مقالة منهجية

تقدير الحمض النووي الريبي المتكرر التيلوميري من مركبات هجينة DNA/RNA

DOI:

10.3791/67984

⸱

ديسمبر 5, 2025

 ,  ,  ,  , 
1Betul-Ziya Eren Genome and Stem Cell Center, Erciyes University, 2Department of Medical Biology, Faculty of Medicine, Erciyes University, 3INSERM-CNRS, Université de Nice

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتيح هذا البروتوكول عزل الهجائن بين DNA:RNA والحمض النووي الريبي المرتبط بها (بما في ذلك TERRA) عبر عدة أنسجة. بينما يلتقط نهجنا مجموعة فرعية من التفاعلات الهجينة، سيكون من الضروري إجراء خرائط جينومية إضافية لتوصيف الجينوم الكامل.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

RNA المتكرر التيلوميري (TERRA) هو RNA طويل غير مشفر يتم نسخه من جميع التيلوميرات في حقيقيات النواة العليا، وفقط جزء فرعي من هذه الجزيئات يشكل هجنا مستقرة من DNA/RNA عند التيلوميرات. لقد وضعنا بروتوكولا جزيئيا مفصلا لتحديد وتنقية هذه التقديرات الهجينة. تمكن هذه الطريقة المبسطة من استخراج تفاعلات هجينة DNA/RNA تتكون طبيعيا في الجسم الحي ، ويمكن تطبيقها للكشف عن جميع هذه المناطق. من خلال تقليل الخطوات الإجرائية، تكون هذه التقنية فعالة للغاية في عزل الحمض النووي الريبي المتصل بالحمض النووي، مما يقدر موثوقية وقابلية تكرار التسلسل اللاحق. يستخدم كاشف إيزوثيوسيانات الجوانيدين في التحلل الكلي للخلايا وتجانسها، مع الحفاظ على سلامة الأحماض النووية (الحمض النووي والحمض النووي الريبي)، وخاصة الهجائن بين الحمض النووي والحمض النووي الريبي. إضافة الكلوروفورم تبدأ فصل الطور عبر الطرد المركزي (ثلاث طبقات مميزة): مرحلة الفينول الكلوروفورم السفلى، مرحلة التفاعل، ومرحلة مائية علوية. يتم الاحتفاظ بالحمض النووي الريبي، الذي يطلق من كل من النواة والسيتوبلازم، في الطور المائي، بينما يحتصر الحمض النووي النووي عالي الوزن الجزيئي، بما في ذلك مناطق هجينة DNA/RNA، في الطور التداخلي. مع كحول الأيزوبروبيل، يليه الطرد المركزي، يتم استعادة الطور المائي (RNA الحر)، والطور التداخلي، والحمض النووي، وخاصة الهجائن DNA/RNA. لإزالة آثار البروتينات المتبقية، يتم حضن العينة ببروتيناز K. يستخدم العلاج بإزيز DNase، واستخراج الفينول/الكلوروفورم، والكحول الأيزوبروبيل، والطرد المركزي لإطلاق RNA هجين مع DNA.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يؤدي نسخ الجينوم إلى تكوين جزيئات هجينة مؤقتة تعرف باسم حلقات R، والتي تتكون من هياكل ثلاثية الخيوط. تشمل هذه البنى الخيوط غير المشفرة والترميز للحمض النووي، حيث يتم إزاحة السلسلة غير المشفرة بتكوين الهجائن مع الحمض النووي الريبيالمكمل 1. أثناء نسخ الجينوم، يتم إنتاج عدد كبير من الحمض النووي الريبي غير المشفر بمعدلات متفاوتة من كلا شيطي الحمض النووي. تعمل معظم هذه الحمض النووي الريبي كوسيط قصير العمر، لكن بعضها يلعب أدوارا حاسمة في الشبكات التنظيمية التي تحكم بيولوجيا الجينوم، خصوصا تلك التي تنشأ من مناطق غير مشفرة مثل التيلوميرات والمركزات1. قد يعكس توزيع هجائن DNA/RNA في الجينوم أيضا نشاط النسخ للخلايا في أي وقت.

مع تزايد الاهتمام بالوظائف التنظيمية للحمض النووي الريبي غير المشفر، يزداد الفضول لتتبع نسخها وتوزيعها عبر الجينوم، خاصة في شكل هجن مؤقتة بين DNA/RNA. ولمعالجة ذلك، طورنا اختبارا مستقلا للكشف عن هجائن DNA/RNA مستقرة، قابل للتطبيق على أي خلية أو نسيج بيولوجي. تمكن هذه الطريقة من عزل الحمض النووي الريبي المكملة التي تتنقى مع الحمض النووي، تليها التحليل عبر ترسيب PCR أو التسلسل.

أثبتت الأبحاث من نماذج زراعة الخلايا أنه أثناء تكرار ونسخ الحمض النووي، يمكن أن تحدث إجهاد النسخ، وتلف الحمض النووي، وتصادمات شوك التكرار، وتوقف بوليميراز RNA II بسبب أحداث طوبولوجية وهيكلية وتهجين. هذه العمليات، وخاصة لف اللولب المزدوج للحمض النووي، تسبب إجهادا التوائيا، مما قد يؤدي إلى تكوين هياكل غير طبيعية، مثل حلقات R، أثناء النسخ1.

تم توليد معظم بيانات حلقة R باستخدام الخميرة أو الخلايا السرطانية المزروعة، معتمدة على الجسم المضاد ويدي النسيلة الهجين S9.6 الخاص بالحمض النووي الريبي الريبي. أظهرت الدراسات الهيكلية أن شظية ارتباط المستضد (Fab) في S9.6 ترتبط تحديدا بمزيج RNA-DNA مزدوج 13 bp. الكشف القائم على الأجسام المضادة لحلقات R هو التحديد الأساسي للهجينة التي تتكون في مناطق غنية بالجوانين أثناء النسخ، حيث من المرجح أن يحدث تهجين RNA مع DNA معزز. تشير الدراسات المخبرية باستخدام الجسم المضاد S9.6 إلى أن الحمض النووي الريبي الذي يحتوي على أربعة أو أكثر من الجوانين المتتالية بالقرب من نهايته 5′ يمكن اكتشافه بسهولة أكبر، مما يرتبط بزيادة تكوين حلقة R1. تساعد إنزيمات مختلفة مثل الهيليكاز، والتوبويزوميرات، وRNase H1، وRNase H2، في الحفاظ على توازن حلقة R أثناء النسخ. يرتبط اضطراب توازن حلقة R بزيادة عدم الاستقرار الجيني، مما يساهم في أمراض مثل السرطان والاضطرابات التنكسية العصبية2.

التيلوميرات، التي كانت يعتقد سابقا أنها صامتة من الناحية النسخية، وجد أنها تنسخ RNA طويلة غير مشفرة تعرف باسم RNA المتكرر التيلوميري (TERRA)3. تنشأ هذه النسخ من مناطق تحت التيلوميرية وتحتوي على تكرارات تيلوميرية، وتلعب أدوارا أساسية في الحفاظ على توازن التيلوميرات4. في هذه المخطوطة، نشير إلى 'RNA هجين TERRA' على أنها جزيئات RNA التي تطلق من مركبات هجينة DNA/RNA عبر معالجة DNase I، ويفترض أنها تشمل تسلسلات TERRA بناء على خصائص الاستخلاص وخصوصية البرايمر.

يحدث نسخ TERRA في اتجاه المركزي إلى التيلومير، ويتغير طوله، يتراوح من 100 bp إلى 9 كيلو بلت، حيث يتم استرجاع غالبية TERRA في الطور المائي كجزيء RNA حر. يبقى جزء صغير متصلا بالحمض النووي ويرتبط بالعمليات البيولوجية الرئيسية، مثل السرطان والشيخوخة. تختلف مستويات TERRA حسب المواقع تحت التيلوميرية وتنظم بواسطة الحالة غير المتجانسة للتيلوميرات6. تشير دراسات زراعة الخلايا أيضا إلى أن نسخ TERRA من مناطق تحت تيلوميرية مختلفة تظهر تباينا في الطول. في بعض دراسات زراعة الخلايا المشتقة من الأورام، وجد الباحثون أن منطقة 20q تحت التيلوميرية هي المصدر الرئيسي لنصوص TERRA، وغالبا ما يتم ميثيل هذه المنطقة عند جزرها CpG 7,8,9. في الفئران، تعد المنطقة تحت التلومورية من الكروموسوم 18 موقعا رئيسيا لإنتاج TERRA10,11. بالإضافة إلى ذلك، أظهرت PAR-TERRAs، وهي نسخ TERRA منشأ من مناطق تحت التيلوميرية الزائفة في الخلايا الجنينية، أن لديها ما يصل إلى 200 ضعف TERRA أكثر من الكروموسوم 1811,12.

يتم التحكم في نسخ TERRA بواسطة مثيلة الحمض النووي وتعديلات الهيستون مثل H3K9 وH4K20 ثلاثي ميثيلة، التي تثبط TERRA، بينما يرتبط أسيتلة الهيستون إيجابيا بنسخ TERRA 6,13,14. يرتبط TERRA أيضا بالمناطق خارج التيلومير، بما في ذلك المواقع والتداخل الجيني والإنترونات، مما يشير إلى دور أوسع في تنظيم الجينوم2.

بالإضافة إلى ذلك، يؤدي استنزاف TERRA إلى اختلال في تنظيم العديد من الجينات، خصوصا تلك القريبة من مواقع ربطه، مما يشير إلى دوره في تنظيم الكروماتين فوق الجيني والتعبير الجيني2. تراكم TERRA عند التيلوميرات القصيرة يعزز تمدد التيلوميرات المعتمدة على إعادة التركيب المتماثل (HR)، مما يساهم في توازن طول التيلوميرات15,16.

لمعالجة دور TERRA وغيرها من الهجائن DNA/RNA، استخدمنا اختبارا مصمما خصيصا لعزل جزيئات RNA المتهجينة بشكل مستقر مع DNA. لفترة وجيزة، تم عزل النوى وعلاجها بأنيس RNase خال من DNase لإزالة الحمض النووي الريبي غير المحمي. ثم تم استخراج هجينة DNA/RNA باستخدام هضم انتقائي لإنزيم DNa، مما يطلق RNA تم تهجين الحمض النووي النووي. تم تحليل هذا الجزء، المعروف باسم "RNA المرتبط بالهجين بين DNA/RNA"، لاحقا بواسطة RNA-seq ومقارن مع RNA القابل للذوبان الكلي الذي تم الحصول عليه من خلال استخراج الفينول-كلوروفورم القياسي17. سمح لنا هذا النهج بتحديد مواقع تكوين هجين RNA-DNA في كل من المواقع التلوميرية وغير التلوميرية، ومقارنة الملفات التصويرية لمجموعات RNA المرتبطة بالحمض النووي مقابل القابلة للذوبان. كان يعتبر TERRA سابقا مجرد منتج ثانوي لنسخ التيلوميرات، لكنه الآن معروف بدوره المزدوج في صيانة التيلوميرات، حيث يؤثر على نشاط التيلوميراز وإعادة التركيب المتماثل، وهو أمر بالغ الأهمية لتوازن طول التيلوميرات. علاوة على ذلك، مكنت التطورات في اختبارات الكشف من فهم أكثر تفصيلا للتفاعلات الديناميكية بين الحمض النووي الريبي والحمض النووي عبر الجينوم. تمهد هذه المعرفة الطريق لمزيد من الاستكشاف لتداعيات الهجائن DNA/RNA، مثل TERRA، في العمليات الخلوية وروابطها المحتملة بأمراض مثل السرطان واضطرابات التنكس العصبي. الأبحاث المستمرة في هذا المجال بلا شك ستعمق فهمنا لتنظيم الجينوم وأهميته للصحة والمرض.

الطريقة المستخدمة لتحديد جزيئات TERRA وهجائن DNA/RNA في هذه الدراسة هي نفس بروتوكول استخلاص الجوانيدينيوم ثيوسيانات-فينول-الكلوروفورم المحسن الموضح هنا. تم تطوير هذا البروتوكول للسماح بعزل هجين RNA-DNA/RNA في الوقت نفسه، والحمض النووي الريبي الكلي، والحمض النووي الجينومي ضمن سير عمل موحد. من خلال تعديل استراتيجي لطريقة الفصل الكلاسيكية ثلاثية الأطوار، يسهل هذا البروتوكول الاحتفاظ الانتقائي لهجينة DNA/RNA عند الطور الداخلي للفينول، مما يقلل من فقدانها - وهو قيد جوهري في تقنيات الاستخراج التقليدية.

تقليديا، كان الكشف عن وعزل هجين DNA/RNA يعتمد على التقرب المناعي باستخدام الجسم المضاد ويدي النسيلة S9.6، الذي يتعرف تحديدا على هياكل هجينة DNA/RNA18,19. هذا النهج القائم على S9.6، رغم استخدامه الواسع، يمكن أن يكون محدودا بسبب سهولة الوصول للأجسام المضادة وتكلفتها وإمكانية التفاعل المتبادل. على النقيض من ذلك، يقدم بروتوكولنا بديلا اقتصاديا ومستقلا عن الأجسام المضادة يمكن تطبيقه بسهولة على العينات الخلوية والنسيجية.

لتعزيز نقاء وسلامة الهيكل الجزئي المعزول من الحمض النووي الريبي الريبي، قمنا بدمج إزالة البروتين بواسطة البروتيناز K، تلاها معالجة DNase I. تقوم خطوة DNase I بهضم سلسلة الحمض النووي الوهجين DNA/RNA بشكل انتقائي، مما يطلق الحمض النووي الهجين للعزل اللاحقوالتحليل الجزيئي في المراحل النهائية. يضمن هذا النهج أن أنواع الحمض النووي الريبي المستخرج هي تحديدا تلك التي تم تهجينها بشكل مستقر مع الحمض النووي في الحي. نظرا لتكوينه المعياري وقابليته للتوسع، فإن بروتوكولنا قابل للتكيف بشكل واسع مع سياقات بيولوجية متنوعة، مما يوفر للباحثين أداة قوية لفحص بيولوجيا الحمض النووي المختلط بين الحمض النووي والحمض النووي الريبي في مجموعة واسعة من الأنظمة التجريبية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت الموافقة على جميع البروتوكولات التجريبية المتعلقة بالحيوانات من قبل لجنة أخلاقيات بجامعة إرسييس (رقم الترخيص 19-07-2019، القرار رقم 19/127). تم استخدام فئران Balb/C في هذه الدراسة: خمس إناث سليمات، تبلغ أعمارهن 6 أسابيع (25 جرام)، وخمسة ذكور بعمر 8 أسابيع (30 جرام). تم رعاية الفئران وعلاجها وفقا لمبادئ رعاية المختبرية (القواعد الأوروبية). استخدمت الدراسة المعروضة هنا عينات دم من 13 شخصا أصحاء في الضابطة، مستمدة من مشروع بحثي سابق حصل على موافقة أخلاقية من لجنة الأخلاقيات الإنسانية بجامعة إرسييس (القرار رقم: 17/002). ملخص رسومي لهذا البروتوكول مقدم في الشكل 1. استخدم مواد خالية من RNase وتقنيات معقمة في جميع الخطوات لتقليل تحلل الحمض النووي الريبي.

1. تربية الفئران

  1. لتحديد الجرعة المناسبة من التخدير اللازم للقتل الرحيم، قم بوزن كل فأر وإعطاء الكيتامين بجرعة 60 ملغ/كجم وزيلزين بجرعة 10 ملغ/كغ عبر الحقن داخل الصفاق.
  2. بعد إعطاء التخدير، تأكد من التخدير الكامل من خلال غياب رد فعل انسحاب الدواسة (ضغط إصبع القدم) وعدم الاستجابة للتحفيز اللمسي. بمجرد تأكيد التخدير، قم بتنفيذ القتل الرحيم عن طريق خلع عنق الرحم.

2. عينات بشرية

  1. اختر المشاركين كعناصر تحكم صحية بعد فحصهم لاستبعاد أي تاريخ للأمراض المزمنة (مثل السكري، أمراض القلب والأوعية الدموية، ارتفاع ضغط الدم، أو السرطان)، أو العدوى الحادة، أو اضطرابات المناعة الذاتية أو الالتهابية، أو الحالات العصبية أو النفسية، والاستخدام الأخير للأدوية الموصوفة17.
  2. جمع عينات خزعة الجلد من المنطقة خلف الركبة (الحفرة العضلية) لكل متطوع باستخدام أداة ثقب 2 مم. قم بإعطاء التخدير الموضعي تحت الجلد قبل الإجراء، وإجراء جميع الخزعات في ظروف معقمة.

