مقالة منهجية

تحرير CRISPR Epigenome في الخلايا البشرية باستخدام تعداء الحمض النووي البلازميد وتوصيل نواة mRNA

DOI:

10.3791/68089

⸱

مايو 30, 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular and Cell Biology, University of California, Berkeley, 2Chan Zuckerberg Biohub - San Francisco

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف البروتوكول طرقا لتحرير الإبيجينوم القائم على التكرارات المتجانسة القصيرة العنقودية المتباعدة بانتظام (CRISPR) في خطوط الخلايا البشرية باستخدام تعداء الحمض النووي البلازميد ونوكة الحمض النووي المرسال المرسال.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يشير علم التخلق إلى التعديلات الكيميائية لبروتينات الهيستون والحمض النووي التي يمكن أن تنظم التعبير عن الجينات. يتغير الإبيجينوم البشري ديناميكيا أثناء تمايز الخلايا والشيخوخة ، وترتبط العديد من الأمراض بنمذجة الجينوم الشاذة. أدت التطورات الحديثة في كريسبر إلى تطوير أدوات قابلة للبرمجة لتحرير التعديلات اللاجينية في المواقع الجينومية المستهدفة ، مما يتيح إعادة الكتابة الدقيقة للتعديلات اللاجينية في الخلايا البشرية. يعتمد محررو الجينوم المستند إلى كريسبر على Cas9 الميت تحفيزيا إلى جانب المعدلات اللاجينية التي تؤدي في النهاية إلى قمع مبرمج أو تنشيط الجينات المستهدفة في جينومات الثدييات. على عكس طرق تحرير الجينوم التقليدية ، لا يتطلب تحرير epigenome فواصل الحمض النووي أو تغييرات في تسلسل الجينوم البشري ، وبالتالي يعمل كبديل أكثر أمانا للتحكم في التعبير الجيني. في هذا البروتوكول ، نسلط الضوء على طريقتين مختلفتين لإجراء تحرير الإبيجينوم بوساطة dCas9 في خطوط الخلايا البشرية باستخدام تعداء الحمض النووي البلازميد ونوة الحمض النووي الريبي المرسال التي تشفر محرري جينوم CRISPR. نظهر تحرير epigenome القابل للبرمجة لقمع الجينات بشكل عابر باستخدام تداخل CRISPR (CRISPRi) وإسكات الجينات بشكل دائم لعدة أسابيع باستخدام CRISPRoff ، وهو اندماج dCas9 في مجال KRAB ومركب ميثيل ترانسفيراز دي نوفو DNA. نقدم أيضا إرشادات حول الأساليب الكمية لقياس التحرير الناجح للجينات المستهدفة والاعتبارات الرئيسية التي يجب استخدامها على أداة تحرير الجينوم ، اعتمادا على المعايير التجريبية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

على الرغم من أن المحتوى الجيني لكل خلية في أجسامنا متطابق تقريبا ، إلا أن ملف النسخ لكل نوع من الخلايا يختلف اختلافا كبيرا. تعد التعديلات اللاجينية على بروتينات الحمض النووي والهيستون من المنظمين الرئيسيين للتعبير النسخي. يتميز اليوكروماتين النشط النسخي بعلامات جينية مميزة مقارنة بالكروماتين غير المتجانس المضغوط وغير النشط من الناحية النسخية. على سبيل المثال ، يتم تعريف المناطق غير المتجانسة من خلال تعديلات هيستون القمعية ، بما في ذلك ثلاثي الميثيل على اللايسين 9 من هيستون 3 (H3K9me3) ، ثلاثي الميثيل على اللايسين 27 من هيستون H3 (H3K27me3) ، ومثيلة الحمض النووي على السيتوزين بجوار الجوانين (CpG) في محفزات الجينات1. يتم تعريف المناطق الجينومية للتعبير الجيني النشط عادة عن طريق أستلة الهيستون وثلاثي الميثيل على اللايسين 4 من هيستون 3 (H3K4me3) 1.

ولدت ثورة التكرارات المتجانسة القصيرة العنقودية المتباعدة بانتظام (CRISPR) ثروة من الأدوات التي تتيح التغيير المبرمج للتسلسلات الجينومية. تعتمد تقنية كريسبر على آلية دفاع بدائية النواة قادرة على شق الأحماض النووية في تسلسلات مستهدفة قابلة للبرمجة. يمكن لنوكليازات كريسبر2،3،4 ، والمحررين الأساسيين5،6 ، والمحررينالرئيسيين 7،8 تغيير تسلسل الحمض النووي لجينومات الثدييات من خلال قطع الحمض النووي وإصلاح هذه الفواصل. على الرغم من فعاليتها ، إلا أن هذه الاستراتيجيات يمكن أن تتسبب في كسر الحمض النووي في المواقع غير المستهدفة9،10 والطفرات الهيكلية الجينومية واسعة النطاق11،12،13،14،15. تتيح الأدوات البديلة القائمة على كريسبر التعديل القابل للتتبع لتنشيط الجينات وقمعها دون تغيير تسلسل الحمض النووي الأساسي. تسخر هذه الأدوات Cas9 (dCas9) الذي يعاني من نقص النوكلياز ، مما يسمح بربط الحمض النووي في المواقع المستهدفة التي يمليها تسلسل sgRNA ، بالاشتراك مع بروتينات المستجيب التي تغير مشهد الكروماتين16،17،18. يمكن دمج البروتينات المستجيبة ، مثل الكتاب اللاجينية والقراء والممحاة ، مباشرة في dCas9 أو تجنيدها بواسطة سقالة ببتيد مدمجة في dCas9 ، مثل SunTag ، أو سقالة الحمض النووي الريبي على sgRNA ، مثل نظام MS2-MCP16،17،18. تتضمن أمثلة أدوات التحكم في النسخ القابلة للبرمجة تنشيط CRISPR (CRISPRa) 19،20،21 وتداخل CRISPR (CRISPRi) 22،23. يعمل CRISPRa عن طريق تجنيد آلية النسخ مباشرة ، مما يزيد من التعبير الجيني للنسخ المستهدف19. في المقابل ، يقمع CRISPRi النسخ عن طريق إنشاء H3K9me3 ، وهي علامة جينية قمعية22.

وقد مكن التقدم في تحرير الإبيجينوم من الاستخدام الواسع لهذه الأدوات عبر المجالات العلمية. أدت عمليات اندماج مجالات المستجيب والبروتينات المختلفة إلى توسيع مجموعة أدوات محرري الجينوم المتاحين18،24،25،26،27،28،29،30. بالإضافة إلى ذلك ، يتم استخدام محرري epigenome لفك تشفير أدوار التعديلات اللاجينية31،32،33،34،35،36 ، والمؤثرات37،38،39 ، والطفرات المستجيبة28،40،41 في تنظيم الجينات. على وجه التحديد ، يتم استخدام CRISPRi و CRISPRa في شاشات الجينوم الوظيفية لمجموعة متنوعة من العمليات البيولوجية ، بما في ذلك بقاء الخلية42 ومصير الخلية43،44،45،46،47. علاوة على ذلك ، فإن تحرير epigenome يحمل إمكانات علاجية لهندسة الخلايا خارج الجسم الحي والعلاجات في الجسم الحي 18.

هنا ، نصف طرق تطبيق اثنين من محرري الجينوم المستندين إلى dCas9 لقمع النسخ القابل للبرمجة في خطوط الخلايا البشرية: CRISPRi22 و CRISPRoff48. CRISPRi هو اندماج dCas9 إلى مجال KRAB القمعي من بروتين إصبع الزنك مثل ZNF10 (KOX1) و ZIM322،23. عندما يتم استهداف CRISPRi إلى محفز جين معين ، يقوم مجال KRAB بتجنيد كاتب H3K9me3 ، SETDB1 ، لقمع الجين المستهدف (الشكل 1 أ). عندما يتم التعبير عن CRISPRi بشكل عابر ، لا يتم الحفاظ على H3K9me3 الذي تم إنشاؤه في الموضع المستهدف ، ويتم استعادة التعبير الجيني بمرور الوقت32،48. لإجراء ضربة قاضية مستقرة باستخدام CRISPRi كما هو الحال في تطبيقات الجينوم الوظيفية ، يعد التعبير التأسيسي ل CRISPRi في الخلايا جنبا إلى جنب مع sgRNA أمرا ضروريا. في الآونة الأخيرة ، تم تصميم CRISPRoff لبرمجة تحرير الإبيجينوم الوراثي48. CRISPRoff هو اندماج بروتيني واحد ل dCas9 إلى مجال KRAB ومركب ميثيل ترانسفيراز دي نوفو DNA و DNMT3A و DNMT3L. نبضة عابرة من CRISPRoff في الخلايا البشرية برامج ترسب H3K9me3 ومثيلة الحمض النووي في الجينات المستهدفة ، مما يؤدي إلى قمع طويل الأمد للجينات المستهدفة عن طريق الحفاظ على مثيلة الحمض النووي و H3K9me3 (الشكل 1 ب) 48. علاوة على ذلك ، يمكن عكس تعديلات epigenome. على سبيل المثال ، يمكن إعادة تنشيط الجين الذي يتم إسكاته بثبات بواسطة CRISPRoff بواسطة TET1-dCas9 والذي يمكنه إزالة علامات مثيلة الحمض النووي إنزيميا في المواقعالمستهدفة 49.

سيفصل هذا البروتوكول طريقتين للتسليم للتعبير العابر لمحرري الإبيجينوم: تعداء الحمض النووي البلازميد ونوكة الحمض النووي المرسال المرسال. بالإضافة إلى ذلك ، نوضح كيفية استخدام قياس التدفق الخلوي لتقييم فعالية تحرير الإبجنوم في جينين داخليين ، CLTA و CD55. يمكن تكييف هذه الطرق وتطبيقها على تجارب تحرير الإبيجينوم الأخرى باستخدام محررين إضافيين أو يمكن استخدامها لاستهداف جينات مختلفة.

figure-introduction-1
الشكل 1: تخطيطي لآلية تحرير الجينوم CRISPRi و CRISPRoff وسير العمل. (أ) المخططات الخطية لمحرر الجينات المعدل sgRNA ومحرر الجينوم CRISPRi. تسمح إضافة CRISPRi و sgRNA بإضافة علامة هيستون H3K9me3 القمعية لإسكات الموضع المستهدف. يتم تحقيق أعلى مستوى من الإسكات في وقت مبكر بعد إضافة CRISPRi ، ويتم إعادة تنشيط هدف الجين بشكل عام بعد بضع مقاطع. (ب) المخططات الخطية لمحرر الجينوم المعدل sgRNA ومحرر الجينوم CRISPRoff. تؤدي إضافة CRISPRoff إلى الخلايا التي تستهدف جينا ذا أهمية إلى إضافة H3K9me3 القمعي جنبا إلى جنب مع مثيلة الحمض النووي في مواقع CpG لإسكات الجين المستهدف. إسكات بواسطة CRISPRoff وراثي - يتم تحقيق المستوى العالي من الإسكات في وقت مبكر أثناء التعدي ويستمر على انقسامات الخلايا المتعددة. (ج) نظرة عامة على الجدول الزمني لتحرير epigenome عن طريق طريقة التعدين. في اليوم 0 ، يتم طلاء الخلايا للتعداد. في اليوم الأول ، يمكن إدخال المحرر والدليل البلازميد في الخلايا عن طريق التعداد. في اليوم 3 ، سيتم تقييم الخلايا لتعبير BFP عن طريق قياس التدفق الخلوي. يتم استخدام النسبة المئوية ل BFP كعامل تطبيع لتحديد فعالية الإسكات النهائية للتجربة لكل حالة. في اليوم السادس فصاعدا ، يتم تحليل الخلايا لإسكات المراسل المهتم حيث سيتم تحقيق أعلى مستوى من الإسكات في هذا اليوم. (د) نظرة عامة على طريقة التعدي حيث تتم إضافة محرر epigenome و sgRNA البلازميدات إلى الخلايا بطريقة متساقطة. (ه) نظرة عامة على الجدول الزمني لتحرير الإبيجينوم عبر طرق النواة. في هذا البروتوكول ، mRNA هو نواة في الخلايا في اليوم 0. يتم تقييم الخلايا للإسكات في اليوم 3 بعد النوة باستخدام تحليل قياس التدفق الخلوي. (و) نظرة عامة على بروتوكول النواة. يتم خلط كميات مناسبة من الخلايا و mRNA وإضافتها إلى كوفيت نوكليوفكتور. إذا تم إدخال sgRNA عن طريق النواة ، فيمكن أيضا إضافته إلى هذا الخليط. يتم وضع الكوفيتات في النواة ، ويتم استخدام رموز النبض المناسبة لإدخال الرنا المرسال في الخلايا. بعد النواة ، يتم طلاء الخلايا وتمريرها لتحليلها في الأيام اللاحقة. (ز) مقارنة بين تعداء البلازميد واستراتيجيات نوكليوفكت الرنا المرسال لتحرير الإبيجينوم. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: يحتوي الملف التكميلي 1 على تفاصيل حول تصميم sgRNA والاستنساخ وتوليد خط الخلية لبياناتنا التمثيلية. كما يوضح قسم النتائج التمثيلية اقتراحات لعناصر التحكم.

