مقالة منهجية

منصة التصوير البصري متعدد الوسائط لدراسة التمثيل الغذائي الخلوي

DOI:

10.3791/67906

⸱

يونيو 6, 2025

 ,  ,  , 
1Shu Chien-Gene Lay Department of Bioengineering, University of California San Diego, 2Aiiso Yufeng Li Family Department of Chemical and Nano Engineering, University of California San Diego, 3Department of Electrical and Computer Engineering, University of California San Diego, 4Institute of Engineering in Medicine, University of California San Diego, 5Synthetic Biology Institute, University of California San Diego

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

باستخدام منصة متعددة الوسائط تجمع بين طرائق التصوير البصري الخالية من الملصقات ، قمنا بتطوير بروتوكول لتصور وقياس الديناميكيات الخلوية والتمثيل الغذائي. من خلال التصوير عبر التألق متعدد الفوتون ، والجيل التوافقي الثاني ، والفحص المجهري المشتت رامان المحفز ، يمكننا إنشاء نظرة عامة شاملة على البيئة الخلوية والجزيئية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعتبر تقنيات التصوير البصري ضرورية في الدراسات الطبية الحيوية لقدرتها على الحصول على المعلومات المورفولوجية والوظيفية من العينات البيولوجية بدقة مكانية عالية. تستغل هذه العمليات البصرية تفاعلات جزيئات الضوء المختلفة ، مثل التشتت والامتصاص والانبعاث والتوليد التوافقي ، بين الفوتونات والجزيئات داخل الخلايا أو الأنسجة أو الأعضاء. في حين أن التصوير الطبي الحيوي التقليدي قد ركز تاريخيا على تطبيق طريقة واحدة ، فقد أظهرت الأبحاث الحديثة أن هذه التقنيات المتنوعة توفر رؤى تكميلية ، وتوفر مخرجاتها مجتمعة فهما أكثر شمولا للتغيرات الجزيئية في عمليات الشيخوخة وتطور المرض والأساسيات في بيولوجيا الخلية.

في العقود الماضية ، تقدمت طرق التصوير البصري الخالية من الملصقات ، مما مكن من الاستكشاف التفصيلي للبيئات الخلوية وتحت الخلوية. على سبيل المثال ، لا يسهل التألق متعدد الفوتون (MPF) تصوير البروتين المستهدف فحسب ، بل يحدد أيضا النشاط الأيضي من خلال الإنزيمات المساعدة الفلورية الذاتية ، مما يحقق عمق اختراق عال ودقة مكانية. يستخدم الجيل التوافقي الثاني (SHG) لتصوير هياكل مثل الكولاجين في المصفوفة خارج الخلية ، بينما يرسم تشتت رامان المحفز (SRS) الروابط الكيميائية والتركيب الجزيئي في الموقع بدقة تحت الخلية.

لقد قمنا بتطوير منصة تصوير متعددة الوسائط تجمع بين طرائق MPF و SHG و SRS. يتيح دمج هذه الطرائق في منصة واحدة الحصول على معلومات متعددة الأوجه من نفس التوطين داخل الخلايا أو الأنسجة أو الأعضاء أو حتى الأجسام ، مما يسهل استكشافا أكثر تفصيلا للعلاقات المعقدة بين التمثيل الغذائي الخلوي وبنية المصفوفة خارج الخلية والتركيب الجزيئي. يوفر هذا النظام متعدد الوسائط دقة تحت الخلايا ، واختراق الأنسجة العميقة ، وتصوير الخلايا الحية / الأنسجة في الموقع ، بالإضافة إلى الكشف الخالي من الملصقات والتسجيل المشترك الفوري دون الحاجة إلى تعديلات الموضع أو تبديل الجهاز أو محاذاة ما بعد التحليل. هنا ، نقدم بروتوكولا للتصوير الخالي من الملصقات باستخدام هذه المنصة متعددة الوسائط ونوضح تطبيقه في توصيف التمثيل الغذائي الخلوي ، وعدم التجانس الجزيئي في الخلايا والأنسجة لدراسة الشيخوخة والأمراض.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

كان التصوير الطبي الحيوي البصري محوريا في تعزيز فهمنا للبنية البيولوجية والوظيفة. يتم إنشاء الصور عن طريق تعديل ضوء الإثارة واكتشاف الإشارات من تفاعلات الأنسجة الضوئية. استخدم المجهر المركب الأول ، الذي طوره هانز وزكريا يانسن حوالي عام 1590 ، عدستين محدبتين في أنبوب ، مما يوفر تكبيرا يصل إلى 30 ×1. يمكن للمجاهر البصرية الحديثة ، بعد قرون من التقدم ، أن تحقق الآن دقة تصل إلى 1-3 نانومتر2،3. بالإضافة إلى تقديم دقة عالية ، توفر أنظمة التصوير المتقدمة الآن اختراقا أعمق للأنسجة ، وكفاءة أكبر ، وأقل ضررا للعينة ، مما يجعلها مناسبة بشكل خاص لتصوير الخلايا الحية والأنسجة. يعد التصوير الخالي من الملصقات مفيدا بشكل خاص لأنه يلتقط المعلومات دون تعطيل العمليات داخل الخلايا أو المساس بسلامة العينة.

