يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

يعمل سير العمل المحسن للتبييض التكراري على توسيع التصوير المتعدد للعينات السريرية عالية الفلورسنت الذاتي

1.4K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/67980

⸱

يوليو 11, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Critical Care Medicine and Pulmonary Branch, National Heart, Lung and Blood Institute, National Institutes of Health, 2Lymphocyte Biology Section and Center for Advanced Tissue Imaging, Laboratory of Immune System Biology, NIAID, NIH, 3Leica Microsystems Inc., 4T Lymphocyte Biology Section, Laboratory of Parasitic Diseases, National Institute of Allergy and Infectious Disease, National Institutes of Health

في هذه المقالة

ملخص

يسمح تنفيذ تقنية التشعيع الضوئي منخفضة التكلفة ومتعددة الاستخدامات باستخدام طريقة IBEX اليدوية بالتصوير الأمثل للأنسجة البشرية ذات التألق الذاتي الأصلي الكبير. يوضح هذا البروتوكول بالتفصيل كيفية الحصول على صور متعددة الإرسال وكاملة الشرائح من العينات السريرية المؤرشفة باستخدام مجهر مقلوب وكواشف متاحة على نطاق واسع وبرامج مفتوحة المصدر لمحاذاة الصور ومعالجتها.

الملخص

يتزايد انتشار الأمراض الرئوية الناجمة عن البكتيريا الفطرية غير السلية (NTM) على مستوى العالم. على الرغم من أن المرض الرئوي الناجم عن NTM غالبا ما يظهر مع توسع القصبات وعقيدات الرئة ومرض التجويف ، إلا أن استجابة المضيف المرتبطة بأنماط الإصابة الرئوية المميزة هذه لم يتم تمييزها بشكل جيد في الموقع. سعينا إلى تقييم آليات علم الأمراض الناجم عن NTM من خلال إجراء تحليل النمط الظاهري العميق لتجمعات الخلايا المناعية في أنسجة الرئة من الأفراد المصابين بمرض NTM مقارنة بالمعيار الذهبي للالتهاب الحبيبي والورم الحبيبي ومرض الرئة السلي (TB).

تم تقطيع كتل الرئة المثبتة بالفورمالين والمضمنة في البارافين (FFPE) من المرضى الذين يعانون إما من مرض NTM المنتشر أو NTM الرئوي أو مرض السل الرئوي وتلطيخها بعد نسخة معدلة من طريقة التصوير المتكرر للتبييض يمتد متعدد الوضوح (IBEX). كان تحسين طريقة IBEX مطلوبا أولا لمعالجة التألق الداخلي الكبير لأقسام الرئة بسبب الكثافة العالية للكولاجين والإيلاستين وكريات الدم الحمراء الأصلية في الأنسجة الرئوية التي تتفاقم بسبب الحفاظ على FFPE وعمر كتل FFPE. في هذا البروتوكول ، نقوم بتفصيل بروتوكول التشعيع الضوئي وطريقة استرجاع المستضد المعدلة التي تقلل من التألق الذاتي للعينات المؤرشفة سريريا.

علاوة على ذلك ، نقدم إرشادات حول تصميم لوحة الأجسام المضادة ، بما في ذلك التحديات الشائعة مثل التفاعل المتبادل ، وفقدان الحاتمة بعد التشعيع الضوئي ، والتداخل الطيفي بين الفلوروفورات المجاورة ، وانخفاض الإشارة إلى الضوضاء لأهداف معينة. لتسهيل التصوير الفعال لأقسام أنسجة الرئة بأكملها ، تم تصوير الشرائح بمجهر واسع النطاق ومعالجتها بعد ذلك باستخدام برنامج مفتوح المصدر لتحسين جودة الصورة. يلبي سير العمل هذا معا حاجة ماسة من خلال توثيق كيفية الحصول على صور متعددة الإرسال عالية الدقة وعالية الدقة من عينات صعبة باستخدام أجهزة وكواشف متوفرة على نطاق واسع. بالإضافة إلى التصوير الكمي للعينات السريرية ، يمكن تطبيق هذه التقنيات على أنواع متنوعة من العينات للتغلب على كل من مصادر التألق الداخلية والخارجية.

المقدمة

السل هو أحد الأسباب الرئيسية للوفاة، حيث يموت حوالي 1.3 مليون شخص بسبب عدوى السل كل عام. على الرغم من أنه ليس مميتا مثل السل ، فقد حدثت زيادة كبيرة في الالتهابات الرئوية والأمراض اللاحقة التي تسببها البكتيريا الفطرية غير السلية (NTM) في السنوات الأخيرة2. على مستوى الأنسجة ، تمت دراسة الاستجابة المناعية للمضيف لعدوى المتفطرة السلية الرئوية (Mtb) جيدا وتشمل تكوين الأورام الحبيبية ، والمجاميع غير المتجانسة للخلايا الليمفاوية ، والخلايا المتغصنة ، والضامة ، والعدلات3. في حين أن التهاب الورم الحبيبي هو أيضا سمة أساسية لمناعة المضيف ضد عدوى NTM ، فإن مجموعات الخلايا المناعية والخصائص المكانية لهذه الاستجابة لا تزال غير مدروسة. يعد اكتساب فهم مفصل لمكونات الأنسجة في علم الأمراض المناعي مقابل التئام الجروح أمرا بالغ الأهمية لتطوير العلاجات (على سبيل المثال ، العلاجات الموجهة من قبل المضيف) والاستراتيجيات العلاجية الوقائية (أي اللقاحات).

في هذه الدراسة ، تمكن فريقنا من الوصول إلى عينات سريرية نادرة مؤرشفة تم الحصول عليها أثناء استئصال الرئة أو تشريح الجثث من المرضى المصابين بعدوى Mtb أو NTM. كانت غالبية هذه العينات يزيد عمرها عن 10 سنوات وتم حفظها كعينات مثبتة بالفورمالين ومدمجة في البارافين (FFPE) ، مما يحد من استخدامها في المقايسات النسيجية. للتغلب على قيود العلامات للكيمياء المناعية التقليدية (IHC) والتصوير المناعي (IF) ، استخدمنا طريقة التبييض التكراري يمتد متعدد الدقة (IBEX) ، وهي طريقة تصوير مفتوحة المصدر ومضاعفة للغاية4،5. يتطلب تمديد طريقة IBEX إلى عينات FFPE للرئة البشرية تحسينا كبيرا بسبب المستويات العالية من التألق الداخلي ، وهي عقبة موصوفة جيدا للتصوير القائم على الأجسام المضادة متعددةالإرسال 6.

هنا ، نقدم بروتوكولا مفصلا لتقليل التألق الذاتي باستخدام طريقة التشعيع الضوئي المحسنة لأقسام أنسجة FFPE في الرئة7،8. الأهم من ذلك ، أن الطريقة الموضحة هنا تستخدم صندوقا ضوئيا غير مكلف ومتاح على نطاق واسع يمكن تمديده ليشمل مستحضرات العينات الأخرى ذات التألق الذاتي العالي. بالإضافة إلى تقليل التألق الذاتي قبل الحصول على الصورة ، نقدم إرشادات حول تصميم لوحة الأجسام المضادة مثل إقران علامات الوفرة المنخفضة مع ملصقات الفلوروفور الساطعة ، وتقييم تأثير التشعيع الضوئي على وضع العلامات على الأجسام المضادة ، والتضخيم بالأجسام المضادة الثانوية في القنوات ذات التألق الداخلي العالي. في المتوسط ، قمنا بمعالجة خمس شرائح تتوافق مع قسم واحد من الأنسجة ، تتراوح كل منها من 37 إلى 114 مم2. أخيرا ، نوضح كيفية الحصول على صور الشريحة الكاملة باستخدام أداة واسعة النطاق. باختصار ، يصف هذا البروتوكول اعتماد IBEX للعينات السريرية المؤرشفة ويقدم أيضا إرشادات حول كيفية استكشاف المشكلات التي تتم مواجهتها بشكل شائع مع تصوير عينات عالية الفلورسنت الذاتي وإصلاحها.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تم جمع أقسام أنسجة الرئة المؤرشفة والاستئصال الجراحي بموجب البروتوكول 09-H-0172 (NCT00943514) ، التاريخ الطبيعي لتوسع القصبات ، في مختبر المركز السريري للمعاهد الوطنية للصحة. تمت الموافقة على هذا البروتوكول من قبل IRB ، وقدم المشاركون موافقة مستنيرة.

