Method Article

استخراج الحمض النووي للبكتيريا الفطرية باستخدام ضرب الخرزة في مخزن مؤقت مخصص متبوعا بسير عمل NGS

DOI:

10.3791/68037

⸱

June 13th, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Experimental Medicine, University of California, San Francisco, 2DSI-NRF Centre of Excellence for Biomedical Tuberculosis Research, SAMRC for Tuberculosis Research, Division of Molecular Biology and Human Genetics, Faculty of Medicine and Health Sciences, Stellenbosch University, 3Division of Pulmonary and Critical Care Medicine, Zuckerberg San Francisco General Hospital and Trauma Centre, University of California, San Francisco

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوضح هذا البروتوكول أن ضرب الخرزة جنبا إلى جنب مع تنقية حبة التقاط الحمض النووي يوفر طريقة سريعة ومتسقة لاستخراج الحمض النووي من عينات المتفطرة السلية ، مما يجعلها خيارا فعالا لتطبيقات تسلسل الجيل التالي.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

السل مرض مميت، وظهور مقاومة للأدوية بالمضادات الحيوية في البكتيريا المسببة للسل، المتفطرة السلية، يؤدي إلى تفاقم نتائج العلاج. هناك حاجة إلى تحديد دقيق وسريع لمقاومة الأدوية من خلال تقنيات التسلسل لتحسين نتائج مرضى السل من خلال أنظمة علاجية مكيفة. تعد طريقة استخراج الحمض النووي أمرا بالغ الأهمية للمقايسات الجزيئية النهائية وهي معقدة بسبب جدار الخلية الصلبة للبكتيريا المتفطرة ، والحمل العصاري المنخفض للعديد من العينات السريرية ، وتعقيد مصفوفة البلغم. هناك العديد من طرق استخراج الحمض النووي لمرض السل ، ولكن لا يوجد حاليا معيار ذهبي. علاوة على ذلك، تبين أن القليل من هذه الطرق يعمل بشكل متسق، والعديد منها غير مناسب لظروف السل منخفضة الموارد والعبء المرتفع. وبالتالي ، تقدم المختبرات في كثير من الأحيان تعديلات الإجراءات الخاصة بها ، مما يؤدي إلى تباين كبير في الطريقة. نقدم هنا بروتوكولا فعالا من حيث التكلفة وسريعا وموحدا لاستخراج الحمض النووي الفطري من كل من البلغم السريري والمزرعة التي تنتج الحمض النووي المناسب ل qPCR ، والتي يجب أخذها في الاعتبار للاستخدام في مختبرات التشخيص السريري.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعد استخراج الحمض النووي عالي الجودة من المتفطرة السلية ضروريا للكشف عن السل المقاوم للأدوية (TB) باستخدام تسلسل الجيل التالي المستهدف (NGS) وتسلسل الجينوم الكامل (WGS) ولكن غالبا ما يتم تجاهله. لقد طورنا بروتوكولا موحدا لتوفير حمض نووي متسق وعالي الجودة لتطبيقات NGS السريرية ، بما في ذلك مناهج NGS المستهدفة مثل Deeplex-MycTB (GenoScreen) وتسلسل الجينوم الكامل ، والتي توصي بها الآن منظمة الصحة العالمية (WHO) لتشخيص السل المقاوم للأدوية. والجدير بالذكر أنه في حين أن منظمة الصحة العالمية توصي باستراتيجيات التشخيص القائمة على NGS ، إلا أنها لا تحدد بروتوكولات استخراج الحمض النووي الخاصة لدعمها. يمكن استخدام طريقتنا مع الاختبارات المعتمدة من منظمة الصحة العالمية وكذلك مع التقنيات الناشئة التي تتطلب حمضا للبكتيريا الفطرية عالية الجودة.