تم استخدام الفحص المجهري الفلوري متعدد الفوتون (MPF) ، وخاصة الفحص المجهري الفلوري ثنائي الفوتون ، على نطاق واسع للتصوير الخالي من الملصقات. على عكس الفحص المجهري الفلوري التقليدي ، الذي يعتمد على امتصاص وانبعاث الفوتون الأحادي الخطي ، فإن إثارة MPF تتضمن امتصاصا متزامنا لفوتونات متعددة ، والتي تثير طاقتها المجمعة جزيء فلوروفور واحد4،5. تمتلك هذه الفوتونات ، عادة في طيف الأشعة تحت الحمراء ، نصف أو أقل من الطاقة المطلوبة لإثارة الفوتون الفردي. تؤدي الأطوال الموجية الأطول والإثارة الموضعية في النقطة المحورية في هذه العملية غير الخطية إلى تشتت أقل ، واختراق أعمق للأنسجة ، وتقليل السمية الضوئية.

يمكن التقاط معلومات التمثيل الغذائي الخلوي عن طريق الفحص المجهري MPF الخالي من الملصقات من خلال الكشف عن إشارات التألق الذاتي من ركائز التمثيل الغذائي الذاتية ، مثل انخفاض نيكوتيناميد الأدينين ثنائي النوكليوتيد (NADH) وفلافين الأدينين ثنائي النوكليوتيد (FAD). تظهر هذه الإنزيمات المساعدة أطياف إثارة وانبعاث مميزة ، وتعكس نسبة شدة التألق ، والمعروفة باسم نسبة الأكسدة والاختزال (NADH / FAD) ، الحالة التأكسدية للخلية. منذ أن قدم Britton Chance مفهوم نسبة الأكسدة والاختزال لأول مرة في عام 1979 ، تم اقتراح نسب إضافية ، بما في ذلك NAD (P) H / FAD و NAD (P) H / (FAD + NAD (P) H) ، و FAD / (FAD + NAD (P) H)، 6،7،8،9. يوفر القياس الكمي لنسب الأكسدة والاختزال البصرية هذه عبر تصوير MPF نظرة ثاقبة لديناميكيات التمثيل الغذائي. على سبيل المثال ، يمكن لتصوير MPF التمييز بين الخلايا السرطانية والخلايا الطبيعية بناء على عملية التمثيل الغذائي المتغيرة ، مما يدل على قدرتها على تشخيص السرطان10،11،12. ومع ذلك ، فإن الكشف عن التألق الذاتي القائم على MPF له قيود. قد تساهم الفلوروفورات الجوهرية الأخرى ، مثل الكيراتين ، في شدة التألق ، مما يؤدي إلى الحديث الطيفي وتفسير الإشارة غير الدقيق13. بالإضافة إلى ذلك ، تعكس نسبة الأكسدة والاختزال فقط التغيرات الإجمالية في تقليل الأكسدة الخلوية ولا تميز بين NADH من مصادر مختلفة (على سبيل المثال ، السيتوبلازمي أو الميتوكوندريا) أو بين NADH و NAD (P) H ، حيث يظهر كلاهما قمما طيفية متشابهة عند 450 نانومتر ، مما ينتج عنه إشارات شدة ممزوجة14.

تم استخدام الجيل التوافقي الثاني (SHG) ، وهي عملية بصرية غير خطية تم عرضها لأول مرة في المجال الطبي الحيوي في الثمانينيات ، على نطاق واسع للتصوير الخالي من الملصقات للهياكل الخلوية15،16. على غرار MPF ، يتضمن SHG الامتصاص المتزامن لفوتونين من نفس الطاقة من ليزر نبضي فائق السرعة. يتم إعادة تجميع هذه الفوتونات لإصدار فوتون جديد ضعف تردد الضوء الساقط ، مما يؤدي إلى اكتشاف الإشارة التوافقية الثانية. يحدث هذا التفاعل البصري غير الخطي حصريا في المواد غير المتماثلة المركزية التي تظهر قابلية غير صفرية من الدرجة الثانية للحث على استقطاب لتوليد الإشارة التوافقية الثانية17،18. هذا يجعل SHG فعالا بشكل خاص في تصوير البروتينات الخيطية والهياكل الليفية ، مثل الكولاجين والميوسين والتوبولين ، دون الحاجة إلى أصباغ مضان خارجية15،17،19،20. ينتشر الشذوذ في وفرة التليف والكولاجين وتصلبه ومحاذاته وهيكله في العديد من الحالات مثل الالتهاب والسرطان ، مما يجعل SHG أداة واعدة للكشف الفعال وغير الجراحي لبعض الحالات المرضية21،22،23. سلط التطبيق الواسع النطاق لتصوير SHG في أبحاث الأورام ، بما في ذلك الدراسات التي أجريت على سرطان الثدي والمبيض والجلد ، الضوء على دوره الحاسم في كل من الأبحاث الأساسية والتطبيقات السريريةالمحتملة 24،25،26،27.

