يعمل سير العمل المحسن للتبييض التكراري على توسيع التصوير المتعدد للعينات السريرية عالية الفلورسنت الذاتي

Aleksandra Lunich; Andrea J. Radtke; Margaret Williams; Julia M. Stern; Daniel L. Barber; Ronald N. Germain; Ifeanyichukwu U. Anidi

doi:10.3791/67980

Method Article

يعمل سير العمل المحسن للتبييض التكراري على توسيع التصوير المتعدد للعينات السريرية عالية الفلورسنت الذاتي

DOI:

10.3791/67980

⸱

July 11th, 2025

Aleksandra Lunich¹ , Andrea J. Radtke²^,³ , Margaret Williams¹ , Julia M. Stern¹ , Daniel L. Barber⁴ , Ronald N. Germain² , Ifeanyichukwu U. Anidi¹^,⁴

¹Critical Care Medicine and Pulmonary Branch, National Heart, Lung and Blood Institute, National Institutes of Health, ²Lymphocyte Biology Section and Center for Advanced Tissue Imaging, Laboratory of Immune System Biology, NIAID, NIH, ³Leica Microsystems Inc., ⁴T Lymphocyte Biology Section, Laboratory of Parasitic Diseases, National Institute of Allergy and Infectious Disease, National Institutes of Health

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يسمح تنفيذ تقنية التشعيع الضوئي منخفضة التكلفة ومتعددة الاستخدامات باستخدام طريقة IBEX اليدوية بالتصوير الأمثل للأنسجة البشرية ذات التألق الذاتي الأصلي الكبير. يوضح هذا البروتوكول بالتفصيل كيفية الحصول على صور متعددة الإرسال وكاملة الشرائح من العينات السريرية المؤرشفة باستخدام مجهر مقلوب وكواشف متاحة على نطاق واسع وبرامج مفتوحة المصدر لمحاذاة الصور ومعالجتها.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتزايد انتشار الأمراض الرئوية الناجمة عن البكتيريا الفطرية غير السلية (NTM) على مستوى العالم. على الرغم من أن المرض الرئوي الناجم عن NTM غالبا ما يظهر مع توسع القصبات وعقيدات الرئة ومرض التجويف ، إلا أن استجابة المضيف المرتبطة بأنماط الإصابة الرئوية المميزة هذه لم يتم تمييزها بشكل جيد في الموقع. سعينا إلى تقييم آليات علم الأمراض الناجم عن NTM من خلال إجراء تحليل النمط الظاهري العميق لتجمعات الخلايا المناعية في أنسجة الرئة من الأفراد المصابين بمرض NTM مقارنة بالمعيار الذهبي للالتهاب الحبيبي والورم الحبيبي ومرض الرئة السلي (TB).

تم تقطيع كتل الرئة المثبتة بالفورمالين والمضمنة في البارافين (FFPE) من المرضى الذين يعانون إما من مرض NTM المنتشر أو NTM الرئوي أو مرض السل الرئوي وتلطيخها بعد نسخة معدلة من طريقة التصوير المتكرر للتبييض يمتد متعدد الوضوح (IBEX). كان تحسين طريقة IBEX مطلوبا أولا لمعالجة التألق الداخلي الكبير لأقسام الرئة بسبب الكثافة العالية للكولاجين والإيلاستين وكريات الدم الحمراء الأصلية في الأنسجة الرئوية التي تتفاقم بسبب الحفاظ على FFPE وعمر كتل FFPE. في هذا البروتوكول ، نقوم بتفصيل بروتوكول التشعيع الضوئي وطريقة استرجاع المستضد المعدلة التي تقلل من التألق الذاتي للعينات المؤرشفة سريريا.

علاوة على ذلك ، نقدم إرشادات حول تصميم لوحة الأجسام المضادة ، بما في ذلك التحديات الشائعة مثل التفاعل المتبادل ، وفقدان الحاتمة بعد التشعيع الضوئي ، والتداخل الطيفي بين الفلوروفورات المجاورة ، وانخفاض الإشارة إلى الضوضاء لأهداف معينة. لتسهيل التصوير الفعال لأقسام أنسجة الرئة بأكملها ، تم تصوير الشرائح بمجهر واسع النطاق ومعالجتها بعد ذلك باستخدام برنامج مفتوح المصدر لتحسين جودة الصورة. يلبي سير العمل هذا معا حاجة ماسة من خلال توثيق كيفية الحصول على صور متعددة الإرسال عالية الدقة وعالية الدقة من عينات صعبة باستخدام أجهزة وكواشف متوفرة على نطاق واسع. بالإضافة إلى التصوير الكمي للعينات السريرية ، يمكن تطبيق هذه التقنيات على أنواع متنوعة من العينات للتغلب على كل من مصادر التألق الداخلية والخارجية.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

