مقالة منهجية

الكشف القائم على التألق لنشاط نوكلياز FEN1 وفحص مثبطات الجزيئات الصغيرة

DOI:

10.3791/67968

⸱

يونيو 27, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Chemistry and Life Sciences, Suzhou University of Science and Technology, 2Jiangsu Province Engineering Research Center of Molecular Target Therapy and Companion Diagnostics in Oncology, Suzhou Vocational Health College, 3Jiangsu Province Engineering Research Center of Development and Translation of Key Technologies for Chronic Disease Prevention and Control, Suzhou Vocational Health College

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول الاختبار الكيميائي الحيوي لتحول الهلام لقياس نشاط FEN1 (Flap Endonuclease 1) وتطور المثبطات.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

FEN1 (Flap Endonuclease 1) هو نوكلياز رئيسي للحمض النووي يشارك في تكرار الحمض النووي وإصلاح التلف ، ويلعب دورا مهما في الحفاظ على الاستقرار الجيني. ترتبط المستويات المرتفعة من نشاط FEN1 ارتباطا وثيقا بتطور أنواع مختلفة من السرطانات ، مما يجعل FEN1 مؤشرا حيويا معترفا به وهدفا دوائيا لسرطانات الرئة والثدي والبروستاتا. تمثل طرق وضع العلامات التقليدية على النظائر المشعة للكشف عن نشاط نوكلياز FEN1 تحديات من حيث الراحة والسلامة. في هذه الدراسة ، تم تصنيع ركيزة جزء من الحمض النووي بهيكل رفرف في المختبر. تم تمييز هذه الركيزة بفلوروفور في نهاية 5 بوصات من السديلة ، مما يسمح لنوكلياز FEN1 بالتعرف على الموقع المحدد وشقه على وجه التحديد. ثم تم تحديد نشاط FEN1 عن طريق الكشف عن إشارة الفلوروفور بعد الرحلان الكهربائي للهلام. تتيح هذه الطريقة التقييم السريع والفعال لنشاط نوكلياز FEN1 وفحص مثبطاته. يوفر نهجا حساسا ومحددا لتحليل نشاط FEN1 وتقييم فعالية مثبطات الجزيئات الصغيرة. علاوة على ذلك ، فإنه يساهم بشكل كبير في البحث عن إصلاح تلف الحمض النووي وتطوير السرطان ، ويقدم استراتيجية جديدة للبحث السريري حول آليات المرض والكشف عن المواد السامة للجينات.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لا يكون تكرار الحمض النووي دائما خاليا من العيوب ويمكن أن يتعطل بسبب العوامل الداخلية والخارجية. وبالتالي ، فإن آليات تكرار الحمض النووي وإصلاح الضرر ضرورية لبقاء الخلية واستقرار الجينوم. في هذه العملية ، يلعب نوكلياز داخلي FEN1 الخاص بالهيكل المتفرع البشري FEN1 (نوكلياز السديلة 1) ، وهو نوكلياز الحمض النووي الأساسي ، دورا حاسما1،2،3.

يشارك FEN1 بشكل أساسي في تكرار الحمض النووي ولا غنى عنه لنضج شظايا أوكازاكي على الخيط المتأخر4،5. هذا يضمن التقدم الفعال لتكرار الحمض النووي والإصلاح الدقيق للحمض النووي التالف. ومع ذلك ، فقد ارتبطت الزيادات غير الطبيعية في مستويات FEN1 ارتباطا وثيقا بتطور أنواع مختلفة من السرطانات6،7 ، مثل سرطان الرئة والثدي7. وبالتالي ، فإن FEN1 ليس ضروريا فقط لتكرار الحمض النووي وإصلاحه ولكنه حظي أيضا باهتمام كبير كمؤشر حيوي لتشخيص السرطان وهدف علاجي محتمل8،9. يعد الكشف عن نشاط FEN1 ضروريا للتشخيص المبكر للسرطانات وللنهوض بالأبحاث حول العلاجات المستهدفة.