تظهر الجزيئات المختلفة مستويات طاقة اهتزازية مميزة ، والتي تحفز درجات متفاوتة من التشتت غير المرن عند إثارة الضوء الساقط - وهي ظاهرة تميزت لأول مرة بواسطة C. V. Raman في عام 192828. منذ ذلك الحين ، تم استخدام تأثير رامان على نطاق واسع في المجهر البصري للكشف عن التركيبات الجزيئية والأنسجة دون وضع العلامات الخارجية. يثير كل من تشتت رامان المحفز (SRS) وتشتت رامان المتماسك المضاد للستوكس (CARS) الاهتزازات الجزيئية بشكل متماسك ويستفيد من التفاعل غير الخطي للضوء لإنتاج إشارة أقوى مقارنة بالتحليل الطيفي التقليدي لرامان. تم الإبلاغ عن ظاهرة SRS لأول مرة في عام 196229. في عام 2008 ، تم دمج هذه الآلية في التصوير ثلاثي الأبعاد متعدد الفوتون ، مما يسمح بالكشف الانتقائي عن المواد الكيميائية بناء على تغيرات الشدة في حزم المضخة وستوكس بسبب التحولات الاهتزازية الجزيئية30. تقلل هذه الطريقة من تداخل الخلفية غير الرنانة ، مما يولد إشارة شدة نظيفة تتجاوز إشارة CARS. يتفوق تصوير SRS في توفير التصوير متعدد الإرسال وفائق الأطياف ، مما يتيح الكشف المتزامن عن الروابط الكيميائية المتعددة والسماح بتصور عالي الدقة للتركيب الجزيئي في العينات ذات عمق الاختراق الكبير. على الرغم من كونه تقنية جديدة نسبيا ، فقد أثبت تصوير SRS فعاليته في كل من التشخيص السريري وأبحاث التمثيل الغذائي ، في الجسم الحي وفي المختبر30،31،32،33،34،35،36. على سبيل المثال ، يمكن ل SRS التمييز بين الأنسجة التي تتسلل إلى ورم المخ عن القشرة والمادة البيضاء عن طريق تحديد نسبة الدهون إلى البروتين ، مما يتيح تحديد هوامش الورم بطريقة خالية من الملصقات وغيرجراحية 37،38. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تقييم التغيرات الأيضية ، التي غالبا ما تعتبر السمات المميزة للأمراض المرتبطة بالشيخوخة والسرطان ، كميا باستخدام SRS الذي يتم تحقيقه عن طريق اكتشاف روابط الكربون الديوتيريوم في العينات المعالجة بالماء الثقيل (D2O) ، مما يسمح بالقياس الكمي لتخليق البروتين ، وتكوين الدهون ، وعمليات التمثيل الغذائي الجزيئية الكبيرة الأخرى31،33،34،35،36. تضع القدرة على تتبع المستقلبات ذات الدقة الزمنية والمكانية العالية SRS كأداة واعدة للتحقيق في المرض وتشخيصه ، مع إمكانية التطبيقات السريرية الأوسع.

ظهر التصوير متعدد الوسائط كنهج قوي في البحوث الطبية الحيوية ، حيث يدمج طريقتين أو أكثر من طرق التصوير لاكتساب فهم أكثر شمولا للأنظمة البيولوجية المعقدة داخل نفس العينة. في عام 2018 ، تم تقديم تقنية الفحص المجهري متعدد التوافقيات الخالية من الملصقات ، والتي تدمج مضان ثنائي الفوتون (2PF) ، ومضان ثلاثي الفوتون (3PF) ، و SHG ، والجيل التوافقي الثالث (THG) 39. يسهل هذا النهج التصور المتزامن للتفاعلات الخلوية والعمليات الديناميكية والمكونات الفردية داخل البيئة المكروية للورم. يوفر الفحص المجهري SLAM الحد الأدنى من الاضطراب ومتطلبات طاقة الليزر المنخفضة للعينة ، مما يتيح توصيف الأنسجة العميقة ويوفر طريقة أكثر أمانا للمراقبة داخل الحيوية40. تم تطوير طريقة أخرى متعددة الوسائط ، تجمع بين التحليل الطيفي المضان الجوهري ، والتحليل الطيفي للانعكاس المنتشر ، والتحليل الطيفي رامان ، للكشف عن السرطان في الموقع أثناء العملياتالجراحية 41. بالإضافة إلى ذلك ، أظهر نظام التنظير الداخلي غير الخطي متعدد الوسائط المصمم مؤخرا ، والذي يدمج CARS و SHG والتألق ثنائي الفوتون (TPF) ، القدرة على تصوير العينات البيولوجية بدقة مكانية دون ميكرون وشبه الخلوية42. تم استخدام الفحص المجهري المشترك 2PF و SRS بالمثل للتصوير عالي الدقة في الجسم الحي للأنسجة والخلايا والعضيات42،43،44،45. تسخر تقنيات التصوير متعددة الوسائط الناشئة نقاط القوة في الطرائق الفردية ، مما يؤدي إلى تحسين الدقة وعمق الاختراق وكفاءة الحصول على الصور ، وبالتالي إظهار إمكانات كبيرة للتطبيقات السريرية والجراحية.

يفضل هذا النهج متعدد الوسائط بشكل متزايد على التصوير أحادي الطريقة لأنه يوفر نطاقا أوسع من القياسات مع التخفيف من القيود المرتبطة بالتقنيات الفردية. كما تمت مناقشته سابقا ، يقيس MPF التألق الداخلي ليعكس التغيرات الأيضية ، ويمكن ل SHG تصوير الهياكل غير المتماثلة المركزية مثل الكولاجين في العينات البيولوجية ، ويكتشف SRS في الغالب البروتينات والدهون بسبب الكثافة العالية للروابط الكيميائية التي تولد إشارات رامان مميزة بناء على أوضاعها الاهتزازية. نظرا لخصائصها المتماسكة والمبدأ المشترك للخصائص البصرية غير الخطية ، يمكن دمج طرق التصوير هذه في إعداد مجهر واحد باستخدام ليزر نبضي فائق القصر ، مما يسمح بالحصول على العديد من المؤشرات الحيوية في المناطق المحلية لتوفير رؤية أكثر اكتمالا للعملياتالبيولوجية 44،45. تحدد هذه الورقة بروتوكولا لتنفيذ منصة تصوير متعددة الوسائط تدمج MPF و SHG و SRS لتطبيقات البحوث الطبية الحيوية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. تجارب التصوير متعدد الوسائط الخالية من الملصقات

ملاحظة: يركز هذا البروتوكول على إجراء إعداد واستحواذ التصوير متعدد الوسائط الخالي من الملصقات.