3. استخراج هجين بين DNA وRNA من جميع أنواع الخلايا

  1. جمع الأنسجة وتحللها
    1. لكل استخراج، استخدم 500 ميكرولتر من دم القلب، أو مركب كامل تحت المهاد، أو الغدة الكظرية الكاملة، أو عينة منوية مجمعة من فأر واحد.
    2. انقل جميع العينات المجمعة إلى أنابيب معقمة بسعة 1.5 مل. أضف 500 ميكرولتر من الفينول إلى كل أنبوب. عينات دم الدوامة جيدا لخلطها.
      1. بالنسبة لعينات الأنسجة، قم بالتجانس الكامل باستخدام حقنة 2 مم حتى لا تبقى شظايا مرئية.
    3. ضع الأنابيب على كتلة تبريد للحفاظ على سلامة العينة.
      ملاحظة: اتبع دائما إرشادات السلامة المختبرية عند التعامل مع الكواشف الخطرة مثل الفينول، الكلوروفورم، وأسيتات الأمونيوم.
  2. فصل الطور
    1. أضف 180 ميكرولتر من الكلوروفورم إلى كل أنبوب ودوامة لفترة وجيزة للخلط. حضن الأنابيب على الجليد لمدة 15 دقيقة للسماح بفصل الطور.
    2. افحص العينات - تأكد من أن الطور المائي يبدو صافيا. إذا كانت الطور غائمة، قم بتدوير الدوامة مرة أخرى وارجع إلى الجليد لمدة 5 دقائق إضافية.
    3. عينات الطرد المركزي عند 12,000 × جرام، 4 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة.
  3. ترسيبات الحمض النووي الريبي
    1. انقل الطور المائي الشفاف بعناية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد معقم بسعة 1.5 مل موضوع على كتلة تبريد.
    2. أضف حجما متساويا (1:1) من الإيزوبروبانول إلى الطور المائي، ثم قم بدوامة قصيرة للخلط، ثم حضن على الثلج لمدة 15 دقيقة.
    3. الطرد المركزي عند 12,000 × جرام، 4 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة.
      ملاحظة: يجب أن تكون حبيبات الحمض النووي الريبي مرئية في أسفل الأنبوب.
  4. غسل حبيبات الحمض النووي الريبي
    1. اقلب الأنبوب بحذر لتخلص المادة الفائقة دون إزعاج الحبيبة.
    2. أضف 1.5 مل من الإيثانول بنسبة 70٪ إلى الحبيبة. انقر بلطف على الأنبوب لمدة 5 ثوان ليغسل.
    3. الطرد المركزي عند 7,500 × جرام، 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق.
    4. قلب الأنبوب لتخلص السوبرناتانت. كرر غسل الإيثانول مرتين (ليصبح المجموع ثلاث غسولات).
  5. تنقية الحمض النووي الريبي
    1. بعد الغسل النهائي بالإيثانول، اقلب الأنبوب واترك أي إيثانول متبقي ليجف في الهواء أو أزله بعناية باستخدام ماصحة.
    2. أضف 100 ميكرولتر من الماء الخالي من RNase إلى حبيبات RNA واستخدم الماصة بلطف للأعلى والأسفل أو حرك الأنبوب لإعادة تعليق RNA بالكامل.
      ملاحظة: دائما احتفظ بعينات الحمض النووي الريبي على الثلج أو على رف/كتلة تبريد مبردة لمنع التحلل.
  6. قياس وتخزين الحمض النووي الريبي
    1. ضع الأنبوب الذي يحتوي على RNA معلق على الثلج.
    2. قياس تركيز ونقاء الحمض النووي الريبي باستخدام مقياس طيفي. سجل الامتصاص عند 260 نانومتر (A260) لتحديد تركيز RNA. قيم النقاء بحساب نسب A260/A280 وA260/A230.
    3. استخدم فقط عينات RNA بنسب A260/A280 بين 1.9 و2.1 للتطبيقات اللاحقة.
      ملاحظة: في هذه الدراسة، تراوحت تركيزات الحمض النووي الريبي النموذجية بين 100 إلى 180 نانوغرام/ميكرولتر.
    4. تخزين عينات RNA عند −80 درجة مئوية حتى الاستخدام الإضافي.
  7. إزالة البروتين وعزله للحمض النووي
    1. بعد عزل الحمض النووي الريبي، احتفظ بالطور التداخلي من خطوة استخراج الفينول.
      ملاحظة: هذه الخطوة ضرورية لأن الطور التداخلي يحتوي على حمض نووي، ويمكن معالجته لاحقا لعزل الحمض النووي بعد إضافة الفينول والطرد المركزي.
    2. تابع استخراج الحمض النووي باتباع الخطوات 3.2.1-3.4.1، بدءا من الطور التداخل كمادة البداية. انقل بعناية كامل الطور (الذي يحتوي على الحمض النووي) من استخراج الفينول إلى أنبوب طرد مركزي دقيق معقم بسعة 1.5 مل محفوظ على رف تبريد.
    3. هضم البروتين: أضف 0.5 مل من محلول التحلل (20 ملليمول تريس-HCl، درجة حموضة 8.0؛ 100 ململ EDTA؛ 0.1٪ SDS؛ 400 ميكروغرام/ملليتر بروتيناز K) إلى الأنبوب. حضن العينات طوال الليل عند درجة حرارة 56 درجة مئوية لهضم البروتينات.
    4. ترسيب الملح في الحمض النووي
      1. في اليوم التالي، أضف 100 ميكرولتر من أسيتات الأمونيوم 5 M إلى كل عينة وامزج لفترة وجيزة. الطرد المركزي عند 1,788 × جرام لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
      2. انقل الطور المائي الشفاف بعناية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد بسعة 1.5 مل. أضف حجما متساويا من الإيزوبروبانول بدرجة علم الأحياء الجزيئي (بنسبة 1:1) إلى الطور المائي، وامزجه بعكس لطيف، واستخدم الطرد المركزي عند 1,788 × جرام لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تخلص من المادة الفائقة دون إزعاج حبيبات الحمض النووي.
      3. اغسل حبيبة الحمض النووي ب 1 مل من الإيثانول 70٪، ثم استخدم الطرد المركزي بحرارة 1,788 × جرام لمدة 10 دقائق.
      4. قم بإزالة غسول الإيثانول وتخلص منه. دع حبيبة الحمض النووي تجف في الهواء لفترة وجيزة.
      5. أعد تعليق حبيبة الحمض النووي المجففة في 50 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكليز.
  8. إزالة الحمض النووي الحر لتنظيف الحمض النووي:
    1. تحميل الحمض النووي المذاب على عمود دوران الحمض النووي. قم بالطرد المركزي عند 15,000 × جرام لمدة 15 ثانية، وتخلص من تدفق الماء.
    2. اغسل العمود مرتين بنسبة 70٪ إيثانول، مع الطرد المركزي في كل مرة لمدة دقيقة واحدة عند 15,000 × جرام. تخلص من التدفق بعد كل غسل.
    3. انقل عمود الدوران إلى أنبوب تجميع نظيف بسعة 1.5 مل. أضف 30 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكلياز إلى مصفوفة الأعمدة، واحتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق، ثم قم بالطرد المركزي لمدة دقيقة واحدة عند 15,000 × جرام لاستخراج الحمض النووي.
    4. ضع الحمض النووي الممزوج بالجليد. قسم العينة إلى أنبوبين: واحد لتخزين الحمض النووي عند 4 درجات مئوية، والثاني لاستخراج هجين لاحق بين DNA/RNA.
  9. استخراج RNA المرتبط بالحمض النووي (الحمض النووي الهجين DNA/RNA)
    1. علاج DNase
      1. تحضير خليط هضم DNase عن طريق دمج 5 ميكرولتر (15 يوكيلاتر) من DNase I و75 ميكرولتر من 10x DNase لمخزن الهضم.
      2. أضف 80 ميكرولتر من خليط DNase إلى الحبيبات المجافة للحمض النووي. حضن العينة في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
    2. استخراج الفينول كلوروفورم
      1. أضف 300 ميكرولتر من الفينول إلى العينة وحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
      2. أضف 180 ميكرولتر من الكلوروفورم إلى الخليط وحضن لمدة 5 دقائق إضافية في درجة حرارة الغرفة.
      3. الطرد المركزي عند أقصى سرعة (مثلا 15,000 × جم) لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية لفصل الطورين. انقل بعناية الطور المائي العلوي (الذي يحتوي على هجن RNA:DNA) إلى أنبوب جديد.
  10. عزل هجين بين الحمض النووي النووي/الحمض النووي الريبي
    1. أكمل عزل الهجائن DNA/RNA من الخطوات 3.3 إلى 3.5.2.
    2. أضف حجما متساويا (1:1) من الإيزوبروبانول إلى الطور المائي، ثم قم بدوامة قصيرة للخلط، ثم حضن على الثلج لمدة 15 دقيقة.
    3. الطرد المركزي عند 12,000 × جرام، 4 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة. ابحث عن حبيبات RNA في أسفل الأنبوب. اقلب الأنبوب بحذر لتخلص المادة الفائقة دون إزعاج الحبيبة.
    4. أضف 1.5 مل من الإيثانول بنسبة 70٪ إلى الحبيبة. انقر بلطف على الأنبوب لمدة 5 ثوان ليغسل. جهاز طرد مركزي عند 7,500 × جرام، 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق. قلب الأنبوب لتخلص السوبرناتانت. كرر غسل الإيثانول مرتين (ليصبح المجموع ثلاث غسولات).
  11. تنقية الحمض النووي الريبي:
    1. بعد الغسل النهائي بالإيثانول، اقلب الأنبوب واترك أي إيثانول متبقي ليجف في الهواء أو أزله بعناية باستخدام ماصحة.
    2. أضف 30 ميكرولتر من الماء الخالي من RNase إلى الحبيبات الهجينة بين DNA/RNA واستخدم الماصة بلطف للأعلى والأسفل أو لف الأنبوب لإعادة تعليق RNA بالكامل.
    3. تخزين عينات هجينة DNA/RNA عند −80 درجة مئوية حتى الاستخدام الإضافي.

4. تخليق cDNA

ملاحظة: تأكد من سلامة الحمض النووي الريبي وcDNA والحمض النووي باستخدام مواد خالية من RNase أو DNase والحفاظ على العينات في الثلاجة طوال الإجراء.

  1. لكل عينة، استخدم 6 ميكرولتر (20 نانوغرام من الحمض النووي الريبي؛ كما هو معزول في الخطوة 3.6.5 للحمض النووي الحر أو الخطوة 3.13.3 للحمض النووي الريبي الهجين بين DNA/RNA). انقل الحجم المطلوب من الحمض النووي الريبي إلى أنابيب PCR معنونة.
  2. جهز خليط تخليق cDNA الرئيسي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة للمجموعة. لكل تفاعل، تأكد من أن المزيج الرئيسي يحتوي على نسخ عكسي، dNTPs، بادئات، مخزن مؤقت، ومثبطات RNase. لكل تفاعل، اجمع 14 ميكرولتر من الخليط الرئيسي مع 6 ميكرولتر من عينة RNA في أنبوب PCR (الحجم الكلي: 20 ميكرولتر لكل تفاعل). تضمين على الأقل تحكم واحد بدون نسخ عكسي (-RT) عن طريق تحضير تفاعل مواز دون إضافة إنزيم النسخ العكسي، باستخدام نفس كمية RNA.
  3. قم بإجراء تخليق cDNA في جهاز تدوير حراري باستخدام برنامج درجة الحرارة المحدد في الجدول 1.
  4. قم بتخفيف cDNA الناتج بنسبة 1:5 بماء خال من النوكلياز وتخزينه عند −80 درجة مئوية حتى تحليل qPCR.

5. تحديد مستويات تعبير TERRA عبر Q-PCR

  1. جهز خليط تفاعل qPCR باستخدام مجموعة qPCR مبنية على SYBR Green، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. لكل تفاعل، اجمع 1 ميكرولتر من خليط SYBR الأخضر الرئيسي، و0. ميكرولتر من البرايمر الأمامي ل TERRA (انظر الجدول 2)، و0. μL من البرايمر العكسي ل TERRA (انظر ب)، وμL من الماء الخالي من النوكلياز.
  2. توزيع 16 ميكرولتر من خليط التفاعل في كل بئر من صفيحة qPCR بسعة 96 بئر.
  3. أضف 4 ميكرولتر من cDNA المخفف (من الخطوة 4.6) إلى كل بئر، ليصبح حجم التفاعل النهائي 20 ميكرولتر.
    ملاحظة: لكل عينة، أضف على الأقل نسختين تقنيتين ونسختين بيولوجيتين. تضمين ضوابط بدون قالب (NTCs) للتحقق من التلوث وضوابط عدم النسخ العكسي لضمان الخصوصية للإشارات المشتقة من RNA.
  4. قم بإجراء qPCR باستخدام برنامج درجة الحرارة المحدد في الجدول 3.
  5. تطبيع تعبير TERRA إلى β-أكتين (جين التدبير المنزلي) باستخدام طريقة 2-ΔΔCt .

6. تحديد طول التيلومير

  1. جهز خليط qPCR لقياس طول التيلومير 21. لكل تفاعل، اجمع 1 ميكرولتر من خليط SYBR Green Master، و0. μL من برايمر التيلومير الأمامي (انظر الجدول 2])، و0. μL من تمهيد التيلومير العكسي (انظر الجدول 2)، وμL من الماء الخالي من النوكلياز.
  2. توزيع 16 ميكرولتر من خليط تفاعل التيلومير في كل بئر من صفيحة qPCR بسعة 96 بئر.
  3. أضف 4 ميكرولتر من الحمض النووي الجينومي (من الخطوة 3.10.5) إلى كل بئر، ليصبح حجم التفاعل النهائي 20 ميكرولتر.
  4. قم بإجراء qPCR وفقا لمعلمات البرنامج المناسبة التي يحددها المصنع (انظر الجدول 3).
  5. بالتوازي، قم بإعداد تفاعلات لجين مرجعي أحادي النسخة (36B4) باستخدام نفس التركيزات والحجم النهائي.
  6. تم توليد منحنيات قياسية باستخدام تخفيفات تسلسلية لأوليغونيوكليوتيد تيلوميري صناعي (الجدول 2) لتقدير الوفرة النسبية وكفاءة التضخيم. لم يتم إجراء قياس مطلق. يتم حساب الطول النسبي للتيلومير كنسبة T/S (عدد نسخ تكرار التيلومير إلى عدد جين النسخة الواحدة) باستخدام طريقة ΔCt21.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذه الدراسة، قمنا بقياس ومقارنة مستويات TERRA الحر، وTERRA الهجين بين DNA/RNA، وطول التيلوميرات عبر عدة أنسجة فأرية (الدم، المنوية، الجلد، تحت المهاد، الغدة النخامية، الغدة الكظرية) وكذلك في عينات دم وجلد بشري، للتحقيق في ديناميكيات النسيج الخاصة وعلاقتها ببيولوجيا التيلوميرات. تم عزل TERRA الحر من المرحلة المائية بعد استخراج الفينول-كلوروفورم (خطوات البروتوكول 3.6.1-3.6.5)، وتم تخصيبه لإنتاج RNA السيتوبلازمي والنوكليوبلازمي - بما في ذ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تكمن القوة المركزية للبروتوكول المعروض هنا في استخراجه وتمييزه التدريجي لهجينة TERRA الحرة والحمض النووي الريبي TERRA من عينات أنسجة معقدة. تشمل الخطوات الحرجة الفصل الدقيق بين الأجزاء المائية والبين أثناء استخراج الفينول-الكلوروفورم، حيث يمكن أن يربك التلوث المتبادل التمييز بين TERRA الحر والهجين. كما أن معالجة DNase I اللاحقة لجزء الطور بين الطور حاسمة: فقد يؤدي الهضم غير الكاف إلى جعل الحمض النووي الريبي المرتبط بالحمض النووي غير متاح، بينما يهدد الهضم بتلف الهجين. يعد استخدام مجموعات...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لا يوجد لدى المؤلفين تضارب مصالح للكشف عنها.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نحن ممتنون لوحدة البحوث العلمية بجامعة إرسييس لدعمها هذا العمل بأرقام المنح TYL-2019-9224 وTSA-2022-11929.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
أنابيب PCR سعة 0.2 مل/nbsp;غرينر671201
أنابيب فالكون بسعة 15 ملإيزولاب078.02.001
حقنة 2 ملحياةلا يوجد
96- لوحة مولتيويلغرينر50-720-3203
الإيثانول المطلقميرك1070172511
أسيتات أمونيومسيغما238074-500G
مجموعة تزامن cDNAروش07 912 439 001
الكلوروفورمميرك1024451000
DNAse I Kit زيموE1010
EDTAسيغماE9884-1KG
زجاجة زجاجيةإيزولابLB. IS.061.01.901
الأسطوانة المتدرجةإيزولاب  015.01.901
غوانيدين إيزوثيوسيانات  سيغماG9277-100G
الإيزوبروبونالميرك1096342511
لايت سايكلر 480 IIروش5015278001
أنابيب الطرد المركزي الدقيق (1.5 مل)غرينر616201
الميكروبايبتات (10 وميكرو؛ L)جيلسونFD10001
الميكروبايبتات (100 وميكرو؛ L)جيلسونFD10004
الميكروبايبتات (1000 وميكرو؛ L)جيلسونFD10003
الميكروبايبتات (2 وميكرو؛ L)جيلسونGFAM00064
نانودروبشيمادزوC101-E112
تابلت PBSسيغماP4417-50TAB
جهاز PCRسينسوكويستT3-0140
متجه PGL3 الأساسيبروميغا #212936
أطراف البيبيت (10 وميكرو؛ L، 200 وميكرو؛ L، 1000 وميكرو؛ L)غرينر772352
أطباق بتري بلاستيكيةغرينر627102
إنزيم البروتيناز KسيغماP6556-10MG
SDSسيغما8170342500
الماصبة المصليةغرينر760107
دورانجيلسونPMC880
سيبر غرين ماسترروش4707516001
خلاط حراريإبندورف#5355
قاعدة تريزماسيغما1503-1KG         
تريزولبيوراد7326890
Unimax 1010 DT Shakerهايدولف543-12310-00-6
الدوامةهايدولف541-10000-00-1
أعمدة زيمو-سبين IزيموC1003-50

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Allison, D. F., Wang, G. G. R-loops: formation, function, and relevance to cell stress. Cell Stress. 3, 38-46 (2019).
  2. Cusanelli, E., Chartrand, P. Telomeric noncoding RNA: telomeric repeat-containing RNA in telomere biology. Wiley Interdiscip Rev RNA. 5, 407-419 (2014).
  3. Azzalin, C. M., Reichenbach, P., Khoriauli, L., Giulotto, E., Lingner, J. Telomeric repeat-containing RNA and RNA surveillance factors at mammalian chromosome ends. Science. 318, 798-801 (2007).
  4. Azzalin, C. M., Reichenbach, P., Khoriauli, L., Giulotto, E., Lingner, J. Telomeric repeat containing RNA and RNA surveillance factors at mammalian chromosome ends. Science. 318, 798-801 (2007).
  5. Oliva-Rico, D., Herrera, L. A. Regulated expression of the lncRNA TERRA and its impact on telomere biology. Mech Ageing Dev. 167, 16-23 (2017).
  6. Azzalin, C. M., Lingner, J. Telomeres: the silence is broken. Cell Cycle. 7, 1161-1165 (2008).
  7. Roake, C. M., Artandi, S. E. Approaching TERRA Firma: genomic functions of telomeric noncoding RNA. Cell. 170, 8-9 (2017).
  8. Xu, Y., et al. Finding a human telomere DNA-RNA hybrid G-quadruplex formed by human telomeric 6-mer RNA and 16-mer DNA using click chemistry: a protective structure for telomere end. Bioorg Med Chem. 22, 4419-4421 (2014).
  9. Montero, J. J., López De Silanes, I., Graña, O., Blasco, M. A. Telomeric RNAs are essential to maintain telomeres. Nat Commun. 7, 1-13 (2016).
  10. Cusanelli, E., Chartrand, P. Telomeric noncoding RNA: telomeric repeat-containing RNA in telomere biology. Wiley Interdiscip Rev RNA. 5, 407-419 (2014).
  11. De Silanes, I. L., et al. Identification of TERRA locus unveils a telomere protection role through association to nearly all chromosomes. Nat Commun. 5, 4723(2014).
  12. Azzalin, C. M., Reichenbach, P., Khoriauli, L., Giulotto, E., Lingner, J. Telomeric repeat containing RNA and RNA surveillance factors at mammalian chromosome ends. Science. 318, 798-801 (2007).
  13. Roake, C. M., Artandi, S. E. Approaching TERRA Firma: genomic functions of telomeric noncoding RNA. Cell. 170, 8-9 (2017).
  14. Pfeiffer, V., Lingner, J. TERRA promotes telomere shortening through exonuclease 1-mediated resection of chromosome ends. PLoS Genet. 8, e1002747(2012).
  15. Balk, B., Dees, M., Bender, K., Luke, B. The differential processing of telomeres in response to increased telomeric transcription and RNA-DNA hybrid accumulation. RNA Biol. 11, 95-100 (2014).
  16. Yu, T. Y., Kao, Y. W., Lin, J. J. Telomeric transcripts stimulate telomere recombination to suppress senescence in cells lacking telomerase. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 3377-3382 (2014).
  17. Mehmetbeyoglu, E., et al. Decrease in RNase HII and accumulation of lncRNAs/DNA hybrids: a causal implication in psoriasis. Biomolecules. 12 (3), 368(2022).
  18. Boguslawski, S. J., et al. Characterization of monoclonal antibody to DNA.RNA and its application to immunodetection of hybrids. J Immunol Methods. 89, 123-130 (1986).
  19. Phillips, D. D., et al. The sub-nanomolar binding of DNA-RNA hybrids by the single-chain Fv fragment of antibody S9.6. J Mol Recognit. 26, 376-381 (2013).
  20. Ginno, P. A., Lott, P. L., Christensen, H. C., Korf, I., Chédin, F. R-loop formation is a distinctive characteristic of unmethylated human CpG island promoters. Mol Cell. 45, 814-825 (2012).
  21. O'Callaghan, N. J., Fenech, M. A quantitative PCR method for measuring absolute telomere length. Biol Proced Online. 13, 1-10 (2011).
  22. Arora, R., Azzalin, C. M. Telomere elongation chooses TERRA ALTernatives. RNA Biol. 12, 938-941 (2015).
  23. Balk, B., et al. Telomeric RNA-DNA hybrids affect telomere-length dynamics and senescence. Nat Struct Mol Biol. 20, 1199-1206 (2013).
  24. Roake, C. M., Artandi, S. E. Approaching TERRA Firma: genomic functions of telomeric noncoding RNA. Cell. 170, 8-9 (2017).
  25. Luke, B., Lingner, J. TERRA: telomeric repeat-containing RNA. EMBO J. 28, 2503-2510 (2009).
  26. Cañas, J. C., Aguilera, A., Gómez-González, B. Detection of R-loops by in vivo and in vitro cytosine deamination in Saccharomyces cerevisiae. Methods Mol Biol. 2528, 39-53 (2022).
  27. Cerritelli, S. M., Sakhuja, K., Crouch, R. J. RNase H1, the gold standard for R-loop detection. Methods Mol Biol. 2528, 91-114 (2022).
  28. Skourti-Stathaki, K. Detection of R-loop structures by immunofluorescence using the S9.6 monoclonal antibody. Methods Mol Biol. 2528, 21-29 (2022).
  29. Kianmehr, L., et al. Analysis of RNA/DNA hybrid profiles in blood from autistic patients reveals differences in mRNA and non-coding RNA regions. bioRxiv. , (2024).
  30. Yilmaz Sukranli, Z., et al. Experimentally altering microRNA levels in embryos alters adult phenotypes. Sci Rep. 14, 19014(2024).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

TERRA

مقالات ذات صلة