ينبع تحدي الاستخراج من جدار الخلية الفريد من نوعه ل M. tuberculosis ، والذي يتكون من الأحماض الفطرية والدهون التي تجعل من الصعب للغاية فتحها. تحتوي حلول الاستخراج المنشورة حاليا على تباين كبير في التحلل (على سبيل المثال ، الصوتنة ، والكيميائية ، والحرارة ، وضرب الخرز) وطرق استخراج الحمض النووي (على سبيل المثال ، استخراج الفينول كلوروفورم ، ترسيب الإيثانول ، الطرق القائمة على CTAB والعمود والخرز) ، مما يؤدي إلى اختلافات في إنتاجية الحمض النووي ونقائها وجودتها1،2،3،4،5،6،7،89،10،11،12،13،14،15،16. بالإضافة إلى ذلك ، نادرا ما تستخدم المجموعات البحثية نفس طريقة استخراج الحمض النووي وغالبا ما تقيس النجاح بشكل مختلف. هذا يجعل تحديد الطريقة التي تعمل بشكل أفضل أمرا صعبا لأن النهج الأمثل يعتمد على نوع التطبيق الجزيئي. على سبيل المثال ، يتطلب حل المتغيرات الهيكلية للمفطرة السلية في البلغم باستخدام تسلسل القراءة الطويلة حمض نووي عالي الجودة وبوليميراز أكثر دقة من تشغيل أداة تشخيص مدفوعة تستهدف فقط منطقة صغيرة من rpoB. هناك عدة عوامل تزيد من تعقيد نجاح استخراج الحمض النووي. تختلف كمية الحمض النووي التي يمكننا استخراجها بناء على نوع العينة ، وعدد البكتيريا الموجودة ، وما إذا كانت هناك مواد (الحمض النووي غير الفطري المستخرج بشكل مشترك ومثبطات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) تتداخل مع العملية. حتى الجوانب الفنية مثل مدى دقة ماصات فني المختبر التي يمكن أن تؤثر على النتائج. غالبا ما تقصر الطرق الحالية عند معالجة العينات ذات الأحمال البكتيرية المنخفضة أو المستويات العالية من الحمض النووي الملوث ، والتي تتم مواجهتها عادة في الإعدادات السريرية17،18،19.

يوفر ضرب الخرزة في المخزن المؤقت المخصص ، متبوعا ببروتوكول تنظيف الخرزة ، مزايا رئيسية على الطرق الأخرى. إنه سير عمل بسيط وسريع يقلل من فرصة التباين المعتمد على المشغل ويحافظ على سلامة الحمض النووي لتطبيقات NGS النهائية. يناسب هذا النهج المعياري بشكل خاص المختبرات السريرية التي تسعى إلى الحصول على نتائج موثوقة وقابلة للتكرار باستخدام فحوصات مقاومة الأدوية NGS الموصى بها من قبل منظمة الصحة العالمية وجميع تطبيقات WGS.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أجريت هذه الدراسة في جامعة كاليفورنيا سان فرانسيسكو (UCSF) تحت موافقة لجنة السلامة البيولوجية المؤسسية (BUA #BU198320-01GBUA / BABB) وتتبع إرشادات أخلاقيات البحث في جامعة كاليفورنيا في سان فرانسيسكو. حصلنا على عينات من بقايا البلغم التي تم جمعها بواسطة Discovery Life Sciences بموجب بروتوكول التنازل عن الموافقة المعتمد من IRB من الأفراد الذين يعانون من أمراض الجهاز التنفسي غير المصابة بالسل.

1. تحضير المخازن المؤقتة

  1. المخزن المؤقت المخصص Triton (الجدول 1): لتحضير 100 مل من المخزن المؤقت المخصص Triton ، ابدأ بدمج 2 مل من 5 M كلوريد الصوديوم ، و 1 مل من 1 M Tris-HCl (درجة الحموضة 8) ، و 1 مل من Triton X-100 ، و 0.2 مل من 0.5 M حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA). أضف الماء عالي النقاء ليصل الحجم الإجمالي إلى 100 مل. قم بتعقيم الفلتر قبل الاستخدام. يحتوي المخزن المؤقت النهائي على 100 ملي كلوريد الصوديوم ، و 10 ملي مولار Tris-HCl ، و 1 ملي مولار EDTA ، و 1٪ تريتون X-100.
  2. انخفاض EDTA TE (الجدول 2): لتحضير 100 مل من المخزن المؤقت منخفض EDTA TE ، اجمع بين 1 مل من 1M Tris-HCl (الرقم الهيدروجيني 8) و 0.02 مل من 0.5 M EDTA. أضف الماء عالي النقاء ليصل الحجم الإجمالي إلى 100 مل. يحتوي المخزن المؤقت النهائي على 10 ملي مولار Tris-HCl و 0.1 ملي EDTA.