  1. إعداد المجهر متعدد الوسائط (الشكل 1 أ) ومعايرة النظام
    1. قم بتسخين الليزر وانتظر حوالي 15-20 دقيقة.
    2. قم بتشغيل وحدات التحكم والشاشات بالتسلسل التالي: صندوق التحكم | وحدة تحكم في لوحة اللمس | محول التيار المتردد لمحول التيار المتردد عن بعد بالليزر الرئيسي لجهاز التحكم عن بعد بالليزر الفرعي.
    3. قم بتشغيل كاشف الثنائي الضوئي Si ومكبر للصوت.
    4. قم بتكوين أشعة الليزر للمضخة وشعاع ستوكس. قم بإعداد نظام الليزر بشعاع مضخة قابل للضبط من 780 نانومتر إلى 990 نانومتر ، وعرض نبضة 5-6 ps ، ومعدل تكرار 80 ميجاهرتز. شعاع ليزر ستوكس له طول موجي ثابت يبلغ 1,031 نانومتر مع نبضة 6 ps ومعدل تكرار 80 ميجاهرتز . تأكد من أن كل من المضخة وعوارض Stokes منخفضة الطاقة (20 ميجاوات على الأقل) لتكون مرئية على لوحة المحاذاة.
    5. ضع لوحة محاذاة واحدة في المسار البصري (مباشرة بعد صندوق الليزر) للتحقق من التداخل المكاني للمضخات وحزم Stokes وضبط المرآة حتى تتداخل كلتا النقطتين في وسط لوحة المحاذاة.
      ملاحظة: على الرغم من أن المضخات وحزم ستوكس متداخلة تقريبا ، إلا أن الضبط الدقيق للتداخل المكاني لشعاعي ليزر يمكن أن يحقق إشارة SRS المثلى.
    6. بعد التداخل المكاني ، قم بالضبط الدقيق مع PSD (كاشف حساس للموضع) بالنقر أولا على برنامج التحكم OPO . استخدم المفتاح السداسي لضبط المرآة البصرية 1 (OM1) بعناية ومشاهدة شاشة PSD لتغيير موضع XY لاستهداف الحد الأدنى من الانحراف عن المركز. بعد ذلك ، لإجراء تعديلات أكثر دقة ، استخدم المفتاح السداسي العشري على المرآة البصرية 2 (OM2) حتى يتم توسيط مؤشر الموضع على شاشة PSD.
      ملاحظة: OM1 و OM2 مرآتان في رأس OPO لضبط محاذاة الليزر.
    7. أخيرا ، قم بتوسيط المكثف عن طريق تدوير المسمارين لتوسيط المكثف لتحريك صورة غشاء القزحية إلى مركز مجال الرؤية.
      ملاحظة: يمكن أن يحد غشاء القزحية الميداني من قطر شعاع الضوء الذي يدخل الهدف وبالتالي يستبعد الضوء الدخيل ، مما يحسن تباين الصورة.
  2. خطوات الحصول على التصوير متعدد الوسائط بدون ملصقات
    1. ضع الزيت على مكثف الزيت ذو الفتحة العددية العالية (1.4 NA) وقم بتركيب شريحة المجهر على المكثف المزيت. أخيرا ، ضع قطرة ماء كبيرة على شريحة المجهر لهدف الماء 25x. تأكد من أن المجهر مثبت بإحكام وغير متحرك ثم اضبط المرحلة z لضبط التركيز البؤري حتى يمكن رؤية صورة المجال الساطع للعينة البيولوجية تحت هدف الماء 25x.
    2. ابدأ عملية التصوير بالتسلسل الصحيح: MPF و SHG و SRS لتجنب التبييض الضوئي ، مما سيؤثر على جودة الصورة والتحليل الدقيق ل MPF. للتبديل بين MPF و SHG بسرعة ، قم بالتبديل من شعاع المضخة إلى شعاع Stokes الثابت.
      ملاحظة: يمكن أن يستغرق ضبط ليزر المضخة من 800 نانومتر (التألق الذاتي NADH و FAD) إلى 791.3 نانومتر (إزاحة CH3 Raman) 1-2 دقيقة.
    3. حدد دقة الصورة (512 × 512 بكسل) ووقت المكوث المناسب لكل طريقة. استخدم 8 ميكرو ثانية / بكسل ل MPF و SHG بمتوسط إطار أعلى من 3. استخدم 40 ميكرو ثانية / بكسل مع متوسط الإطار 2 لطريقة SRS.
      ملاحظة: متوسط الإطار يعني عدد الصور التي سيتم حساب متوسطها قبل الحفظ.
    4. للحصول على التألق الذاتي باستخدام MPF ، قم بإيقاف تشغيل شعاع ليزر Stokes وضبط ليزر المضخة على 800 نانومتر للحصول على NADH و flavin المثيرين. قم بتثبيت مكعب مرشح FVOPT في مسار الضوء مع 460 ± 10 نانومتر و 515 ± 10 نانومتر ل NADH و flavin ، على التوالي. وبالتالي فإن القوة على العينة تقريبا 15 [مو].
    5. احصل على إشارة ألياف الكولاجين باستخدام SHG. قم بإيقاف تشغيل شعاع ليزر المضخة ، واستخدم فقط شعاع ليزر stokes ، واضبط الطاقة على 500 ميجاوات. احصل فقط على القناة المتعلقة بمرشح 515 نانومتر.
    6. الحصول على التوزيع المكاني للبروتينات والدهون باستخدام SRS. حافظ على كل من حزم الليزر واضبط تردد شعاع الليزر ليتناسب مع الوضع الاهتزازي المحدد لكل جزيء.
      ملاحظة: عادة ، يتم استخدام 791.3 نانومتر ل CH3 ، و 797 نانومتر ل CH2 ، و 787 نانومتر للدهون غير المشبعة ، و 794.6 للدهون المشبعة. وبالتالي فإن القوة على العينة حوالي 40 [مو].
    7. للحصول على مجموعات بيانات الصور الفائقة الطيفية SRS ، افتح برنامج التحكم OPO لتحديد المسح ، واضبط نطاق الطول الموجي من 780 نانومتر إلى 806.5 نانومتر ، واختر رقم مكدس لا يقل عن 60. ثم التقط مكدس الصور الفائق الطيفي.
      ملاحظة: تحتوي مجموعة البيانات الناتجة على 60 صورة ، تمثل كل منها التوزيع المكاني عند تحول رامان محدد (من 2,700 سم -1 إلى 3,150 سم -1). يعتمد وقت الحصول على الطيف الفائق على مجال الرؤية (FOV) للصورة ووقت المسح الضوئي ولكنه سيكون ما بين 5 دقائق و 8 دقائق تقريبا لصورة 512 × 512. بالنسبة للصور الأكبر حجما ، يجب توخي الحذر لتقليل المدة تحت الليزر لمنع أي تلف ضوئي ، والذي يمكن أن يحدث بعد ساعتين (اعتمادا على سمك العينة وحجم مجال الرؤية).
    8. احفظ جميع الصور من نفس مناطق الاهتمام (ROIs) في نفس المجلد. تنسيق الصورة هو ملف Olympus .oir.