نظرا لأهمية FEN1 ، والحاجة إلى دراسة نشاطه للتشخيص المبكر للسرطان وتطوير العلاج الموجه ، كان الهدف الأساسي للطريقة التي تم تطويرها في هذه التجربة هو قياس نشاط نوكلياز FEN1 بدقة وكفاءة. تهدف هذه الطريقة إلى توفير منصة موثوقة لفحص مثبطات الجزيئات الصغيرة التي تستهدف FEN1. من خلال تحقيق هذه الأهداف ، تسعى الدراسة إلى المساهمة في فهم أفضل لدور FEN1 في السرطان وتسهيل اكتشاف استراتيجيات علاجية جديدة.

توجد العديد من التقنيات للكشف عن نشاط نوكلياز FEN1 ، ولكل منها خصائص ومبادئ ومزايا وقيود وسيناريوهات قابلة للتطبيق. على سبيل المثال ، توفر طرق فصل الركيزة الهلامية وفصلها القائم على HPLC نتائج بديهية ولكنها تنطوي على إجراءات مرهقة وإنتاجية منخفضة10،11. تواجه فحوصات الاستقطاب الفلوري (FP) تحديات في تقييم نشاط FEN1 بسبب التداخل من التألق الذاتي المركب أو تشتت الضوء ، مما يؤثر على إشارات FP. على الرغم من أن استراتيجيات الفحص المضاد يمكن أن تستبعد جزئيا الإيجابيات الكاذبة ، إلا أن ما يقرب من 15٪ من المركبات النشطة الأولية لا تزال غير محددة بشكل خاطئ بسبب التداخلالتقني 12. يمثل الاستخدام المشترك لأزواج المانحين / المرويين الفلورية (على سبيل المثال ، TAMRA / BHQ-2) و AlphaScreen التلألؤ الكيميائي عيوبا ، مثل تكلفة التوليف العالية للركائز الفلورية المعقدة ثلاثية الرفرف ، ولا سيما الحد من فائدتها في الفحص على نطاق واسع. علاوة على ذلك ، قد يعيق هيكل الرفرف المزدوج للركائز الارتباط الأمثل ب FEN1 ، مما يقلل من كفاءة الانقسام الأنزيمي ويعرض حساسية الكشف للخطر. بالإضافة إلى ذلك ، يعتمد هذا النهج بشكل كبير على الأدوات المتخصصة (على سبيل المثال ، ViewLux و EnVision) ، مما يحد من اعتماده في المختبرات المحدودة الموارد13 ، 14 ، 15. تعاني طرق الكشف عن الفلورسنت القائمة على مجسات الحمض النووي النانوية على شكل دمبل مزدوجة الرفرف والتي تعمل باستخدام العناقيد النانوية الفضية (DNA-AgNCs) من تباين دفعة إلى أخرى بسبب اعتمادها على التلدين الدقيق وخطوات التنوي في الموقع ، مما يعيق قابلية التكاثر وقابلية التوسع. التكاليف المرتفعة والإجراءات الطويلة تحد من تطبيقهاالعملي 16.

في هذه المقالة ، تم تطوير اختبار قائم على وضع العلامات على التألق لمعالجة القيود التقنية الحالية وتلبية الطلب المتزايد على طرق أكثر أمانا ويمكن للمستخدم الوصول إليها لدراسة نشاط FEN1. تستفيد هذه التقنية من الخصوصية والحساسية العالية للكشف عن التألق ، فضلا عن القدرة على هندسة ركائز الحمض النووي بهياكل محددة يمكن التعرف عليها وشقها بواسطة FEN1 (الشكل 1). تعمل هذه الطريقة على تبسيط الإجراءات التجريبية مع الحفاظ على دقة عالية في تقييم نشاط نوكلياز FEN1. بالمقارنة مع الرحلان الكهربائي الهلامي التقليدي والتقنيات القائمة على HPLC ، فإنه يوفر تشغيلا مبسطا وتحولا أسرع. على عكس فحوصات الاستقطاب الفلوري ، يتيح هذا النهج الفحص النوعي السريع للمركبات ، مما يضع استراتيجية فعالة للتقييم الأنزيمي الأولي.