1. استرجاع المستضد الآلي

ملاحظة: تم إجراء إزالة البارافينات واسترجاع المستضد باستخدام منصة تلطيخ بحثية آلية (الشكل 1). حدد العمل السابق أن نهج استرجاع المستضد المزدوج الذي يتكون من 30 دقيقة مع محلول استرجاع حاتمة قائم على درجة الحموضة 6 (ER1) ثم 30 دقيقة مع محلول استرجاع الحاتمة الأس الهيدروجيني 9 القائم على EDTA (ER2) أسفر عن أفضل نتائج الملصقات المناعية لأنسجة FFPE9. يمكن الحصول على نتائج قابلة للمقارنة باستخدام إزالة الشمع يدويا واسترجاع المستضد المزدوج باستخدام الطرق الموصوفة الأخرى والدعم المقدم من مجتمع التصوير IBEX10،11.

  1. اجمع الشرائح ومستلزمات استرجاع المستضدات الآلية (أغطية الشرائح ، ونظام الكشف عن الأبحاث ، وحل استرجاع الحاتمة القائم على السترات ، وحل استرجاع الحاتمة الأس الهيدروجيني 6 القائم على السترات (ER1) ، ومحلول استرجاع الحاتمة الأس الهيدروجيني 9 القائم على EDTA (ER2) ، إلخ).
  2. قم بتشغيل الأداة ، واتركها بالتهيئة لمدة 20 دقيقة ، ثم ضع ذراع الكشف عن البحث في الجهاز ، وأدخل حاويات الكاشف في الجزء السفلي من الجهاز.
  3. افتح البرنامج، وانقر فوق إعداد الشريحة وحدد إضافة دراسة، وقم بإنشاء اسم جديد للدراسة.
  4. حدد إضافة شريحة وقم بتسمية الشرائح حسب الرغبة.
  5. لاتباع هذا البروتوكول ، قم بإجراء بروتوكول Bake and Dewax باستخدام بروتوكول HIER يتكون من 30 دقيقة من ER1 و 30 دقيقة من ER2.
  6. اطبع الملصقات وضعها أعلى الشرائح. قم بإزالة رف الشرائح الأسود من الأداة وضع الشرائح ذات الأهمية على الرف. ضع أغطية منزلقة شفافة على كل شريحة ، وأعد رف الشرائح إلى الجهاز ، واضغط على الزر الموجود أسفل الحامل لمطالبة الجهاز بإجراء مسح الباركود للشرائح.
  7. حدد تشغيل | موافق ودع استرجاع المستضد الآلي يبدأ بمدة تقريبية تبلغ 3 ساعات.

2. وضع العلامات على الأجسام المضادة قبل التشعيع الضوئي

  1. بعد اكتمال استرجاع المستضد ، اغمر الشرائح في PBS.
    ملاحظة: بعض الحلقات حساسة للإشعاع الضوئي وتتحلل بعد التعرض الليلي لمصباح LED. يجب تحديد الحواتم الحساسة تجريبيا وعند اكتشافها ، يجب أن يحدث وضع العلامات المناعية لهذه الحلقات في هذه الخطوة. تأكد من بقاء الشريحة رطبة في جميع الأوقات بعد استرجاع المستضد.
  2. قم بإزالة شريحة واحدة من PBS وجفف جميع PBS الزائدة على الشريحة باستخدام مسحة خالية من النسالة ؛ احرص على عدم لمس الأنسجة. ارسم حدا حول الأنسجة بقلم مسعور. كرر العملية لجميع الشرائح المتبقية. دع الحاجز الكارهة للماء يجف لمدة 10 دقائق.
  3. قم بإعداد غرفة رطوبة منزلقة عن طريق وضع كمية صغيرة من الماء في قاع كل بئر. ضع الشرائح في غرفة الترطيب المنزلقة. قم بإزالة PBS من الأنسجة دون لمس عينة الأنسجة مباشرة.
  4. أضف 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للحجب (جدول المواد) إلى كل شريحة. ضع غرفة الرطوبة المنزلقة في ميكروويف علمي غير قابل للتسخين مع آلية للحفاظ على درجة حرارة ثابتة.
  5. قم بحظر وضع العلامات على الأجسام المضادة غير المحددة عن طريق تنفيذ البرنامج التالي الذي تم إنشاؤه سابقا4: برنامج 2-1-2-1-2-1-2-1-2 ، حيث يشير "2" إلى دقيقتين عند 100 واط و "1" يشير إلى دقيقة واحدة عند 0 واط. قم بتنفيذ البرنامج أعلاه مرة واحدة للحظر. إذا لم تكن هذه الأداة متوفرة ، فقم بسد أقسام الأنسجة (5-10 ميكرومتر) لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية كما هو موضحسابقا 5.
  6. قم بإنشاء محلول تلطيخ الأجسام المضادة الأولي # 1 (الدورة 1) (جدول المواد) أثناء حجب حضانة المخزن المؤقت. تحضير خلطات الأجسام المضادة وفقا لجدول المواد. امزج كوكتيل الأجسام المضادة برفق وقم بتدوير مزيج الأجسام المضادة باستخدام جهاز طرد مركزي صغير عند 2,680 × جم لمدة 30 ثانية.
    ملاحظة: يحتوي محلول التلوين هذا على تخفيف 1: 5000 من Hoechst الذي يجب أن يكون كافيا طوال مدة التجربة المكونة من دورتين. قد يحتاج المستخدمون إلى معايرة Hoechst والأجسام المضادة الأخرى للحصول على أفضل النتائج لأنسجتهم وتكوين التصوير.
  7. قم بإزالة غرفة الرطوبة المنزلقة من الميكروويف عند اكتمال الدورة وقم بإزالة محلول المخزن المؤقت المانع من كل نسيج. أضف 200 ميكرولتر من محلول تلطيخ الأجسام المضادة الأولية # 1 (الدورة 1) (جدول المواد) إلى كل شريحة. ضع الغرفة مع الشرائح مرة أخرى في الميكروويف وقم بتشغيل برنامج الأجسام المضادة الأساسية لمدة 30 دقيقة تقريبا: قم بتنفيذ برنامج 2-1-2-1-2-1-2-1-2 مرتين لوضع العلامات على الأجسام المضادة الأولية.
    ملاحظة: هنا ، 200 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الأولية هو تقدير. استخدم حجما مناسبا من المحلول لتغطية سطح قسم الأنسجة بالكامل.
  8. بمجرد اكتمال خطوة وضع العلامات الأساسية على الأجسام المضادة ، اغسل كل شريحة ب 1,000 ميكرولتر من PBS عن طريق إمالة الشريحة عموديا ، وسحب PBS على الأنسجة ، وترك PBS ينفجر. كرر هذه الخطوة 3-5x.
  9. قم بإزالة PBS الزائد وقم بإصلاح الشرائح بنسبة 1٪ بارافورمالدهايد (PFA) لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة في غرفة الرطوبة.
    ملاحظة: يمكن أن يخفي تثبيت PFA الحلقات ، مما يمنع الأجسام المضادة من ربط أهدافها المقصودة. عند إنشاء لوحة الأجسام المضادة لأول مرة ، نوصي بتقييم تأثير التثبيت اللطيف (1٪ PFA لمدة 10 دقائق) من خلال مقارنة نمط وضع العلامات لأقسام الأنسجة المعالجة بمثبت أو بدونه قبل وضع العلامات المناعية. إذا كان الجسم المضاد حساسا لتثبيت PFA بنسبة 1٪ ، فقم بتحريك هذا الجسم المضاد قبل خطوة التثبيت.
  10. اغسل الشرائح على نطاق واسع باستخدام 1,000 ميكرولتر من PBS 3-5x. اترك PBS على الأنسجة حتى خطوة التشعيع الضوئي.