2. تحليل الصور

  1. استخدم برنامج معالجة الصور لفتح جميع الصور الأولية المحفوظة لتعيين اللون وإضافة شريط المقياس لعرض الصورة. استخدمه أيضا لإنشاء القناع الثنائي ل NADH والأحماض الدهنية المشبعة (SFAs ، 2،880 سم -1) لنسبة الأكسدة والاختزال البصرية وتحليل عدم تشبع الدهون.
    ملاحظة: تأكد من أن شدة القناع تحتوي على 0 و 1 فقط.
  2. استخدم البرنامج النصي python المصمم محليا لإجراء أي تحليل نهائي (الكود متاح في https://github.com/lingyanshi2020/HSI_Analysis).
    ملاحظة: تم تصميم هذا البرنامج النصي لمعالجة مناطق متعددة ذات أهمية (ROIs) من كل من عينات التحكم والسرطان. تتطلب الوظيفة الرئيسية للبرنامج النصي مدخلين فقط: مسارات الملفات لمجلدات التحكم وصور السرطان.
    1. كرر من خلال المجلدات ، ومطابقة الصور بنفس الاسم الأساسي (على سبيل المثال ، "roi_1_flavin.tif" و "roi_1_nadh.tif" و "roi1_mask.tif").
    2. لكل مجموعة من الصور المتطابقة ، دع البرنامج النصي يقوم بإجراء تحليل القياس النسبي وإنشاء صور نسبية قياسية جديدة بناء على هذه العمليات الحسابية.
      يتم حساب نسبة الأكسدة والاختزال البصرية على أنها فلافين / (NADH + فلافين).
      يتم حساب عدم تشبع الدهون على النحو التالي: USFAs / (SFAs + USFAs) حيث تمثل USFAs الأحماض الدهنية غير المشبعة.
    3. ثم يتم تخزين جميع القيم النسبية من الصور في إطار بيانات الباندا لسهولة التلاعب. قم بإجراء ANOVA أحادي الاتجاه واستخدم matplotlib مع styple "ggplot" أو seaborn للقيام بقطعة شريطية أو boxplot للقياس الكمي.
    4. استخدم الصور 2,930 سم -1 (CH3) و 2,850 سم -1 (CH2) لإنشاء صورة مطروحة (CH3 -CH 2). بعد ذلك ، امزج صورة CH2 CH3 - CH2 في مساحة ألوان RGB مع جدول بحث مخصص يحاكي تلطيخ H & E لإنشاء صورة الأنسجةالرقمية 46.
  3. بعد الحصول على صور SRS الفائقة الطيفية ، استخدم نص python المبني محليا للقيام بتجميع k-means لتقسيم الصور بناء على أوجه التشابه الطيفية (الكود متاح في https://github.com/lingyanshi2020/HSI_Analysis).
    1. قم بتحميل مكدسات الصور .tiff باستخدام حزمة tifffile. أعد تشكيل مكدس الصور الفائق الطيفي SRS (x ، y ، الأطياف) إلى مصفوفة ثنائية الأبعاد (وحدات البكسل ، الأطياف).
    2. استخدم حزمة scikit-learn لنشر خوارزمية k-means إلى هذه المصفوفة ثنائية الأبعاد، مع العدد المحدد من المجموعات.
    3. أعد تشكيل تسميات نظام المجموعة الناتجة مرة أخرى إلى أبعاد الصورة الأصلية، وإنشاء خريطة تجزئة.
    4. قم بتعيين ألوان فريدة لكل مجموعة ، مما يؤدي إلى إنشاء صورة بألوان زائفة تمثل تركيبات كيميائية حيوية مختلفة داخل الأنسجة.
    5. استخدم matplotlib لرسم أطیف كل مجموعة بقيمة متوسطة (خط متصل) والانحراف المعياري (منطقة الظل)
    6. اتبع بروتوكول بروتوكول مطابقة المرجع المرجعي المعاقب SRS (PRM-SRS) باستخدام MATLAB لإنشاء الكشف عن النوع الفرعي للدهون الخالي من التسمية المكانية باستخدام مجموعات بيانات الصور الفائقة الطيفية SRS47.
    7. قم بتنظيم الصور وحفظها بتنسيق 300 نقطة في البوصة .tif.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمثل الصور الواردة في الشكل 2 النتائج التي تم الحصول عليها من اتباع بروتوكول الحصول على التألق الذاتي ل FAD و NADH بالإضافة إلى قنوات SRS الأربع للبروتين والدهون الكلية والدهون غير المشبعة والدهون المشبعة. هنا نقوم أيضا بإنشاء صورة نسيجية زائفة كما هو موضح في البروتوكول من خلال مزج ألوان RGB. يوفر الحصول على قنوات MPF و SRS ملفات الصور التي سيتم استخدامها لاحقا في التحليل النسبي. يمكن رؤية مثال على هذا التحليل في الشكل 3 على أنسجة الرئة البشرية. بعد الحصول على ا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هذا النظام متعدد الوسائط هو منصة تصوير قوية لالتقاط تصور شامل للبيئة الجزيئية للعينات عبر مجموعة واسعة من الأصول البيولوجية والظروف المرضية. تكمن ميزة الاستفادة من الطرائق المختلفة الخالية من الملصقات في القدرة على الحصول على معلومات تكميلية واستهداف تحليلات محددة قد تكون صعبة أو مستحيلة في تقنية تصوير واحدة خالية من الملصقات. على وجه التحديد ، تسمح تقنيات التصوير غير الخطية الثلاث (SRS ، MPF ، SHG) المذكورة في هذه الورقة بالقياس الكمي لتكوين الجزيئات الكبيرة ، وديناميكيات الطاقة عبر نسب...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإعلان عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر الدكتورة غلوريا بريهوبر وأعضاء فريق HuBMAP على توفير شرائح أنسجة الرئة البشرية. نشكر الدكتور كون تشانغ على توفير أنسجة المخ البشري. نشكر أيضا الدكتور جنرال شنغ فنغ على تقديم عينات من كبد الفأر. نحن نقدر الدعم من NIHU54DK134301 ، R01GM149976 المعاهد الوطنية للصحة ، U01AI167892 المعاهد الوطنية للصحة ، R01HL170107 المعاهد الوطنية للصحة ، المعاهد الوطنية للصحة 5R01NS111039 ، المعاهد الوطنية للصحة R21NS125395 ، المعاهد الوطنية للصحة U54CA132378 ، صناديق بدء التشغيل في جامعة كاليفورنيا في سان ديسكو ، جائزة زميل أبحاث سلون ، وجائزة CZI DAF2023-328667.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
460 نانومتر مكعب تصفيةأوليمبوسOCT-ET 460 / 50M32
مرشح ممر النطاقالترددي KR ElectronicsKR27248 ميجا هرتز
BNC 50 أوم Terminatorالدوائر الصغيرةSTRM-50
DC مزود الطاقةTopWard6302D
ثنائي اللون جبلThorlabsKM100CL
FIJI ImageJImageJ
مكثف الزيت عالي NAأوليمبوس6-U130
مرشح ممر عالي ODThorlabs950 نانومتر
مجهر المسح الضوئي بالليزر المقلوبأوليمبوسFV1200MPE
مكبر للصوتزيورخ إنسترولز
بيكو نظام ليزر الزمردالفيزياء التطبيقية & شركة الإلكترونيات  شعاع المضخة النبضية المتزامنة (قابل للضبط 720 & ndash; 990 & thinsp ؛ الطول الموجي نانومتر ، 5 & ndash ؛ 6 & thinsp ؛ عرض النبض PS ، و 80 & thinsp ؛ معدل تكرار MHz) و Stokes (الطول الموجي عند 1032 & thinsp ؛ نانومتر ، 6 & thinsp ؛ عرض النبض PS ، و 80 & thinsp ؛ معدل التكرار ميغاهيرتز)
كاشف الصمام الثنائي الضوئي SIالمصنوعة منزليا
Olympus
VF-300 Compresstome  ؛دقيق
وحدة تحكم لوحة اللمس

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wollman, A. J. M., Nudd, R., Hedlund, E. G., Leake, M. C. From Animaculum to single molecules: 300 years of the light microscope. Open Biol. 5 (4), 150019(2015).
  2. Vicidomini, G., Bianchini, P., Diaspro, A. STED super-resolved microscopy. Nat Methods. 15 (3), 173-182 (2018).
  3. Weber, M., et al. MINSTED fluorescence localization and nanoscopy. Nat Photonics. 15 (5), 361-366 (2021).
  4. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. , (1990).
  5. Hell, S. W., et al. Three-photon excitation in fluorescence microscopy. J Biomed Optics. 1 (1), 71-74 (1996).
  6. Alhallak, K., Rebello, L. G., Muldoon, T. J., Quinn, K. P., Rajaram, N. Optical redox ratio identifies metastatic potential-dependent changes in breast cancer cell metabolism. Biomed Opt Express. 7 (11), 4364-4374 (2016).
  7. Pena, A. -M., et al. Multiphoton FLIM imaging of NADH and FAD to analyze cellular metabolic activity of reconstructed human skin in response to UVA light. Multiphoton Microscopy in the Biomedical Sciences XIX. 10882, 23-33 (2019).
  8. Hu, L., Wang, N., Cardona, E., Walsh, A. J. Fluorescence intensity and lifetime redox ratios detect metabolic perturbations in T cells. Biomed Opt Express. 11 (10), 5674-5688 (2020).
  9. Chance, B., Schoener, B., Oshino, R., Itshak, F., Nakase, Y. Oxidation-reduction ratio studies of mitochondria in freeze-trapped samples. NADH and flavoprotein fluorescence signals. J Biol Chem. 254 (11), 4764-4771 (1979).
  10. Ostrander, J. H., et al. Optical redox ratio differentiates breast cancer cell lines based on estrogen receptor status. Cancer Res. 70 (11), (2010).
  11. Skala, M. C., et al. In vivo multiphoton microscopy of NADH and FAD redox states, fluorescence lifetimes, and cellular morphology in precancerous epithelia. Proc Natl Acad Sci USA. 104 (49), 19494-19499 (2007).
  12. Varone, A., et al. Endogenous two-photon fluorescence imaging elucidates metabolic changes related to enhanced glycolysis and glutamine consumption in precancerous epithelial tissues. Cancer Res. 74 (11), 3067-3075 (2014).
  13. Malak, M., James, J., Grantham, J., Ericson, M. B. Contribution of autofluorescence from intracellular proteins in multiphoton fluorescence lifetime imaging. Sci Rep. 12, 16584(2022).
  14. Blacker, T. S., Duchen, M. R. Investigating mitochondrial redox state using NADH and NADPH autofluorescence. Free Radic Biol Med. 100, 53-65 (2016).
  15. Roth, S., Freund, I. Second harmonic generation in collagen. J Chem Phys. 70 (4), 1637-1643 (1979).
  16. Freund, I., Deutsch, M. Second-harmonic microscopy of biological tissue. Opt Lett. 11 (2), 94(1986).
  17. Boyd, R. W., Gaeta, A. L., Giese, E. Nonlinear optics. Springer Handbook of Atomic, Molecular, and Optical Physics. Drake, G. W. F. , Springer. 1097-1110 (2023).
  18. Aghigh, A., et al. Second harmonic generation microscopy: a powerful tool for bio-imaging. Biophys Rev. 15 (1), 43-70 (2023).
  19. Mohler, W., Millard, A. C., Campagnola, P. J. Second harmonic generation imaging of endogenous structural proteins. Methods. 29 (1), 97-109 (2003).
  20. Cox, G. Biological applications of second harmonic imaging. Biophys Rev. 3 (3), 131(2011).
  21. Brown, E., et al. Dynamic imaging of collagen and its modulation in tumors in vivo using second-harmonic generation. Nat Med. 9 (6), 796-800 (2003).
  22. Keikhosravi, A., Bredfeldt, J. S., Sagar, A. K., Eliceiri, K. W. Chapter 28 - Second-harmonic generation imaging of cancer. Methods Cell Bio. 123, 531-546 (2014).
  23. Hui Mingalone, C. K., et al. Bioluminescence and second harmonic generation imaging reveal dynamic changes in the inflammatory and collagen landscape in early osteoarthritis. Lab Invest. 98 (5), 656-669 (2018).
  24. Tsafas, V., et al. Polarization-dependent second-harmonic generation for collagen-based differentiation of breast cancer samples. J Biophotonics. 13 (10), e202000180(2020).
  25. Nadiarnykh, O., LaComb, R. B., Brewer, M. A., Campagnola, P. J. Alterations of the extracellular matrix in ovarian cancer studied by Second Harmonic Generation imaging microscopy. BMC Cancer. 10, 94(2010).
  26. Xiong, S. Y., Yang, J. G., Zhuang, J. Nonlinear spectral imaging of human normal skin, basal cell carcinoma and squamous cell carcinoma based on two-photon excited fluorescence and second-harmonic generation. Laser Phys. 21 (10), 1844-1849 (2011).
  27. Tilbury, K., Campagnola, P. J. Applications of second-harmonic generation imaging microscopy in ovarian and breast cancer. Perspect Medicin Chem. 7, 21-32 (2015).
  28. Raman, C. V., Krishnan, K. S. A New type of secondary radiation. Nature. 121 (3048), 501-502 (1928).
  29. Eckhardt, G., et al. Stimulated Raman scattering from organic liquids. Phys Rev Lett. 9 (11), 455-457 (1962).
  30. Freudiger, C. W., et al. Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy. Science. 322 (5909), 1857-1861 (2008).
  31. Li, Y., et al. Microglial lipid droplet accumulation in tauopathy brain is regulated by neuronal AMPK. Cell Metab. 36 (6), 1351-1370.e8 (2024).
  32. Lu, F. -K., et al. Label-free neurosurgical pathology with stimulated Raman imaging. Cancer Res. 76 (12), 3451-3462 (2016).
  33. Shi, L., et al. Optical imaging of metabolic dynamics in animals. Nat Commun. 9 (1), 2995(2018).
  34. Zhang, L., et al. Spectral tracing of deuterium for imaging glucose metabolism. Nat Biomed Eng. 3 (5), 402-413 (2019).
  35. Li, Y., et al. Bioorthogonal stimulated Raman scattering imaging uncovers lipid metabolic dynamics in Drosophila brain during aging. GEN Biotechnol. 2 (3), 247-261 (2023).