2. تحضير أنابيب التحلل

  1. باستخدام شفرة مشرط ، قم بقطع الجزء السفلي بعناية من أنبوب غطاء لولبي سعة 1.5 مل أسفل نقطة الانعطاف مباشرة.
  2. اقطع الطرف من طرف P1000 ، وقطع إسفينا على شكل حرف V بالقرب من النهاية ، وقم بتثبيت الجزء السفلي المحضر من أنبوب الغطاء اللولبي فيه. راجع الشكل 1 للحصول على رسم تخطيطي للسبق الصحفي.
  3. املأ وعاءا معقما (على سبيل المثال ، خزان أو طبق بتري) بخرز سيليكات الزركونيا 0.1 مم واستخدم المغرفة المحضرة لتوزيع مغرفة واحدة من الخرز (~ 200 مجم) في أنابيب غطاء لولبي سعة 1.5 مل.

figure-protocol-1
الشكل 1: مغرفة توزيع الخرز الداخلي. تم تصميم المغرفة لسهولة نقل ~ 200 مجم من حبات الزركونيوم 0.1 مم إلى أنابيب المعالجة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

3. إعداد المدخلات

ملاحظة: يجب إجراء جميع عمليات تحضير العينات وفقا لبروتوكولات السلامة البيولوجية الخاصة بمنشأتك. نوصي بشدة بالتعامل مع المواد المعدية داخل خزانة السلامة البيولوجية من الفئة الثانية (BSC) لتقليل مخاطر التعرض للهباء الجوي.

  1. زراعة الخلايا البكتيرية
    1. جهاز طرد مركزي ~ 5 مل من مزرعة السل (إما MGIT أو مزرعة سائلة عكرة) في أنبوب طرد مركزي مخروطي 15 مل بأقصى سرعة (≥ 3,000 × جم) لمدة 10 دقائق.
    2. باستخدام ماصة مصلية سعة 10 مل ، قم بإزالة كل المادة الطافية بعناية باستثناء ~ 500 ميكرولتر دون إزعاج الحبيبات. قم بإزالة المادة الطافية المتبقية باستخدام ماصة P1000 دون إزعاج الحبيبات.
    3. أعد تعليق الحبيبات في 350 ميكرولتر من مخزن Triton المؤقت المخصص عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل. إذا لزم الأمر (أي لإزالة العينات للمعالجة خارج BSL-3) ، قم بإلغاء تنشيط العينة وفقا لإجراءات التشغيل القياسية.
  2. تحضير البلغم
    1. نقل 1-5 مل من عينة البلغم (تلقائية أو مستحثة) إلى أنبوب طرد مركزي معقم سعة 50 مل.
  3. تسييل DTT
    1. أضف أربعة أحجام من 100 ملي مولار ديثيوثريتول إلى عينة البلغم (قد يختلف الحجم). إذا كنت تستخدم كاشفا تجاريا ، فاتبع تعليمات التخفيف الخاصة بالشركة المصنعة.
    2. دوامة تماما لمدة 30 ثانية. احتضان في درجة حرارة الغرفة (20-25 درجة مئوية) لمدة 7 دقائق. دوامة مرة أخرى لمدة 30 ثانية.
    3. كرر الخطوات 3.3.1. و 3.3.2. 1x ، للعينات اللزجة جدا ، قم بإجراء ما يصل إلى 5 دورات حضانة دوامة.
    4. جهاز طرد مركزي بأقصى سرعة (≥ 3,000 × جم) لمدة 10 دقائق. باستخدام ماصة مصلية سعة 10 مل، تخلص بعناية من جميع المواد الطافية باستثناء ~ 500 ميكرولتر. قم بإزالة المادة الطافية المتبقية باستخدام ماصة P1000 دون إزعاج الحبيبات.
    5. أعد تعليق الحبيبات في 350 ميكرولتر من مخزن Triton المخصص.
  4. تسييل NALC-NaOH
    1. لتحضير محلول NALC-NaOH ، اتبع تعليمات الشركة المصنعة للتحضير والتخفيف.
    2. أضف أربعة أحجام من محلول NALC-NaOH إلى عينة البلغم (تلقائي أو مستحث ، قد يختلف الحجم).
    3. دوامة لمدة 30 ثانية. احتضان في درجة حرارة الغرفة (20-25 درجة مئوية) لمدة 7 دقائق. كرر الخطوتين 3.4.1 و 3.4.2. 1x. بالنسبة للعينات اللزجة جدا ، قم بإجراء ما يصل إلى 5 دورات حضانة دوامة.
    4. أضف PBS إلى علامة 50 مل. دوامة لفترة وجيزة للخلط. جهاز طرد مركزي بأقصى سرعة (≥ 3,000 × جم) لمدة 10 دقائق.
    5. باستخدام ماصة مصلية سعة 50 مل، تخلص بعناية من جميع المواد الطافية باستثناء ~ 500 ميكرولتر. قم بإزالة المادة الطافية المتبقية باستخدام ماصة P1000 دون إزعاج الحبيبات.
    6. أعد تعليق الحبيبات في 350 ميكرولتر من مخزن Triton المخصص. إذا لزم الأمر (أي لإزالة العينات للمعالجة خارج BSL-3) ، قم بإلغاء تنشيط العينة وفقا لإجراءات التشغيل القياسية.

4. استخراج الحمض النووي

  1. انقل المعلق البكتيري المعطل (350 ميكرولتر من الخطوة 3) إلى أنبوب غطاء لولبي جديد سعة 1.5 مل يحتوي على ~ 250 ميكرولتر من حبات سيليكات الزركونيا 0.1 مم.
  2. تغلب الخرزة على المحللة بسرعة 6.5 م / ث لمدة 45 ثانية مع دقيقتين للراحة بين الأشواط. كرر لمدة ثلاث دورات لضرب الخرز.
  3. جهاز طرد مركزي بسرعة قصوى (≥ 12,000 × جم) لمدة دقيقتين ونقل 150 ميكرولتر من المادة الطافية إلى أنبوب جديد جيد التصنيف. احرص على عدم نقل الخرز أو بقايا الخلايا.
  4. اسمح للتنظيف بالخرز المغناطيسي بالتوازن مع درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة والدوامة تماما لضمان إعادة التعليق الكامل قبل الاستخدام.
  5. أضف 180 ميكرولتر (حجم 1.2x) من حبيبات التنظيف المغناطيسية واخلطها عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل 10 أضعاف. احتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 دقيقة.
  6. ضعه على رف مغناطيسي وانتظر حتى يزول المحلول لمدة ~ 2 دقيقة. باستخدام ماصة P200، تخلص من المادة الطافية بعناية دون إزعاج الخرزات المغناطيسية.
  7. مع بقاء الأنبوب على الرف المغناطيسي ، أضف 500 ميكرولتر من الإيثانول المحضر حديثا بنسبة 70٪ (v / v) ، مع الاستغناء عن جدار الأنبوب المقابل إلى الخرز المغناطيسي. انتظر لمدة 30 ثانية.
  8. كرر الخطوات 4.5. - 4.7. لما مجموعه غسلتين. في نهاية الغسيل الأخير ، قم بإزالة الإيثانول المتبقي باستخدام ماصة P10. جفف الخرزات لفترة وجيزة لمدة ~ 2 دقيقة.
  9. مباشرة بعد أن تصبح حبيبات الخرزة معتمة ، قم بإزالة الأنبوب من الرف المغناطيسي وأعد تعليقه في 20 ميكرولتر من Low EDTA Tris Buffer. لا تدع الخرزات تجف ومتشققة.
  10. امزج عن طريق سحب العينات أو الدوامة للتأكد من أن جميع الخرزات في المحلول. احتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
  11. ضعه على رف مغناطيسي وانتظر حتى يصبح المحلول واضحا لمدة ~ 2 دقيقة. انقل الحمض النووي الملوطوف إلى أنبوب جديد جيد التسمية لتحليله في اتجاه مجرى النهر. استنشق <20 ميكرولتر من الحمض النووي المستخرج لتجنب ترحيل الخرزة المغناطيسية.