هذه الطريقة مناسبة لدراسة نشاط نوكلياز FEN1 في البيئات المختبرية حيث يكون الوصول إلى المواد المشعة محدودا. كما أنها مناسبة تماما لفحص عدد كبير من مثبطات الجزيئات الصغيرة في وقت قصير نسبيا ، خاصة عندما تكون هناك حاجة إلى حساسية وخصوصية عالية. ومع ذلك ، فهي ليست مثالية للدراسات التي تتطلب القياس الكمي المطلق بدقة عالية جدا أو للمختبرات التي تفتقر إلى معدات الكشف عن التألق الأساسية والخبرة في تحليل إشارات التألق. بالنسبة للدراسات التي تركز على التطبيقات في الجسم الحي - حيث قد يتأثر سلوك FEN1 بعوامل بيولوجية معقدة لا يتم تكرارها في تصميمات الفحص الحالي في المختبر - قد يكون من الضروري إجراء مزيد من التحسين أو الطرق البديلة.

يعد اختبار التألق هذا حساسا ومحددا للغاية ، مما يوفر أداة آمنة ومريحة وفعالة لدراسة نشاط FEN1 وتطوير مثبطاته.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكواشف والمعدات المستخدمة في هذه الدراسة مدرجة في جدول المواد.

1. تنقية تعبير بروتين FEN1

  1. تنقية البروتين
    1. قم بإزالة المخزون البكتيري الذي يحتوي على البلازميد المستهدف (انظر جدول المواد) من -80 درجة مئوية. قم بإذابة الثلج في درجة حرارة الغرفة وتلقيح 200 ميكرولتر من أنابيب الطرد المركزي الدقيقة المجمدة سعة 1.5 مل في وسط 20 مل رطل يحتوي على 50 ميكروغرام / مل كاناميسين باستخدام طرف ماصة 200 ميكرولتر.
      ملاحظة: السلالة هي الإشريكية القولونية BL21 (DE3) -FEN1.
    2. احتضان عند 37 درجة مئوية مع الاهتزاز عند 160 دورة في الدقيقة لمدة 12 ساعة.
    3. انقل المعلق البكتيري إلى قارورة إرلينماير سعة 200 مل تحتوي على وسط LB مكمل ب 50 ميكروغرام / مل كاناميسين. استمر في الحضانة عند 37 درجة مئوية مع الاهتزاز عند 160 دورة في الدقيقة لمدة 2-3 ساعات.
    4. عندما يصل OD600 من المزرعة إلى حوالي 0.6 ، أضف 2 مل من IPTG (التركيز النهائي: 1 ملي). استمر في الحضانة عند 25 درجة مئوية ، 160 دورة في الدقيقة لمدة 10 ساعات.
    5. انقل المزرعة المستحثة إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل موزن مسبقا. جهاز طرد مركزي عند 4 درجات مئوية و 2500 × جم لمدة 15 دقيقة. تخلص من المادة الطافية. قم بوزن الأنبوب المحتوي على الحبيبات واطرح وزن الأنبوب الفارغ لحساب كتلة الحبيبات.
    6. أضف 7 مل من المخزن المؤقت للتحلل لكل جرام من حبيبات الخلية الرطبة. استخدم ماصة لإعادة تعليق الحبيبات تماما عن طريق سحب العينة لأعلى ولأسفل.
      ملاحظة: يحتوي المخزن المؤقت للتحلل (إجمالي 10 مل) على 20 ملي مولار من Tris-HCl و 250 ملي مولار من كلوريد الصوديوم و 2٪ Triton X-100 و ddH2O. قم بتنفيذ هذه الخطوة في غطاء الدخان لضمان التعامل الآمن مع الكواشف الكيميائية.
    7. انقل المعلق البكتيري في محلول التحلل إلى فريزر -80 درجة مئوية وقم بتجميده طوال الليل. في اليوم التالي ، قم بإذابة التعليق على شاكر 4 درجات مئوية لمدة 1 ساعة لتعزيز كفاءة التحلل.
    8. خلايا Lyse باستخدام الموجات فوق الصوتية بقوة 75٪ لمدة 45 دقيقة. جهاز الطرد المركزي المحللة عند 12,000 × جم لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية لفصل المادة الطافية عن الحبيبات.
      ملاحظة: إذا ظل المحلل عكرا ، فقم بزيادة حجم المخزن المؤقت للتحلل أو كرر دورات التجميد والذوبان. يمكن أيضا إضافة مثبط نوكلياز للحفاظ على سلامة البروتين ومنع التدهور.
    9. ضع المادة الطافية المصفاة على طول جدار أنبوب يحتوي على راتنج تنقية البروتين المحضر. يغسل ب 10 مل من محلول الشطف لإزالة البروتينات غير المرتبطة على وجه التحديد.
      ملاحظة: يحتوي المخزن المؤقت Elution على 20 ملي مولار من Tris-HCl (درجة الحموضة 7.5) ، و 250 ملي مولار من كلوريد الصوديوم ، و 2٪ تريتون X-100 ، و 200 ملي مولار من إيميدازول ، والماء المقطر.
    10. قم بإزالة بروتين FEN1 عن طريق إضافة 5 مل من محلول الشطف على طول الجدار الداخلي للأنبوب.
  2. تحديد البروتينات المستهدفة عن طريق تلطيخ coomassie الأزرق اللامع السريع
    1. قم بإعداد المواد الهلامية SDS-PAGE باستخدام جل فصل بنسبة 12٪ وجل تكديس بنسبة 5٪ وفقا للحجم المتوقع ل FEN1.
    2. امزج عينة البروتين المستهدفة ومعيار BSA مع 5× عينة عازلة بنسبة 1: 4. سخني الخليط على حرارة 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق لتغيير طبيعة البروتينات بالكامل.
    3. قم بتحميل 20 ميكرولتر لكل من عينات البروتين القياسية BSA والمشوهة في آبار منفصلة من هلام SDS-PAGE.
    4. قم بتوصيل جهاز الرحلان الكهربائي. اضبط الجهد على 90 فولت وقم بتشغيله لمدة 1 ساعة و 40 دقيقة.
    5. بعد الرحلان الكهربائي ، انقل الجل إلى وعاء تلطيخ. اشطفها بالماء منزوع الأيونات ، ثم أضف 30 مل من محلول تلطيخ البروتين وصمة عار لمدة 25 دقيقة. استرجع محلول التلوين ، واشطف الجل ب 20 مل من الماء منزوع الأيونات ، وقم بإزالة اللون طوال الليل على شاكر أفقي.
    6. بعد إزالة اللون ، ضع الجل على طبق بلاستيكي شفاف وراقب عصابات البروتين تحت الضوء الأبيض.
      ملاحظة: إذا كانت العصابات باهتة أو كان تركيز البروتين منخفضا ، فقم بتركيز العينة باستخدام أنابيب الترشيح الفائق. تزيل هذه الخطوة المذيبات الزائدة والجزيئات الصغيرة ، مما يحسن تركيز البروتين ويضمن التحليل الدقيق في التجارب اللاحقة.

2. تحضير ركيزة الحمض النووي المسمى FEN1 TAMRA

  1. تحضير ركيزة الحمض النووي المسمى TAMRA
    1. تصميم خيوط قليل النوكليوتيد DNA بناء على نشاط الانقسام المحدد ل FEN1 ، في إشارة إلى الطرق المنشورة17 (انظر الجدول 1). يتم تعديل نهاية 5 من تسلسل D1 باستخدام ملصق TAMRA الفلوري.
    2. أضف قليل النوكليوتيدات الحمض النووي أحادية الشريطة المختلطة إلى 10 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتلدين في المجلدات التالية: 5 ميكرولتر من D1 (10 pmol / μL) ، 10 ميكرولتر من T1 (10 pmol / μL) ، و 7.5 ميكرولتر من U2 (10 pmol / μL). أضف الماء منزوع الأيونات ليصل الحجم الإجمالي إلى 50 ميكرولتر.
      ملاحظة: يحتوي المخزن المؤقت للتلدين على 100 ملي مولار من Tris-HCl (درجة الحموضة 7.5) و 10 ملي من MgCl2.
    3. سخني خليط التفاعل في حمام معدني عند 100 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة ، ثم انقله على الفور إلى 72 درجة مئوية لمدة 10 دقائقو 18.
      ملاحظة: يبلغ طول ركيزة الحمض النووي النهائية 80 نيوكليوتيد. تضمن درجة الحرارة الأولية العالية (100 درجة مئوية) التمسخ ، بينما تعزز درجة حرارة التلدين (72 درجة مئوية) الاقتران الدقيق للخيوط.
    4. قم بإيقاف تشغيل مصدر الحرارة واترك المحلول يبرد تدريجيا إلى درجة حرارة الغرفة ، لتشكيل ركيزة الحمض النووي المزدوجة الكاملة التي تقطعت بها السبل.
  2. فحص ركيزة الحمض النووي المسمى TAMRA
    1. قم بإعداد هلام بولي أكريلاميد متغير الطبيعة بنسبة 12٪ عن طريق خلط 4.8 مل من 30٪ أكريلاميد (29: 1) ، 4.32 مل من 6 M يوريا ، 2.4 مل من 5× TBE ، 50 ميكرولتر من 10٪ APS ، 5 ميكرولتر من TEMED ، و 0.48 مل من الماء منزوع الأيونات. تخلط جيدا لتحضير الجل.
    2. ضع الجل في فرن 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة حتى يتجمد.
    3. للكشف ، قم بإدخال 2 ميكرولتر من ركيزة الحمض النووي المركب في 18 ميكرولتر من الماء المقطر وإضافة 7.7 ميكرولتر من المخزن المؤقت للإيقاف .
    4. كمرجع، قم بإدخال 2 ميكرولتر من D1 الملصق على علامة TAMRA في 18 ميكرولتر من الماء المقطر وإضافة 7.7 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتوقف.
    5. قم بتحميل 20 ميكرولتر من كل عينة محضرة على الجل وقم بإجراء الرحلان الكهربائي SDS-PAGE لتحليل تكوين ركيزة الحمض النووي.

3. مقايسة نشاط نوكلياز FEN1

  1. مقايسة نشاط إنزيم FEN1
    1. قم بإعداد 20 ميكرولتر من خليط التفاعل عن طريق الجمع بين 2 ميكرولتر من ركيزة الحمض النووي مع نوكلياز FEN1 في المخزن المؤقت للتفاعل.
      ملاحظة: يتكون المخزن المؤقت للتفاعل من 100 ملي مولار من Tris-HCl (الرقم الهيدروجيني 7.5) ، و 200 ملي مولار من MgCl2 ، و 2 ملي مولار من DTT ، و 0.2 مجم / مل BSA ، والماء منزوع الأيونات.
    2. احتضان خليط التفاعل عند 37 درجة مئوية في حمام معدني لمدة 15 دقيقة.
    3. قم بإنهاء التفاعل بإضافة 20 ميكرولتر من 2× المخزن المؤقت للإنهاء.
    4. قم بتحميل 20 ميكرولتر من العينة المتفاعلة على هلام بولي أكريلاميد متغير الطبيعة بنسبة 12٪ معد مسبقا وقم بإجراء الرحلان الكهربائي عند 100 فولت لمدة 60 دقيقة.
    5. بعد الرحلان الكهربائي ، تصور النتائج باستخدام نظام التصوير الفلوري (600 مسار).

4. فحص مثبطات الجزيئات الصغيرة لنوكيلاز FEN1

  1. فحص مثبطات الجزيئات الصغيرة
    1. استخدم ماصة لنقل 2 ميكرولتر من ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل.
    2. أضف 2 ميكرولتر من نوكلياز FEN1 و 10 ميكرولتر من 2× المخزن المؤقت للتفاعل إلى الأنبوب.
    3. تخلط جيدا وتحتضن الخليط على الثلج لمدة 10 دقائق.
    4. أضف 2 ميكرولتر من ركيزة الحمض النووي و 4 ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات ، واخلطها جيدا ليصل حجم التفاعل الكلي إلى 20 ميكرولتر.
    5. قم بإعداد تخفيف عملي لمثبط نوكلياز FEN1 ، FEN1-IN-4 ، عن طريق إجراء تخفيف تسلسلي مزدوج لمحلول مخزون 1 متر في DMSO.
    6. ماصة 2 ميكرولتر من نوكلياز FEN1 (0.03 ميكروغرام/ميكرولتر) و2 ميكرولتر من مثبط FEN1-IN-4 المخفف في أنبوب جديد للطرد المركزي الدقيق سعة 1.5 مل. أضف 10 ميكرولتر من 2× محلول تفاعل و 4 ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات. تخلط برفق وتحتضن على الثلج لمدة 10 دقائق لضمان التفاعل الكافي بين المثبط والإنزيم.
    7. أضف 2 ميكرولتر من ركيزة الحمض النووي إلى الأنبوب لتشكيل خليط تفاعل نهائي سعة 20 ميكرولتر.
    8. احتضان التفاعل عند 37 درجة مئوية في حمام معدني لمدة 15 دقيقة.
    9. قم بإنهاء التفاعل بإضافة 20 ميكرولتر من 2× المخزن المؤقت للإنهاء.

5. تقييم الفاعلية المثبطة لمثبط الجزيئات الصغيرة FEN1-IN-4

  1. استخدم ماصة دقيقة لأخذ 10 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتفاعل 2× وإضافته إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل.
  2. أضف 2 ميكرولتر من نوكلياز FEN1 بتركيز 0.03 ميكروغرام / ميكرولتر ، بالإضافة إلى 2 ميكرولتر من مثبط FEN1 FEN1-IN-4 بتركيزات مختلفة.
    ملاحظة: يجب إنشاء تدرجات تركيز متعددة وفقا للمتطلبات التجريبية.
  3. أضف 4 ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات واخلط المحلول جيدا. ضع أنبوب الطرد المركزي الدقيق سعة 1.5 مل على الثلج واحتضنه لمدة 10 دقائق.
  4. أضف 2 ميكرولتر من ركيزة الحمض النووي مزدوجة الشريطة إلى الأنبوب لتشكيل نظام تفاعل 20 ميكرولتر.
  5. ضع أنبوب EP في حمام معدني 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
  6. بعد اكتمال التفاعل ، أضف 20 ميكرولتر من 2× توقف المخزن المؤقت إلى خليط التفاعل لإنهاء التفاعل.
  7. راقب النتائج باستخدام جهاز التصوير الفلوري وارسم منحنى IC50 19.
    ملاحظة: تم إجراء القياس الكمي لشدة التألق باستخدام Fiji / ImageJ20 ، متبوعا بالتحليل الإحصائي والتصور باستخدام برنامج الرسوم البيانية والتحليل21.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