السل هو أحد الأسباب الرئيسية للوفاة، حيث يموت حوالي 1.3 مليون شخص بسبب عدوى السل كل عام^. على الرغم من أنه ليس مميتا مثل السل ، فقد حدثت زيادة كبيرة في الالتهابات الرئوية والأمراض اللاحقة التي تسببها البكتيريا الفطرية غير السلية (NTM) في السنوات الأخيرة². على مستوى الأنسجة ، تمت دراسة الاستجابة المناعية للمضيف لعدوى المتفطرة السلية الرئوية (Mtb) جيدا وتشمل تكوين الأورام الحبيبية ، والمجاميع غير المتجانسة للخلايا الليمفاوية ، والخلايا المتغصنة ، والضامة ، والعدلات³. في حين أن التهاب الورم الحبيبي هو أيضا سمة أساسية لمناعة المضيف ضد عدوى NTM ، فإن مجموعات ال....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم جمع أقسام أنسجة الرئة المؤرشفة والاستئصال الجراحي بموجب البروتوكول 09-H-0172 (NCT00943514) ، التاريخ الطبيعي لتوسع القصبات ، في مختبر المركز السريري للمعاهد الوطنية للصحة. تمت الموافقة على هذا البروتوكول من قبل IRB ، وقدم المشاركون موافقة مستنيرة.

