Method Article

استخراج الحمض النووي للبكتيريا الفطرية باستخدام ضرب الخرزة في مخزن مؤقت مخصص متبوعا بسير عمل NGS

DOI:

10.3791/68037

⸱

June 13th, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Experimental Medicine, University of California, San Francisco, 2DSI-NRF Centre of Excellence for Biomedical Tuberculosis Research, SAMRC for Tuberculosis Research, Division of Molecular Biology and Human Genetics, Faculty of Medicine and Health Sciences, Stellenbosch University, 3Division of Pulmonary and Critical Care Medicine, Zuckerberg San Francisco General Hospital and Trauma Centre, University of California, San Francisco

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوضح هذا البروتوكول أن ضرب الخرزة جنبا إلى جنب مع تنقية حبة التقاط الحمض النووي يوفر طريقة سريعة ومتسقة لاستخراج الحمض النووي من عينات المتفطرة السلية ، مما يجعلها خيارا فعالا لتطبيقات تسلسل الجيل التالي.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

السل مرض مميت، وظهور مقاومة للأدوية بالمضادات الحيوية في البكتيريا المسببة للسل، المتفطرة السلية، يؤدي إلى تفاقم نتائج العلاج. هناك حاجة إلى تحديد دقيق وسريع لمقاومة الأدوية من خلال تقنيات التسلسل لتحسين نتائج مرضى السل من خلال أنظمة علاجية مكيفة. تعد طريقة استخراج الحمض النووي أمرا بالغ الأهمية للمقايسات الجزيئية النهائية وهي معقدة بسبب جدار الخلية الصلبة للبكتيريا المتفطرة ، والحمل العصاري المنخفض للعديد من العينات السريرية ، وتعقيد مصفوفة البلغم. هناك العديد من طرق استخراج الحمض النووي لمرض السل ، ولكن لا يوجد حاليا معيار ذهبي. علاوة على ذلك، تبين أن القليل من هذه الطرق يعمل بشكل متسق، والعديد منها غير مناسب لظروف السل منخفضة الموارد والعبء المرتفع. وبالتالي ، تقدم المختبرات في كثير من الأحيان تعديلات الإجراءات الخاصة بها ، مما يؤدي إلى تباين كبير في الطريقة. نقدم هنا بروتوكولا فعالا من حيث التكلفة وسريعا وموحدا لاستخراج الحمض النووي الفطري من كل من البلغم السريري والمزرعة التي تنتج الحمض النووي المناسب ل qPCR ، والتي يجب أخذها في الاعتبار للاستخدام في مختبرات التشخيص السريري.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعد استخراج الحمض النووي عالي الجودة من المتفطرة السلية ضروريا للكشف عن السل المقاوم للأدوية (TB) باستخدام تسلسل الجيل التالي المستهدف (NGS) وتسلسل الجينوم الكامل (WGS) ولكن غالبا ما يتم تجاهله. لقد طورنا بروتوكولا موحدا لتوفير حمض نووي متسق وعالي الجودة لتطبيقات NGS السريرية ، بما في ذلك مناهج NGS المستهدفة مثل Deeplex-MycTB (GenoScreen) وتسلسل الجينوم الكامل ، والتي توصي بها الآن منظمة الصحة العالمية (WHO) لتشخيص السل المقاوم للأدوية. والجدير بالذكر أنه في حين أن منظمة الصحة العالمية توصي باستراتيجيات التشخيص القائمة على NGS ، إلا أنها لا تحدد بروتوكولات استخراج الحمض النووي الخاصة لدعمها. يمكن استخدام طريقتنا مع الاختبارات....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أجريت هذه الدراسة في جامعة كاليفورنيا سان فرانسيسكو (UCSF) تحت موافقة لجنة السلامة البيولوجية المؤسسية (BUA #BU198320-01GBUA / BABB) وتتبع إرشادات أخلاقيات البحث في جامعة كاليفورنيا في سان فرانسيسكو. حصلنا على عينات من بقايا البلغم التي تم جمعها بواسطة Discovery Life Sciences بموجب بروتوكول التنازل عن الموافقة المعتمد من IRB من الأفراد الذين يعانون من أمراض الجهاز التنفسي غير المصابة بالسل.