3. التشعيع الضوئي للأنسجة

  1. لتحضير صندوق التشعيع الضوئي (الشكل 2) ، احصل على مصباح LED بقوة 150 واط ، ومصباح LED فيضاني RGBW بقوة 40 واط ، وحاوية بلاستيكية كبيرة (حجم 20 جالونا [75.71 لترا] أو أكثر) ، و 1x PBS طازج ، وطبق بتري.
  2. ضع طبق بتري في وسط المصباح بقوة 150 واط واملأه ب 1x PBS. استخدم مستوى صوت كاف لغمر الشرائح في PBS. قم بإجراء عملية التشعيع الضوئي في الغرفة الباردة لتقليل توليد الحرارة من المصابيح.
  3. قم بإزالة الشرائح من غرفة الرطوبة المنزلقة وضعها في طبق بتري ، مع التأكد من غمر جميع الشرائح في PBS.
  4. ضع المصباح بقوة 40 واط مباشرة فوق طبق بتري بحيث يكون مصدر الضوء مواجها للشرائح. تأكد من ضبط المصباح بقدرة 40 واط على إعداد الضوء الأحمر قبل وضعه.
  5. قم بتشغيل كل من المصابيح 150 واط و 40 واط. قم بتغطية إعداد التشعيع الضوئي بغطاء الحاوية البلاستيكية. حافظ على المصباح 40 واط على إعداد الضوء الأحمر لمدة ساعتين ، ثم قم بالتبديل إلى إعداد الضوء الأخضر عبر جهاز التحكم عن بعد المرفق لمدة 16 ساعة المتبقية.
    ملاحظة: من الضروري إجراء التشعيع الضوئي عند حوالي 4 درجات مئوية لمنع التشويه الحراري غير المرغوب فيه للأنسجة المنزلقة. نقطة الإيقاف المؤقت: يمكن إجراء التشعيع الضوئي بين عشية وضحاها ويمكن استئناف البروتوكول في صباح اليوم التالي.

4. وضع العلامات على الأجسام المضادة بعد التشعيع الضوئي

  1. قم بإزالة الشرائح من طبق بتري واغمرها في 1x PBS في وعاء كوبلن ، أو أنبوب مخروطي سعة 50 مل ، أو دلو من نظام تلطيخ الشريحة. قم بإعداد محلول تلطيخ الأجسام المضادة الأساسي # 2 (الدورة 1) (جدول المواد) عند التخفيفات الموصى بها (الجدول 1). استخدم 200 ميكرولتر من المحلول لكل شريحة.
  2. قم بإزالة PBS الزائد من كل شريحة فردية بمنديل خال من النسالة مع التأكد من تجفيف المنطقة المحيطة بالأنسجة دون لمس الأنسجة نفسها. ضع الشرائح في غرفة الرطوبة المنزلقة.
  3. قم بلطف بلطف محلول تلطيخ الأجسام المضادة الأولية # 2 (الدورة 1) وأضف 200 ميكرولتر إلى كل شريحة ، مما يضمن تغطية الأنسجة بالكامل.
  4. ضع غرفة الرطوبة المنزلقة مع الشرائح مرة أخرى في الميكروويف وقم بتشغيل برنامج الأجسام المضادة الأساسي لمدة 30 دقيقة تقريبا كما هو مفصل في الخطوة 2.7
  5. أثناء وضع العلامات الأولية على الأجسام المضادة ، اصنع محلول تلطيخ الأجسام المضادة الثانوية # 1 (الدورة 1) (جدول المواد).
  6. بمجرد اكتمال برنامج الميكروويف ، قم بإزالة غرفة الرطوبة المنزلقة واغسل كل شريحة 3-5x مع 1,000 ميكرولتر من 1x PBS.
  7. قم بإزالة PBS الزائد من كل شريحة فردية بمسح خال من النسالة ، وقم بتدوير محلول تلطيخ الجسم المضاد الثانوي ، وأضف 200 ميكرولتر إلى كل شريحة.
  8. ضع غرفة الرطوبة المنزلقة في الميكروويف وقم بتشغيل برنامج الأجسام المضادة الثانوية: برنامج 2-1-2-1-2-1-2-1-2-2 ، حيث يشير "2" إلى دقيقتين عند 100 واط و "1" يشير إلى دقيقة واحدة عند 0 واط. قم بتنفيذ البرنامج أعلاه مرة واحدة لوضع العلامات الثانوية على الأجسام المضادة.
  9. اغسل الشرائح على نطاق واسع 3-5x مع 1 مل من 1x PBS وتخلص من PBS الزائد من كل شريحة.
  10. أضف محلول تلطيخ الأجسام المضادة الأولية # 3 (الدورة 1) الذي يحتوي على أجسام مضادة مترافقة مباشرة لكل شريحة. قم بتلطيخ الأجسام المضادة باستخدام الميكروويف أو البديل (1 ساعة عند 37 درجة مئوية) كما هو موضح في الخطوة 2.7.
  11. اغسل الشرائح مرة أخرى 3-5x مع 1 مل من 1x PBS وتخلص بعناية من PBS الزائدة من كل شريحة.
  12. أضف 30 ميكرولتر من وسط التركيب مباشرة إلى كل قسم من أقسام الأنسجة وضع غطاء يغطي الجزء الكامل من الأنسجة افحص الشريحة بحثا عن فقاعات الهواء وادفع فقاعات الهواء إلى محيط الشريحة بضغط لطيف. كرر العملية للشرائح المتبقية.
  13. قم بإزالة وسيط التثبيت الزائد بمنديل خال من النسالة واستخدم منظف العدسة البصري لتنظيف أي بقايا متبقية على سطح الغطاء. اسمح لجميع الشرائح بالضبط لمدة 10-15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة قبل إجراء الحصول على الصور على المجهر.

5. إعداد الفحص المجهري والحصول على الصور

  1. قم بتشغيل المجهر واسع النطاق ومصدر ضوء LED8 ؛ قم بتشغيل البرنامج. حدد الهدف (هنا ، هدف جاف 20x / 0.8). ضع الكاميرا في وضع 16 بت في علامة تبويب التكوين . حدد القنوات المطلوبة بناء على الفلوروفورات الموجودة في لوحات الأجسام المضادة (انظر الجدول 1 لمزيد من الإرشادات).
    ملاحظة: يتم تحديد الخطوات التالية للمجهر المشار إليه. يمكن استخدام مجهر واسع المجال مكافئ مع مصدر ضوء مماثل ومكعبات ترشيح لإثارة وانبعاث العديد من الفلوروفورات ومرحلة الدقة.
  2. قم بتنظيف الغطاء باستخدام منظف العدسة وورق العدسة مباشرة قبل التصوير. افحص الغطاء بصريا وقم بإزالة أي غبار أو نسالة من السطح قبل التصوير. ضع الشريحة بإحكام في الزاوية العلوية اليسرى (أو ما يعادلها) من ملحق المسرح ، بحيث يتم وضع الأنسجة باستمرار في المستوى XY (أمر بالغ الأهمية لمحاذاة الصور الدورية).
  3. قم بإعداد إعدادات الاستحواذ عن طريق إنشاء قناة تتوافق مع كل فلوروفور مضمن في لوحة الجسم المضاد. حدد مكعب المرشح المقابل ومؤشر LED لكل فلوروفور. اضبط شدة كل مؤشر LED وأوقات التعريض لكل قناة. انظر الجدول 1 للحصول على قائمة بإعدادات الصور المستخدمة هنا.
  4. قبل الحصول على الصورة، حدد قناة Hoechst وقم بتشغيل التظليل المرتبط. استخدم معالج التظليل المرتبط لتعيين هذا للهدف المحدد.
    ملاحظة: يوضح هذا البروتوكول بالتفصيل كيفية إجراء صور الشرائح بأكملها من خلال الحصول على عمليات مسح كبيرة للبلاط. هناك حاجة إلى تصحيح التظليل أو التظليل المرتبط للتغلب على الإضاءة غير المتساوية عبر الصور المتجانبة.
  5. في البرنامج ، انقر فوق الزر Live لتصور قناة Hoechst. استخدم مقبض التركيز البؤري الخشن لتركيز قسم المناديل.
  6. حدد كل قناة فلورية وقم بتقييم قسم الأنسجة لنمط التلوين المتوقع لجميع الأجسام المضادة المصنفة بالفلورسنت في الدورة.
  7. حدد Navigator في البرنامج. باستخدام قناة Hoechst والوظيفة الحلزونية في Navigator ، قم بتعيين قسم الأنسجة بالكامل أو المنطقة المهمة المراد تصويرها. إذا تم تصوير أقسام أنسجة متعددة لكل شريحة، فكرر هذه الخطوة لإنشاء خريطة للأنسجة باستخدام Navigator.
  8. حدد عائد (الاستثمار) المراد تصويره باستخدام المضلع أو العصا السحرية أو أدوات تحديد عائد الاستثمار الأخرى في Navigator. ارسم مخطط الأنسجة بعناية لالتقاط أقل عدد من البلاط المطلوب لتغطية عائد الاستثمار المطلوب. احذف اللوحات الإضافية لتقليل إجمالي وقت الاستحواذ.
  9. بمجرد إنشاء عائد الاستثمار، قم بمراجعة إعدادات القناة وضبطها لتقليل وحدات البكسل المشبعة وتحسين تحويل الإشارة إلى ضوضاء. حدد جدول البحث عن خريطة التمثيل اللوني في نافذة عرض الصورة. تشير الألوان إلى مستوى تعبئة وحدات البكسل ، حيث تشير درجات اللون الأحمر والبرتقالي والأصفر والأبيض إلى اختلافات أسهل في الكثافة ؛ تشير وحدات البكسل الزرقاء إلى وحدات البكسل المشبعة. لتجنب فقدان المعلومات والمساس بجودة الصورة، قلل وقت التعريض الضوئي لتقليل عدد وحدات البكسل المشبعة (الزرقاء).
  10. في Navigator، استخدم أداة خريطة التركيز لإنشاء خريطة طبوغرافية للأنسج. قم بتعيين نقطة خريطة التركيز البؤري كل 3-4 مجالات رؤية للمربعات الكبيرة أو العينات غير المستوية.
    ملاحظة: هذه الخطوة ضرورية لعمليات فحص اللوحات الكبيرة المطلوبة لتصوير الشرائح بالكامل. بشكل عام ، يتم قياس جودة الصورة مع عدد نقاط خريطة التركيز المحددة ؛ ومع ذلك ، يمكن أن تستغرق هذه العملية وقتا طويلا ، خاصة بالنسبة لعمليات مسح البلاط الكبيرة.
    1. قم بإنشاء نقاط خريطة التركيز بالترتيب الذي سيتم مسحها ضوئيا بواسطة المجهر. لمطابقة ترتيب مسح البلاط للمجهر المشار إليه، حدد نقاط خريطة التركيز البؤري على طول مسار أفعواني يطابق المسار الذي يستخدمه المجهر.
    2. قم بتعيين نقطة خريطة التركيز البؤري الأولى باستخدام التركيز البؤري اليدوي. استخدم التركيز البؤري التلقائي لنقاط خريطة التركيز البؤري المتبقية. اجلس وراقب للتأكد من تحديد التركيز البؤري الأمثل لكل نقطة خريطة تركيز بؤري. اضبط نقاط خريطة التركيز يدويا حسب الحاجة. قم بزيادة النطاق المستخدم للعثور على كل نقطة خريطة تركيز بؤري للأنسجة غير المستوية أو الكبيرة.
  11. قم بإعداد المعالجة باستخدام المعلمات التالية: المقاصة الحسابية ذات الحجم الصغير (SVCC) مع ضبط معامل الانكسار (RI) لمطابقة وسيط التركيب (هنا ، 1.4) ؛ تم ضبط القوة على 98٪ ، وضبط حجم الميزة على 2,000 نانومتر لعلامات الغشاء أو 3,000 نانومتر للعلامات النووية. قم بتشغيل بروتوكول المقاصة الحسابية أثناء الحصول على الصور.
  12. ابدأ فحص البلاط. اكتب رقم اللوحة وحافظ على عائد الاستثمار ثابتا خلال جميع الدورات.
  13. بعد الحصول على الصور، قم بدمج الصور التي تم مسحها حسابيا مع دمج الفسيفساء الموجود في علامة التبويب العملية ، مع تحديد الخيار السلس . افحص كل صورة بصريا بحثا عن أخطاء الخياطة وكرر دمج الفسيفساء مع معلمات جديدة في حالة وجود أخطاء في التجانب.
    ملاحظة: ستمنع الصور المحاذاة بشكل سيئ تسجيل الصور المكتسبة بشكل متكرر.
  14. إذا لزم الأمر ، استخدم وحدة فصل الصبغة للتعويض عن الامتداد الطيفي بين القنوات كما هو موضحسابقا 5.

6. دورات تعطيل الصبغة ، ووضع العلامات على الأجسام المضادة ، واكتساب الصور

  1. بعد اكتمال الحصول على الصورة ، اغمر الشرائح في أنبوب مخروطي سعة 50 مل من 1x PBS المعقم حتى تسقط الغطاء. إذا لم يسقط الغطاء ، فقم بتشغيل PBS مباشرة فوق الشريحة أو استخدم الملقط لإزالة الغطاء برفق.
  2. قم بإعداد محلول ليثيوم بوروهيدريد (LiBH4) عن طريق قياس 3-5 مجم من المسحوق في قارب وزن بلاستيكي. أضف diH2O بنسبة 1: 1 مباشرة إلى المسحوق (على سبيل المثال ، 3.2 مجم من LiBH4 و 3.2 مل من diH2O) وقم بتجانس المحلول باستخدام ماصة. استخدم حقنة لتشغيل المحلول من خلال مرشح 0.2 ميكرومتر في أنبوب مخروطي سعة 50 مل وتسجيل التركيز والوقت الدقيق لإنشاء المحلول. اترك المحلول يحتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 3-5 دقائق حتى تظهر فقاعات كبيرة في جميع أنحاء المحلول.
    ملاحظة: نوصي باستخدام محلول تعطيل الصبغة في غضون 4 ساعات من التحضير. تنبيه: قم بتنفيذ الخطوات التالية في غطاء الدخان الكيميائي واستخدم معدات الحماية الشخصية المناسبة (PPE). يمكن أن ينتج عن هذا التفاعل غاز الهيدروجين شديد الاشتعال. من المهم العمل بكميات صغيرة من LiBH4 (<10 مجم) في جميع الأوقات. لمزيد من الإرشادات ، شاهد مقاطع الفيديو التعليمية حول كيفية تحضير LiBH4 بأمان على قاعدة المعرفة IBEX10،11.
    استبدل قارورة LiBH4 بعد 4 أسابيع من الاستخدام بسبب انخفاض فعالية التبييض بعد التعرض المتكرر للهواء. نوصي بشراء كميات صغيرة من LiBH4 (1 جرام).
  3. قم بإزالة كل شريحة من نقع 1x PBS ، وتخلص من PBS الزائد بمسح خال من النسالة ، وضعها في غرفة الرطوبة المنزلقة.
  4. عالج كل شريحة غير مغطاة باستخدام LiBH4 لمدة 30 دقيقة عن طريق سحب المحلول مباشرة على الشريحة بحجم كاف لتغطية الأنسجة. قم بإزالة محلول LiBH4 القديم من كل شريحة وقم بتحديثه باستخدام كمية جديدة من LiBH4 في 10 دقائق و 20 دقيقة من نفس محلول مخزون LiBH4 .
  5. اغسل الشرائح على نطاق واسع 3-5x باستخدام 1x PBS. استخدم التبادلات السريعة ل PBS ، ونقع الشرائح لمدة 1 دقيقة لكل غسلة.
  6. للحصول على صورة لطرح الخلفية ، ضع غطاء جديدا على كل شريحة كما هو موضح في الخطوات 4.12-4.13 واحصل على صور لتعطيل الأنسجة بعد الصبغة. قم بإنشاء مشروع جديد لصورة طرح الخلفية وكرر الخطوات 5.2-5.14 للحصول على الصورة. صورة باستخدام نفس عدد المربعات والقنوات وإعدادات القناة ومجالات الرؤية التي تم إنشاؤها لصورة الدورة 1. احتفظ بنقاط خريطة التركيز البؤري في نفس مجالات الرؤية، ولكن استخدم التركيز البؤري التلقائي لضبط كل نقطة خريطة تركيز لهذه الصورة الجديدة.
    ملاحظة: استخدم القناة التي تحتوي على العلامة الإيمانية المتكررة (Hoechst) لتحديد الهياكل الفريدة (الأشكال النووية) الموجودة في الصورة "الحية" (صورة طرح الخلفية، على سبيل المثال) والصورة السابقة (الدورة 1).
  7. لتقليل إشارات الفلورسنت غير المحددة من الأجسام المضادة البيوتينيل في دورة الأجسام المضادة الثانية ، قم بإجراء حجب أفيدين والبيوتين.
    1. تخلص من PBS الزائد وقم بتطبيق محلول حجب أفيدين على كل شريحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
    2. اغسل الشرائح 3-5x باستخدام 1x PBS وتخلص من PBS الزائد عند اكتمال الغسيل.
    3. ضع محلول حجب البيوتين على كل شريحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة واغسل الشرائح 3-5x باستخدام 1x PBS كما في الخطوة 6.7.2.
  8. إعداد مخزن مؤقت جديد خال من BSA (الدورة 2) (جدول المواد) ل
    محلول تلطيخ الأجسام المضادة الأولية # 4 (الدورة 2) ومحلول تلطيخ الأجسام المضادة الثانوية # 2 (الدورة 2).
    ملاحظة: لن تتطلب هذه الحلول ألبومين مصل الأبقار لأن BSA يمكن أن يضر بخطوة حجب أفيدين / البيوتين.
  9. تخفيف الأجسام المضادة الأولية بالتركيزات الموصى بها من قبل الشركة المصنعة في محلول تلطيخ الأجسام المضادة الأولية #4 (الدورة 2). قم بتدوير هذا المحلول برفق وأضفه إلى كل شريحة داخل غرفة الرطوبة ، مما يضمن تغطية الأنسجة بالكامل بمحلول الجسم المضاد الأساسي. ضع حجرة الرطوبة المنزلقة مع الشرائح في الميكروويف وقم بتشغيل برنامج الأجسام المضادة الأساسية لمدة 30 دقيقة تقريبا كما هو مفصل في الخطوة 2.7-2.8.
  10. قم بإجراء وضع العلامات الثانوية على الأجسام المضادة باستخدام محلول تلطيخ الأجسام المضادة الثانوية # 2 (الدورة 2) كما هو مفصل في الخطوات 4.6-4.9. بمجرد اكتمال التلوين ، ضع غطاء جديدا على كل شريحة كما هو موضح سابقا في الخطوات 4.12-4.13. ضع الشريحة مرة أخرى على مرحلة المجهر وأعد وضع الشريحة لتكون في نفس مستوى XY للصور السابقة.
    ملاحظة: استخدم القناة التي تحتوي على العلامة الإيمانية المتكررة (Hoechst) لتحديد الهياكل الفريدة (الأشكال النووية) الموجودة في الصورة "الحية" (الدورة 2، على سبيل المثال) والصورة السابقة (الدورة 1).
  11. قم بإنشاء مشروع جديد لصورة الدورة 2 وكرر الخطوات 5.2-5.14 للحصول على صورة الدورة 2. صورة باستخدام نفس عدد المربعات والقنوات وإعدادات القناة ومجالات الرؤية التي تم إنشاؤها لصورة الدورة 1. احتفظ بنقاط خريطة التركيز البؤري في نفس مجالات الرؤية ولكن استخدم التركيز البؤري التلقائي لضبط كل نقطة خريطة تركيز لهذه الصورة الجديدة. بمجرد الحصول على صورة الدورة 2 ، انتقل إلى محاذاة الصورة أو كرر الخطوات في القسم 6 لدورات إضافية مع الأجسام المضادة المترافقة مباشرة. ملاحظة: استخدم القناة التي تحتوي على العلامة الإيمانية المتكررة (Hoechst) لتحديد الهياكل الفريدة (الأشكال النووية) الموجودة في الصورة "الحية" (صورة الدورة 2، على سبيل المثال) والصورة السابقة (الدورة 1). تتطلب الدورات الإضافية أجساما مضادة مترافقة مباشرة لأن IBEX لا يجرد الأجسام المضادة.