  36. Li, X., et al. Quantitative imaging of lipid synthesis and lipolysis dynamics in Caenorhabditis elegans by stimulated Raman scattering microscopy. Anal Chem. 91 (3), 2279-2287 (2019).
  37. Ji, M., et al. Detection of human brain tumor infiltration with quantitative stimulated Raman scattering microscopy. Sci Transl Med. 7 (309), 309ra163(2015).
  38. Ji, M., et al. Rapid, label-free detection of brain tumors with stimulated Raman scattering microscopy. Sci Transl Med. 5 (201ra119), 201ra119(2013).
  39. You, S., et al. Intravital imaging by simultaneous label-free autofluorescence-multiharmonic microscopy. Nat Commun. 9, 2125(2018).
  40. You, S., et al. Label-free deep profiling of the tumor microenvironment. Cancer Res. 81 (9), 2534-2544 (2021).
  41. Jermyn, M., et al. Highly accurate detection of cancer in situ with intraoperative, label-free, multimodal optical spectroscopy. Cancer Res. 77 (14), 3942-3950 (2017).
  42. Pshenay-Severin, E., et al. Multimodal nonlinear endomicroscopic imaging probe using a double-core double-clad fiber and focus-combining micro-optical concept. Light Sci Appl. 10 (1), 207(2021).
  43. Wu, W., Li, X., Qu, J. Y., He, S. In vivo imaging of biological tissues with combined two-photon fluorescence and stimulated Raman scattering microscopy. J Vis Exp. (178), e63411(2021).
  44. Li, X., Jiang, M., Lam, J. W. Y., Tang, B. Z., Qu, J. Y. Mitochondrial imaging with combined fluorescence and stimulated Raman scattering microscopy using a probe of the aggregation-induced emission characteristic. J Am Chem Soc. 139 (47), 17022-17030 (2017).
  45. Li, Z., et al. Multimodal imaging of metabolic activities for distinguishing subtypes of breast cancer. Biomed Opt Express. 14 (11), 5764-5780 (2023).
  46. Fung, A. A., et al. Label-free optical biopsy reveals biomolecular and morphological features of diabetic kidney tissue in 2D and 3D. , (2024).
  47. Zhang, W., et al. Multi-molecular hyperspectral PRM-SRS microscopy. Nat Commun. 15 (1), 1599(2024).
  48. Xu, F. X., et al. Discrimination of lipid composition and cellular localization in human liver tissues by stimulated Raman scattering microscopy. J Biomed Opt. 29 (1), 016008(2024).
  49. Zoumi, A., Yeh, A., Tromberg, B. J. Imaging cells and extracellular matrix in vivo by using second-harmonic generation and two-photon excited fluorescence. Proc Natl Acad Sci USA. 99 (17), 11014-11019 (2002).
  50. Liaudanskaya, V., et al. Mitochondria dysregulation contributes to secondary neurodegeneration progression post-contusion injury in human 3D in vitro triculture brain tissue model. Cell Death Dis. 14 (8), 1-15 (2023).
  51. Walsh, A. J., et al. Optical metabolic imaging identifies glycolytic levels, sub-types and early treatment response in breast cancer. Cancer Res. 73 (20), 6164-6174 (2013).
  52. Conklin, M. W., et al. Aligned collagen is a prognostic signature for survival in human breast carcinoma. Am J Pathol. 178 (3), 1221-1232 (2011).
  53. Sun, W., et al. Nonlinear optical microscopy: use of second harmonic generation and two-photon microscopy for automated quantitative liver fibrosis studies. J Biomed Optics. 13 (6), 064010(2008).
  54. Nejim, Z., Navarro, L., Morin, C., Badel, P. Quantitative analysis of second harmonic generated images of collagen fibers: a review. Res Biomed Eng. 39 (1), 273-295 (2023).
  55. Burke, K., Brown, E. The use of second harmonic generation to image the extracellular matrix during tumor progression. Intravital. 3 (3), e984509(2015).
  56. Balasubramanian, P., Prabhakaran, M. P., Sireesha, M., Ramakrishna, S. Collagen in human tissues: Structure, function, and biomedical implications from a tissue engineering perspective. Polymer Composites - Polyolefin Fractionation - Polymeric Peptidomimetics - Collagens. Abe, A., Kausch, H. H., Möller, M., Pasch, H. 251, 173-206 (2012).
  57. Dadsena, S., et al. Lipid unsaturation promotes BAX and BAK pore activity during apoptosis. Nat Commun. 15, 4700(2024).
  58. Barelli, H., Antonny, B. Lipid unsaturation and organelle dynamics. Curr Opin Cell Biol. 41, 25-32 (2016).
  59. Harayama, T., Antonny, B. Beyond fluidity: The role of lipid unsaturation in membrane function. Cold Spring Harb Perspect Biol. 15 (7), a041409(2023).
  60. Yoon, H., Shaw, J. L., Haigis, M. C., Greka, A. Lipid metabolism in sickness and in health: Emerging regulators of lipotoxicity. Mol Cell. 81 (18), 3708-3730 (2021).
  61. Villazon, J., Shi, L. Utilizing K-means clustering on hyperspectral DO-SRS images of the mouse hippocampus. CLEO 2024, Technical Digest Series. , Optica Publishing Group. (2024).
  62. Fu, D., et al. Quantitative chemical imaging with multiplex stimulated Raman scattering microscopy. J Am Chem Soc. 134 (8), 3623-3626 (2012).
  63. Periasamy, A., Diaspro, A. Special section guest editorial: Multiphoton microscopy. J Biomed Optics. 8 (3), 327(2003).
  64. Lakowicz, J. R., Szmacinski, H., Nowaczyk, K., Johnson, M. L. Fluorescence lifetime imaging of free and protein-bound NADH. Proc Natl Acad Sci USA. 89 (4), 1271-1275 (1992).
  65. Blacker, T. S., et al. Separating NADH and NADPH fluorescence in live cells and tissues using FLIM. Nat Commun. 5, 3936(2014).
  66. Xiong, H., et al. Background-free imaging of chemical bonds by a simple and robust frequency-modulated stimulated Raman scattering microscopy. Opt Express. 28 (10), 15663-15677 (2020).
  67. Georgakoudi, I., Quinn, K. P. Label-free optical metabolic imaging in cells and tissues. Annu Rev Biomed Eng. 25, 413-443 (2023).
  68. Alam, S. R., Wallrabe, H., Christopher, K. G., Siller, K. H., Periasamy, A. Characterization of mitochondrial dysfunction due to laser damage by 2-photon FLIM microscopy. Sci Rep. 12 (1), 11938(2022).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة