يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

فحص تبادل الدهون في الخلايا الحية

1.4K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/68008

⸱

مارس 21, 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology and Biophysics, Stony Brook University, 2Program in Cellular and Molecular Medicine, Boston Children's Hospital, Harvard Medical School, 3Department of Biochemistry and Cell Biology, Stony Brook University

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

نصف طريقة لاستخدام السيكلودكسترين للتوسط في التبادل بين دهون غشاء البلازما مع الدهون الخارجية. يمكن إقران هذه التقنية بتجارب تدرس بروتينات الغشاء ، والتي تتصرف بشكل مختلف في البيئات الشبيهة بالطوافة الدهنية عما تتصرف في البيئات غير الشبيهة بالطوافة.

الملخص

الطوافات الدهنية هي مجالات ديناميكية ومرتبة في غشاء البلازما غالبا ما تتشكل أثناء تجميع البروتين الغشائي والإشارات. تدفع الهوية الدهنية للنشرة الخارجية ميل الغشاء إلى تكوين طوافات دهنية. تجعل الطبيعة العابرة للطوافات الدهنية من الصعب الدراسة في الخلايا الحية. لذلك ، فإن الطرق التي تضيف أو تزيل الدهون المكونة للطوافة في النشرة الخارجية للخلايا الحية تسهل دراسة خصائص الطوافات ، مثل تأثيراتها على بروتينات الغشاء. تستخدم تجارب تبادل الدهون التي تم تطويرها في مختبرنا السيكلودكسترين المحملة بالدهون لإزالة وإضافة الدهون الفوسفورية الخارجية لتغيير تكوين الدهون في غشاء البلازما. يمكن أن يساعد استبدال الغشاء بطوف أو دهون غير مكونة للطوافة في دراسة التأثيرات على نشاط البروتين عبر الغشاء. هنا ، نصف طريقة لتبادل الدهون على النشرة الخارجية لغشاء البلازما باستخدام السيكلودكسترين المحمل بالدهون. نوضح تحضير وسائط التبادل والعلاج اللاحق لخلايا الثدييات المرفقة. نعرض أيضا كيفية قياس كفاءة التبادل باستخدام HP-TLC. ينتج عن هذا البروتوكول استبدالا شبه كامل للنشرة الخارجية بدهون خارجية دون تغيير الجدوى الخلوية ، مما يسمح بمزيد من التجارب على أغشية البلازما السليمة المعدلة.

المقدمة

يتكون غشاء البلازما من طبقة ثنائية دهنية غنية ببروتينات غشائية مختلفة ، بما في ذلك مستقبلات الغشاء والقنوات الأيونية. تم توضيح مجالات الدهون داخل الغشاء من خلال المناطق القابلة للذوبان في المنظفات وغير القابلة للذوبان التي تم تحديدها في تجارب تجزئة الغشاء المقاوم للمنظفات (DRM)1. تميزت الأجزاء غير القابلة للذوبان بأنها غنية بالكوليسترول ، وأسفل الفنجوميلين المعبأ بإحكام والفوسفوليبيدات المشبعة ، مما يظهر نقاط انصهار أعلى ، على عكس الكسور القابلة للذوبان التي تتكون في الغالب من درجة حرارة انصهار منخفضة وفوسفوليبيدات غير مشبعة معبأة بشكل فضفاض. يشار إلى المناطق المعبأة بإحكام باسم مجالات الدهون السائلة (Lo) ، أو الطوافات الدهنية ، في حين أن مجالات الدهون الأكثر تنظيما بالسائل (Ld) هي المناطق غير الطوفية في غشاء البلازما2،3. من المعروف أن مناطق الطوافة الدهنية تسهل عمليات الإشارات ، مع وجود أدلة تشير إلى أن مستقبلات الأنسولين النشطة ترتبط بهذه الطوافات4،5. ومع ذلك ، نظرا للطبيعة الديناميكية لغشاء الخلية وصغر حجم المجالات بشكل عام ، فإن التصور المباشر لوجود الطوافات في الخلايا الحية يمثل تحديات كبيرة. في هذا السياق ، نقدم طريقة للتحقيق في تأثير الطوافات الدهنية على مستقبلات الأنسولين من خلال تقنيات تبادل الدهون.

تتكون السيكلوديكسترين (CDs) من مونومرات الجلوكوز المرتبطة التي تخلق بنية تشبه الحلقة مع تجويف مركزي. يتم تحديد حجم هذا التجويف من خلال عدد وحدات الجلوكوز: ست وحدات تشكل ألفا سيكلودكسترين (α-CD) ، بينما تخلق سبع وحدات بيتا سيكلودكسترين (β-CDs). الأقراص المضغوطة هي جزيئات عالية الذوبان في الماء قادرة على تغليف الدهون داخل تجويفها ، وبالتالي تسهيل نقلها إلى غشاء الخلية6. تم استخدام بيتا سيكلودكسترين على نطاق واسع لإضافة وإزالة الدهون من الأغشية7. ومع ذلك ، فإن تجويفه الأكبر يفتقر إلى خصوصية الكوليسترول أو الدهونالفوسفورية 8. في المقابل ، تظهر ألفا سيكلودكسترين ، بتجويفها الأصغر ، انتقائية أكبر في ربط جزيئات الدهون على الستيرولات. على وجه التحديد ، لا يتفاعل ميثيل α-سيكلودكسترين (الميثيل α-CDs) مع الستيرولات وقد تم استخدامه بشكل فعال لتبادل الدهون الفوسفورية والسفينجوميلين دون تغيير تكوين الكوليسترول في غشاء الخلية8،9.

في هذه المخطوطة ، نقدم بروتوكولا مفصلا لاستخدام الميثيل α-CDs (MαCD) لتبادل الدهون في النشرة الخارجية لغشاء الخلية مع الدهون الخارجية التي لها خصائص إما تعزز أو تعطل تكوين طوف الدهون. يستخدم هذا التبادل للتحقيق في تأثير الطوافات الدهنية على نشاط مستقبلات الأنسولين. سيركز العرض التوضيحي على إدخال الفوسفوليبيد والسفينجوميلين الذي يؤثر على تكوين مجالات سائلة (Lo) في غشاء البلازما لخطوط خلايا مبيض الهامستر الصيني (CHO) التي تفرط في التعبير بثبات عن مستقبلات الأنسولين (IR)10. سيتم تقييم مدى تبادل الدهون في خلايا CHO IR من خلال كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة عالية الأداء (HP-TLC) ، بينما سيتم قياس التغيرات في نشاط مستقبلات الأنسولين عن طريق تحليل اللطخة الغربية بعد تحفيز الأنسولين بعد تبادل الدهون.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. تحضير محلول الميثيل α-CD

  1. أضف 20 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) إلى ~ 10 جم من مسحوق MαCD في زجاجة زجاجية. احتضن في حمام ماء دافئ (45 درجة مئوية) حتى يذوب مع التحريك من حين لآخر حتى يذوب جيدا.
    ملاحظة: قد يظل المحلول غائما بسبب أنواع الأقراص المضغوطة غير القابلة للذوبان.
  2. مرر المحلول من خلال مرشح حقنة 0.22 ميكرومتر. سوف يصبح الحل واضحا.
  3. استخدم مقياس الانكسار لتحديد التركيز الدقيق ل MαCD.
    1. ضع 10 ميكرولتر من العينة على منطقة عينة مقياس الانكسار ، وقم بإضاءةها باستخدام لمبة متوهجة بيضاء ، وسجل معامل انكسار المحلول.
    2. احسب تركيز MαCD باستخدام المعادلة
      RI = (1.49 × 10 × درجة مئوية) + 1.33
      حيث RI = معامل الانكسار ، C = تركيز MαCD (مللي مولار). تم الحصول على المعادلة من خلال التحليل الوزني ، أو قياس معامل الانكسار لوزن معروف من MαCD المذاب في حجم معروف.
  4. أغلق الزجاجة بغطاء ولف الغطاء بغشاء شفاف لمنع التبخر. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية.

2. تحضير الحويصلات متعددة الصفائح (MLVs)

  1. الحفاظ على محاليل مخزون الدهون الخارجية المرغوبة الذائبة في الكلوروفورم بتركيزات من 20 ملي مولار إلى 50 ملي مولار وتخزينها عند -20 درجة مئوية أو أقل لتقليل تبخر المذيبات.
    ملاحظة: يمكن إذابة جميع الدهون الواردة في الجدول 1 بالكامل في مخزونات الكلوروفورم. ومع ذلك ، من الممكن أن تتطلب الدهون البديلة 1: 1 كلوروفورم: الميثانول ليذوب تماما.
  2. قم بتخزين مخزون الدهون في أنابيب البورسليكات باستخدام ماصة ذات إزاحة موجبة بطرف زجاجي. بدلا من ذلك ، يمكن استخدام حقنة زجاجية.
  3. كمية الدهون الجافة على كتلة تسخين عند إعداد منخفض يبلغ حوالي 50 درجة مئوية تحت تيار من غاز N2 حتى يتبخر كل الكلوروفورم الظاهر.
  4. قم بإزالة المذيب المتبقي من الدهون المجففة عن طريق وضع الأنبوب في غرفة مفرغة وتعريضه لفراغ عال (أقل من 200 mTorr) لمدة 1 ساعة.
  5. أضف وسائط Ham F-12 الخالية من المصل لتجفيف طبقة الدهون للوصول إلى التركيز النهائي البالغ 20 ملم. غطيها بغطاء أو شريط تفلون وسخنيها في حمام مائي 70 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
  6. دوامة لتعليق الدهون وتشكيل MLVs. يجب أن تظهر الوسائط الآن غائمة.
    ملاحظة: قد لا يتم تعليق بعض الدهون المشبعة بالكامل عن طريق الدوامة وحدها وقد تحتاج إلى تعليقها عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل حتى يصبح الفيلم غير مرئي.
    1. انقل الحجم بالكامل إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق. يمكن تخزين MLVs لمدة تصل إلى 3 أيام عند 4 درجات مئوية.

3. تحضير وسائط تبادل الدهون

  1. أضف مخزون MαCD إلى التركيز النهائي البالغ 40 ملي مولار ، جنبا إلى جنب مع MLVs المحضرة إلى تركيز الدهون النهائي الموجود في الجدول 1.
    ملاحظة: في حالة استخدام MLVs المخزنة عند 4 درجات مئوية ، تسويتها في قاع الأنبوب. قم بالإحماء إلى درجة حرارة الغرفة وتأكد من تعليقها عن طريق النقر أو تحريك الأنبوب.
    1. قم بتحميل الدهون على MαCD عن طريق الحضانة لمدة 30 دقيقة في حمام مائي 37 درجة مئوية أو 55 درجة مئوية وفقا للجدول 1. يجب أن تكون درجة الحرارة المختارة أعلى من نقطة انصهار طور الهلام إلى السائل للدهون المختارة. يجب أن تنتقل وسائل الإعلام من غائم إلى صافية.
    2. دع وسائط تبادل الدهون تبرد إلى درجة حرارة الغرفة لمدة 30-60 دقيقة.

4. علاج تبادل الدهون للخلايا

  1. تنمو خلايا CHO IR عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 في وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM ، 4.5 جم / لتر جلوكوز) مكملا بنسبة 10٪ مصل بقري للجنين (FBS) ، 300 ميكروغرام / مل L-glutamine ، 100 ميكروغرام / مل من الأحماض الأمينية غير الأساسية ، 50 ميكروغرام / مل G418 ، 2 ميكرومتر ميثوتريكسات ، و 1x مضاد حيوي مضاد للفطريات.
    1. البذور 1.5 × 106 خلايا في ألواح 60 مم وتنمو حتى تصبح 80٪ -90٪ ملتقية.
    2. اغسل الخلايا 3 مرات عن طريق إضافة 1 مل من PBS ثم الشفط. تجويع الخلايا طوال الليل في 2 مل من وسائط هام F12 الخالية من المصل.
  2. اغسل الخلايا 3x مع 1 مل من PBS. أضف 1 مل من وسائط التبادل المحضرة أو الوسائط الخالية من المصل كعنصر تحكم للخلايا واحتضانها لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة (25 درجة مئوية -27 درجة مئوية). قم بتدوير الخلايا كل 15 دقيقة لضمان التعرض المتساوي لوسائط التبادل.
    1. اغسل الخلايا 3x مع 1 مل من PBS. يمكن معالجة كل لوحة لاحقا لاستخراج الدهون في الخطوة 5 ، أو للفسفرة الذاتية بالأشعة تحت الحمراء في الخطوة 7.

5. استخراج الدهون على لوحة زراعة الخلايا

  1. قم بإزالة PBS تماما واضبط اللوحة بزاوية 45 درجة لمدة 10 دقائق أو حتى تجف تماما ، مع إزالة أي مخزن مؤقت قد يتجمع على طول الجزء السفلي.
  2. أضف 1 مل من الهكسان 3: 2 (v: v): محلول الأيزوبروبانول إلى الخلايا المجففة واحتضنه لمدة 10 دقائق على شاكر في درجة حرارة الغرفة.
  3. انقل المحلول إلى أنبوب البورسيليكات. يغطى بشريط تفلون ويخزن في درجة حرارة -20 درجة مئوية.
  4. قم بإذابة بقايا الخلية المتبقية عن طريق إضافة 500 ميكرولتر من 1N هيدروكسيد الصوديوم والرج لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    1. استخدم هذا المحلول في مقايسة القياس الكمي للبروتين مثل اختبار برادفورد لتحديد تركيز البروتين لكل عينة. يمكن استخدام قيم التركيز هذه لتطبيع أحجام تحميل مستخلصات الدهون على ألواح HP-TLC لتحميل الدهون المتساوي عبر جميع العينات.

6. التحقق من كفاءة التبادل باستخدام HP-TLC

  1. اصنع 100 مل من 65: 25: 5 (v: v: v) كلوروفورم: ميثانول: 30٪ (v / v) هيدروكسيد الأمونيوم واسكبه في خزان TLC زجاجي. قم بتغطيته بإحكام واترك البخار يتوازن لمدة 1 ساعة على الأقل.
  2. عينة مستخلص الدهون الجافة على كتلة تسخين عند إعداد منخفض تحت تيار من غاز N2 حتى يتبخر كل المذيبات العضوية الظاهرة.
  3. قم بإذابة الطبقة الدهنية في 50 ميكرولتر من 1: 1 (v: v) كلوروفورم: الميثانول.
  4. استخدم حقنة هاميلتون سعة 10 ميكرولتر لتحميل 1-10 ميكرولتر من العينة في نطاقات 1 سم على لوحة HP-TLC من السيليكا. قم بتحميل 10 أشرطة كحد أقصى على لوحة مقاس 20 سم. استخدم القيم العادية لتحديد الأحجام اللازمة لتحميل كميات متساوية من الدهون عبر جميع العينات.
    ملاحظة: قبل تحميل كل عينة ، يجب تنشيط اللوحة عن طريق وضعها على لوح تسخين عند إعداد متوسط إلى مرتفع.
  5. ضع اللوحة في وضع مستقيم في خزان TLC واترك مقدمة المذيب تنتقل 8 سم لضمان فصل أنواع الفوسفوليبيد.
  6. دع الطبق يجف لمدة 10 دقائق. رش بمحلول مائي بنسبة 3٪ (وزن / حجم) أسيتات النحاسية و 8٪ (حجم / حجم) حمض الفوسفوريك.
    1. اترك الطبق يجف لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة أو بمسدس حراري. يجب أن تتحول اللوحة من اللون الأزرق الشفاف إلى الأبيض غير الشفاف.
  7. طبق الفحم في فرن 180 درجة مئوية -200 درجة مئوية لمدة 5-10 دقائق أو حتى تصبح عصابات الدهون السوداء قابلة للاكتشاف.