7. محاذاة الصورة

  1. قم بتحويل الصور الأولية من ملفات إخراج المجهر .lif إلى ملفات .ims باستخدام محول الملفات المجاني ومعالجة الصور باستخدام البرنامج مفتوح المصدر كما هو موضح سابقا5 ومفصل في مقاطع الفيديو على قاعدة المعرفة IBEX10،11.
  2. لكل دورة تصوير ، قم بتحرير الملف وقم بتطبيق أي خطوات معالجة مطلوبة (على سبيل المثال ، تسمية القناة ، والتلوين الزائف للقناة).
    1. قم بإجراء طرح الخلفية وعتبة القناة باستخدام وظائف حساب القناة التي تم إنشاؤها ل SimpleITK لتقليل إشارة التألق الذاتي (https://niaid.github.io/imaris_extensions/XTChannelArithmetic.html).
      ملاحظة: نقوم بتنفيذ هذه الخطوات على كل صورة (على سبيل المثال، الدورة 1، الدورة 2) قبل محاذاتها في صورة مركبة واحدة. هذا لأنه من الأسهل العمل على الصور الفردية الأصغر من الصورة المدمجة الأكبر.
  3. ضع استراتيجية تسمية متسقة لاستخدام برنامج التسجيل. قم بتسمية القنوات ذات البادئة فاصلة الحرف اللاحق (على سبيل المثال "Cycle1 CD8_AF647") مع مسافة كحرف فاصل للإشارة إلى القناة التي استخدم فيها الجسم المضاد المضاد CD8 AF647 في الدورة الأولى.
    ملاحظة: راجع امتداد ملف التعليمات لمزيد من التفاصيل: https://niaid.github.io/imaris_extensions/XTRegisterSameChannel.html.
  4. بعد تسمية جميع القنوات بشكل مناسب ، قم بتشغيل برنامج التسجيل ، وانقر فوق ملحقات Imaris | سيمبيل آي تي كي | أفين.
  5. قم بتحميل ملف .ims لكل دورة باستخدام زر الاستعراض بجوار أسماء الملفات. أدخل حرف فاصل بادئة اسم القناة. إذا اتبعت المثال أعلاه، فاكتب مسافة واحدة، ثم انقر على التالي.
  6. حدد قناة التسجيل المستخدمة كعلامة ائتمانية مشتركة بين الدورات (مثل Hoechst).
  7. حدد الصورة الثابتة ، الصورة التي سيتم تسجيل الصور الأخرى فيها.
    ملاحظة: نوصي بالتسجيل في الدورة 2 من الصور التكرارية.
  8. حدد الدليل المطلوب ل "ملف الإخراج". سيتم تعيين خيار بدء التسجيل عند الدقة بأقصى دقة افتراضيا للسماح بأفضل تسجيل ممكن. إذا كانت قوة الحوسبة محدودة، فقم بتقليل هذه المعلمة.
    ملاحظة: بالنسبة للبيانات الموضحة هنا (12-15 جيجابايت لكل صورة) استخدمنا دقة قصوى تبلغ 5.
  9. انقر فوق تسجيل للبدء. بمجرد اكتمال التسجيل ، انتظر حتى يظهر الزر "إعادة التشكيل وحفظ الصورة المجمعة " ، وانقر فوقه ، وانتظر حتى ينتقل شريط التقدم حتى يكتمل.
  10. افتح ملف الإخراج المكتمل في برنامج المعالجة. ستكون الصورة المسجلة مع جميع الدورات ومعلومات القناة متاحة وجاهزة للتحليل أو النشر.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

يتطلب تصميم لوحة تصوير متعددة الإرسال قائمة على الأجسام المضادة وقتا وجهدا وجهدا ومواردكبيرة 12. تظهر هذه التحديات بشكل خاص عند تصميم لوحة لعينات FFPE المؤرشفة من الأنسجة عالية الفلورسنت كما هو موضح هنا (الشكل 1). للتغلب على هذه التحديات ، حددنا أولا ألمع الفلوروفورات المتوافقة مع بروتوكول تعطيل الصبغة الخاص بنا (الجدول 1). على سبيل المثال ، تم الإبلاغ عن أن الأجسام المضادة الثانوية Alexa Fluor Plus لديها إشارة إلى ضوضاء أكبر بمقدار 4 أضعاف في فحوصات ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يتميز علم أمراض الرئة السريري من السل الرئوي بالتهاب الورم الحبيبي الناخر. يحدث علم أمراض الرئة NTM بشكل أساسي في مجموعتين متميزتين من المرضى مع نمطين مرضيين منفصلين: إصابة الرئة المعزولة التي تتميز بالتهاب الورم الحبيبي مع طمس الشعب الهوائية وتشكيل التجويف في الأفراد ذوي الكفاءة المناعية ، أو مرض عقيدي منتشر يؤثر على الرئتين والأعضاء الأخرى لدى الأفراد الذين يعانون من نقص المناعة13،14،15،<...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

A.J.R. موظف في Leica Microsystems، Inc. يعلن المؤلفون الآخرون عدم وجود مصالح متضاربة.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل من قبل برنامج البحوث الداخلية ل DIR / NIAID و NCI و NHLBI. تم إنشاء الشكل 1 باستخدام BioRender بموجب اتفاقية ترخيص مؤسسي مع المعاهد الوطنية للصحة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
0.3٪ تريتون-X-100سيجما ألدريتشتي 8787حل لحجب المخزن المؤقت
1٪ BSAسيجما ألدريتشأ4503حل لحجب المخزن المؤقت
1٪ كتلة BD Fc البشريةBD Biosciences564220كتلة Fc مطلوبة لحظر المخزن المؤقت
مصباح LED 150 واطالامازونB07VH3CVSFمصدر ضوء LED للإشعاع الضوئي للأنسجة
1x PBS   ؛جيبكو10010-023حل لحجب المخزن المؤقت وخطوات الغسيل
حاوية تخزين 20 جالونالامازونB001B1C4G0حاوية لعملية التشعيع الضوئي
40 واط RGBW الفيضان LED مصباح   ؛الامازونB08QFPJSMDمصدر ضوء RGB للإشعاع الضوئي للأنسجة
Ag85BأبكامAB43019 / NAالأجسام المضادة لتصوير IBEX. انظر الجدول 1.
أكتين ألفا الملساء العضلات DyLight 755نوفوس بيولوجيڪلNBP2-345221R / NAالأجسام المضادة لتصوير IBEX. انظر الجدول 1.
مجموعة حجب Avidin / Biotinأبكامأب64212محلول حجب الأفيدين والبيوتين
BD Cytofix / CytopermBD Biosciences554714حل التثبيت
حل بوند لإزالة الشمعلايكا بيوسيستمزNC0221076محلول إزالة البارافين
حل استرجاع الحاتمة BOND 1لايكا بيوسيستمزNC0235529محلول استرجاع الحاتمة القائم على السترات (ER1)
حل استرجاع الحاتمة BOND 2لايكا بيوسيستمزNC0235530محلول استرجاع الحاتمة القائم على الأس الهيدروجيني 9 (ER2)
نظام الكشف عن البحوث BONDلايكا بيوسيستمزNC0396648كاشف تلطيخ البحث الآلي
BOND RX Research Stainerلايكا بيوسيستمزNAمنصة تلطيخ البحث الآلي
محلول غسيل بوندلايكا بيوسيستمزNC0221077عازلة الغسيل
سي دي 15BD Biosciences347420/AB_400298الأجسام المضادة لتصوير IBEX. انظر الجدول 1.
CD20 eFluor 660ثيرمو فيشر العلمي50-0202-82/AB_11150959الأجسام المضادة لتصوير IBEX. انظر الجدول 1.
CD4 أليكسا فلور 488آر آند د سيستمزFAB8165G/AB_2728839الأجسام المضادة لتصوير IBEX. انظر الجدول 1.
CD45 فيكواريثرين (PE)نوفوس بيولوجيڪلNBP2-34528PE / NAالأجسام المضادة لتصوير IBEX. انظر الجدول 1.
CD68 iFluor 594كابريكو للتقنيات الحيوية1064135/AB_2892745الأجسام المضادة لتصوير IBEX. انظر الجدول 1.
الحمار المضادة للماعز IgG Alexa Fluor Plus 488ثيرمو فيشر العلميA32814/AB_2762838الأجسام المضادة لتصوير IBEX. انظر الجدول 1.
الحمار المضادة للفأر IgG Alexa Fluor Plus AF647ثيرمو فيشر العلميA32787/ AB_2762830الأجسام المضادة لتصوير IBEX. انظر الجدول 1.
الحمار المضادة للفأر IgM Alexa Fluor 488جاكسون إيمونوبيرسيرش715-545-020/AB_2340844الأجسام المضادة لتصوير IBEX. انظر الجدول 1.
حمار مضاد للأرانب IgG Alexa Fluor Plus AF555ثيرمو فيشر العلميA32794/AB_2762834الأجسام المضادة لتصوير IBEX. انظر الجدول 1.
نظام تلطيخ EasyDipتوريد الوافدين الجدد5300 مجموعةنظام تلطيخ الشرائح
فلوروماونت-جيثيرمو فيشر العلمي00-4958-02وسائط التركيب
هوشستالبيوتيوم40046وصمة عار نووية لتصوير IBEX. انظر الجدول 1.
محول ملفات Imaris x64 10.2.0إماريس أكسفورد إنسترومنتسمحول ملفات مجاني
برنامج ImarisViewer x64 10.2.0إماريس أكسفورد إنسترومنتسبرنامج مجاني لمعالجة الصور
قلم ImmEdgeمختبرات ناقلاتإتش -4000قلم حاجز مسعور
ليثيوم بوروهيدريد (1 جرام)STREM للكيماويات93-0397مادة كيميائية لتعطيل الصبغة ، قم بشراء كميات صغيرة من هذه المادة الكيميائية (1 جرام)
لوميكان بيوتينآر آند د سيستمزBAF2846الأجسام المضادة لتصوير IBEX. انظر الجدول 1.
نظارات الغطاء الصغيرVWR48393-241أغطية الشرائح الزجاجية
بان سيتوكيراتين أليكسا فلور 750نوفوس بيولوجيڪلNBP2-33200AF750 / AB_2868569الأجسام المضادة لتصوير IBEX. انظر الجدول 1.
نظام الميكروويف PELCO BioWave Proشركة تيد بيلا36500-230ميكروويف علمي غير مسخن
بيلكو SteadyTemp Proشركة تيد بيلا50062تحكم مؤتمت بالكامل في درجة الحرارة للميكروويف العلمي
سيمبلل آي تي كيبرنامج مفتوح المصدربرامج التسجيل ومعالجة القنوات
ستريبتافيدين أليكسا فلور 594ثيرمو فيشر العلميس 11227كاشف الملصقات لتصوير IBEX. انظر الجدول 1.
مجهر واسع المجالأنظمة لايكا الدقيقةNAجهاز تصوير Leica Microsystems THUNDER مع مصدر ضوء LED8 وبرنامج LAS X (3.7.1.21655). للتصوير الفلوري ، تم استخدام مرشح رباعي النطاق مخصص مع عجلة مرشح خارجية (PN: 11536075) مع مرشحين إضافيين أحادي النطاق (PN: 8118215) لتصوير سبع قنوات صبغ لكل تمريرة. خطوط الإثارة وثنائية اللون والانبعاث هي (1) مكعب رباعي النطاق: ثنائي اللون عند 391/32 ، 479/33 ، 554/24 ، 638/31 ، لا توجد مرشحات إثارة أو انبعاث ؛ (2) موضع عجلة المرشح الخارجية 1: 434/32 ، الموضع 2: 520/40 ، الموضع 3: 585/20 ، الموضع 4: 720/60 ، الموضع 5: المرور ؛ (3) فرقة واحدة 1 و [مدش] ؛ 585/22 إثارة ، 594 ثنائي اللون ، 625/30 انبعاث ؛ (4) فرقة واحدة 2 و [مدش] ؛ 635/20 إثارة ، 647 ثنائي اللون ، 667/30 انبعاث.
منظف العدسات البصرية ZeissالامازونB00GPVQVCOمنظف العدسة الموضوعية المجهري
<قوي>الأجسام المضادة
Ag85Bأبكامأب43019الأرنب متعدد النسيلة IgG ، الدورة 1
أكتين ألفا الملساء العضلات DyLight 755نوفوس بيولوجيڪلNBP2-345221R1A4/asm-1، الدورة 1
CD4 أليكسا فلور 488آر آند د سيستمزFAB8165Gالماعز متعدد النسيلة IgG ، الدورة 1
CD8 أليكسا فلور 647بيو ليجند372906C8/144B، الدورة 1
CD68 iFluor 594كابريكو للتقنيات الحيوية1064135KP1 ، الدورة 1
الحمار المضادة للماعز IgG Alexa Fluor Plus 488ثيرمو فيشر العلميأ32814حمار متعدد النسيلة ، الدورة 1
الحمار المضادة للفأر IgG Alexa Fluor Plus AF647ثيرمو فيشر العلميأ 32787حمار متعدد النسيلة ، الدورة 1
حمار مضاد للأرانب IgG Alexa Fluor Plus AF555ثيرمو فيشر العلميأ32794حمار متعدد النسيلة ، الدورة 1
هوشستالبيوتيوم40046الملصق النووي ، الدورة 1
سي دي 15BD Biosciences347420MMA ، الدورة 2
CD20 eFluor 660ثيرمو فيشر العلمي50-0202-82L26 ، الدورة 2
CD45 فيكواريثرين (PE)نوفوس بيولوجيڪلNBP2-34528PE2B11 + PD7/26، الدورة 2
الحمار المضادة للفأر IgM Alexa Fluor 488جاكسون إيمونوبيرسيرش715-545-020حمار متعدد النسيلة ، الدورة 2
لوميكان بيوتينآر آند د سيستمزBAF2846الماعز متعدد النسيلة IgG ، الدورة 2
بان سيتوكيراتين أليكسا فلور 750نوفوس بيولوجيڪلNBP2-33200AF750AE-1/AE-3، الدورة 2
ستريبتافيدين أليكسا فلور 594ثيرمو فيشر العلميس 11227غير متاح ، الدورة 2
هوشستالبيوتيوم40046الدورة 2
<قوية>حلول
حظر المخزن المؤقت (الدورة 1) < / قوي>< / em>
تريتون إكس 100سيجما ألدريتشتي 87870.3٪ من حيث الحجم
جيش صرب البوسنهسيجما ألدريتشأ45031٪ من حيث الحجم
كتلة BD Fc البشريةBD Biosciences5642201٪ من حيث الحجم
1x PBS   ؛جيبكو10010-02397.7٪ من حيث الحجم
<قوي>محلول تلطيخ الأجسام المضادة الأولية # 1 (الدورة 1) < / قوي>
المخزن المؤقت للحجب (الدورة 1)انظر أعلاهقم بتعبئة الحجم بعد إضافة الأجسام المضادة
هوشستالبيوتيوم400461:5000
CD8 AF647بيو ليجند3729061:10
<قوي>محلول تلطيخ الأجسام المضادة الأولية # 2 (الدورة 1) < / قوي>
المخزن المؤقت للحجب (الدورة 1)انظر أعلاهقم بتعبئة الحجم بعد إضافة الأجسام المضادة
CD4  أف488آر آند د سيستمزFAB8165G1:10
Ag85BأبكامAB43019 / NA1:100
<قوي> حل تلطيخ الأجسام المضادة الثانوية # 1 (الدورة 1) < / قوي>
المخزن المؤقت للحجب (الدورة 1)انظر أعلاهقم بتعبئة الحجم بعد إضافة الأجسام المضادة
الحمار المضادة للماعز AF Plus 488ثيرمو فيشر العلميA32814/AB_27628381:100
الحمار المضادة للأرانب AF Plus 555ثيرمو فيشر العلميA32794/AB_27628341:100
الحمار المضادة للماوس AF Plus 647ثيرمو فيشر العلميA32787/AB_27628301:50
<قوي>محلول تلطيخ الأجسام المضادة الأولية # 3 (الدورة 1) < / قوي>
المخزن المؤقت للحجب (الدورة 1)انظر أعلاهقم بتعبئة الحجم بعد إضافة الأجسام المضادة
CD68 iF594كابريكو للتقنيات الحيوية10641351:10
أ-SMA DL755نوفوس بيولوجيڪلNBP2-345221R / NA1:30
<قوي> المخزن المؤقت للحجب الخالي من BSA (الدورة 2)  < / قوي >< / م>
تريتون إكس 100سيجما ألدريتشتي 87870.3٪ من حيث الحجم
كتلة BD Fc البشريةBD Biosciences5642201٪ من حيث الحجم
1x PBS   ؛جيبكو10010-02398.7٪ من حيث الحجم
<قوي>محلول تلطيخ الأجسام المضادة الأولية # 4 (الدورة 2) < / قوي>
المخزن المؤقت للحجب الخالي من BSA (الدورة 2)انظر أعلاهقم بتعبئة الحجم بعد إضافة الأجسام المضادة
سي دي 15BD Biosciences3474201:30
لوميكان بيوتينآر آند د سيستمزBAF28461:100
CD45 PEنوفوس بيولوجيڪلNBP2-34528PE1:20
CD20 eFluor 660ثيرمو فيشر العلمي50-0202-821:10
بان سيتوكيراتين AF750نوفوس بيولوجيڪلNBP2-33200AF7501:10
<قوي> حل تلطيخ الأجسام المضادة الثانوية # 2 (الدورة 2) < / قوي>
المخزن المؤقت للحجب الخالي من BSA (الدورة 2)انظر أعلاهقم بتعبئة الحجم بعد إضافة الأجسام المضادة
الحمار المضادة للفأر IgM AF488جاكسون إيمونوبيرسيرش715-545-020/AB_23408441:100
ستريبافيدين AF594ثيرمو فيشر العلميس 112271:200

