يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

في المختبر نموذج تأثير لتوليد إصابة الخلايا الغضروفية شبه المميتة في مستخلصات الغضروف البقري

943 مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/68061

⸱

يونيو 27, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Weldon School of Biomedical Engineering, Purdue University, 2Indiana Center for Musculoskeletal Health, Indiana University School of Medicine, 3School of Mechanical Engineering, Purdue University, 4Department of Orthopaedic Surgery, Indiana University School of Medicine

في هذه المقالة

ملخص

لفهم استجابة إصابة الخلايا الغضروفية بشكل أفضل للحمل الزائد للغضروف الميكانيكي ، يصف البروتوكول تطوير نموذج تأثير الغضروف خارج الجسم الحي الذي كان شبه مميت لمدة 24 ساعة.

الملخص

هشاشة العظام اللاحقة للصدمة (PTOA) هو مرض متفجر وتنكسي ومؤلم في المفاصل ينشأ عادة بعد صدمة كبيرة في المفاصل ، ويصيب أكثر من 6 ملايين أمريكي. تؤدي صدمة الغضروف الناجمة عن التأثير إلى استجابة إصابة الخلايا الغضروفية التي تبلغ ذروتها في PTOA. يعد فهم الأحداث الجزيئية المرتبطة بإصابة الخلايا الغضروفية أمرا ضروريا لتطوير علاجات لمنع PTOA أو إبطاء تقدمها. لتسهيل ذلك ، تم تطوير نموذج تأثير الغضروف خارج الجسم الحي الذي كان شبه مميت لمدة 24 ساعة. تم حصاد النباتات العظمية الغضروفي من مفاصل metacarpophalangeal البقرية ، وتم استخدام برج إسقاط لتوصيل أحمال الصدمات إلى النباتات. لضمان تطبيق الإجهاد والتأثير بشكل موحد نسبيا على الغضروف المفصلي ، تم وضع النماذج مع توجيه سطح العظم لأعلى ، وتأثر العظم من الأعلى. تم تطبيق أحمال مختلفة على التحويلات من ارتفاعات النقل 4.0 سم و 4.5 سم و 5.0 سم ، مما أدى إلى متوسط إجهادات ذروة 10.87 ± 1.84 ميجا باسكال و 11.69 ± 0.67 ميجا باسكال و 12.98 ± 0.75 ميجا باسكال على التوالي. حللت الدراسة دور وجود العظام تحت الغضروف في الغضروف أثناء زراعة ما بعد التأثير وتأثير استخدام حامل مناسب أو فضفاض أثناء التأثير ، وتقييم بقاء الخلية وموت الخلايا المبرمج. قدم الغضروف المفصلي المتأثر من 4.5 سم ، جنبا إلى جنب مع حامل مناسب وإزالة العظام الفورية ، النموذج الأمثل للحث على إصابة الغضروف مع الحد الأدنى من موت الخلايا بعد 24 ساعة من الاصطدام.

المقدمة

هشاشة العظام اللاحقة للصدمة (PTOA) هو مرض منهك يصيب أكثر من 5 ملايين بالغ في الولايات المتحدة1. يمكن أن يؤدي التأثير المؤلم الفردي للغضروف إلى استجابة إصابة الخلايا الغضروفية ، مما يؤدي إلى ظهور أعراض مبكرة وصراع مدى الحياة مع آلام المفاصل والخللالوظيفي 2. الغضروف لديه قدرة قليلة على الإصلاح الجوهري ، وبالتالي ، هناك حاجة غير ملبأة لتطوير علاجات لتعديل تطور المرض3. نظرا لأن PTOA يرتبط بحدث صادم واحد محدد بوضوح ، فهناك فرصة للتدخل قبل تطور المرض. ومع ذلك ، فإن تطوير هذه العلاجات يعيقه الفجوة في المعرفة حول الإشارات الجزيئية التي تنظم استجابة إصابة الخلايا الغضروفية وتؤدي إلى هشاشة العظام بعد الصدمة2،3،4. يمكن أن يساعد الفهم الأفضل للأحداث الجزيئية بعد إصابة الخلايا الغضروفية في تصميم علاجات علاجية جديدة تنقذ استجابة إصابة الخلايا الغضروفية وتمنع أو تؤخر تطور PTOA2،5،6.

لفهم الإشارات الجزيئية لإصابة الخلايا الغضروفية بشكل أفضل ، استخدمت الأبحاث السابقة أبراج إسقاط أو أجهزة مماثلة تؤثر ميكانيكيا على مستخلصات الغضروف بحيث تبدأ الاستجابة للإصابة. سعت هذه الدراسات إلى توصيف العديد من جوانب هذه الاستجابة ، بما في ذلك التغييرات في الخواص الميكانيكية والهيكل7،8 ، وتلف المصفوفة ، والتوليف6،9،10،11 ، والخلل الوظيفي في الميتوكوندريا12،13،14،15 ، ومسارات نقل الأيونات16،17،18 ،19 ، والتعبير الجيني9،11،20،21،22،23. ومع ذلك ، في العديد من هذه الدراسات ، لم يتم الإبلاغ عن بقاء الخلية أو تم تعرضها للخطر ، مع بقاء الخلية بنسبة 50٪ أو أقل في بعض الدراسات24،25،26. قد تجعل التأثيرات المربكة لانخفاض قابلية الخلايا للحياة من الصعب دراسة الاستجابة للإصابة. موت الخلايا الغضروفية الذي يتبع إصابة المفاصل مباشرة لا رجعة فيه ، لكن العلاجات التي تعالج إصابة الخلايا الغضروفية تخفف من PTOA27 اللاحقة. من أجل تحديد التغيرات الجزيئية المرتبطة بإصابة الخلايا الغضروفية وليس فقدان الخلايا القابلة للحياة ، من الضروري وضع نموذج تأثير الغضروف الذي يحافظ على صلاحية الخلايا الغضروفية لفترة من الوقت. بالإضافة إلى ذلك ، فإن تأثير الغضروف الذي يولد استجابة إصابة الخلايا الغضروفية الموحدة نسبيا في جميع أنحاء أنسجة الغضروف سيوفر النتائج الأكثر اتساقا في تحليل سلوك الخلية.

كان الهدف من الدراسة هو تطوير وتوصيف نموذج إصابة تأثير خارج الجسم الحي فعال من حيث التكلفة للغضروف المفصلي الذي يحافظ على القدرة على دراسة مسارات الإشارات المتأصلة في الاستجابة لإصابة الغضروف الحادة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام مثل هذا النموذج لتقييم العلاجات المحتملة لإنقاذ الاستجابة للإصابة. لتحقيق ذلك ، قمنا أولا بتطوير تقنية معقمة لحصاد النباتات الغضروفية من مفاصل القشط البقري من الناضجة هيكليا باستخدام لقمة حفر ذات رأس ماسي مثبتة على مكبس حفر. يتم التخلص من مفاصل Metacarpophalangeal بواسطة المسلخ عندما تتم معالجة لاستهلاك الطعام ، مما يجعل هذا المفصل مصدرا للأنسجة يسهل الوصول إليه. بعد ذلك ، أنشأنا نموذجا لإصابة الصدمات حيث تم وضع عينة العظم الغضروفي في حامل أسفل جهاز برج الإسقاط. في هذا النموذج ، تم وضع العينات العظمية الغضروفي مع توجيه السطح المفصلي لأسفل على سطح من الفولاذ المقاوم للصدأ المصقول بالمرآة # 8 ، وتعرض العظم لتأثير من الأعلى ، مما أدى إلى حمل موحد نسبيا لأنسجة الغضروف. تم تحديد معلمات التأثير التي تحافظ على صلاحية الخلايا الغضروفية لمدة 24 ساعة بعد الاصطدام مع استمرار تحفيز استجابة الإصابة الجزيئية موت الخلايا المبرمج. تم تقييم حاملي المركبات الذين سمحوا بكميات مختلفة من الحركة الجانبية للعينة أثناء التأثير لتأثيرهم على بقاء الخلية وموت الخلايا المبرمج. أخيرا ، تم تقييم تأثير إزالة الغضروف من العظم تحت الغضروف بعد التأثير.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

لا يتطلب استخدام أطراف الأبقار التي تم الحصول عليها من مسلخ محلي موافقة أخلاقية ، حيث تم جمع الأنسجة بعد الوفاة من المعالجة للاستهلاك الغذائي.

1. حصاد النبتة العظمية الغضروفي

  1. قم بتعقيم المواد التالية باستخدام الأوتوكلاف قبل حصاد المشتع: محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS ؛ حوالي 1 لتر لكل مفصل) ، مثقاب الحفر ، محول دوار الماء ، زجاجة غسيل واحدة قابلة للتعقيم ، مقبض مشرط واحد ، ملقطان ، وشفرة منشار تشريح الجثة.
  2. قم بإعداد غطاء مزرعة الأنسجة باستخدام مكبس الحفر والملزمة داخل حوض لاحتواء PBS. قم بتجميع مثقاب الحفر والمحول الدوار في مكبس الحفر وقم بتوصيل فوهة المحول الدوارة بخرطوم بعربة مملوءة ب PBS المعقم. قم بتجميع منشار تشريح الجثة وضعه داخل غطاء المحرك (الشكل 1 أ-ب).
  3. انشر الوسادات السفلية التي تستخدم لمرة واحدة في كومة في غطاء مزرعة الأنسجة ، واحدة لكل مفصل.
    ملاحظة: تمتص الوسادات السفلية PBS والسائل الزليلي الذي قد يتساقط أثناء فتح المفصل. يسمح تكديس العديد من الوسادات السفلية بإزالة الطبقة العليا بسهولة عندما تصبح رطبة جدا ، مما يوفر مساحة عمل نظيفة وجافة طوال العملية.
  4. قم بإعداد أنبوب اختبار سعة 50 مل يحتوي على 70٪ إيثانول وأنبوب اختبار آخر سعة 50 مل يحتوي على 0.13٪ من البيتادين في PBS ، وضعه في الغطاء. ضع الملقط ومقبض المشرط في أنبوب اختبار الإيثانول للحفاظ على العقم أثناء التعامل مع الأنسجة وضع لوحة ثقافة خلايا معقمة مكونة من 6 آبار في الجزء الخلفي من الغطاء.
  5. قم بإعداد 3 مل من وسائط زراعة الخلايا لكل عينة متوقعة. تتكون وسائط الاستزراع من وسط النسر المعدل (DMEM) مع 0.9 ملي مولار بيروفات الصوديوم والأنسولين والترانسفيرين والسيلينيوم (ITS) و 50 مجم / مل من حمض الأسكوربيك L-ascorbic والأحماض الأمينية غير الأساسية للحد الأدنى من الوسط الأساسي (MEM) والبنسلين والستربتومايسين والأمفوتريسين B. أضف حمض الأسكوربيك و ITS في يوم الاستخدام28.
  6. احصل على أرجل أبهية من الناضجة هيكليا من مسلخ محلي في غضون 6 ساعات من التضحية. احتفظ بالمناديل على الجليد أثناء النقل.
  7. اعزل مفصل الحقن عن طريق إزالة الحافر باستخدام منشار شريطي اللحم دون فتح كبسولة المفصل. قم بإزالة الجلد باستخدام شفرات مشرط # 22 دون ثقب كبسولة المفصل.
  8. اشطف كل ساق جيدا خارج خزانة السلامة الحيوية بالماء البارد لإزالة الأوساخ وقم بتغطيتها بالبيتادين للتطهير.
  9. داخل غطاء مزرعة الأنسجة، افتح كبسولة المفصل باستخدام شفرة مشرط جديدة #22. اعزل المفصل البعيد وحافظ على ترطيب الغضروف المفصلي باستخدام PBS من زجاجة غسيل (الشكل 1 ج). قم بتغطية الغضروف المفصلي بشاش معقم مبلل ب PBS للحفاظ على الترطيب.
  10. قم بعزل المفصل البعيد عن طريق قطع مشط القدم بمنشار تشريح الجثة (الشكل 1 د). ضع المفصل البعيد في الملزمة بحيث يكون الغضروف المغطى متجها لأعلى وشدها حتى يتم تثبيتها. خلال العملية برمتها ، قم بترطيب الشاش على الغضروف بانتظام باستخدام PBS.
  11. قم بطي الشاش بعيدا عن لقمة واحدة واضبط موضع الملزمة بحيث تكون لقمة الحفر فوق المنطقة المسطحة من السطح المفصلي (الشكل 1E).
  12. افتح صمام الكربوي للسماح ل PBS بالتدفق عبر لقمة الحفر. استخدم زجاجة غسيل لترطيب الأنسجة باستمرار باستخدام PBS وتبريد العينات أثناء الحفر.
    ملاحظة: PBS من carboy وزجاجة الغسيل له تأثير تبريد أثناء عملية الحفر.
  13. قلب في اللقمة ببطء ، عن طريق الضغط على لقمة الحفر في سطح اللقمة حرر الضغط بشكل متكرر واترك الحرارة تتبدد. استمر حتى يصل عمق الحفر إلى حوالي 2 مم في العظم تحت الغضروف. كرر لكل جانب (الشكل 1E).
    ملاحظة: تشمل علامات ارتفاع درجة الحرارة التبخر السريع للسوائل أو رائحة الاحتراق.
  14. استخدم منشار تشريح الجثة لتحرير النوى العظمية الغضروفي عن طريق قطع العظم بالتوازي مع سطح الغضروف المفصلي ، مع الاستمرار في الضغط على PBS من زجاجة الغسيل إلى واجهة منشار تشريح الجثة وعظم الغضروف أثناء القطع. خلال هذه الخطوة ، حافظ على الشاش المبلل على سطح الغضروف المفصلي لتجنب الجفاف.
  15. قم بتخزين النوى العظمية الغضروفي (الشكل 1F) في محلول البيتادين المخفف (انظر الخطوة 1.3) حتى تتم معالجة جميع المفاصل.
  16. اشطف النوى العظمية الغضروفي في PBS وانقل العينات إلى آبار فردية من صفيحة معقمة مكونة من 6 آبار تحتوي على 3 مل من وسائط الاستزراع الدافئة مسبقا (DMEM مع 0.9 ملي مولار بيروفات الصوديوم والأنسولين ترانسفيرين والسيلينيوم (ITS) و50 ملغم / مل من حمض الأسكوربيك لتر والأحماض الأمينية غير الأساسية والبنسلين والستربتومايسين والأمفوتريسين ب)28. حفظ العينات في حاضنة مرطبة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 حتى إجراء التأثير في اليوم التالي.

2. تأثير النبات العظمي الغضروفي

  1. قم بتصنيع حامل الصدمات المصنوع من الفولاذ المقاوم للصدأ بسطح تصادم مصقول بالمرآة (الشكل التكميلي 1 والشكل التكميلي 2) وقم بحفر الثقوب المقابلة في لوحة قاعدة برج الإسقاط (الشكل التكميلي 3).
  2. قم بتعقيم المواد التالية باستخدام الأوتوكلاف قبل إجراء التأثير: رأس صادم كروي من الفولاذ المقاوم للصدأ بقطر 15 مم ، حامل من الفولاذ المقاوم للصدأ مع سطح تصادم مصقول بالمرآة ، 4 براغي 6/32 ، 4 غسالات ، ملقط.
  3. ضع برجا إسقاط تم تصميمه وتصنيعهمسبقا 29 في خزانة السلامة الحيوية. استخدم برجا إسقاط برأس تأثير كروي بقطر 15 مم مركب على عربة مجهزة بخلية تحميل ومقياس تسارع (الشكل 2 أ) ، بكتلة نقل إجمالية تبلغ 358.4 جم لهذه الدراسة.
  4. قم بتثبيت الحامل على لوحة قاعدة برج الإسقاط بأربعة براغي معقمة (الشكل 2 ب). في هذه الدراسة ، تم اختبار حاملات ذات فتحات دائرية يبلغ قطرها 8.7 مم و 9.1 مم.
  5. ضع نواة عظمية الغضروف في الحامل (الشكل التكميلي 1 ، الشكل التكميلي 2 ، الشكل التكميلي 3) تحت رأس الاصطدام لبرج الإسقاط بحيث يكون العظم متجها لأعلى.
    ملاحظة: تم اختيار وضع قلب العظم الغضروفي مع توجيه العظم لأعلى والسطح المفصلي المواجه لأسفل30 لتحميل أكثر تجانسا.
  6. اضبط عربة برج الإسقاط على الارتفاع المطلوب بالنسبة إلى الجزء العلوي من العظم. تحديد الارتفاع التقريبي لبرج الإسقاط من الدراسات التجريبية. تم تقييم ارتفاعات 4.0 و 4.5 و 5.0 سم في هذه الدراسة.
  7. انقر فوق الزر ابدأ في برنامج الحصول على البيانات (ملف الترميز التكميلي 1) قبل تحرير عربة برج الإسقاط مباشرة عن طريق تحرير حاجز توقف عمود الدوران (الشكل 2 أ) والسماح لرأس الاصطدام بالسقوط تحت وطأة الجاذبية على العينة. ارفع العربة على الفور وضعها على توقف المغزل.
    ملاحظة: أثناء الارتطام، سيتم جمع البيانات عند kHz 100 باستخدام برنامج الحصول على البيانات المتصل بوحدة الحصول على البيانات، والتي تسجل الإشارات من خلية تحميل موضوعة بين رأس الارتطام والعربة، وكذلك من مقياس التسارع. بينما نرفع العربة في أسرع وقت ممكن بعد الاصطدام ، إلا أنها لا تحتوي على ميزة مقاومة الارتداد أو آلية أخرى لمنع الاصطدام الثاني.
  8. ضع الملف .txt الذي تم إنشاؤه بواسطة برنامج الحصول على البيانات في نفس المجلد مثل كود تحليل بيانات Matlab (ملف الترميز التكميلي 2 ، المتوفر أيضا في https://github.com/sogol-younesi/cartilage-impact-analysis) وقم بتشغيل كود تحليل البيانات لتصفية البيانات الأولية وحساب معلمات التأثير.
    ملاحظة: يستخدم رمز تحليل البيانات سمك غضروف يبلغ 0.563 مم لحساب طاقة التأثير. تم تحديد ذلك على أنه متوسط سمك الغضروف المأخوذ من > 50 موقعا في كل من العينات الخمس في دراسة منفصلة باستخدام طريقة الإبرة31 وجهاز اختبار ميكانيكي Biomomentum Mach-1. يتم حساب معلمات التأثير كما هو موضحسابقا 32.
  9. قم بإزالة الغضروف من العظم بشفرة مشرط # 11 ، حسب الاقتضاء. أعد العينة إلى الوسائط والحاضنة المرطبة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2 حتى التصوير في اليوم التالي.
    ملاحظة: تم تقييم تأثير إزالة الغضروف من العظام مباشرة بعد الاصطدام أو بعد 24 ساعة من التأثير في هذه الدراسة.

3. توصيف صلاحية الخلية في عينات الغضاريف

  1. قم بإزالة الغضروف من العظام إذا لزم الأمر. قطع عينة الغضروف إلى نصفين بمشرط حاد. تجنب إجراء تخفيضات متعددة. اهدف إلى شق واحد لضمان حافة ناعمة.
  2. اغمر كل نصف عينة ذات أهمية في محلول يتكون من 5 ميكرومتر من homodimer الإيثيديوم و 2.5 ميكرومتر كالسيان AM في PBS. احميها من الضوء واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة لإكمال تلطيخ الموتى الحي.
  3. اشطف العينات باستخدام PBS 2x واحتفظ بالعينات في PBS حتى التصوير. الصورة في أقرب وقت ممكن بعد اكتمال التلوين.
  4. ضع عينة الغضروف في وضع مستقيم على بضع قطرات من PBS في طبق مجهري بحيث تكون نصف الدائرة الكاملة مرئية من مقدمة المجهر. التقط الصور باستخدام مجهر متحد البؤر المقلوب. ثني الغضروف قليلا بالملقط إذا فشل في الوقوف منتصبا من تلقاء نفسه.
  5. باستخدام FIJI ، وهو توزيع من ImageJ مع المكونات الإضافيةالمجمعة 33 ، قم أولا بتحويل الصورة إلى 8 بت بالنقر فوق Image > Type > 8 بت. بعد ذلك، قم بتعيين الحد ضمن > صورة ضبط > الحد، وانقر فوق تطبيق. بعد ذلك ، قم بتنفيذ وظيفة مستجمعات المياه ضمن Process > Binary ، وقم بتشغيل تحليل الجسيمات ... ضمن تحليل لكل من القناتين الخضراء والحمراء. قم بتحليل الصور الملتقطة بارتفاع z ثابت لكل عينة لإجراء مقارنات دقيقة بين المجموعات.
  6. احسب صلاحية الخلية بقسمة عدد الخلايا الحية على إجمالي عدد الخلايا في العينة.

4. توصيف موت الخلايا المبرمج في عينات الغضروف

  1. اغمر كل نصف عينة ذات أهمية في كاشف الكشف الأخضر Caspase-3/7 8 ميكرومتر في PBS. يحفظ من الضوء ويحتضن عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  2. اغسل العينات باستخدام PBS 3x. قم بإصلاح العينات الملطخة عن طريق احتضان 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) لمدة 15 دقيقة. اغسلها باستخدام PBS مرة أخرى واحفظها في PBS حتى التصوير. الصورة في غضون 24 ساعة من تلطيخها.
  3. صورة بمجهر متحد البؤر (انظر الخطوة 3.4 أعلاه). للحصول على مقارنات صحيحة لشدة التألق بين المجموعات ، حافظ على معلمات تصوير متسقة لجميع العينات ، بما في ذلك العدسة الموضوعية ، وقوة ليزر الإثارة ، وكسب كاشف أنبوب المضاعف الضوئي ، وحجم الثقب ، وسمك الشريحة البصرية ، وسرعة المسح ، ومتوسط الخط ، ودقة الصورة.
  4. باستخدام ملحق FIJI الخاص ب ImageJ، حدد متوسط القيمة الرمادية ضمن قائمة تحليل > تعيين القياسات... .
  5. استخدم أداة Polygon Section لتحديد مساحة العينة بأكملها الموضحة في الصورة. قم بتنفيذ وظيفة القياس ضمن قائمة التحليل وسجل متوسط القيمة الرمادية، باستخدام نفس معلمات المعالجة عبر المجموعات.
  6. استخدم أداة Polygon Section لتحديد منطقة من الصورة لا تحتوي على العينة وتنفيذ الدالة Measure مرة أخرى. سجل هذا كقيمة رمادية تعني الخلفية.
  7. احسب شدة التألق عن طريق طرح متوسط قيمة الخلفية الرمادية من متوسط القيمة الرمادية للعينة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

تم تطبيق حمل التأثير الميكانيكي على النماذج العظمية الغضروفي باستخدام برج إسقاط بارتفاع عربة يبلغ 4.0 سم و 4.5 سم و 5.0 سم فوق الأنسجة (ن = 3 أو 4). أدت زيادة ارتفاع العربة قبل إطلاقها إلى ارتفاع قوى التأثير ، ومتوسط ضغوط الذروة ، ومعدلات التحميل ، وطاقات التأثير (الجدول 1).

سعينا إلى تطوير نموذج إصابة الغضروف خارج الجسم الحي الذي كان شبه مميت لمدة 24 ساعة بعد الاصطدام. يشير توصيف البقعة الحية / الميتة بعد 24 ساعة من الاصطدام مع ارتفاعات مختلفة لعربة برج الإسقاط إلى أ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

كان الهدف من هذه الدراسة هو توصيف وتحسين نموذج تأثير الغضروف الذي لا يضر بصلاحية الخلية لدراسة الأحداث الجزيئية بعد إصابة الخلايا الغضروفية ، مع الهدف النهائي المتمثل في تطوير علاج ينقذ الخلايا المصابة لمنع تقدم PTOA. سعيا لتحقيق هذا الهدف ، تم تسليم حمولة ميكانيكية إلى الجزء العظمي من النوى العظمية الغضروفي ، ونقل الحمل إلى أنسجة الغضروف. علاوة على ذلك ، قمنا بفحص ارتفاعات التأثير المختلفة ، وتأثيرات لوحات الحامل المختلفة أثناء التأثير ، وتأثيرات وجود العظام في زراعة أنسجة الغضروف بعد ا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

تم دعم هذه الدراسة من قبل NIH NIAMS Grant R21 AR080255. يود المؤلفون أن يشكروا كيفن كار على تقديم خبرته في التصنيع والتصنيع لهذا المشروع. يقر المؤلفون بمتجر جزارة موريسفيل (موريسفيل ، إنديانا) لتوفير الأنسجة لهذه الدراسة. يشكر المؤلفون الموظفين في مركز إنديانا للفحص المجهري البيولوجي الأساسي على مساعدتهم في الفحص المجهري متحد البؤر.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
# 11 شفرة مشرط معقمةThermo Fisher Scientific10-001-823إزالة الغضروف من العظم
# 22 شفرة مشرط معقمةThermo Fisher Scientific10-001-833قم بإزالة الجلد من أنسجة الأبقار وفتح المفصل عن طريق قطع الأربطة
10-1000 ul أطراف ماصةThermo Fisher Scientific02-707-411القياس والنقل  PBS والإعلام الثقافي وغيرها من الحلول 
200 دليل على الإيثانولثيرمو فيشر العلمي03-007-647يستخدم لتحضير 70٪ من الإيثانول كعامل تعقيم لتطهير الأدوات الجراحية والحفاظ على بيئة معقمة أثناء تحضير الأنسجة ومعالجتها.
أنبوب الطرد المركزي سعة 50 مل (معقم)339652 Thermo Fisher Scientificيستخدم لتخزين الوسائط والعينات
جالونThermo Fisher Scientific04-355-233حاوية PBS معقمة متصلة بمحول دوار بواسطة خرطوم.
صفيحة 6 آبار (معقمة)140685Thermo Fisher Scientificتستخدم لتخزين نوى العظم الغضروفي مؤقتا في بيئة معقمة مع وسائط دافئة مسبقا أثناء التجميع ، والحضانة قبل دراسات التأثير ، والتصوير
مقياس تسارعKistler8743A5يستخدم لقياس التسارع الناتج أثناء
طقم تلطيخ موت الخلايا المبرمج (CellEvent)Thermo Fisher ScientificC10423تستخدم لاكتشاف وتصور الخلايا المبرمجة
زجاجات الغسيل القابلة للتعقيمNalgene2405-0500املأ ب PBS المعقم لترطيب الغضروف أثناء حصاد الأنسجة.
منشار تشريح الجثةMopecBD 810إزالة أي عظام زائدة إما بعد فتح المفصل أو استخراج قلب العظم الغضروفي
شفرة المنشار التشريح  موبكد.ب 101يستخدم لقطع العظام لعزل وإطلاق النبتات العظمية الغضروفية.
بيت الدينأفريو الصحة إل بيغيريستخدم لتطهير السطح الخارجي لعينات الأبقار قبل نقلها إلى غطاء المحرك وتخفيفها لتطهير العينات العظمية الغضروفي النهائية.
خرطوم واضح 4 أقدامn / an / aيستخدم لتوصيل العربة سعة 5 لترات التي تحتوي على PBS بالمحول الدوار لمكبس الحفر   ؛ لنقل PBS.
حفر مثقاب أدوات UKAM الصناعية Superhard3EDCD7160تستخدم لاستخراج الإستخلاص العظمي الغضروفي من العظام عن طريق الحفر في الغضروف المفصلي والعظام تحت الغضروف.-  قطر لقمة الحفر: 7/16 "(المثاقب الأساسية الماسية المطلية بالكهرباء)مفتاح
ربط الهلالماكماستر كار5362A1يستخدم لتشديد المشبك (الذي يثبت المفصل في مكانه) وتشديد مثقاب الحفر   ؛  
الماصات المصلية التي يمكن التخلص منهاThermo Fisher Scientific13-678-11قياس ونقل PBS ووسائط الثقافة
الوسادة السفلية التي يمكن التخلص منهاThermo Fisher Scientific23-666-062تستخدم لتغطية المساحة المقابلة لامتصاص الماء والسوائل أثناء الحصاد لمزيد من الراحة والنظافة
وحدات تصفية الفراغ التي تستخدم لمرة واحدةمرشح SCGP00525 Thermo Fisher ScientificPBS وغيرها من الحلول
مكبس الحفر   WEN433TV 3.25 بوصةقم بتطبيق القوة على حفر عينات العظم الغضروفي - WEN 433TV 3.25 بوصة قوة صناعية على منضدة
مكبس إمالة زاوية ملزمةWENTV434يؤمن عينات العظم الغضروفي في وضع ثابت بالزاوية المرغوبة أثناء عملية الحفر.
برج إسقاطمخصص غيرمتاحيستخدم للتأثير على العينات
FIJI (ImageJ Extension)n / an / aالبرنامج المستخدم لمعالجة وتحليل صور الفحص المجهري ، بما في ذلك صلاحية الخلية وقياس موت الخلايا
المبرمج ملقطFisherbrand12-000-163يستخدم لقطع الأنسجة في غطاء المحرك وفتح المفصل ونقل العينات
شاش (معقم)دوكال6412تستخدم لترطيب الغضروف المفصلي بعد فتح كبسولة المفصل
زجاجة وسائط زجاجية سعة 1 لترSigmaAldrich CLS13951LHTCتستخدم لتخزين PBS & nbsp المعقمة ؛
قفازاتThermo Fisher Scientific19-130-1597Dتستخدم لحماية فريق التجميع
الأنسولين - ترانسفيرين - السيلينيوم (ITS)Gibco41400-045ملحق الوسائط
LabVIEW برنامج الحصول على البياناتNational Instrumentsn / aيلتقط البيانات من خلية الحمل ومقياس التسارع أثناء اختبار التأثير للتحليل اللاحق.
حمض الأسكوربيك L-ascorbicMerckA4403مكمل الوسائط
مجهر المسح الضوئي متحد البؤر بالليزرأوليمبوسFV1000Dيستخدم لالتقاط صور عالية الدقة وثلاثية الأبعاد لعينات الأنسجة الملطخة.
مجموعة تلطيخ الفحص الحي والميتThermo Fisher ScientificL3224تستخدم للتمييز بين الخلايا الحية والميتة في عينات الأنسجة لتقييم صلاحية
الخلية خلية الحملKistler9712B5000تستخدم لقياس القوة المطبقة أثناء الاصطدام.
MATLAB شركة MathWorks Inc.n / a
رأى شريطاللحم SkymsenMSKLEإزالة الحافر الرسغي من عينات الأبقار
Micropipette 10-100 uLThermo Fisher ScientificFBE00100Measurement and Transfering  PBS ووسائط الثقافة
الحد الأدنى من الوسط الأساسي (MEM) محلول الأحماض الأمينية غير الضروريGibco11140-050ملحق الوسائط
النسر المعدل s متوسط (DMEM)Gibco10566-016ثقافة زرع العظم الغضروفي.
البنسلين ستربتومايسينثيرمو فيشر العلمي15-140-148مكمل الوسائط
مخزن بالفوسفاتThermo Fischer ScientificBP399-20يستخدم لشطف وترطيب وتبريد الأنسجة للحفاظ على الظروف الفسيولوجية ومنع الجفاف وإعداد محاليل تلطيخ
حامل عينة على برج إسقاطمصنوع حسب الطلبغيريؤمن قلب العظم الغضروفي أثناء الاصطدام.
مقبض مشرط ثيرمو فيشر العلمي16-100-107يستخدم للقطع الدقيق وتشريح الأنسجة وفتح المفصل.
مسامير (أضف إلى cad)6-32 خيط بحجم -18-8 مسامير رأس مقبس من الفولاذ المقاوم
للصدأ بيروفات الصوديومGibco11360-070ملحق الوسائط
رأس الاصطدام الكرويماكماستر كار9292K52الأوتوكلاف قبل إجراء التأثير
الأقنعة الجراحيةقناع الترشيح375101تستخدم لحماية فريق التجميع
محول دوار المياه   ؛UKAM Industrial SuperhardTools 7035812بمثقاب الحفر لتوفير تدفق مستمر ل PBS للتبريد أثناء عملية الحفر.
سعة 5 متاح محلول ملحي متوفر يتصل

المراجع

  1. Thomas, A. C., Hubbard-Turner, T., Wikstrom, E. A., Palmieri-Smith, R. M. Epidemiology of Posttraumatic Osteoarthritis. J Athletic Training. 52 (6), 491(2017).
  2. Dilley, J. E., Bello, M. A., Natoli, R. M., McKinley, T. O., Sankar, u Post-traumatic Osteoarthritis: A Review of Pathogenic Mechanisms and Novel Targets for Mitigation. Bone Rep. 18, 101658(2023).
  3. Grande, D. A., Schwartz, J. A., Brandel, E., Chahine, N. O., Sgaglione, N. Articular Cartilage Repair: Where We Have Been, Where We Are Now, and Where We Are Headed. Cartilage. 4 (4), 281(2013).
  4. Punzi, L., et al. Post-traumatic Arthritis: Overview On Pathogenic Mechanisms and Role of Inflammation. RMD Open. 2 (2), e000279(2016).
  5. Chubinskaya, S., Wimmer, M. A. Key Pathways to Prevent Posttraumatic Arthritis for Future Molecule-Based Therapy. Cartilage. 4 (3 Suppl), 13S(2013).
  6. Ding, L., et al. Mechanical Impact Induces Cartilage Degradation via Mitogen Activated Protein Kinases. Osteoarthritis Cartilage. 18 (11), 1509(2010).
  7. Bonnevie, E. D., et al. Characterization of Tissue Response to Impact Loads Delivered Using a Hand-Held Instrument for Studying Articular Cartilage Injury. Cartilage. 6 (4), 226(2015).
  8. Nishimuta, J. F., Levenston, M. E. Response of Cartilage and Meniscus Tissue Explants to In Vitro Compressive Overload. Osteoarthritis and Cartilage. 20 (5), 422(2012).
  9. Liu, Q., et al. Effects of Mechanical Stress on Chondrocyte Phenotype and Chondrocyte Extracellular Matrix Expression. Sci Rep. 6 (1), 1-8 (2016).
  10. Martin, J. A., McCabe, D., Walter, M., Buckwalter, J. A., McKinley, T. O. N-Acetylcysteine Inhibits Post-Impact Chondrocyte Death in Osteochondral Explants. Bone Joint Surg Am. 91 (8), 1890(2009).
  11. Natoli, M. R., Scott, C. C., Athanasiou, A. K. Temporal Effects of Impact on Articular Cartilage Cell Death, Gene Expression, Matrix Biochemistry, and Biomechanics. Ann Biomed Eng. 36 (5), 780-792 (2008).
  12. Huser, C. A. M., Davies, M. E. Calcium Signaling Leads to Mitochondrial Depolarization in Impact-Induced Chondrocyte Death in Equine Articular Cartilage Explants. Arthritis Rheumatism. 56 (7), 2322-2334 (2007).
  13. Delco, M. L., Bonnevie, E. D., Bonassar, L. J., Fortier, L. A. Mitochondrial Dysfunction is An Acute Response of Articular Chondrocytes to Mechanical Injury. J Ortho Res. 36 (2), 739-750 (2018).
  14. Goodwin, W., et al. Rotenone Prevents Impact Induced Chondrocyte Death. J Ortho Res. 28 (8), 1057(2010).
  15. Bartell, L. R., et al. Mitoprotective Therapy Prevents Rapid, Strain-Dependent Mitochondrial Dysfunction After Articular Cartilage Injury. Ortho Res. 38 (6), 1257-1267 (2020).
  16. Zhang, K., et al. Mechanosensory and Mechanotransductive Processes Mediated by Ion Channels in Articular Chondrocytes: Potential Therapeutic Targets for Osteoarthritis. Channels. 15 (1), 339(2021).
  17. Xu, B. Y., et al. The Potential Role of Mechanically Sensitive Ion Channels in the Physiology, Injury, and Repair of Articular Cartilage. J Ortho Surg. 28 (3), 2309499020950262(2020).
  18. Lee, W., et al. Synergy Between Piezo1 and Piezo2 Channels Confers High-strain Mechanosensitivity to Articular Cartilage. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (47), E5114-E5122 (2014).
  19. Jia, Y. Double-Edged Role of Mechanical Stimuli and Underlying Mechanisms in Cartilage Tissue Engineering. Front Bioeng Biotechnol. 11, 1271762(2023).
  20. Chan, P. S., et al. Gene Expression Profile of Mechanically Impacted Bovine Articular Cartilage Explants. J Ortho Res. 23 (5), 1146-1151 (2005).
  21. Burton-Wurster, N., et al. Genes in Canine Articular Cartilage that Respond to Mechanical Injury: Gene Expression Studies with Affymetrix Canine GeneChip. J Heredity. 96 (7), 821-828 (2005).
  22. Ashwell, M. S., et al. Changes in Chondrocyte Gene Expression Following In Vitro Impaction of Porcine Articular Cartilage in an Impact Injury Model. J Ortho Res. 31 (3), 385-391 (2013).
  23. Karnik, S., et al. Decreased SIRT1 Activity Is Involved in the Acute Injury Response of Chondrocytes to Ex Vivo Injurious Mechanical Overload. Int J Mol Sci. 24 (7), 6521(2023).
  24. Martin, J. A., McCabe, D., Walter, M., Buckwalter, J. A., McKinley, T. O. N-Acetylcysteine Inhibits Post-Impact Chondrocyte Death in Osteochondral Explants. J Bone Joint Surg Am. 91 (8), 1890(2009).
  25. Argote, P. F., et al. Chondrocyte Viability is Lost During High-Rate Impact Loading by Transfer of Amplified Strain, But not Stress, to Pericellular and Cellular Regions. Osteoarth Cartil. 27 (12), 1822(2019).
  26. Bush, P. G., Hodkinson, P. D., Hamilton, G. L., Hall, A. C. Viability and Volume of In Situ Bovine Articular Chondrocytes-Changes Following a Single Impact and Effects of Medium Osmolarity. Osteoarth Cartil. 13 (1), 54-65 (2005).
  27. Coleman, M. C., et al. Targeting Mitochondrial Responses to Intra-Articular Fracture to Prevent Posttraumatic Osteoarthritis. Sci Transl Med. 10 (427), 5372(2018).
  28. Garrity, J. T., Stoker, A. M., Sims, H. J., Cook, J. L. Improved Osteochondral Allograft Preservation Using Serum-Free Media at Body Temperature. Am J Sports Med. 40 (11), 2542-2548 (2012).
  29. Bonitsky, C. M., et al. Genipin Crosslinking Decreases the Mechanical Wear and Biochemical Degradation of Impacted Cartilage In Vitro. J Ortho Res. 35 (3), 558-565 (2017).
  30. Henson, F. M. D., Vincent, T. Chondrocyte Outgrowth Into a Gelatin scaffold in a Single Impact Load model of Damage/RepairEffect of BMP-2. BMC Musculoskel Disorders. 8, 120(2007).
  31. Jurvelin, J. S., Räsänen, T., Kolmonens, P., Lyyra, T. Comparison of Optical, Needle Probe and Ultrasonic Techniques for the Measurement of Articular Cartilage Thickness. J Biomech. 28 (2), 231-235 (1995).
  32. Dilley, J., et al. A Reproducible Cartilage Impact Model to Generate Post-Traumatic Osteoarthritis in the Rabbit. J Vis Exp. (201), e64450(2023).
  33. Schindelin, J., et al. Fiji: an Open-Source Platform for Biological-Image Analysis. Nat Meth. 9 (7), 676-682 (2012).
  34. Buckwalter, J. A., Brown, T. D. Joint injury, repair, and remodelling: Roles in post-traumatic osteoarthritis. Clin Ortho Related Res. 423, 7-16 (2004).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

نموذج صدم الغضروفالفصال العظمي ما بعد الصدمةتطبيق الحمل الميكانيكيالمستأصلات العظمية الغضروفيةمقايسة حيوية الخلاياإشارات الموت الخلوي المبرمجتقنية برج الإسقاطالعظم تحت الغضروفي
في المختبر نموذج تأثير لتوليد إصابة الخلايا الغضروفية شبه المميتة في مستخلصات الغضروف البقري
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.