1. استرجاع المستضد الآلي

ملاحظة: تم إجراء إزالة البارافينات واسترجاع المستضد باستخدام منصة تلطيخ بحثية آلية (الشكل 1). حدد العمل السابق أن نهج استرجاع المستضد المزدوج الذي يتكون من 30 دقيقة مع محلول استرجاع حاتمة قائم على درجة الحموضة 6 (ER1) ثم 30 دقيقة مع محلول استرجاع الحاتمة الأس الهيدروجيني 9 القا....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتطلب تصميم لوحة تصوير متعددة الإرسال قائمة على الأجسام المضادة وقتا وجهدا وجهدا وموارد^{كبيرة 12}. تظهر هذه التحديات بشكل خاص عند تصميم لوحة لعينات FFPE المؤرشفة من الأنسجة عالية الفلورسنت كما هو موضح هنا (الشكل 1). للتغلب على هذه التحديات ، حددنا أولا ألمع الفلوروفورات المتوافقة مع بروتوكول تعطيل الصبغة الخاص بنا (الجدول 1). على سبيل المثال ، تم الإبلاغ عن أن الأجسام المضادة الثانوية Alexa Fluor Plus لديها إشارة إلى ضوضاء أكبر بمقدار 4 أضعاف في فحوصات .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتميز علم أمراض الرئة السريري من السل الرئوي بالتهاب الورم الحبيبي الناخر. يحدث علم أمراض الرئة NTM بشكل أساسي في مجموعتين متميزتين من المرضى مع نمطين مرضيين منفصلين: إصابة الرئة المعزولة التي تتميز بالتهاب الورم الحبيبي مع طمس الشعب الهوائية وتشكيل التجويف في الأفراد ذوي الكفاءة المناعية ، أو مرض عقيدي منتشر يؤثر على الرئتين والأعضاء الأخرى لدى الأفراد الذين يعانون من نقص المناعة¹³^،¹⁴^،¹⁵^،<.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A.J.R. موظف في Leica Microsystems، Inc. يعلن المؤلفون الآخرون عدم وجود مصالح متضاربة.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من قبل برنامج البحوث الداخلية ل DIR / NIAID و NCI و NHLBI. تم إنشاء الشكل 1 باستخدام BioRender بموجب اتفاقية ترخيص مؤسسي مع المعاهد الوطنية للصحة.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number	Comments
0.3٪ تريتون-X-100	سيجما ألدريتش	تي 8787	حل لحجب المخزن المؤقت
1٪ BSA	سيجما ألدريتش	أ4503	حل لحجب المخزن المؤقت
1٪ كتلة BD Fc البشرية	BD Biosciences	564220	كتلة Fc مطلوبة لحظر المخزن المؤقت
مصباح LED 150 واط	الامازون	B07VH3CVSF	مصدر ضوء LED للإشعاع الضوئي للأنسجة
1x PBS ؛	جيبكو	10010-023	حل لحجب المخزن المؤقت وخطوات الغسيل
حاوية تخزين 20 جالون	الامازون	B001B1C4G0	حاوية لعملية التشعيع الضوئي
40 واط RGBW الفيضان LED مصباح ؛	الامازون	B08QFPJSMD	مصدر ضوء RGB للإشعاع الضوئي للأنسجة
Ag85B	أبكام	AB43019 / NA	الأجسام المضادة لتصوير IBEX. انظر الجدول 1.
أكتين ألفا الملساء العضلات DyLight 755	نوفوس بيولوجيڪل	NBP2-345221R / NA	الأجسام المضادة لتصوير IBEX. انظر الجدول 1.
مجموعة حجب Avidin / Biotin	أبكام	أب64212	محلول حجب الأفيدين والبيوتين
BD Cytofix / Cytoperm	BD Biosciences	554714	حل التثبيت
حل بوند لإزالة الشمع	لايكا بيوسيستمز	NC0221076	محلول إزالة البارافين
حل استرجاع الحاتمة BOND 1	لايكا بيوسيستمز	NC0235529	محلول استرجاع الحاتمة القائم على السترات (ER1)
حل استرجاع الحاتمة BOND 2	لايكا بيوسيستمز	NC0235530	محلول استرجاع الحاتمة القائم على الأس الهيدروجيني 9 (ER2)
نظام الكشف عن البحوث BOND	لايكا بيوسيستمز	NC0396648	كاشف تلطيخ البحث الآلي
BOND RX Research Stainer	لايكا بيوسيستمز	NA	منصة تلطيخ البحث الآلي
محلول غسيل بوند	لايكا بيوسيستمز	NC0221077	عازلة الغسيل
سي دي 15	BD Biosciences	347420/AB_400298	الأجسام المضادة لتصوير IBEX. انظر الجدول 1.
CD20 eFluor 660	ثيرمو فيشر العلمي	50-0202-82/AB_11150959	الأجسام المضادة لتصوير IBEX. انظر الجدول 1.
CD4 أليكسا فلور 488	آر آند د سيستمز	FAB8165G/AB_2728839	الأجسام المضادة لتصوير IBEX. انظر الجدول 1.
CD45 فيكواريثرين (PE)	نوفوس بيولوجيڪل	NBP2-34528PE / NA	الأجسام المضادة لتصوير IBEX. انظر الجدول 1.
CD68 iFluor 594	كابريكو للتقنيات الحيوية	1064135/AB_2892745	الأجسام المضادة لتصوير IBEX. انظر الجدول 1.
الحمار المضادة للماعز IgG Alexa Fluor Plus 488	ثيرمو فيشر العلمي	A32814/AB_2762838	الأجسام المضادة لتصوير IBEX. انظر الجدول 1.
الحمار المضادة للفأر IgG Alexa Fluor Plus AF647	ثيرمو فيشر العلمي	A32787/ AB_2762830	الأجسام المضادة لتصوير IBEX. انظر الجدول 1.
الحمار المضادة للفأر IgM Alexa Fluor 488	جاكسون إيمونوبيرسيرش	715-545-020/AB_2340844	الأجسام المضادة لتصوير IBEX. انظر الجدول 1.
حمار مضاد للأرانب IgG Alexa Fluor Plus AF555	ثيرمو فيشر العلمي	A32794/AB_2762834	الأجسام المضادة لتصوير IBEX. انظر الجدول 1.
نظام تلطيخ EasyDip	توريد الوافدين الجدد	5300 مجموعة	نظام تلطيخ الشرائح
فلوروماونت-جي	ثيرمو فيشر العلمي	00-4958-02	وسائط التركيب
هوشست	البيوتيوم	40046	وصمة عار نووية لتصوير IBEX. انظر الجدول 1.
محول ملفات Imaris x64 10.2.0	إماريس أكسفورد إنسترومنتس		محول ملفات مجاني
برنامج ImarisViewer x64 10.2.0	إماريس أكسفورد إنسترومنتس		برنامج مجاني لمعالجة الصور
قلم ImmEdge	مختبرات ناقلات	إتش -4000	قلم حاجز مسعور
ليثيوم بوروهيدريد (1 جرام)	STREM للكيماويات	93-0397	مادة كيميائية لتعطيل الصبغة ، قم بشراء كميات صغيرة من هذه المادة الكيميائية (1 جرام)
لوميكان بيوتين	آر آند د سيستمز	BAF2846	الأجسام المضادة لتصوير IBEX. انظر الجدول 1.
نظارات الغطاء الصغير	VWR	48393-241	أغطية الشرائح الزجاجية
بان سيتوكيراتين أليكسا فلور 750	نوفوس بيولوجيڪل	NBP2-33200AF750 / AB_2868569	الأجسام المضادة لتصوير IBEX. انظر الجدول 1.
نظام الميكروويف PELCO BioWave Pro	شركة تيد بيلا	36500-230	ميكروويف علمي غير مسخن
بيلكو SteadyTemp Pro	شركة تيد بيلا	50062	تحكم مؤتمت بالكامل في درجة الحرارة للميكروويف العلمي
سيمبلل آي تي كي	برنامج مفتوح المصدر		برامج التسجيل ومعالجة القنوات
ستريبتافيدين أليكسا فلور 594	ثيرمو فيشر العلمي	س 11227	كاشف الملصقات لتصوير IBEX. انظر الجدول 1.
مجهر واسع المجال	أنظمة لايكا الدقيقة	NA	جهاز تصوير Leica Microsystems THUNDER مع مصدر ضوء LED8 وبرنامج LAS X (3.7.1.21655). للتصوير الفلوري ، تم استخدام مرشح رباعي النطاق مخصص مع عجلة مرشح خارجية (PN: 11536075) مع مرشحين إضافيين أحادي النطاق (PN: 8118215) لتصوير سبع قنوات صبغ لكل تمريرة. خطوط الإثارة وثنائية اللون والانبعاث هي (1) مكعب رباعي النطاق: ثنائي اللون عند 391/32 ، 479/33 ، 554/24 ، 638/31 ، لا توجد مرشحات إثارة أو انبعاث ؛ (2) موضع عجلة المرشح الخارجية 1: 434/32 ، الموضع 2: 520/40 ، الموضع 3: 585/20 ، الموضع 4: 720/60 ، الموضع 5: المرور ؛ (3) فرقة واحدة 1 و [مدش] ؛ 585/22 إثارة ، 594 ثنائي اللون ، 625/30 انبعاث ؛ (4) فرقة واحدة 2 و [مدش] ؛ 635/20 إثارة ، 647 ثنائي اللون ، 667/30 انبعاث.
منظف العدسات البصرية Zeiss	الامازون	B00GPVQVCO	منظف العدسة الموضوعية المجهري

<قوي>الأجسام المضادة
Ag85B	أبكام	أب43019	الأرنب متعدد النسيلة IgG ، الدورة 1
أكتين ألفا الملساء العضلات DyLight 755	نوفوس بيولوجيڪل	NBP2-345221R	1A4/asm-1، الدورة 1
CD4 أليكسا فلور 488	آر آند د سيستمز	FAB8165G	الماعز متعدد النسيلة IgG ، الدورة 1
CD8 أليكسا فلور 647	بيو ليجند	372906	C8/144B، الدورة 1
CD68 iFluor 594	كابريكو للتقنيات الحيوية	1064135	KP1 ، الدورة 1
الحمار المضادة للماعز IgG Alexa Fluor Plus 488	ثيرمو فيشر العلمي	أ32814	حمار متعدد النسيلة ، الدورة 1
الحمار المضادة للفأر IgG Alexa Fluor Plus AF647	ثيرمو فيشر العلمي	أ 32787	حمار متعدد النسيلة ، الدورة 1
حمار مضاد للأرانب IgG Alexa Fluor Plus AF555	ثيرمو فيشر العلمي	أ32794	حمار متعدد النسيلة ، الدورة 1
هوشست	البيوتيوم	40046	الملصق النووي ، الدورة 1

سي دي 15	BD Biosciences	347420	MMA ، الدورة 2
CD20 eFluor 660	ثيرمو فيشر العلمي	50-0202-82	L26 ، الدورة 2
CD45 فيكواريثرين (PE)	نوفوس بيولوجيڪل	NBP2-34528PE	2B11 + PD7/26، الدورة 2
الحمار المضادة للفأر IgM Alexa Fluor 488	جاكسون إيمونوبيرسيرش	715-545-020	حمار متعدد النسيلة ، الدورة 2
لوميكان بيوتين	آر آند د سيستمز	BAF2846	الماعز متعدد النسيلة IgG ، الدورة 2
بان سيتوكيراتين أليكسا فلور 750	نوفوس بيولوجيڪل	NBP2-33200AF750	AE-1/AE-3، الدورة 2
ستريبتافيدين أليكسا فلور 594	ثيرمو فيشر العلمي	س 11227	غير متاح ، الدورة 2
هوشست	البيوتيوم	40046	الدورة 2