كما هو موضح في الشكل 2 أ ، يرتبط كاشف التلوين بالبروتين ، مما يتسبب في ظهور البروتين على شكل شريط أزرق على الجل. يحتوي الممر الأول على البروتين المسمى المستخدم كمرجع للوزن الجزيئي ، حيث يتوافق نطاق البروتين القياسي BSA مع الوزن الجزيئي البالغ 70 كيلو دالتون ، ويتوافق نطاق بروتين الحمض النووي FEN1 مع الوزن الجزيئي البالغ 45 كيلو دالتون. أظهرت النتائج التجريبية أن نوكلياز FEN1 ظهر كنطاق واضح عند حوالي 45 كيلو دالتون ، مما يشير إلى تنقية ناجحة لتعبير البروتين المستحث.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعد اختبار نشاط نوكلياز FEN1 وفحص مثبطات الجزيئات الصغيرة أمرا أساسيا للبحث في إصلاح تلف الحمض النووي وتطور السرطان. بالمقارنة مع تقنيات وضع العلامات الراديوية التقليدية ، توفر الطريقة الحالية بديلا فعالا من حيث التكلفة وفعالا وسهل التشغيل وأكثر أمانا. بالإضافة إلى ذلك ، على عكس فحوصات FEN1 القائمة على الانفجار الفلوري ، يوفر هذا النهج تصورا أكثر سهولة لانقسام الركيزة ، مما يسمح بتقييم أكثر دقة لنشاط الإنزيم وتقديم منصة أكثر موثوقية للدراسات ذات الصلة14.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من قبل فريق البحث المبتكر لمؤسسة التعليم العالي في جيانغسو للعلوم والتكنولوجيا (2021) ، وبرنامج مركز أبحاث تكنولوجيا الهندسة في كلية جيانغسو المهنية (2023) ، وبرنامج التكنولوجيا الرئيسية لمشاريع تكنولوجيا سبل عيش الشعب في سوتشو (SYWD2024099) ، ومشروع المختبر الرئيسي للدولة للطب الإشعاعي والحماية ، جامعة سوتشو (GZK12023013) ، وبرامج كلية الصحة المهنية في سوتشو (SZWZYTD202201 ، SZWZYTD202205) ، ومشروع تشينغ لان بمقاطعة جيانغسو في الصين (2021 ، 2022).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
1 م تريس HCLبيوتايمالمعيار ST774
30٪ Acr-Bis (29: 1)بيوتايمST003-500 مل
5 م كلوريد الصوديومبيوتايمال ST347
بيو بلو بلسبيوتايمP0003S
BL21 (DE3) -FEN1فازيمسي 504 - إف 1
جيش صرب البوسنهبيوتايمص 0007
شاكر إزالة اللونكايلين بيلتي إس-100
دي إل-ديثيوثريتولبيوتايمالمعيار ST041
حاضنة الحمام الجافرويتشنغدرهم 200
جهاز الرحلان الكهربائيباي جينغ ليوي للتكنولوجيا الحيويةDDY-6D
FEN1 في 4الهدفتي 8545
IPTGتكابة9030
كاناميسين سلوفاتبيوشارببكالس 152
جهاز الطرد المركزي للمختبرالحراريهSL 16R
مرق رطلسولاربيوL8291
Ni-NTA راتنج ربطه7se التكنولوجيا الحيويةPANF001-001 ج
أوديسي إف سياوديسيلي-كور
صفحة SDSبيوتايمP0015L
تريشن-x-100شيوانيط15022

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Xu, S., et al. Novel cell-virus-virophage tripartite infection systems discovered in the freshwater lake Dishui Lake in Shanghai, China. J Virol. 94 (11), e00149(2020).
  2. Mougari, S., Sahmi-Bounsiar, D., Levasseur, A., Colson, P., La Scola, B. Virophages of giant viruses: An update at eleven. Viruses. 11 (8), 733(2019).
  3. Paez-Espino, D., et al. Diversity, evolution, and classification of virophages uncovered through global metagenomics. Microbiome. 7 (1), 157(2019).
  4. Zheng, L., et al. Functional regulation of FEN1 nuclease and its link to cancer. Nucleic Acids Res. 39 (3), 781-794 (2011).
  5. Yang, F., Hu, Z., Guo, Z. Small-molecule inhibitors targeting FEN1 for cancer therapy. Biomolecules. 12 (7), 946(2022).
  6. Wang, Z., et al. Inhibition of FEN1 promotes DNA damage and enhances chemotherapeutic response in prostate cancer cells. Med Oncol. 40 (8), 242(2023).
  7. Abdel-Fatah, T. M., et al. Genomic and protein expression analysis reveals flap endonuclease 1 (FEN1) as a key biomarker in breast and ovarian cancer. Mol Oncol. 8 (7), 1326-1338 (2014).
  8. Guo, E., et al. FEN1 endonuclease as a therapeutic target for human cancers with defects in homologous recombination. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (32), 19415-19424 (2020).
  9. Zhao, E., Zhou, C., Chen, S. Flap endonuclease 1 (FEN1) as a novel diagnostic and prognostic biomarker for gastric cancer. Clin Res Hepatol Gastroenterol. 45 (1), 101455(2021).
  10. Finger, L. D., et al. The 3'-flap pocket of human flap endonuclease 1 is critical for substrate binding and catalysis. J Biol Chem. 284 (33), 22184-22194 (2009).
  11. Liu, R., Qiu, J., Finger, L. D., Zheng, L., Shen, B. The DNA-protein interaction modes of FEN-1 with gap substrates and their implication in preventing duplication mutations. Nucleic Acids Res. 34 (6), 1772-1784 (2006).
  12. McWhirter, C., et al. Development of a high-throughput fluorescence polarization DNA cleavage assay for the identification of FEN1 inhibitors. J Biomol Screen. 18 (5), 567-575 (2013).
  13. Dorjsuren, D., Kim, D., Maloney, D. J., Wilson, D. M. 3rd, Simeonov, A. Complementary non-radioactive assays for investigation of human flap endonuclease 1 activity. Nucleic Acids Res. 39 (2), e11(2011).
  14. Van Pel, D. M., et al. An evolutionarily conserved synthetic lethal interaction network identifies FEN1 as a broad-spectrum target for anticancer therapeutic development. PLoS Genet. 9 (1), e1003254(2013).
  15. Tumey, L. N., et al. The identification and optimization of a N-hydroxy urea series of flap endonuclease 1 inhibitors. Bioorg Med Chem Lett. 15 (2), 277-281 (2005).
  16. Tang, Y., Wei, W., Liu, Y., Liu, S. Fluorescent assay of FEN1 activity with nicking enzyme-assisted signal amplification based on ZIF-8 for imaging in living cells. Anal Chem. 93 (11), 4960-4966 (2021).
  17. Liu, S., et al. fragment maturation involves α-segment error editing by the mammalian FEN1/MutSα functional complex. EMBO J. 34 (13), 1829-1843 (2015).
  18. Zheng, L., Dai, H., Qiu, J., Huang, Q., Shen, B. Disruption of the FEN-1/PCNA interaction results in DNA replication defects, pulmonary hypoplasia, pancytopenia, and newborn lethality in mice. Mol Cell Biol. 27 (8), 3176-3186 (2007).
  19. Hilda, S., et al. Alginate-based 3D cell culture technique to evaluate the half-maximal inhibitory concentration: An in vitro model of anticancer drug study for anaplastic thyroid carcinoma. Thyroid Res. 14 (1), 10(2021).
  20. Nadine, S. Microstructure analysis of polymer amended fluid fine tailings using Fiji-ImageJ image analysis software. , Carleton University Theses and Dissertations. (2022).
  21. Pablo, T. Quantifications figures 2-6 & supplemental fig. 1 (GraphPad Prism 8.1 files). Figshare. , (2019).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة