحمض النووي الريبي الريبي الخاص ب X و Y المستخدمة في SNP-FISH. يتم اقتران المجسات التي تستهدف متغير X rDNA في تعدد الأشكال الأربعة rRNA إلى فلوروفور مشترك (أخضر) ، ويتم اقتران المجسات التي تستهدف متغيرات Y rDNA بفلوروفور مختلف (أرجواني). يتم استخدام قناع مشترك لكل SNP (أربعة في المجموع). يمكن لربط المسبار الخاص ب SNP في كل موضع SNP على rRNA تسمية rRNA على وجه التحديد من مواقع X و Y rDNA مع ما يصل إلى أربعة مجسات قليل النوكليوتيدات FISH. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: أمثلة على نتائج تسلسل rDNA SNP متماثل الزيجوت ومتغاير الزيجوت. مثال على تسلسل الكروماتوغرامات من تسلسل 18S SNP للحمض النووي من عينات (أ) من الإناث و (ب) الذكور. يشار إلى موضع SNP 18S بعلامة النجمة (*). تشير إشارة الثايمين المفردة (T) لموضع SNP في العينة الأنثوية إلى وجود ثايمين في موضع SNP في موضع rDNA للكروموسوم X. تشير الإشارة المزدوجة في موضع SNP المنقسمة بين الثايمين والسيتوزين (C) في العينة الذكرية إلى وجود سيتوزين في موضع SNP في موضع rDNA للكروموسوم Y (يتم الاستدلال عليه من خلال معرفة أن الثايمين موجود في موضع الكروموسوم X). تم عرض نتائج التسلسل باستخدام ApE - برنامج محرر البلازميد19. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3: أمثلة على نتائج SNP-FISH في ذبابة الفاكهة الخصية باستخدام مجموعتين فقط من مسبار SNP-FISH. أمثلة SNP FISH في خصية التي تحتوي على (A) كل من X و Y rDNA ، (B) فقط Y rDNA ، أو (C) X rDNA فقط. استخدمت هذه الأمثلة فقط مجموعات المسبار التي تصنف اثنين من ITS1 rRNA SNPs ، مما يدل على أن أسماك rRNA SNP تعمل مع أقل من اثنين من تعدد الأشكال المستهدف. يتم التعرف على الخلايا الجرثومية من خلال نواتها المستديرة الكبيرة ، والخلايا الجسدية من خلال نواتها الأصغر والأقل استدارة. يتم تحديد الخلايا الجذعية الجرثومية من خلال موقعها بجوار المحور الجسدي مباشرة ، والذي يتميز بعلامة النجمة (*). يتم تحديد الخلايا الجرثومية التي تنسخ rDNA من كل من مواقع X و Y rDNA بواسطة إشارات FISH النووية X و Y (الدوائر البيضاء المنقطة ، A-A'). الخلايا الجرثومية التي تنسخ الحمض النووي من موضع Y rDNA فقط لديها إشارة FISH نووية Y (دائرة صفراء منقطة). يتم تمييز الخلايا الجسدية التي تعبر عن Y فقط بسهم أحمر. يمكن ملاحظة وضع العلامات المشتركة الاصطناعية لمواقع X و Y rDNA في المحور الجسدي (السهم الأصفر). شريط المقياس هو 10 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الملف التكميلي 1: تسلسل الحمض النووي الريبي للكروموسوم X. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا ، نصف طريقة لاستخدام SNP-FISH لتمييز نصوص 45S rRNA المشتقة من مواقع rDNA للكروموسوم X و Y في ذبابة الفاكهة أنسجة ميلانوجاستر . تتمثل الخطوة الأكثر أهمية في هذا البروتوكول في التنميط الجيني الدقيق ل 45S SNPs لاستخدامها كأهداف SNP-FISH. نحن نقدم بادئات وبروتوكولات للنمط الجيني الرابع ذبابة الفاكهة 45S تعدد الأشكال المعروف ، ولكن قد تكشف طرق التسلسل الأخرى عن تعدد الأشكال الجديدة التي يمكن استخدامها بدلا من ذلك في الفحص. لا يمكن استخدام أي مواضع SNP متطابقة بين مواقع rDNA للكروموسوم X و Y (على سبيل المثال ، هناك ذروة تسلسل واحدة في عينات الحمض النووي للذكور) ل SNP FISH. يمكن العثور على بعض مواضع SNP غير متجانسة داخل موضع rDNA واحد (على سبيل المثال ، لا تعطي نتائج التسلسل متغيرا واحدا ل SNP لعينات XX أو ذروة تسلسل ثانية طفيفة جدا في عينات XY). كما أن تعدد الأشكال غير المتجانسة داخل موضع rDNA واحد ليست مناسبة لهذا الاختبار نظرا لأن أحد المتغيرات سيتم مشاركته بين موقعي rDNA ، مما يجعل النسخ من موضع واحد أو مواقع متعددة لا يمكن تمييزه. علاوة على ذلك ، نظرا لتخزين المنوية الأنثوية20 ، قد يحتوي الحمض النووي المعزول من الإناث المتزاوجة على كروموسوم Y rDNA. وبالتالي ، من الأهمية بمكان استخدام الإناث غير المتزاوجة لتحليل تسلسل XX. الأهم من ذلك ، تتطلب هذه الطريقة ما لا يقل عن اثنين من تعدد الأشكال الخاص بالكروموسوم لتمكين مجسين على الأقل خاصين بالموضع من ربط كل جزيء rRNA للكشف ، مما يحد من تطبيقه على مواقع rDNA مع اثنين على الأقل من تعدد الأشكال المميزة بينهما. يسمح توفر المزيد من تعدد الأشكال بمزيد من المجسات لربط كل RNA ويمكن أن يوفر فعالية أكبر للإشارة. ومن المثير للاهتمام أن هذه الطريقة تصنف فقط الرنا المرسال في النواة ، على الرغم من زوجين من المسبار يستهدفان تعدد الأشكال في 18S و 28S rRNAs التي يتم تصديرها إلى السيتوبلازم (الحمض النووي الريبي الريبي الذي يحتوي على الموقعين المستهدفين ل ITS1 موجود فقط في النواة). يشير عدم وجود إشارة FISH السيتوبلازمية إلى احتمالين غير حصريين: 1) مجسات 18S و 28S وحدها غير كافية للكشف عن الحمض النووي الريبي السيتوبلازمي ، ربما لأن الحمض النووي الريبي الريبي أكثر تشتتا في جميع أنحاء السيتوبلازم منه في النواة ، أو 2) هناك كفاءة ربط مسبار أقل للحمض النووي الريبي المدمج في الوحدات الفرعية الريبوسومية الناضجة مقارنة ب 45S rRNA غير المعالجة. قد تمكن تعدد الأشكال الإضافية داخل 18S و 28S rRNAs من اكتشاف FISH الحساسة ل SNP للرينا الريبي السيتوبلازمي.

تشمل الطرق الأخرى لتقييم نسخ الحمض النووي الريبي الخاص بالموقع مناهج تسلسل الرنا الريبي التي تميز التعبير عن متغيرات الرنا المرسال التي يتم تعيينها لمواقع محددة6. وبالمثل ، يمكن ل qPCR تقييم تعبير متغيرات الحمض النووي الريبي المميزة بما يكفي لتمكين الكشف الفريد5،21 ، على الرغم من أنه من غير الواضح ما إذا كان إسكات هذه المتغيرات يمثل إسكات موضع الحمض النووي الريبوزي بأكمله. في حين أن هذه الطرق يمكن أن تكون فعالة في تحديد التعبير عن متغيرات محددة من الرنا الريبي الريبي ، إلا أنه لا يمكن إجراؤها بدقة خلية واحدة. يشير عدم تجانس إسكات الحمض النووي للكروموسوم X في أنسجة ذبابة الفاكهة إلى أن هناك تباينا قويا من خلية إلى أخرى في نسخ موضع الحمض النوويrDNA 17 ويسلط الضوء على الحاجة إلى تقنيات يمكن أن تفسر هذا التباين. تم استخدام ميزات التصوير المرتبطة بالنسخ النشط في مواقع الحمض النووي الريبوني ، مثل متغير هيستونH3.3 10 أو عامل النسخ Pol I UBF22 ، لتحديد نسخ الحمض النووي الريبي المرسال الخاص بالموضع بدقة الخلية الواحدة. ومع ذلك ، تتطلب كلتا الطريقتين الكروموسومات المكثفة للخلايا الانقسامية من أجل التمييز بين النسخ الذي يحدث في أي موضع معين من الحمض النووي الريبي. في ذبابة الفاكهة ، يمكن تحديد مواقع الحمض النووي الريبوسي في الكروموسومات X و Y من خلال شكل الكروموسوم10 ، ولكن تحديد مواقع الحمض النووي الريبوسي النشطة نسخيا في الخلايا البشرية يتطلب أيضا تلطيخا مشتركا مع الملصقات الخاصةبالكروموسوم 22. لا تتطلب طريقة SNP-FISH وضع العلامات المشتركة الخاصة بالكروموسوم أو وضع العلامات على علامات النسخ ويمكن تقييمها في أي مرحلة من مراحل دورة الخلية أو خلايا ما بعد الانقسام ، مما يوفر المرونة للاستخدام في الأنسجة المتنوعة والظروف التجريبية.

يمكن تعديل طريقة rRNA SNP-FISH هذه لاستخدامها مع تعدد الأشكال الأخرى التي تميز بين ذبابة الفاكهة rRNAs أو من المحتمل تطبيقها على تعدد الأشكال التي تميز بين مواقع الحمض النووي الريبي في الكائنات الحية الأخرى. سيتطلب تطبيق هذه الطريقة على الكائنات الحية التي تحتوي على أكثر من موقعين من مواقع الحمض النووي الريفي أن يكون للموضع نمط فرسان فريد من نوعه متغير الحمض النووي يحتوي على اثنين على الأقل من تعدد الأشكال غير موجودين في أي موضع آخر من الحمض النووي الريبوني وتتم مشاركتها بين جميع نسخ 45S في هذا الموضع. يعني هذا المطلب أن الطريقة ستكون قادرة فقط على تحديد النسخ من موضع واحد محدد مقارنة بجميع المواقع الأخرى (على سبيل المثال ، rRNA SNPs من الموضع 1 مقارنة ب SNPs المشتركة بواسطة المواقع 2 و 3). ومع ذلك ، إذا كان لكل موضع rDNA نمط فرسان متوافق ، فيمكن دمج تجارب متعددة لتقييم نسخ كل موضع واحدا تلو الآخر بشكل فردي. تسمح الصرامة المنخفضة نسبيا لدرجة حرارة التهجين (37 درجة مئوية) المستخدمة في هذا البروتوكول بربط مسبار قوي ، لا سيما بالنظر إلى الجزء القصير غير المقنع من المسبار ، على الرغم من أن التهجين في درجات حرارة أعلى (50-75 درجة مئوية) قد ثبت أنه يعزز إشارة بعض مجسات FISH23. قد تؤدي درجات حرارة التهجين المرتفعة إلى تحسين إزاحة خيط القناع وزيادة ارتباط المسبار ، لكن درجات الحرارة المرتفعة جدا قد تزعزع استقرار ارتباط قناع المسبار وتفقد خصوصية SNP. لهذا السبب ، لا نتوقع أن يقوم SNP-FISH بتسمية الحمض النووي على وجه التحديد لأن درجات الحرارة اللازمة لإذابة أهداف الحمض النووي مزدوجة الشريطة لتمكين ربط المسبار من شأنها أيضا أن تزعزع استقرار ارتباط قناع المسبار وتزيل خصوصية الهدف الحساسة ل SNP. ومع ذلك ، فإن تحسين درجة حرارة التهجين لمجسات rRNA SNP الجديدة قد يزيد من الإشارة ، خاصة عندما يتوفر موقعان فقط ل SNP. يرتبط فقدان إسكات rDNA للكروموسوم X بانخفاض عدد نسخ الحمض النووي الريفي ذبابة الفاكهة13 ، لذا فإن تطوير فحوصات SNP-FISH لتوصيف نسخ الحمض النووي الريبي الريبي الخاص بالموضع في أنظمة أخرى قد يكون بمثابة أداة مفيدة لتقييم سلامة الحمض النووي الريبي ووظيفة الريبوسوم. علاوة على ذلك ، تم تعديل هذه الطريقة للاستخدام مع متغير الحذف في ذبابة الفاكهة ، وكان متغير الرنا الريبي الهيكلي الفردي مناسبا للكشف (ربما بسبب تقارب ربط الهدف الأكبر بدون قناع مسبار)17. يؤدي استخدام متغيرات الرنا الريبي الهيكلية التي يحتمل أن تتحد مع متغيرات SNP إلى توسيع إمكانية التطبيق في الأنظمة الأخرى. نظرا لأن الآليات التي تنظم نسخ موضع الحمض النووي الريبي لا تزال غير واضحة إلى حد كبير ، فإن المرونة والقدرة المحتملة على التكيف ل rRNA SNP-FISH مع الأنظمة الأخرى تجعلها أداة قوية للدراسات المستقبلية للتحقيق في نسخ الحمض النووي الريبي.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر مركز بلومنجتون ذبابة الفاكهة ، ومركز كيوتو ذبابة الفاكهة ، و FlyBase على مواردهم. تم دعم هذا العمل من خلال أموال بدء التشغيل المقدمة من قسم الكيمياء الحيوية وبيولوجيا الخلية بجامعة ستوني بروك وكلية النهضة للطب (JON).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
PTC Tempo 96 Thermal CyclerBio Rad12015382يمكن استخدام أي دورة حرارية
0.2 مل 8 شرائط مسطحة أنابيب PCRVWR89133-912يمكن استخدام أي أنابيب متوافقة
1 كيلو بايت سلم الحمض النوويNEBN3232Sللاستخدام عند التحقق من تسلسل حجم أمبليكون PCR عن طريق الرحلان الكهربائي للهلام
1.5 مل أنابيب الطرد المركزي الدقيقة المتدرجة الولاياتالمتحدة الأمريكية العلمية1615-5510أي أنبوب خال من RNase معتمد سيقوم بعمل
2 ملي مولار dNTP MixThermoFisher ScientificR0241
50x TAE BufferBioRad 1610743يستخدم في الرحلان الكهربائي للهلام. يمكن استخدام أي مخزن مؤقت ل TAE.
5M كلوريديمكن استخدام أي كلوريد الصوديوم أو تحضيره من أي مصدر
AgaroseVWR97064-250يمكن استخدام أي Agarose
ApE - برنامج محرر البلازميدN / AN / A
طلاءاستخدام أي طلاء أظافر من أي بائع تجزئة
زجاجي ، رقم 1 سماكةتوماس ساينتيك6672A38
فورماميد فيشر منزوع الأيوناتNC9569627
ديكستران كبريتات الصوديومسيجما ألدريتشD8906-10G
دريم تك جرين PCR ماستر ميكسثيرموفيشر العلميK1081
دومون # 5 ملقطأدوات العلوم الدقيقة11252-20تستخدم لتشريح العينات
EDTA (0.5 م) ، درجة الحموضة 8.0يمكن استخدام أيمنتج مماثل
الإيثانولVWR89125-172استخدام أي إيثانول 200 برهان. تستخدم للتخفيف إلى 70٪ من الإيثانول للنفاذية والتنظيف للظروف الخالية من الرناس
الإيثيديوم بروميدThermoFisher Scientific15585011
نظام الرحلان الكهربائي الأفقي الصغيرGel Fisher Scientific14-955-170استخدام أي نظام الرحلان الكهربائي للهلام
KimwipesFisher Scientific06-666
Micro-Test StainingDish Electron علوم الفحص المجهري71564تستخدم لتشريح
العينات شاكرالجوز سيجما ألدريتشBMSB3D1020يمكن استخدام أي شاكر الجوز
ParafilmUSA Scientific3023-4526
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (10X) درجة الحموضة 7.4 ، تقنيات الحياة الخالية من RNaseAM9624
بيرس 16٪ فورمالديهايد (وزن / حجم) ، تقنيات الحياة الخالية من الميثانول28908
تقنيات حياة حمام الماء للأغراض العامة الدقةTSGP02يمكن استخدام أي حمام مائي
QIAquick Gel ExtractionQiagen28704يمكن استخدام أي مجموعة استخلاص هلام
Protein Protein K المؤتلف (20 مجم / مل)InvitrogenAM2546استخدام أي منتج مماثل
خال من Rnase UltraPure BSAThermoFisher ScientificAM2618
S. cerevisiae< / em> tRNASigma AldrichR8759
SSC (20X) ،Fisher ScientificAM9763
Triton-X 100Life TechnologiesA16046.AE
UltaPure 1M Tris-HCl Buffer ، درجة الحموضة 7.5ThermoFisher Scientific15567027استخدام
أي منتج مماثلتقنيات حياة الماء المقطر الخالية من DNase / RNase10977023
فاناديل ريبونوكليوزيدNEBS1402S
VECTASHIELD معمختبرات ناقلاتH-1200-10
VWR Superfrost Microscope SlideVWR48311-601
y [1] w [1] ذبابة الفاكهة السوداء < / em> خطمركز مخزون بلومنجتون ذبابة الفاكهة1495
Zeiss LSM 980 مجهر متحد البؤرZeiss المجهراستخدام أي مجهر متحد البؤر مع انبعاث وكشف متوافقين يمكن استخدام مجهر
ستيريو Zeiss Stemi 2000-C ومجهر مصدر الضوءCentral455053استخدام أي مجهر مجسم
الصوديوم https://jorgensen.biology.utah.edu/wayned/ape/ أظافر شفاف يمكن غطاء من يمكن يمكن Kit محلول يمكن يمكن وسائط تركيب DAPI يمكن يمكن

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Baßler, J., Hurt, E. Eurokaryotic ribosome assembly. Ann Rev Biochem. 88 (1), 1-26 (2018).
  2. Hall, A. N., Morton, E., Queitsch, C. First discovered, long out of sight, finally visible: ribosomal DNA. Trend Genet. 38 (6), 587-597 (2022).
  3. Srivastava, R., Srivastava, R., Ahn, S. H. The epigenetic pathways to ribosomal DNA silencing. Microbiol Mol Biol Rev. 80 (3), 545-563 (2016).
  4. Kuo, B. A., Gonzalez, I. L., Gillespie, D. A., Sylvester, J. E. Human ribosomal RNA variants from a single individual and their expression in different tissues. Nucl Acid Res. 24 (23), 4817-4824 (1996).
  5. Tseng, H., et al. Mouse ribosomal RNA genes contain multiple differentially regulated variants. PLoS ONE. 3 (3), e1843(2008).
  6. Locati, M. D., et al. Expression of distinct maternal and somatic 5.8S, 18S, and 28S rRNA types during zebrafish development. RNA. 23 (8), 1188-1199 (2017).
  7. Roussel, P., André, C., Comai, L., Hernandez-Verdun, D. The rDNA transcription machinery is assembled during mitosis in active NORs and absent in inactive NORs. J Cell Biol. 133 (2), 235-246 (1996).
  8. Pontes, O., et al. Postembryonic establishment of megabase-scale gene silencing in nucleolar dominance. PLoS ONE. 2 (11), e1157(2007).
  9. Earley, K. W., et al. Mechanisms of HDA6-mediated rRNA gene silencing: suppression of intergenic Pol II transcription and differential effects on maintenance versus siRNA-directed cytosine methylation. Gene Dev. 24 (11), 1119-1132 (2010).
  10. Greil, F., Ahmad, K. Nucleolar dominance of the Y chromosome in Drosophila melanogaster. Genetics. 191 (4), 1119-1128 (2012).
  11. Preuss, S., Pikaard, C. S. rRNA gene silencing and nucleolar dominance: Insights into a chromosome-scale epigenetic on/off switch. Biochim Biophys Acta. 1769 (5-6), 383-392 (2007).
  12. Sharifi, S., Bierhoff, H. Regulation of RNA pPolymerase I transcription in development, disease, and aging. Ann Rev Biochem. 87 (1), 1-23 (2018).
  13. Lu, K. L., Nelson, J. O., Watase, G. J., Warsinger-Pepe, N., Yamashita, Y. M. Transgenerational dynamics of rDNA copy number in Drosophila male germline stem cells. eLife. 7, e32421(2018).
  14. Nurk, S., et al. The complete sequence of a human genome. Science. 376 (6588), 44-53 (2022).
  15. Ritossa, F. M. Unstable redundancy of genes for ribosomal RNA. Proc Natl Acad Sci. 60 (2), 509-516 (1968).
  16. Nelson, J. O., Slicko, A., Yamashita, Y. M. The retrotransposon R2 maintains Drosophila ribosomal DNA repeats. Proc Natl Acad Sci. 120 (23), e2221613120(2023).
  17. Warsinger-Pepe, N., Li, D., Yamashita, Y. M. Regulation of nucleolar dominance in Drosophila melanogaster. Genetics. 214 (4), (2020).
  18. Levesque, M. J., Ginart, P., Wei, Y., Raj, A. Visualizing SNVs to quantify allele-specific expression in single cells. Nat Meth. 10 (9), 865-867 (2013).
  19. Davis, M. W., Jorgensen, E. M. ApE, a plasmid editor: A freely available DNA manipulation and visualization program. Front Bioinfo. 2, 818619(2022).
  20. Qazi, M. C. B., Heifetz, Y., Wolfner, M. F. The developments between gametogenesis and fertilization: ovulation and female sperm storage in Drosophila melanogaster. Dev Biol. 256 (2), 195-211 (2003).
  21. Rogers, M. J., et al. Structural features of the large subunit rRNA expressed in Plasmodium falciparum sporozoites that distinguish it from the asexually expressed subunit rRNA. RNA. 2 (2), 134-145 (1996).
  22. Potapova, T., et al. Epigenetic control and inheritance of rDNA arrays. bioRxiv. , (2024).
  23. Tang, Y. Z., Gin, K. Y. H., Lim, T. H. High-temperature fluorescent in situ hybridization for detecting Escherichia coli in seawater samples, using rRNA-targeted oligonucleotide probes and flow cytometry. Appl Environ Microbiol. 71 (12), 8157-8164 (2005).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

SNP FISH DetectionRibosomal RNA TranscriptionDrosophila MelanogasterrDNA LociSingle Nucleotide PolymorphismLocus Specific rRNAFluorescence In Situ HybridizationGerm Cell NucleolusChromosome Specific TranscriptionTestes Dissection

Related Articles