المراجع

  1. Global tuberculosis report 2023. , World Health Organization. https://iris.who.int/bitstream/handle/10665/373828/9789240083851-eng.pdf?sequence=1 (2023).
  2. Dahl, V. N., et al. Global trends of pulmonary infections with nontuberculous mycobacteria: A systematic review. Int J Infect Dis. 125, 120-131 (2022).
  3. Cadena, A. M., Fortune, S. M., Flynn, J. L. Heterogeneity in tuberculosis. Nat Rev Immunol. 17 (11), 691-702 (2017).
  4. Radtke, A. J., et al. Ibex: A versatile multiplex optical imaging approach for deep phenotyping and spatial analysis of cells in complex tissues. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (52), 33455-33465 (2020).
  5. Radtke, A. J., et al. Ibex: An iterative immunolabeling and chemical bleaching method for high-content imaging of diverse tissues. Nat Protoc. 17 (2), 378-401 (2022).
  6. Hickey, J. W., et al. Spatial mapping of protein composition and tissue organization: A primer for multiplexed antibody-based imaging. Nat Methods. 19 (3), 284-295 (2022).
  7. Duong, H., Han, M. A multispectral led array for the reduction of background autofluorescence in brain tissue. J Neurosci Methods. 220 (1), 46-54 (2013).
  8. Nolta, N. F., Liberti, A., Makol, R., Han, M. Gelatin embedding and LED autofluorescence reduction for rodent spinal cord histology. J Neurosci Methods. 346, 108924(2020).
  9. Radtke, A. J., et al. Multi-omic profiling of follicular lymphoma reveals changes in tissue architecture and enhanced stromal remodeling in high-risk patients. Cancer Cell. 42 (3), 444-463.e10 (2024).
  10. Radtke, A. J., et al. The IBEX knowledge-base: A central resource for multiplexed imaging techniques. PLoS Biol. 23 (3), e3003070(2025).
  11. Yaniv, Z., et al. The IBEX imaging knowledge-base: A community resource enabling adoption and development of immunofluoresence imaging methods. ArXiv. , (2024).
  12. Quardokus, E. M., et al. Organ mapping antibody panels: A community resource for standardized multiplexed tissue imaging. Nat Methods. 20 (8), 1174-1178 (2023).
  13. Mcshane, P. J., Glassroth, J. Pulmonary disease due to nontuberculous mycobacteria: Current state and new insights. Chest. 148 (6), 1517-1527 (2015).
  14. Hsu, A. P., et al. Mutations in GATA2 are associated with the autosomal dominant and sporadic monocytopenia and mycobacterial infection (monomac) syndrome. Blood. 118 (10), 2653-2655 (2011).
  15. Vinh, D. C., et al. Autosomal dominant and sporadic monocytopenia with susceptibility to mycobacteria, fungi, papillomaviruses. Blood. 115 (8), 1519-1529 (2010).
  16. Filipe-Santos, O., et al. X-linked susceptibility to mycobacteria is caused by mutations in nemo impairing CD40-dependent IL-12 production. J Exp Med. 203 (7), 1745-1759 (2006).
  17. Galeotti, T., Van Rossum, G. D., Mayer, D. H., Chance, B. On the fluorescence of NAD(P)H in whole-cell preparations of tumours and normal tissues. Eur J Biochem. 17 (3), 485-496 (1970).
  18. Schneckenburger, H., Gessler, P., Pavenstadt-Grupp, I. Measurements of mitochondrial deficiencies in living cells by microspectrofluorometry. J Histochem Cytochem. 40 (10), 1573-1578 (1992).
  19. Harman, D. Lipofuscin and ceroid formation: The cellular recycling system. Adv Exp Med Biol. 266, 3-15 (1989).
  20. Brunk, U. T., Terman, A. Lipofuscin: Mechanisms of age-related accumulation and influence on cell function. Free Radic Biol Med. 33 (5), 611-619 (2002).
  21. Jung, T., Bader, N., Grune, T. Lipofuscin: Formation, distribution, and metabolic consequences. Ann N Y Acad Sci. 1119, 97-111 (2007).
  22. Sherratt, M. J. Tissue elasticity and the ageing elastic fibre. Age (Dordr). 31 (4), 305-325 (2009).
  23. Laurent, G. J. Lung collagen: More than scaffolding. Thorax. 41 (6), 418-428 (1986).
  24. Lakowicz, J. R. Principles of frequency-domain fluorescence spectroscopy and applications to cell membranes. Subcell Biochem. 13, 89-126 (1988).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

التصوير المتعددالعينات ذات الفلورة الذاتيةالبروتوميات المكانيةأنسجة الرئة المثبتة بالفورمالدهيد والمطمورة في البارافين (FFPE)بروتوكول التشعيع الضوئيتصميم لوحة الأجسام المضادةتصوير الشريحة الكاملةالالتهاب الورمي الحبيبيرسم خرائط الخلايا المناعية
يعمل سير العمل المحسن للتبييض التكراري على توسيع التصوير المتعدد للعينات السريرية عالية الفلورسنت الذاتي
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.