5. تعداد qPCR للحمض النووي الفطري

  1. لقياس الحمض النووي للبكتيريا الفطرية باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي الذي يستهدف 99 نيوكليوتيد من البكتيريا الفطرية atpE (Rv1305) ، قم بتجميع خليط تفاعل 10 ميكرولتر لكل عينة على الجليد يحتوي على 5 ميكرولتر من مزيج المسبار الرئيسي العالمي (2x) ، 0.4 ميكرولتر لكل من التمهيدي الأمامي (5'-AATTCCTGGTGTAGCGGTGG-3 '، 10 ميكرومتر) ، والتمهيدي العكسي (5'-GTTTACGGCGTGGACCACCA-3 '، 10 ميكرومتر) ، 0.2 ميكرولتر من مسبار TaqMan (5'-VIC-AGGAGGAACCGGTGGCGA-MGB-3 '، 10 ميكرومتر) ، 2 ميكرولتر من قالب الحمض النووي ، و 2 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكلياز (الجدول 3).
  2. قم بتشغيل التفاعل باستخدام ظروف الدوران الحراري التالية: التمسخ الأولي عند 95 درجة مئوية لمدة 60 ثانية ، متبوعا ب 35 دورة من 95 درجة مئوية لمدة 10 ثوان و 60 درجة مئوية لمدة 30 ثانية (مع التقاط هنا ، باستخدام معدل منحدر يبلغ 2.11 درجة مئوية / ثانية ؛ الجدول 4).
    ملاحظة: في هذه الحالة ، تم إجراء qPCR باستخدام اختبار TaqMan مع مسبار يحمل علامة VIC على نظام QuantStudio 3 Real-Time PCR ،
  3. قم بتشغيل جميع العينات والمعايير وعناصر التحكم في ثلاث نسخ تقنية. توليد منحنيات قياسية باستخدام التخفيفات التسلسلية للحمض النووي المتفطرة السلية المنقى. إجراء تحليل الكمي النسبي باستخدام برنامج التحليل.
  4. قم بتصدير قيم القياس الكمي النسبية الناتجة إلى تنسيق CSV وتصورها باستخدام R Studio (الإصدار 2024.09.1+394) لإنشاء مخططات مربعة تقارن إنتاجية الحمض النووي عبر طرق الاستخراج.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

اختبرنا بروتوكول استخراج الحمض النووي على كل من عينات البلغم المسننة المستقرة من المتفطرة السلية والمفطرة السلية (العدد = 3 لكل حالة). باستخدام M. tuberculosis H37Rv mc² 7901 المزروع ، قمنا بتوحيد المدخلات إلى 8.4 × 106 خلايا لكل 50 ميكرولتر ، أي ما يعادل 1 مل من ثقافة MGIT عند 200 GU. بالنسبة لتجارب البلغم ، قمنا بزيادة 1 مل من البلغم المجمعة من الأفراد الذين يعانون من أمراض الجهاز التنفسي غير السل (تم الحصول عليها تجاريا) بتركيزين بكتيريين مختلفين (50,000 ، تقريبا 1+ درجة مسحة البل...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذا العمل ، نقدم بروتوكولا قويا ومعتمدا لاستخراج الحمض النووي عالي الجودة لمرض السل باستخدام ضرب الخرز مع تنظيف الخرزة المغناطيسية للتطبيقات الجزيئية النهائية و NGS.

توفر هذه الطريقة العديد من المزايا مقارنة ببروتوكولات استخراج الحمض النووي الحالية لمرض السل . في حين أن استخراج الفينول الكلوروفورم التقليدي يستغرق عادة عدة أيام ويقدم مواد كيميائية خطرة ، فإن هذه الطريقة تكتمل في أقل من 60 دقيقة مع الحد الأدنى من النفايات الخطرة. يوفر هذا ال...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

R01AI153213 المعهد الوطني للحساسية والأمراض المعدية (NIAID).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.1 مم خرز زركونيا سيليكاتمنتجات المواصفات الحيويةهاتف 11079101zالخرز المستخدم في خطوة ضرب الخرز لتحلل الخلايا الفطرية
AMPure XP Beadsبيكمان كولترط63880حبات مغناطيسية لتنظيف الحمض النووي بعد التحلل
EDTA (0.5 مليون ، درجة الحموضة 8.0)   ؛ثيرمو فيشر العلميAM9260Gمكونات عازلة مخصصة Triton / منخفضة EDTA
فاست بريب 24MPbio ، الولايات المتحدة الأمريكية116004500معدات لضرب الخرز بسرعة 6.5 م / ث
التمهيدي الأماميثيرمو فيشر العلميالتوليف المخصصتسلسل التمهيدي: AATTCCTGGTGTAGCGGTGG
H2O (درجة الماء والبيولوجيا الجزيئية)ثيرمو فيشر العلميBP2819-1مكونات عازلة مخصصة Triton / منخفضة EDTA
مسبار لونا العالمينيو إنجلاند بيولابسإم 3004كاشف qPCR لتعداد الحمض النووي الفطري
طقم MycoPrepدينار بحرينيرمز المنتج/المرجع 240863هضم عينة BD MycoPrep لمعالجة بلغم NALC-NaOH
كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم ، محلول 5 أمتار)ثيرمو فيشر العلميAM9759مكونات عازلة مخصصة Triton / منخفضة EDTA
برنامج تلفزيونيميليبور سيجماص 2272معالجة البلغم
التمهيدي العكسيثيرمو فيشر العلميالتوليف المخصصتسلسل التمهيدي: GTTTACGGCGTGGACTACCA
مسبار TaqManثيرمو فيشر العلميالتوليف المخصصتسلسل المسبار: AGGAGGAACACCGGTGGCGA
تريس حمض الهيدروكلوريك (1 ميجا، درجة الحموضة 8.0)ثيرمو فيشر العلميAM9855Gمكونات عازلة مخصصة Triton / منخفضة EDTA
تريتون X-100ثيرمو فيشر العلمي28314مكونات عازلة مخصصة Triton / منخفضة EDTA

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jouet, A., et al. Deep amplicon sequencing for culture-free prediction of susceptibility or resistance to 13 anti-tuberculous drugs. Eur Respir J. 57 (3), 2002338(2021).
  2. George, S., et al. DNA Thermo-Protection Facilitates Whole Genome Sequencing of Mycobacteria Direct from Clinical Samples by the Nanopore Platform. bioRxiv. , (2020).
  3. Doyle, R. M., et al. Direct whole-genome sequencing of sputum accurately identifies drug-resistant mycobacterium tuberculosis faster than MGIT culture sequencing. J Clin Microbiol. 56 (8), e00666-e00718 (2018).
  4. Noordhoek, G. T., et al. Sensitivity and Specificity of PCR for Detection of Mycobacterium Tuberculosis: A Blind Comparison Study among Seven Laboratories. J Clin Microbiol. 32, (1994).
  5. Jaber, M., Rattan, A., Verma, A., Tyagi, J., Kumar, R. A simple method of DNA extraction from Mycobacterium tuberculosis. Tubercle Lung Dis. 76 (6), 578-581 (1995).
  6. Käser, M., Ruf, M. T., Hauser, J., Marsollier, L., Pluschke, G. Optimized method for preparation of DNA from pathogenic and environmental mycobacteria. Appl Environ Microbiol. 75 (2), 414-418 (2009).
  7. De Almeida, I. N., Da Silva Carvalho, W., Rossetti, M. L., Costa, E. R. D., De Miranda, S. S. Evaluation of Six Different DNA Extraction Methods for Detection of Mycobacterium Tuberculosis by Means of PCR-IS6110: Preliminary Study. BMC Res Notes. 6, 561(2013).
  8. Pan, S., et al. Comparison of four DNA extraction methods for detecting Mycobacterium tuberculosis by real-time PCR and its clinical application in pulmonary tuberculosis. J Thorac Dis. 5 (3), 251-257 (2013).
  9. Kelly-Cirino, C., Niles, J., Ray, B., Stewart, A. Maximizing Mycobacterium Tuberculosis DNA Yield for Molecular Methods with PrepIT.MAX. PD-WP-00045 (Issue 2/2015-11), Accessed January 27 (2020).
  10. Votintseva, A. A., et al. Same-day diagnostic and surveillance data for tuberculosis via whole-genome sequencing of direct respiratory samples. J Clin Microbiol. 55 (5), 1285-1298 (2017).
  11. Odumeru, J., Gao, A., Chen, S., Raymond, M., Mutharia, L. Use of the Bead Beater for Preparation of Mycobacterium Paratuberculosis Template DNA in Milk. Can J Vet Res. 65 (4), 201-205 (2001).
  12. Oh, T. S., et al. An Effective Method of RNA Extraction from Mycobacterium tuberculosis. Ann Clin Microbiol. 19 (1), 20-23 (2016).
  13. Miyata, M., et al. Assessment of the quality of dna extracted by two techniques from mycobacterium tuberculosis for fast molecular identification and genotyping. Braz J Microbiol. 42 (2), 774-777 (2011).
  14. Votintseva, A. A., et al. Mycobacterial DNA extraction for whole-genome sequencing from early positive liquid (MGIT) cultures. J Clin Microbiol. 53 (4), 1137-1143 (2015).
  15. Kolia-Diafouka, P., et al. Optimized Lysis-Extraction Method Combined With IS6110-Amplification for Detection of Mycobacterium tuberculosis in Paucibacillary Sputum Specimens. Front Microbiol. 9, 2224(2018).
  16. Bonnet, I., et al. A Comprehensive Evaluation of GeneLEAD VIII DNA Platform Combined to Deeplex Myc-TB Assay to Detect in 8 Days Drug Resistance to 13 Antituberculous Drugs and Transmission of Mycobacterium tuberculosis Complex Directly From Clinical Samples. Front Cell Infect Microbiol. 11, 707244(2021).
  17. Mann, B. C., et al. Systematic review and meta-analysis of protocols and yield of direct from sputum sequencing of Mycobacterium tuberculosis. bioRxiv. , (2024).
  18. Schwab, T. C., et al. Field evaluation of nanopore targeted next-generation sequencing to predict drug-resistant tuberculosis from native sputum in South Africa and Zambia. J Clin Microbiol. 63 (3), e0139024(2025).
  19. Colman, R. E., Seifert, M., De la Rossa, A., et al. Evaluating culture-free targeted next-generation sequencing for diagnosing drug-resistant tuberculosis: a multicentre clinical study of two end-to-end commercial workflows. Lancet Infect Dis. 25 (3), 325-334 (2025).
  20. Oberacker, P., et al. Bio-On-Magnetic-Beads (BOMB): Open platform for high-throughput nucleic acid extraction and manipulation. PLoS Biol. 17 (1), e3000107(2019).
  21. Limberis, J. D., Metcalfe, J. Z. Turbolysis: A low-cost, small footprint alternative to commercial bead beaters for cell lysis. HardwareX. 19, e00576(2024).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Mycobacterial DNA ExtractionBead BeatingCustom BufferTuberculosis DiagnosticsDrug Resistance DetectionSputum Sample ProcessingMagnetic Bead CleanupQuantitative PCRNext Generation SequencingCell Lysis

Related Articles