1. تحضير المخازن المؤقتة

  1. المخزن المؤقت المخصص Triton (الجدول 1): لتحضير 100 مل من المخزن المؤقت المخصص Triton ، ابدأ بدمج 2 مل من 5 M كلوريد الصوديوم ، و 1 مل من 1 M Tris-HCl (درجة الحموضة 8) ، و 1 مل من Trit....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

اختبرنا بروتوكول استخراج الحمض النووي على كل من عينات البلغم المسننة المستقرة من المتفطرة السلية والمفطرة السلية (العدد = 3 لكل حالة). باستخدام M. tuberculosis H37Rv mc² 7901 المزروع ، قمنا بتوحيد المدخلات إلى 8.4 × 106 خلايا لكل 50 ميكرولتر ، أي ما يعادل 1 مل من ثقافة MGIT عند 200 GU. بالنسبة لتجارب البلغم ، قمنا بزيادة 1 مل من البلغم المجمعة من الأفراد الذين يعانون من أمراض الجهاز التنفسي غير السل (تم الحصول عليها تجاريا) بتركيزين بكتيريين مختلفين (50,000 ، تقريبا 1+ درجة مسحة البل.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذا العمل ، نقدم بروتوكولا قويا ومعتمدا لاستخراج الحمض النووي عالي الجودة لمرض السل باستخدام ضرب الخرز مع تنظيف الخرزة المغناطيسية للتطبيقات الجزيئية النهائية و NGS.

توفر هذه الطريقة العديد من المزايا مقارنة ببروتوكولات استخراج الحمض النووي الحالية لمرض السل . في حين أن استخراج الفينول الكلوروفورم التقليدي يستغرق عادة عدة أيام ويقدم مواد كيميائية خطرة ، فإن هذه الطريقة تكتمل في أقل من 60 دقيقة مع الحد الأدنى من النفايات الخطرة. يوفر هذا ال.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

R01AI153213 المعهد الوطني للحساسية والأمراض المعدية (NIAID).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.1 مم خرز زركونيا سيليكاتمنتجات المواصفات الحيويةهاتف 11079101zالخرز المستخدم في خطوة ضرب الخرز لتحلل الخلايا الفطرية
AMPure XP Beadsبيكمان كولترط63880حبات مغناطيسية لتنظيف الحمض النووي بعد التحلل
EDTA (0.5 مليون ، درجة الحموضة 8.0)   ؛ثيرمو فيشر العلميAM9260Gمكونات عازلة مخصصة Triton / منخفضة EDTA
فاست بريب 24MPbio ، الولايات المتحدة الأمريكية116004500معدات لضرب الخرز بسرعة 6.5 م / ث
التمهيدي الأماميثيرمو فيشر العلميالتوليف المخصصتسلسل التمهيدي: AATTCCTGGTGTAGCGGTGG
H2O (درجة الماء والبيولوجيا الجزيئية)ثيرمو فيشر العلميBP2819-1مكونات عازلة مخصصة Triton / منخفضة EDTA
مسبار لونا العالمينيو إنجلاند بيولابسإم 3004كاشف qPCR لتعداد الحمض النووي الفطري
طقم MycoPrepدينار بحرينيرمز المنتج/المرجع 240863هضم عينة BD MycoPrep لمعالجة بلغم NALC-NaOH
كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم ، محلول 5 أمتار)ثيرمو فيشر العلميAM9759مكونات عازلة مخصصة Triton / منخفضة EDTA
برنامج تلفزيونيميليبور سيجماص 2272معالجة البلغم
التمهيدي العكسيثيرمو فيشر العلميالتوليف المخصصتسلسل التمهيدي: GTTTACGGCGTGGACTACCA
مسبار TaqManثيرمو فيشر العلميالتوليف المخصصتسلسل المسبار: AGGAGGAACACCGGTGGCGA
تريس حمض الهيدروكلوريك (1 ميجا، درجة الحموضة 8.0)ثيرمو فيشر العلميAM9855Gمكونات عازلة مخصصة Triton / منخفضة EDTA
تريتون X-100ثيرمو فيشر العلمي28314مكونات عازلة مخصصة Triton / منخفضة EDTA

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jouet, A., et al. Deep amplicon sequencing for culture-free prediction of susceptibility or resistance to 13 anti-tuberculous drugs. Eur Respir J. 57 (3), 2002338(2021).
  2. George, S., et al. DNA Thermo-Protection Facilitates Whole Genome Sequencing of Mycobacteria Direct from Clinical Samples by the Nanopore Platform.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Mycobacterial DNA ExtractionBead BeatingCustom BufferTuberculosis DiagnosticsDrug Resistance DetectionSputum Sample ProcessingMagnetic Bead CleanupQuantitative PCRNext Generation SequencingCell Lysis

Related Articles