7. فحص تنشيط المستقبلات باستخدام فحص الفسفرة الذاتية واللطخة الغربية

  1. احتضان الخلايا ب 500 ميكرولتر من الأنسولين 100 نانومتر في وسائط خالية من المصل في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
  2. اغسل الخلايا باستخدام PBS المثلج وضع الخلايا على الجليد لوقف التحفيز. أضف على الفور 1 مل من PBS المثلج إلى الخلايا والحصاد باستخدام مكشطة الخلايا. خلايا الحبيبات عند 3000 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  3. أضف 100-200 ميكرولتر من المخزن المؤقت الكامل لتحلل RIPA (50 ملي مولار Tris pH 8 ، 200 ملي كلوريد الصوديوم ، 1 ملي مولار EDTA ، 1٪ (حجم / حجم) Triton X-100 ، 1٪ (وزن / حجم) منقوص أوكسي كولات الصوديوم ، 1 ملي مولار أورثوفانادات الصوديوم المنشط ، 10 ميكروغرام / مل أبروتينين ، 10 ميكروغرام / مل ليوببتين) إلى حبيبات الخلية على الجليد. الماصة لأعلى ولأسفل 30x-40x للتحلل.
  4. احتضان المحللة على الثلج لمدة 10 دقائق. قم بمسح حطام الخلية عن طريق الدوران عند 16,000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية وجمع المادة الطافية. احتفظ بحوالي 20 ميكرولتر من المحللة لتحديد تركيز البروتين باستخدام مقايسة برادفورد.
  5. يمزج المحللة مع 5x Laemmli buffer (350 ملي مولار Tris HCl درجة الحموضة 6.8 ، 30٪ حجم / حجم جلسرين ، 10٪ وزن / حجم SDS ، 25٪ حجم / حجم β-mercaptoethanol ، 0.002 جم من البروموفينول الأزرق) ويغلي عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. يجب أن يكون حجم المخزن المؤقت المضاف كافيا لتحقيق تركيز نهائي يبلغ 1x Laemmli buffer.
  6. قم بتشغيل المحللات من خلال الرحلان الكهربائي لجل دوديسيل كبريتات الصوديوم - بولي أكريلاميد (SDS-PAGE).
    1. قم بتحميل كتلة متساوية من البروتين لجميع العينات جنبا إلى جنب مع علامة الوزن الجزيئي على هلام SDS-PAGE. تعمل عند 100 فولت -150 فولت في المخزن المؤقت قيد التشغيل (2.5 ملي مولار تريس درجة الحموضة 8 ، 19.2 ملي مولار جلايسين ، 0.01٪ (وزن / حجم) SDS) حتى يتم حلها جيدا في نطاق 100-250 كيلو دالتون.
  7. نقل إلى غشاء فلوريد البولي فينيلدين (PVDF) في مخزن مؤقت للنقل (2.5 ملي مولار تريس درجة الحموضة 8 ، 19.2 ملي مولار جلايسين) لمدة ساعة واحدة عند 100 فولت و 4 درجات مئوية.
  8. قم بحظر غشاء PVDF لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في محلول BSA بنسبة 5٪ في TBST (50 ملي مولار Tris pH 8 ، 150 ملي كلوريد الصوديوم ، 0.1٪ (حجم / حجم) Tween 20).
  9. احتضان الجسم المضاد للأشعة تحت الحمراء pYpY أو الجسم المضاد IR-β بتركيز 1: 1000 في محلول BSA 5٪ في TBST لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: يتعرف الجسم المضاد pYpY IR على وجه التحديد على التيروزينات الفسفرية 1162 و 1163 ويعمل على الإشارة إلى الفسفرة الذاتية للمستقبل. يتعرف الجسم المضاد IR-β على الوحدة الفرعية بيتا للمستقبل بشكل عشوائي بغض النظر عن حالة الفسفرة ويعمل على الإشارة إلى المستويات العالمية للمستقبل.
  10. اغسل 3 مرات باستخدام TBST في درجة حرارة الغرفة. احتضان بجسم مضاد α Rabbit-HRP بتركيز 1: 3000 في محلول BSA 1٪ في TBST لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  11. اغسل 3 مرات باستخدام TBST في درجة حرارة الغرفة. احتضان مع الركيزة الكيميائية المحسنة (ECL) لمدة 1 دقيقة وصور الفيلم.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

لإثبات التغيير الملحوظ في تكوين الدهون الخلوية بعد التبادل ، أجرينا HP-TLC على خلايا CHO IR بعد تبادل SM الدماغ (bSM) و 1،2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) (الشكل 1). في الحالات التي يتم فيها استخدام sphingomyelins مثل bSM للتبادل ، تظهر زيادة في شدة نطاق SM ، إلى جانب انخفاض في شدة نطاق الكمبيوتر بالنسبة للتحكم غير المعالج. على العكس من ذلك ، عند تبادل الفوسفاتيديل كولين مثل DOPC ، يصبح نطاق الكمبيوتر أكثر كثافة بينما يصبح نطاق SM أقل كثافة. يمكن تحديد كفاءة التبادل عن طريق قياس...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

منذ تصور وجود طوافات دهنية في غشاء الخلية ، كانت هناك محاولات عديدة لتصورها في الخلايا ودراسة ارتباط الدهون والمستقبلات. استخدمت التجارب التي تنطوي على الفحصالمجهري 11 في الخلايا المؤشرات الحيوية ذات العلامات الفلورية ، وعادة البروتينات والدهون المعروفة بارتباطها بالطوافات ، لدراسة توطين مجالات الدهون المرتبة في الخلية12 بصريا. ومع ذلك ، فإن غشاء الخلية مليء بالطيات13،14 ، وغزوات ال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

تم توفير التمويل من قبل منحة المعاهد الوطنية للصحة GM 122493. كانت خلايا CHO IR هدية لطيفة من الدكتور جوناثان ويتاكر (جامعة كيس ويسترن ريزيرف).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
1،2-ديلاورويل-sn-glycero-3-phosphocholine (DLPC)Avanti Polar Lipids850335
1،2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC)Avanti Polar Lipids850345
1،2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)Avanti Polar Lipids850375
1،2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC)Avanti Polar Lipids850355
1،2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC)AvantiPolar Lipids850365
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycerol-3-phosphocholine (POPC)Avanti Polar Lipids850457
الأنسولين المضادة وبيتا تقنية إشارات خلايا الأجسام المضادةCST3025
الأجسام المضادة للأجسامR & دي سيستمز إنك.AF2507
IgG المضاد للأرانب ، تقنية إشارات خلايا الأجسام المضادة المرتبطة ب HRP7074
أنابيب اختبار زجاج البورسليكات (12 × 75 مم)Thermo Fisher Scientific14-961-26
sphingomyelin الدماغ (bSM)Avanti Polar Lipids860062
Egg sphingomyelin (eSM)Avanti Polar Lipids860061
مصل الأبقار الجنينية ( FBS)كورنينج35-016-CV
G418 ملح ثاني كبريتاتسيجما ألدريتشA1720
جيبكو محلول مضاد للمضادات الحيوية ومضاد للفطريات (100x)ثيرمو فيشر ساینتيك15240062
جيبكو دولبيكو s وسط النسر المعدل (DMEM ، 4.5 جم / لتر جلوكوز ، L-جلوتامين ، بيروفات الصوديوم)ثيرمو فيشر Scientific11965092
Gibco ham ' s F12 mediaThermo Fisher Scientific11765054
Gibco L-glutamineThermo Fisher Scientific25030032
Gibco MEM محلول الأحماض الأمينية غير الأساسية (100X)Thermo Fisher Scientific11140050
ملحي مخزن بفوسفات جيبكو (PBS) بدون الكالسيوم والمغنيسيوم (0.144 جم / لتر KH2PO4 ، 9 جم / لتر كلوريد الصوديوم ، 0.795 جم / لتر Na2- HPO4 (اللاماء))ثيرموفيشر العلمي10010023
جيبكو تريبسين-EDTA (0.05٪) ، فينول أحمرثيرمو فيشر العلمي25300054
كروماتوغرافيا طبقة رقيقة عالية الأداء (HP-TLC)ميركHP-TLC هلام السيليكا 60 لوحة غشاء
Immobilon-P PVDFMilliporeIPVH00010
ميثوتريكساتسيجما ألدريتش454126
الميثيل - ألفا ؛ - سيكلودكسترين (M & alpha ؛ CD)AraChemCDexA076 / BR
بيرس ECL الركيزة النشاف الغربيةالحرارية فيشر العلمية32106
أورثوفانادات الصوديوم ، المنشطسيجما ألدريتش5.08605
مستقبلات المضادة لمستقبلات الأنسولين محلول

المراجع

  1. Brown, D. A., London, E. Functions of lipid rafts in biological membranes. Annu Rev Cell Dev Biol. 14, 111-136 (1998).
  2. Brown, D. A. Lipid rafts, detergent-resistant membranes, and raft targeting signals. Physiology. 21, 430-439 (2006).
  3. Schroeder, R., London, E., Brown, D. Interactions between saturated acyl chains confer detergent resistance on lipids and glycosylphosphatidylinositol (GPI)-anchored proteins: GPI-anchored proteins in liposomes and cells show similar behavior. Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (25), 12130-12134 (1994).
  4. Suresh, P., Miller, W. T., London, E. Phospholipid exchange shows insulin receptor activity is supported by both the propensity to form wide bilayers and ordered raft domains. J Biol Chem. 297 (3), 101010(2021).
  5. Delle Bovi, R. J., Kim, J., Suresh, P., London, E., Miller, W. T. Sterol structure dependence of insulin receptor and insulin-like growth factor 1 receptor activation. Biochim Biophys Acta Biomembr. 1861 (4), 819-826 (2019).
  6. Zidovetzki, R., Levitan, I. Use of cyclodextrins to manipulate plasma membrane cholesterol content: evidence, misconceptions and control strategies. Biochim Biophys Acta. 1768 (6), 1311-1324 (2007).
  7. Ohtani, Y., Irie, T., Uekama, K., Fukunaga, K., Pitha, J. Differential effects of α-, β- and γ-cyclodextrins on human erythrocytes. Eur J Biochem. 186 (1-2), 17-22 (1989).
  8. Suresh, P., London, E. Using cyclodextrin-induced lipid substitution to study membrane lipid and ordered membrane domain (raft) function in cells. Biochim Biophys Acta Biomembr. 1864 (1), 183774(2022).
  9. Li, G., et al. Efficient replacement of plasma membrane outer leaflet phospholipids and sphingolipids in cells with exogenous lipids. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (49), 14025-14030 (2016).
  10. Yoshimasa, Y., Paul, J. I., Whittaker, J., Steiner, D. F. Effects of amino acid replacements within the tetrabasic cleavage site on the processing of the human insulin receptor precursor expressed in Chinese hamster ovary cells. J Biol Chem. 265 (28), 17230-17237 (1990).
  11. Gaus, K., et al. Visualizing lipid structure and raft domains in living cells with two-photon microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (26), 15554-15559 (2003).
  12. Klymchenko, S., Kreder, R. Fluorescent probes for lipid rafts: From model membranes to living cells. Chem Biol. 21 (1), 97-113 (2014).
  13. Pike, L. J. Growth factor receptors, lipid rafts and caveolae: An evolving story. Biochim Biophys ActaMol Cell Res. 1746 (3), 260-273 (2005).
  14. Brown, D. A., London, E. Structure of detergent-resistant membrane domains: does phase separation occur in biological membranes. Biochem Biophys Res Commun. 240 (1), 1-7 (1997).
  15. Lin, Q., London, E. Preparation of artificial plasma membrane mimicking vesicles with lipid asymmetry. PLoS One. 9 (1), e87903(2014).
  16. Sezgin, E., et al. Elucidating membrane structure and protein behavior using giant plasma membrane vesicles. Nat Protoc. 7 (6), 1042-1051 (2012).
  17. Deveaux, P. F., Hermann, A., Ohlwein, N., Kozlov, M. M. How lipid flippases can modulate membrane structure. Biochimica et Biophysica Acta Biomembr. 1778 (7), 1591-1600 (2008).
  18. Balasubramaniam, K., Mirnikjoo, B., Schroit, A. J. Regulated externalization of phosphatidylserine at the cell surface: implications for apoptosis. J Biol Chem. 282 (25), 18357-18364 (2007).
  19. Li, G., et al. Replacing plasma membrane outer leaflet lipids with exogenous lipid without damaging membrane integrity. PLoS One. 14 (10), e0223572(2019).
  20. Contreras, F. X., Sanchez-Magraner, L., Alonso, A., Goni, F. M. Transbilayer (flip-flop) lipid motion and lipid scrambling in membranes. FEBS Letters. 584 (9), 1779-1786 (2010).
  21. Suresh, P., London, E. MαCD-based plasma membrane outer leaflet lipid exchange in mammalian cells to study insulin receptor activity. Biophys Approach Study Memb Struct A Exp. 700, 485-507 (2024).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

فحص تبادل الدهون في الخلايا الحية
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.