1. تعداء البلازميدات التي تعبر عن محرر epigenome إلى خلايا HEK293T

ملاحظة: يصف هذا البروتوكول تسليم البلازميدات المشفرة بتقنية CRISPR إلى خلايا HEK293T. لقد قمنا بتصميم الخلايا للتعبير عن sgRNA (Addgene 217306) التي تستهدف منطقة المحفز ل CLTA ، وهو جين غير أساسي ، والذي تم تمييزه داخليا ب GFP. نشأت خلايا CLTA-GFP HEK 293T من دراسة سابقة50. في هذا المثال ، يتم دمج محرري epigenome مباشرة في بروتين الفلورسنت الأزرق (BFP) ، مما يسمح لنا بتحديد كفاءة التعدي ويضمن تقييما دقيقا للظروف التجريبية. تظهر فعالية هذا النهج من خلال إسكات CLTA-GFP ، والذي يمكن قياسه كميا على مستوى البروتين في الخلايا المفردة باستخدام قياس التدفق الخلوي.

  1. زراعة الخلايا
    1. الحفاظ على خلايا HEK293T في نسبة عالية من الجلوكوز DMEM مع 10٪ FBS و 1x بنسلين ستربتومايسين جلوتامين. قم بتمرير الخلايا كل 2-3 أيام ، مع التأكد من بقائها عند التقاء 60٪ -70٪.
      ملاحظة: لضمان كفاءة التعداء المثلى ، من الأهمية بمكان الحفاظ على التقاء الخلايا أقل من 70٪ ، والتي يمكن مراقبتها يوميا تحت المجهر.
  2. اليوم 0: بذر خلايا HEK293T من أجل التعداء
    1. في اليوم السابق للتعداء ، قم بحساب الخلايا باستخدام عداد خلوي آلي باستخدام تلطيخ أحياء / ميت باللون الأزرق والبذور ~ 1.5 × 104 خلايا حية لكل بئر في صفيحة 96 بئرا. حافظ على الحجم النهائي لكل بئر عند 200 ميكرولتر ، ويجب أن تصل الخلايا إلى التقاء 60٪ -70٪ في اليوم التالي.
      ملاحظة: يمكن أيضا إجراء ذلك في ألواح 24 بئر أو 6 بئر بكفاءة. انظر الجدول 1 لمعرفة أرقام الخلايا وكمية الحمض النووي للتعداد.
  3. اليوم 1: نقل بلازميدات CRISPROFF و CRISPRi إلى خلايا HEK29T
    1. Aliquot 150 ng من بلازميد محرر epigenome (Addgene 167981) لكل بئر في الحجم الكلي 3 ميكرولتر. يمكن تحضير هذه التخفيفات البلازميد في أنابيب شريط PCR.
      ملاحظة: إذا تم نقل محرر epigenome و sgRNA البلازميد بشكل مشترك ، فإننا نوصي بتجربة نسبة مولار 3: 4 من المحرر: بلازميدات sgRNA. قد تحتاج النسبة إلى التحسين لتحقيق أعلى كفاءة لتحرير الإبيجينوم.
    2. قم بتسخين كاشف التعداء والحد الأدنى من المتوسط الأساسي إلى درجة حرارة الغرفة قبل حوالي 30-60 دقيقة من التعدين. امزج 0.6 ميكرولتر من كاشف النفقة و 20 ميكرولتر من الحد الأدنى من الوسط الأساسي لكل بئر واحتضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
      ملاحظة: يمكن عمل مزيج رئيسي من كاشف التعدي والحد الأدنى من الوسط الأساسي في حالة إجراء عمليات تعداء متعددة.
    3. أضف 20.6 ميكرولتر من كاشف التعدي والحد الأدنى من خليط الوسط الأساسي إلى كل أنبوب شريط تفاعل البوليميراز المتسلسل يحتوي على 3 ميكرولتر من الحمض النووي البلازميد. اتركيه في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
    4. أضف الخليط ببطء إلى طبق الخلايا المصنفة واضغط على الطبق برفق لتفريق الخليط. قم بتضمين عنصر تحكم غير منقل لتوفير خط أساس مناسب للمقارنة في التحليلات النهائية.
      ملاحظة: عند إضافة خليط التعدي إلى الخلايا المصنفة ، من الضروري القيام بذلك بالتنقيط وبلطف لتقليل الاضطراب ، لأن هذا يمكن أن يؤثر سلبا على كفاءة التعدي.
  4. اليوم 2: التحقق من نجاح التعدي
    1. افحص الخلايا تحت المجهر بتكبير 10 أضعاف لتحديد ما إذا كانت إيجابية BFP ، لأن هذا يشير إلى تعداء ناجح. تأكد من عدم إزعاج الخلايا أثناء عملية المراقبة.
  5. اليوم 3: تقسيم اللوحة المكونة من 96 بئرا وتقييم كفاءة التعداء باستخدام علامة BFP
    ملاحظة: يجب أن ينتج عن التعدي الناجح ما لا يقل عن 30٪ من الخلايا على أنها إيجابية BFP. ومع ذلك ، مع dCas9 و CRISPRi و CRISPRoff ، نكتشف عادة أكثر من 60٪ من الخلايا الموجبة ل BFP بعد يومين من التعدي. ترتبط كفاءة التعدي سلبا بحجم البلازميد ، لذلك قد ينتج عن محرري الإبيجينوم المختلفين كفاءات تعداء مختلفة.
    1. قم بتسخين التربسين و DMEM مع 10٪ FBS و 1x Penicillin-Streptomycin-Glutamine إلى درجة حرارة الغرفة لمدة 30-60 دقيقة قبل الاستخدام.
    2. استنشاق الوسائط من الآبار. احرص على عدم إزالة الخلايا المتصلة بالأسفل. أضف 50 ميكرولتر من التربسين لكل بئر. احتضان لمدة 2-3 دقائق عند 37 درجة مئوية.
      ملاحظة: ليس من غير المعتاد ملاحظة بعض الخلايا العائمة ، خاصة بعد التعدي باستخدام CRISPRoff. نفترض أن موت الخلية هذا يرجع إلى سمية الإفراط في التعبير DNMT3A-3L.
    3. تثبيط التربسين بإضافة 150 ميكرولتر من DMEM الكامل لكل بئر. الماصة لأعلى ولأسفل لإعادة تعليق الخلايا وتقسيم الخلايا للالتقاء في اليوم 5 (~ 20 ميكرولتر من خليط الخلية في 200 ميكرولتر من الوسائط للوحة 96 بئر).
    4. استخدم 50 ميكرولتر من الخلايا المعلقة لقياس التدفق الخلوي لتقييم كفاءة التعداد.

2. نوة محرر الإبيجينوم mRNA في خلايا K-562

ملاحظة: يوضح هذا القسم بالتفصيل عملية نوة CRISPRoff mRNA إلى خلايا K-562. من أجل البساطة ، قمنا بهندسة خلايا K-562 مسبقا للتعبير بشكل أساسي عن sgRNA الذي يستهدف محفز الجين الذاتي CD55 (Addgene 217306). إن توصيل CRISPRoff mRNA مباشرة إلى الخلايا لديه القدرة على تقليل السمية الخلوية التي تصاحب الأساليب القائمة على الحمض النووي البلازميد مع الاستمرار في تحقيق فعالية إسكات جينات مماثلة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام النواة لإدخال تركيبات محرر الإبيجينوم في خطوط الخلايا التي يصعب نقلها بكفاءة ، مثل K-562s.

  1. زراعة الخلايا
    1. قبل النوة ، احتفظ بخلايا K-562 في قارورة مع RPMI مع 10٪ FBS و 1x Penicillin-Streptomycin-Glutamine. قم بالمرور على الخلايا كل يوم ، مع التأكد من بقائها عند التقاء 60٪ -70٪.
    2. في يوم النواة ، قم بإذابة ودوامة CRISPRoff mRNA برفق في أنبوب طرد مركزي دقيق معقم خال من RNase وتخزين mRNA على الجليد. استخدم 2 ميكروغرام من الرنا المرسال لكل 2.0 × 105 خلايا في كل بئر من شريط النوكليات. تأكد من أن حجم الرنا المرسال لا يتجاوز 10٪ من إجمالي حجم النواة (22 ميكرولتر).
      ملاحظة: يمكن أيضا إجراء النواة في كوفيت أكبر مع المزيد من الخلايا و mRNA. نقترح قياس كمية الرنا المرسال بشكل متناسب مع عدد الخلايا التي ستضيفها. على سبيل المثال ، عند إجراء نوة في كوفيت كبير على 1 × 106 خلايا ، نقترح استخدام 10 ميكروغرام من الرنا المرسال ، بحجم إجمالي للنواة يبلغ 100 ميكرولتر. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تحسين جرعة الرنا المرسال لضمان فعالية تحرير عالية. غالبا ما نستخدم 2-5 ميكروغرام من mRNA للمحرر لكل 2.0 × 105 خلايا للحصول على نتائج فعالة. يجب إزالة النيوكليوتيدات الحرة التي لم يتم دمجها أثناء تخليق mRNA قبل القياس الكمي.
    3. قم بإعداد محلول النواة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة وقم بتسخينه إلى درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة قبل النواة.
      ملاحظة: قد يكون محلول النواة مختلفة أو يحتاج إلى تحسينه لأنواع الخلايا المختلفة.
    4. احصد وعد خلايا K-562 باستخدام عداد خلوي آلي مع تلطيخ حي / ميت باللون الأزرق تريبان. بالنسبة للنوة في كوفيت شريطي ، aliquot ~ 2.0 × 105 خلايا لكل عينة في أنبوب طرد مركزي دقيق معقم.
    5. قم بالطرد المركزي للخلايا عند 500 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، ثم تخلص من المادة الطافية. اغسل الخلايا 1x بدرجة حرارة الغرفة PBS عند 500 × جم لمدة 5 دقائق ، ثم تخلص من المادة الطافية.
    6. احسب كمية محلول النواة المثول لإعادة تعليق الخلايا عن طريق طرح حجم الرنا المرسال من 22 ميكرولتر.
    7. أضف محلول الخلية إلى 2 ميكروغرام من CRISPRoff mRNA (الحجم المحدد في الخطوة 2.1.2) وانقل المحلول إلى كوفيت ، مع الحرص على عدم تكوين فقاعات ، لأن هذا قد يضر بكفاءة النواة. اضغط برفق على النواة للتأكد من أن الخلايا في الأسفل.
    8. قم بتشغيل الخلايا باستخدام نظام 4D-Nucleofector باستخدام رمز النبض المناسب. يوصى باستخدام رمز FF-120 لخلايا K-562.
      ملاحظة: قد يحتاج رمز النبض إلى التحسين لأنواع الخلايا المختلفة. استشر الشركة المصنعة إذا كانت هناك حاجة إلى تحسين إضافي.
    9. بعد النواة ، أضف 80 ميكرولتر من وسائط RPMI إلى كل بئر نوكلي صغير واترك الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
    10. نقل معلق الخلية إلى بئر من صفيحة 24 بئرا تحتوي على 400 ميكرولتر من وسائط RPMI الدافئة مسبقا (nucleocuvette الصغيرة).
      ملاحظة: بعد النواة ، تكون الخلايا هشة بشكل خاص ويجب نقلها من النواة إلى آبار الثقافة برفق.
    11. بعد اليوم 2 بعد النواة: اتبع بروتوكول تلطيخ علامة السطح بالجسم المضاد CD55 كما هو موضح في القسم 3 وقم بقياس تألق CD55 APC على مقياس التدفق الخلوي لفحص فعالية تحرير epigenome.
      ملاحظة: لفحص نجاح النواة ، نوصي بإجراء نوكليوفكتيون باستخدام GFP أو mCherry mRNA. بعد يومين من النواة ، قم بإجراء قياس التدفق الخلوي لهذه الخلايا لتأكيد نجاح النواة. نكتشف بشكل عام 90٪ إلى 100٪ من هذه الخلايا التي تعبر عن GFP أو mCherry. البديل هو إجراء نوة باستخدام CRISPRi mRNA ، والذي يعرف بأنه يسكت بقوة العديد من الجينات المستهدفة. عند إجراء قياس التدفق الخلوي في اليوم 2 ، يجب أن تظهر العينات المعالجة ب CRISPRi إسكات الجينات المستهدفة في أكثر من 90٪ من الخلايا.

3. تلطيخ علامة السطح

ملاحظة: يوضح هذا القسم بالتفصيل تحديد مستويات بروتين CD55 بعد تحرير epigenome في خلايا K-562. نقوم بتحديد انخفاض تعبير CD55 في الخلايا المفردة باستخدام تلطيخ الأجسام المضادة وقياس التدفق الخلوي (انظر القسم 4 أدناه) لتقييم كفاءة الضربة القاضية بوساطة CRISPRoff. يمكن أيضا استخدام تقنيات إضافية ، بما في ذلك النسخ العكسي PCR الكمي أو النشاف الغربي ، لتأكيد مستوى الضربة القاضية على كل من مستويات النسخ والبروتين.

  1. عد الخلايا باستخدام عداد خلوي آلي وأضف حوالي 5.0 × 105 إلى 1.0 × 106 خلايا في أنبوب طرد مركزي دقيق وخلايا طرد مركزي عند 500 × جم لمدة 5 دقائق.
    ملاحظة: يمكن استخدام خلايا أكثر أو أقل للتلوين ، ولكن قد يلزم قياس تركيز الأجسام المضادة وفقا لذلك.
  2. تخلص من المادة الطافية مع التأكد من عدم إزعاج الحبيبات وأضف 500 ميكرولتر من PBS وأعد تعليق الحبيبات برفق.
  3. الطرد المركزي للخلايا مرة أخرى عند 500 × جم لمدة 5 دقائق. تخلص من المادة الطافية وأضف الجسم المضاد بالتركيز المطلوب المخفف في PBS. بالنسبة لتلوين CD55 ، استخدم 1 ميكرولتر من CD55 المنقى المضاد للإنسان (مخزون 0.5 مجم / مل) في 49 ميكرولتر من PBS.
  4. قم بسحب الخلايا برفق واتركها تحتضن لمدة 25 دقيقة في مكان مظلم في درجة حرارة الغرفة. بعد الحضانة ، قم بتدوير الخلايا مرة أخرى عند 500 × جم لمدة 5 دقائق وتخلص من المادة الطافية.
  5. أعد تعليق الحبيبات ب 500 ميكرولتر من PBS لغسل الأجسام المضادة الزائدة. قم بالطرد المركزي للخلايا عند 500 × جم لمدة 5 دقائق وتخلص من المادة الطافية PBS. أعد تعليقه في 100 ميكرولتر إلى 200 ميكرولتر من PBS الطازج وأضفه إلى صفيحة 96 بئرا لتحليل قياس التدفق الخلوي.

4. قياس التدفق الخلوي

ملاحظة: تمت كتابة هذا البروتوكول لاستخدام BD FACSymphony A1 Cell Analyzer. قد تختلف التفاصيل اعتمادا على مقياس التدفق الخلوي الذي تستخدمه. نقترح الرجوع إلى دليل المستخدم للجهاز الذي تستخدمه للحصول على التفاصيل.

  1. قبل تشغيل القياس الخلوي ، تأكد من أن حاوية النفايات ليست ممتلئة وأن هناك الكثير من سائل الغمد. قم بتشغيل مفتاح الطاقة الرئيسي (الأخضر) الموجود بالقرب من سائل الغمد.
  2. قم بتشغيل قارئ اللوحة باستخدام المفتاح الخلفي. بعد ذلك ، قم بتشغيل الجهاز باستخدام الزر الأخضر على الجانب الأيمن وتأكد من ضبط الجهاز على وظيفة قارئ الألواح 96 بئرا.
  3. قم بتشغيل الكمبيوتر وتسجيل الدخول. افتح البرنامج وقم بتسجيل الدخول باستخدام اسم المستخدم وكلمة المرور الخاصين بك.
  4. قم بإعداد التجربة. أنشئ تجربة جديدة عن طريق تحديد تجربة > تجربة جديدة. أعد تسمية التجربة بالنقر المزدوج على الاسم الحالي.
  5. أضف طبقا بالنقر فوق تجربة > لوحة جديدة. حدد تنسيق البئر المراد استخدامه. لإضافة آبار محددة للتشغيل ، انقر فوق موقع البئر في اللوحة ثم انقر فوق المحقنة الزرقاء (يجب الآن تمييز البئر باللون الأزرق). حدد عدة آبار في نفس الوقت لإضافتها ، إذا لزم الأمر.
  6. أضف أسماء محددة إلى كل بئر عن طريق النقر بزر الماوس الأيمن على عينة على يمين شاشة اللوحة. ثم حدد التخطيط التجريبي. سيؤدي هذا إلى فتح صفحة تسرد جميع الآبار التي حددتها. لإعادة تسمية الآبار ، انقر مرة واحدة واكتب الاسم المطلوب. انقر فوق موافق عند الانتهاء.
  7. أضف المخططات والبوابات المناسبة إلى التجربة في ورقة العمل العمومية. نوصي أولا برسم منطقة التشتت الأمامية (FSC-A) مقابل منطقة التشتت الجانبية (SSC-A). ثم قم بإنشاء بوابة عشوائية للخلايا الحية لتنقيحها لاحقا بالنقر فوق أداة Polygon.
  8. انقر بزر الماوس الأيمن فوق هذه البوابة وانقر فوق التنقل لأسفل. سيؤدي هذا إلى إنشاء مخطط جديد يعرض فقط الخلايا من بوابة الخلية الحية.
  9. قم بتغيير محور هذا المخطط الجديد إلى FSC-A مقابل ارتفاع التشتت الأمامي (FSC-H) وقم بإنشاء بوابة للخلايا المفردة.
    1. إذا كان يعبر بشكل أساسي عن sgRNA في الخلايا ، ويقوم الفيروس العدسي أيضا بتشفير بروتين فلوري ، فقم بالتنقل لأسفل هذه البوابة المفردة للخلية وقم بإجراء المزيد من البوابات للتعبير عن هذا البروتين كبديل لتعبير sgRNA (على سبيل المثال: PE-CF594-A مقابل FSC-A).
  10. في بوابة الإعداد النهائية (إما للخلايا المفردة أو للخلايا التي تعبر عن sgRNA)، انقر بزر الماوس الأيمن وحدد التنقل لأسفل. قم بإنشاء بوابة لفحص التعبير عن جين المراسل (مثال: BB515-A مقابل FSC-A).
    1. إذا كنت تستخدم خلايا منقولة ولديك طريقة لقياس كفاءة التعدي مثل تعبير BFP ، فانقر بزر الماوس الأيمن فوق مخطط تعبير المراسل وانقر فوق تكرار. قم بتغيير المحاور إلى BV421-A مقابل FSC-A. قم بإنشاء بوابة عشوائية للخلايا الموجبة ل BFP.
  11. قم بإزالة أي معلمات غير مستخدمة في علامة التبويب المعلمات في شاشة مقياس الخلوي.
  12. لإعداد الجهاز وإعداده للتشغيل، انقر فوق تشغيل على لوحة التحكم في مقياس التدفق الخلوي. يجب أن يظهر الزر باللون الأخضر. في البرنامج ، انتقل إلى HTS في اللوحة العلوية ثم Prime. بمجرد الانتهاء ، أضف اللوحة ، وتأكد من وضعها جيدا في الجهاز وأن الغطاء مطفأ.
  13. للتشغيل ، حدد جميع الآبار (البئر) المراد تشغيلها وتأكد من تعيين عناصر التحكم بشكل مناسب. حدد جيدا بالنقر المزدوج ، وقم بتغيير حجم العينة إلى 10 ميكرولتر وانقر فوق الحصول على البيانات في لوحة معلومات الاكتساب. سيؤدي هذا إلى تشغيل العينة ولكن لن يسجل البيانات. أثناء تشغيل هذه العينة ، اضبط جهد الليزر حسب الحاجة. بالإضافة إلى ذلك ، قم بتغيير البوابات.
    ملاحظة: نوصي بتشغيل عينة سالبة لجميع الألوان التي يتم قياسها وأخرى موجبة لجميع الألوان للتأكد من أن معلمات الليزر والبوابات جيدة.
  14. بعد التحقق من إعدادات الليزر ، انقر فوق العينات في لوحة اللوحة وتحقق من تعيين قيم التشغيل حسب الرغبة.
  15. انقر فوق تشغيل اللوحة للتشغيل في لوحة معلومات الاستحواذ وتسجيل البيانات من جميع الآبار. بمجرد الانتهاء ، قم بتنظيف الجهاز عن طريق إزالة اللوحة.
  16. إلى لوحة جديدة مكونة من 96 بئرا ، أضف 10٪ مبيض إلى الصفوف الأربعة العلوية و H2O إلى الآبار الأربعة أدناه. انتقل إلى HTS > Clean. بمجرد الانتهاء ، أغلق البرنامج وقم بإيقاف تشغيل الأزرار بالترتيب العكسي الذي تم تشغيله على زر جانبي أخضر > قارئ لوحة > مفتاح أخضر عن طريق النفايات.
  17. أضف 20٪ مبيض إلى اللوحة المكونة من 96 بئرا مع الخلايا وتخلص منها.

5. تحليل البيانات

ملاحظة: تحدد هذه الطريقة استراتيجيات البوابات ومعالجة البيانات لتحديد تحرير الإبيجينوم عن طريق قياس التدفق الخلوي. يتم تمثيل استراتيجية البوابات بصريا جنبا إلى جنب مع أمثلة المخططات التي تم إنشاؤها من تحليل البيانات في الشكل 2 والشكل 3.

  1. إعداد بوابة FlowJo
    1. قم بتحميل جميع ملفات FSC على FlowJo عن طريق سحبها وإفلاتها في ورقة عمل جديدة.
    2. انقر فوق جميع العينات لبدء صنع البوابات. سيضمن ذلك إمكانية تطبيق البوابات بسهولة على جميع العينات.
    3. افتح عينة تحكم (مثل untransfected أو un-nucleofected) بالنقر المزدوج على هذا الملف.
    4. قم بإنشاء بوابة للخلايا الحية في مخطط FSC-A مقابل SSC-A باستخدام أداة المضلع. في قائمة جميع العينات ، يجب أن تظهر علامة تبويب Live Cells الآن أسفل اسم العينة. انقر بزر الماوس الأيمن فوق هذه البوابة وحدد نسخ التحليل إلى المجموعة لتطبيق هذه البوابة على جميع العينات (الشكل 2 أ ، الشكل 3 أ).
    5. انقر نقرا مزدوجا فوق بوابة الخلايا الحية للتنقل لأسفل في الخلايا الحية. قم بتغيير المحاور إلى FSC-A مقابل FSC-H (الشكل 2 ب ، الشكل 3 ب).
    6. ارسم مضلعا للبوابة لخلايا مفردة فقط. قم بتطبيق هذه البوابة على جميع العينات كما هو الحال في القسم 4 (الشكل 2 ب ، الشكل 3 ب).
      ملاحظة: إذا كنت تعبر بشكل أساسي عن بنية sgRNA باستخدام مراسل الفلورسنت ، فقم بإجراء مزيد من البوابات على هذا اللون بحيث يركز التحليل فقط على الخلايا التي تعبر عن sgRNA. مثال على ذلك هو إنشاء بوابة للخلايا الإيجابية mCherry (PE-CF594-A مقابل FSC-A) إذا كانت الخلايا تحتوي على sgRNA من العمود الفقري pLG1 (الشكل 2 ج ، الشكل 3 ج).
    7. انقر نقرا مزدوجا فوق بوابة الإعداد الأخير (خلايا مفردة أو خلايا معبرة عن الدليل).
    8. في حالة إجراء تعداء البلازميد ويقوم محرر epigenome بتشفير اندماج BFP ، فقم بإنشاء بوابة للخلايا الموجبة BFP (على سبيل المثال: BV421-A مقابل FSC-A) لعينات اليوم 2 (الشكل 2 د).
    9. قم بإنشاء بوابة لتعبير المراسل (على سبيل المثال: BB515-A مقابل FSC-A لبوابة الخلايا السالبة GFP) وقم بتطبيق هذه البوابة على جميع العينات (الشكل 2E ، الشكل 3D).
  2. تحليل التعدي
    1. بعد إجراء إعداد البوابة ، انقر فوق محرر الجدول في اللوحة العلوية. سحب المجموعات السكانية للتحليل (أمثلة: إيجابي BFP وسلبي GFP).
    2. في لوحة محرر الجدول، انقر فوق إنشاء جدول. انسخ هذه البيانات إلى جدول بيانات لإجراء حسابات التطبيع.
  3. معالجة البيانات
    1. اطرح عدد الخلايا السالبة للمراسل (على سبيل المثال: GFP سلبي) في عينة التحكم من جميع العينات الأخرى. قد يكون هناك بعض إسكات الخلفية للمراسل ، لذلك يؤدي ذلك إلى إزالة ضوضاء الخلفية هذه من البيانات.
    2. سيتم تطبيع جميع القيم إلى النسبة المئوية للخلايا الموجبة BFP (الخلايا التي تم نقلها بنجاح) المقاسة في اليوم 2. للقيام بهذا التطبيع ، خذ القيمة ، واقسم على النسبة المئوية للخلايا الموجبة BFP في اليوم 2 ، واضرب في 100. ينتج عن هذا الحساب القيمة الطبيعية لكفاءة التعدي للخلايا التي تم تحريرها. البيانات جاهزة الآن للرسم. نوصي بالرسوم البيانية الخطية عبر دورة زمنية لتحرير الإبيجينوم كما هو موضح في الشكل 2F.
  4. تحليل النواة
    1. بعد إجراء إعداد البوابة ، انقر فوق محرر الجدول في اللوحة العلوية. اسحب المجموعات السكانية للتحليل (أمثلة: APC سلبي).
    2. في لوحة محرر الجدول، انقر فوق إنشاء جدول. انسخ هذه البيانات إلى محرر جداول البيانات لإجراء حسابات التطبيع.
  5. معالجة البيانات
    1. اطرح عدد الخلايا السالبة للمبلغ (على سبيل المثال: APC سالب) في عينة التحكم من جميع العينات الأخرى. قد يكون هناك بعض إسكات الخلفية للمراسل ، لذلك يؤدي ذلك إلى إزالة ضوضاء الخلفية هذه من البيانات. البيانات جاهزة الآن للرسم. نوصي بالرسوم البيانية الخطية عبر دورة زمنية لتحرير الإبيجينوم.
      ملاحظة: يمكن استخدام الإحصائيات لتحديد الاختلافات في إسكات بين محررين مختلفين للجينوم. نوصي بإجراء جميع تجارب التعدي والنواة في ثلاث نسخ تقنية لإجراء التحليلات الإحصائية. عند تصوير الرسوم البيانية الخطية للإسكات بمرور الوقت ، ارسم الانحراف المعياري للتكرارات الفنية. يمكن إجراء اختبارات t للطلاب في نقاط زمنية محددة لمقارنة الإسكات بين اثنين من محرري epigenome. يجب التعامل مع العينات على أنها غير مقترنة مع تباين غير متساو.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بالنسبة لجميع تجارب تحرير epigenome ، تعد الضوابط المناسبة أمرا بالغ الأهمية لتقييم كفاءات تحرير epigenome. نوصي باستخدام sgRNA للتحكم ، والذي لا يستهدف أي تسلسل في الجينوم البشري. سيعطي استخدام عنصر تحكم دليل غير استهداف الثقة في أن التغييرات في المواقع المستهدفة مدفوعة بمحرر epigenome الذي يتم توجيهه إلى هذا الموقع بدلا من مجرد التعبير المفرط لمحرر epigenome أو الربط غير المحدد. بالإضافة إلى ذلك ، بالنسبة للتجارب القائمة على الجينات للمراسل ، نقترح استخدام عنصر تحكم dCas9 فقط للتأكد من أن التغييرات في تعبير المراسل ترج...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوضح هذا البروتوكول بالتفصيل طريقتين مختلفتين للتوصيل العابر لمحرري CRISPR epigenome: تعداء الحمض النووي البلازميد ونواة mRNA. كلتا التقنيتين لهما مزايا وعيوب واعتبارات عامة فريدة (الشكل 1F).

يؤدي تعداء الحمض النووي البلازميد إلى تعبير قوي لمحرر الإبيجينوم ، ونقوم بتضمين اندماج BFP داخل تركيبات محرر الإبجنوم الذي يسمح باكتشاف وقياس فعالية التعدي باستخدام قياس التدفق الخلوي. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام تعبير BFP لفرز الخلايا ال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

J.K.N. هو مخترع براءات الاختراع المتعلقة بتقنيات CRISPRoff / on ، التي قدمها حكام جامعة كاليفورنيا.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر أعضاء مختبر نونيز ، وخاصة ريثو باتالي وإزايا أورنيلاس ، على تطوير وتحسين البروتوكولات الموضحة في هذه المخطوطة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
4D-NucleofectorLonzaAAF-1003
96 بئر ألواح زراعة الأنسجة Corning3596
96 بئر U-bottom لوحةCorning351177
APC المضادة للإنسان CD55 الأجسام المضادةBioLegend311312
BD FACSymphony A1 Flow Cellularمقياس BD Biosciences
BleachWaxie11003428432
جهاز طرد مركزيEppendorf5425
كونتيسة عداد الخلايا الآليالكونتيسة العلميالحراري 3
CRISPRoff البلازميد النفداءAddgene   ؛167981
كاشف أمراض الدم المخفف 2 لقياس التدفق الخلوي (سائل الغمد)Thermo Scientific23-029-361
11965118علمي حراري عالي الجلوكوز
DPBSGibco14-190-250
أنابيب Eppendorfتوماس العلمية1159M35
FBSAvantor Seradigm89510-186
Lonza Walkersville  SF Cell Line 4D-Nucleofector X Kit LFisher ScientificNC0281111
mMESSAGE mMACHINE & trade ؛ طقم النسخ T7 ULTRAThermo FisherAM1345
Opti-MEMGibco31985070
أنابيب شريط PCR الولاياتالمتحدة الأمريكية العلمية & nbsp ؛1402-4700
البنسلين - الستربتومايسين - الجلوتامينجيبكو10378016
pLG1 sgRNA التعبير عن البلازميدAddgene   ؛217306
RPMI 1640Gibco22-400-105
SF Cell Line 96-well Nucleofector & reg ؛   كيتلونزاV4SC-2096
حاضنة زراعة الأنسجةPHCbiMCO-170AICUVDL-PA
كاشف التعداء TransIT-LTIMirusMIR 2306
Trypsin-EDTA (0.25٪)Gibco25200114
DMEM ،

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kimura, H. Histone modifications for human epigenome analysis. Journal of Human Genetics. 58 (7), 439-445 (2013).
  2. Cong, L., et al. Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  3. Esvelt, K. M., Mali, P., Braff, J. L., Moosburner, M., Yaung, S. J., Church, G. M. Orthogonal Cas9 proteins for RNA-guided gene regulation and editing. Nature Methods. 10 (11), 1116-1121 (2013).
  4. Hou, Z., et al. Efficient genome engineering in human pluripotent stem cells using Cas9 from Neisseria meningitidis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (39), 15644-15649 (2013).
  5. Komor, A. C., Kim, Y. B., Packer, M. S., Zuris, J. A., Liu, D. R. Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature. 533 (7603), 420-424 (2016).
  6. Gaudelli, N. M., et al. Programmable base editing of A•T to G•C in genomic DNA without DNA cleavage. Nature. 551 (7681), 464-471 (2017).
  7. Anzalone, A. V., et al. Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA. Nature. 576 (7785), 149-157 (2019).
  8. Anzalone, A. V., et al. Programmable deletion, replacement, integration and inversion of large DNA sequences with twin prime editing. Nature Biotechnology. 40 (5), 731-740 (2022).
  9. Zhang, X. -H., Tee, L. Y., Wang, X. -G., Huang, Q. -S., Yang, S. -H. Off-target Effects in CRISPR/Cas9-mediated Genome Engineering. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 4, e264(2015).
  10. Lin, Y., et al. CRISPR/Cas9 systems have off-target activity with insertions or deletions between target DNA and guide RNA sequences. Nucleic Acids Research. 42 (11), 7473-7485 (2014).
  11. Adikusuma, F., et al. Large deletions induced by Cas9 cleavage. Nature. 560 (7717), E8-E9 (2018).
  12. Kosicki, M., Tomberg, K., Bradley, A. Repair of double-strand breaks induced by CRISPR-Cas9 leads to large deletions and complex rearrangements. Nature Biotechnology. 36 (8), 765-771 (2018).
  13. Cullot, G., et al. CRISPR-Cas9 genome editing induces megabase-scale chromosomal truncations. Nature Communications. 10 (1), 1136(2019).
  14. Fiumara, M., et al. Genotoxic effects of base and prime editing in human hematopoietic stem cells. Nature Biotechnology. 42 (6), 877-891 (2024).
  15. Tsuchida, C. A., et al. Mitigation of chromosome loss in clinical CRISPR-Cas9-engineered T cells. Cell. 186 (21), 4567-4582.e20 (2023).
  16. Nakamura, M., Gao, Y., Dominguez, A. A., Qi, L. S. CRISPR technologies for precise epigenome editing. Nature Cell Biology. 23 (1), 11-22 (2021).
  17. Villiger, L., Joung, J., Koblan, L., Weissman, J., Abudayyeh, O. O., Gootenberg, J. S. CRISPR technologies for genome, epigenome and transcriptome editing. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 25 (6), 464-487 (2024).
  18. McCutcheon, S. R., Rohm, D., Iglesias, N., Gersbach, C. A. Epigenome editing technologies for discovery and medicine. Nature Biotechnology. 42 (8), 1199-1217 (2024).
  19. Perez-Pinera, P., et al. RNA-guided gene activation by CRISPR-Cas9-based transcription factors. Nature Methods. 10 (10), 973-976 (2013).
  20. Maeder, M. L., Linder, S. J., Cascio, V. M., Fu, Y., Ho, Q. H., Joung, J. K. CRISPR RNA-guided activation of endogenous human genes. Nature Methods. 10 (10), 977-979 (2013).
  21. Tanenbaum, M. E., Gilbert, L. A., Qi, L. S., Weissman, J. S., Vale, R. D. A Protein-Tagging System for Signal Amplification in Gene Expression and Fluorescence Imaging. Cell. 159 (3), 635-646 (2014).
  22. Gilbert, L. A., et al. CRISPR-Mediated Modular RNA-Guided Regulation of Transcription in Eukaryotes. Cell. 154 (2), 442-451 (2013).
  23. Alerasool, N., Segal, D., Lee, H., Taipale, M. An efficient KRAB domain for CRISPRi applications in human cells. Nature Methods. 17 (11), 1093-1096 (2020).
  24. Nakamura, M., Gao, Y., Dominguez, A. A., Qi, L. S. CRISPR technologies for precise epigenome editing. Nature Cell Biology. 23 (1), 11-22 (2021).
  25. Tycko, J., et al. High-Throughput Discovery and Characterization of Human Transcriptional Effectors. Cell. 183 (7), 2020-2035.e16 (2020).
  26. Alerasool, N., Leng, H., Lin, Z. -Y., Gingras, A. -C., Taipale, M. Identification and functional characterization of transcriptional activators in human cells. Molecular Cell. 82 (3), 677-695.e7 (2022).
  27. Ludwig, C. H., et al. High-throughput discovery and characterization of viral transcriptional effectors in human cells. Cell Systems. 14 (6), 482-500.e8 (2023).
  28. DelRosso, N., et al. Large-scale mapping and mutagenesis of human transcriptional effector domains. Nature. 616 (7956), 365-372 (2023).
  29. Tycko, J., et al. Development of compact transcriptional effectors using high-throughput measurements in diverse contexts. Nature Biotechnology. , (2024).
  30. Wilson, C. M., et al. Combinatorial effector targeting (COMET) for transcriptional modulation and locus-specific biochemistry. , (2024).
  31. Liu, X. S., et al. Editing DNA Methylation in the Mammalian Genome. Cell. 167 (1), 233-247.e17 (2016).
  32. Bintu, L., et al. Dynamics of epigenetic regulation at the single-cell level. Science. 351 (6274), 720-724 (2016).
  33. Hilton, I. B., et al. Epigenome editing by a CRISPR-Cas9-based acetyltransferase activates genes from promoters and enhancers. Nature Biotechnology. 33 (5), 510-517 (2015).
  34. Cano-Rodriguez, D., et al. Writing of H3K4Me3 overcomes epigenetic silencing in a sustained but context-dependent manner. Nature Communications. 7 (1), 12284(2016).
  35. O'Geen, H., et al. dCas9-based epigenome editing suggests acquisition of histone methylation is not sufficient for target gene repression. Nucleic Acids Research. 45 (17), 9901-9916 (2017).
  36. O'Geen, H., et al. Ezh2-dCas9 and KRAB-dCas9 enable engineering of epigenetic memory in a context-dependent manner. Epigenetics & Chromatin. 12 (1), 26(2019).
  37. Kim, J. -M., et al. Cooperation between SMYD3 and PC4 drives a distinct transcriptional program in cancer cells. Nucleic Acids Research. 43 (18), 8868-8883 (2015).
  38. Kearns, N. A., et al. Functional annotation of native enhancers with a Cas9-histone demethylase fusion. Nature Methods. 12 (5), 401-403 (2015).
  39. Li, K., et al. Interrogation of enhancer function by enhancer-targeting CRISPR epigenetic editing. Nature Communications. 11 (1), 485(2020).
  40. Stepper, P., et al. Efficient targeted DNA methylation with chimeric dCas9-Dnmt3a-Dnmt3L methyltransferase. Nucleic Acids Research. 45 (4), 1703-1713 (2017).
  41. Valbuena, R., et al. Prediction and design of transcriptional repressor domains with large-scale mutational scans and deep learning. , (2024).
  42. Horlbeck, M. A., et al. Compact and highly active next-generation libraries for CRISPR-mediated gene repression and activation. eLife. 5, e19760(2016).
  43. Liu, Y., et al. CRISPR Activation Screens Systematically Identify Factors that Drive Neuronal Fate and Reprogramming. Cell Stem Cell. 23 (5), 758-771.e8 (2018).
  44. Black, J. B., et al. Master Regulators and Cofactors of Human Neuronal Cell Fate Specification Identified by CRISPR Gene Activation Screens. Cell Reports. 33 (9), 108460(2020).
  45. Yang, J., et al. Genome-Scale CRISPRa Screen Identifies Novel Factors for Cellular Reprogramming. Stem Cell Reports. 12 (4), 757-771 (2019).
  46. Chakraborty, S., Ji, H., Kabadi, A. M., Gersbach, C. A., Christoforou, N., Leong, K. W. A CRISPR/Cas9-Based System for Reprogramming Cell Lineage Specification. Stem Cell Reports. 3 (6), 940-947 (2014).
  47. Black, J. B., et al. Targeted Epigenetic Remodeling of Endogenous Loci by CRISPR/Cas9-Based Transcriptional Activators Directly Converts Fibroblasts to Neuronal Cells. Cell Stem Cell. 19 (3), 406-414 (2016).
  48. Nuñez, J. K., et al. Genome-wide programmable transcriptional memory by CRISPR-based epigenome editing. Cell. 184 (9), 2503-2519.e17 (2021).
  49. Xu, X., et al. A CRISPR-based approach for targeted DNA demethylation. Cell Discovery. 2 (1), 16009(2016).
  50. Leonetti, M. D., Sekine, S., Kamiyama, D., Weissman, J. S., Huang, B. A scalable strategy for high-throughput GFP tagging of endogenous human proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (25), (2016).
  51. Pattali, R. K., Ornelas, I. J., Nguyen, C. D., Xu, D., Divekar, N. S., Nuñez, J. K. CRISPRoff epigenetic editing for programmable gene silencing in human cells without DNA breaks. , (2024).
  52. Moon, H. C., Herschl, M. H., Pawluk, A., Konermann, S., Hsu, P. D. A combinatorial domain screening platform reveals epigenetic effector interactions for transcriptional perturbation. , (2024).
  53. Cappelluti, M. A., et al. Durable and efficient gene silencing in vivo by hit-and-run epigenome editing. Nature. 627 (8003), 416-423 (2024).
  54. Naumann, E. N., et al. rainwide silencing of prion protein by AAV-mediated delivery of an engineered compact epigenetic editor. Science. 384 (6703), ado7082(2024).
  55. Tremblay, F., et al. A potent epigenetic editor targeting human PCSK9 for durable reduction of low-density lipoprotein cholesterol levels. Nature Medicine. 31 (4), 1329-1338 (2025).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

dCas9 CRISPRoff CRISPRi

مقالات ذات صلة