<قوية>حلول
حظر المخزن المؤقت (الدورة 1) < / قوي>< / em>
تريتون إكس 100	سيجما ألدريتش	تي 8787	0.3٪ من حيث الحجم
جيش صرب البوسنه	سيجما ألدريتش	أ4503	1٪ من حيث الحجم
كتلة BD Fc البشرية	BD Biosciences	564220	1٪ من حيث الحجم
1x PBS ؛	جيبكو	10010-023	97.7٪ من حيث الحجم
<قوي>محلول تلطيخ الأجسام المضادة الأولية # 1 (الدورة 1) < / قوي>
المخزن المؤقت للحجب (الدورة 1)	انظر أعلاه		قم بتعبئة الحجم بعد إضافة الأجسام المضادة
هوشست	البيوتيوم	40046	1:5000
CD8 AF647	بيو ليجند	372906	1:10
<قوي>محلول تلطيخ الأجسام المضادة الأولية # 2 (الدورة 1) < / قوي>
المخزن المؤقت للحجب (الدورة 1)	انظر أعلاه		قم بتعبئة الحجم بعد إضافة الأجسام المضادة
CD4 أف488	آر آند د سيستمز	FAB8165G	1:10
Ag85B	أبكام	AB43019 / NA	1:100
<قوي> حل تلطيخ الأجسام المضادة الثانوية # 1 (الدورة 1) < / قوي>
المخزن المؤقت للحجب (الدورة 1)	انظر أعلاه		قم بتعبئة الحجم بعد إضافة الأجسام المضادة
الحمار المضادة للماعز AF Plus 488	ثيرمو فيشر العلمي	A32814/AB_2762838	1:100
الحمار المضادة للأرانب AF Plus 555	ثيرمو فيشر العلمي	A32794/AB_2762834	1:100
الحمار المضادة للماوس AF Plus 647	ثيرمو فيشر العلمي	A32787/AB_2762830	1:50
<قوي>محلول تلطيخ الأجسام المضادة الأولية # 3 (الدورة 1) < / قوي>
المخزن المؤقت للحجب (الدورة 1)	انظر أعلاه		قم بتعبئة الحجم بعد إضافة الأجسام المضادة
CD68 iF594	كابريكو للتقنيات الحيوية	1064135	1:10
أ-SMA DL755	نوفوس بيولوجيڪل	NBP2-345221R / NA	1:30
<قوي> المخزن المؤقت للحجب الخالي من BSA (الدورة 2) < / قوي >< / م>
تريتون إكس 100	سيجما ألدريتش	تي 8787	0.3٪ من حيث الحجم
كتلة BD Fc البشرية	BD Biosciences	564220	1٪ من حيث الحجم
1x PBS ؛	جيبكو	10010-023	98.7٪ من حيث الحجم
<قوي>محلول تلطيخ الأجسام المضادة الأولية # 4 (الدورة 2) < / قوي>
المخزن المؤقت للحجب الخالي من BSA (الدورة 2)	انظر أعلاه		قم بتعبئة الحجم بعد إضافة الأجسام المضادة
سي دي 15	BD Biosciences	347420	1:30
لوميكان بيوتين	آر آند د سيستمز	BAF2846	1:100
CD45 PE	نوفوس بيولوجيڪل	NBP2-34528PE	1:20
CD20 eFluor 660	ثيرمو فيشر العلمي	50-0202-82	1:10
بان سيتوكيراتين AF750	نوفوس بيولوجيڪل	NBP2-33200AF750	1:10
<قوي> حل تلطيخ الأجسام المضادة الثانوية # 2 (الدورة 2) < / قوي>
المخزن المؤقت للحجب الخالي من BSA (الدورة 2)	انظر أعلاه		قم بتعبئة الحجم بعد إضافة الأجسام المضادة
الحمار المضادة للفأر IgM AF488	جاكسون إيمونوبيرسيرش	715-545-020/AB_2340844	1:100
ستريبافيدين AF594	ثيرمو فيشر العلمي	س 11227	1:200

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Global tuberculosis report 2023. , World Health Organization. https://iris.who.int/bitstream/handle/10665/373828/9789240083851-eng.pdf?sequence=1 (2023).
Dahl, V. N., et al. Global trends of pulmonary infections with nontuberculous mycobacteria: A systematic review. Int J Infect Dis. 125, 120-131 (2....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

يعمل سير العمل المحسن للتبييض التكراري على توسيع التصوير المتعدد للعينات السريرية عالية الفلورسنت الذاتي

In This Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

References

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles