مقالة منهجية

في المختبر تعرض القنب للخلايا الظهارية الرئوية في واجهة الهواء السائل

1.5K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/68102

⸱

يونيو 20, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmacology and Therapeutics, McGill University, 2Research Institute of the McGill University Heath Centre, 3SCIREQ - Scientific Respiratory Equipment Inc., 4Department of Biology, University of Ottawa, 5Department of Medicine, McGill University

في هذه المقالة

ملخص

أنشأنا نموذجا موحدا في المختبر لدراسة التعرض لبخار القنب في واجهة الهواء السائل. يوفر هذا النموذج نهجا منهجيا لفحص آثار القنب المتبخر ، ومعالجة الاهتمام المتزايد بمبخرات القنب كبديل للتدخين.

الملخص

يستخدم القنب من قبل ما يقدر بنحو 192 مليون شخص حول العالم. يستخدم معظم الناس الحشيش من خلال استنشاق دخان القنب ، والذي يحتوي على منتجات ثانوية للاحتراق يمكن أن تؤثر سلبا على صحة الرئة. أدت معرفة هذه المخاطر إلى اهتمام متزايد بمبخرات القنب ، التي تسخن زهرة القنب الجافة دون حرق. لا يزال تبخير القنب يطلق القنب للاستنشاق ولكنه يسخن المادة النباتية عند درجة حرارة منخفضة. لا يوجد حاليا نموذج موحد في المختبر لتقييم آثار بخار القنب الجاف. لذلك ، أنشأنا نموذجا للتعرض لمزارع خلايا الرئة في واجهة الهواء السائل (ALI) ، حيث تتعرض الخلايا قمي للقنب المتبخر ، وبالتالي محاكاة فسيولوجيا الخلايا الظهارية في الرئة بشكل أكثر دقة. يضمن هذا البروتوكول توصيلا متسقا وقابلا للتكرار لبخار القنب إلى سطح الخلية ، مما يوفر منصة موثوقة للتحقيق في التأثيرات الخلوية والجزيئية للقنب المتبخر. هذا العمل هو الأول من نوعه طريقة توصيل بخار القنب في المختبر ، والتي يمكن أن تكون بمثابة معيار لأبحاث القنب قبل السريرية في المستقبل.

المقدمة

يستخدم القنب عادة عن طريق استنشاق الدخان الناتج عن حرق زهرة النبات على شكل مفصل ، سواء بشكل ترفيهي أو للأغراض الطبية. ترجع الأنشطة البيولوجية الرئيسية للقنب إلى القنب مثل Δ 9-tetrahydrocannabinol (Δ9-THC) والكانابيديول (CBD) ، والتي يتم إطلاقها في الجسم عند الاستنشاق. يحتوي دخان القنب أيضا على مركبات بيروجينيك، بما في ذلك المواد المسرطنة والمطفرات والمواد المسخة، والتي يمكن أن تسبب نتائج صحيةضارة 1. بالنظر إلى هذه المخاوف ، هناك اهتمام بالتحول إلى مبخرات القنب التي تسخن زهرة القنب دون حرق ، على أمل أن يسمح ذلك بإطلاق القنب للاستنشاق اللاحق ولكن بدون منتجات الاحتراق. تم القيام ببعض الأعمال لتوصيف المكونات الكيميائية لبخار القنب ، مما يدل على وجود القنب ولكن أيضا العديد من المواد السامة التنفسية ، مما يتحدى فكرة أن هذه الأجهزة آمنة2،3. هناك فجوات كبيرة في المعرفة حول كيفية تأثير القنب المتبخر على الرئتين والأعضاء الأخرى.

تعد دراسات زراعة الخلايا ضرورية في علم السموم لعزل وفهم التأثيرات المحددة للمواد المستنشقة على المستوى الخلوي ، مما يتيح رؤى عالية الإنتاجية وفعالة من حيث التكلفة وميكانيكية ذات صلة بعلم الأحياء البشري. تعد طريقة زراعة الخلايا أيضا محددا مهما للنتائج الإجمالية التي تم الحصول عليها من تجربة في المختبر . يتم إجراء معظم دراسات زراعة الخلايا باستخدام بيئة مغمورة ، حيث تزرع الخلايا على البلاستيك وتتعرض قمي للوسائط المائية. ومع ذلك ، تمثل الخلايا الظهارية في مجرى الهواء تحديا فريدا في هذا الصدد. في جميع أنحاء الجهاز التنفسي ، يكون السطح القمي للخلايا الظهارية ملامسا للهواء. داخل الحويصلات الهوائية ، تنتج الخلايا الظهارية الفاعل بالسطح ، بينما تنتج الخلايا الظهارية الأخرى في مجرى الهواء المخاط. بشكل جماعي ، هذا يحمي ويحافظ على وظائف الرئة. تفشل الثقافات المغمورة في تكرار التعرض للهواء القمي ، مما يحد من قدرتها على نمذجة البيئة في الجسم الحي بدقة. بديل لنماذج الاستزراع المغمور هو الاستزراع في واجهة الهواء والسائل (ALI) ، حيث تزرع الخلايا الظهارية التنفسية على غشاء مغلف بالكولاجين مع وسائط على الجانب القاعدي الجانبي أثناء تعرضها للهواء. الخلايا الظهارية المزروعة في ALI هي نماذج أكثر دقة لظهارة الجهاز التنفسي نظرا لقدرتها على الاستقطاب وإنتاج الفاعل بالسطح أو المخاط وتشكيل تقاطعات في هذه البيئة4.

أحد الاعتبارات الإضافية التي تواجهها طرق زراعة الخلايا المغمورة التقليدية هو أن المركبات الكارهة للماء مثل القنب تذوب بشكل سيئ في الوسائط المائية5. المستخلصات الإيثانولية هي مذيب شائع لدراسة المركبات الكارهة للماء في الثقافات المغمورة6،7،8،9،10،11،12. تسمح هذه المستخلصات بإذابة كل من المركبات الكارهة للماء والمحبة للماء في وسط مائي. ومع ذلك ، فإن القيد هو إمكانية التكتل المركب وكذلك المركبات التي تتفاعل مع الوسائط ، وكلاهما يمكن أن يغير التوافر البيولوجي13،14. كانت هناك تطورات مؤخرا للسماح بتوصيل مركبات طور الهباء الجوي إلى الخلايا في حالة عدم وجود مذيب أو وسائط باستخدام أنظمة تعرض متقدمة مثل expoCube15 (ALI / Transwell في نظام التعرض في المختبر / خارج الجسم الحي ) ، بالإضافة إلى أنظمة أخرى. الترسيب المباشر للهباء الجوي ومعلقات الجسيمات باستخدام نظام تعريض متقدم يلغي عملية إعادة التعليق والتجميع الحاسمة للتعرضات المغمورة ، والتي من المعروف أنها تغير بشكل كبير الخصائص الفيزيائية والكيميائية للجسيمات16. هنا ، نصف بروتوكولا موحدا لتعرض خط الخلايا الظهارية السنخية في ALI.

البروتوكول

1. زراعة الخلايا الظهارية الرئوية في ALI

ملاحظة: هنا ، يتم وصف بروتوكول لزراعة خلايا A549 في ALI. يرجى مراجعة الأدبيات الخاصة بنوع الخلية التي سيتم استخدامها في الدراسة. تحتاج خطوط الخلايا المختلفة إلى فترة زمنية مختلفة في ALI للتمايز وتشكيل تقاطعات ضيقة وإنتاج الفاعل بالسطح / المخاط.

  1. زراعة الخلايا
    1. تحضير الوسائط عن طريق إضافة 50 مل من مصل الأبقار الجنينية المعطل بالحرارة (FBS) ، و 5 مل من Glutamax ، و 5 مل من المضادات الحيوية المضادة للفطريات ، و 500 ميكرولتر من الجنتاميسين إلى زجاجة 500 مل من DMEM.
    2. ضع الوسائط المحضرة في حمام مائي لمدة 10-15 دقيقة حتى ترتفع درجة الحرارة إلى 37 درجة مئوية.
    3. رش خزانة السلامة الحيوية بنسبة 70٪ من الإيثانول وامسحها. بمجرد تسخين الوسيط ، ضعه تحت خزانة السلامة الحيوية المعقمة.
    4. تحت غطاء المزرعة، قم بسحب ما يقرب من 10 مل من الوسائط في أنبوب سعة 15 مل.
    5. استرجع الخلايا من النيتروجين السائل وقم بإذابة الثلج عن طريق التقليب برفق في حمام مائي.
    6. تحت غطاء المزرعة ، قم بإدخال الخلايا المذابة من cryovial في أنبوب 15 مل.
    7. جهاز طرد مركزي أنبوب 15 مل عند 300 جم لمدة 5 دقائق.
    8. قم بإزالة المادة الطافية بعناية دون إزعاج الحبيبات.
    9. امزج الحبيبات مع الوسائط وانقلها إلى قارورة T75 .
    10. افحص قارورة T75 تحت المجهر.
    11. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 مع رطوبة مشبعة.
    12. قم بتحديث وسائط زراعة الخلايا كل 2-3 أيام.
    13. تمرير الخلايا وتنميتها حتى يتم الوصول إلى عدد الخلايا المطلوب. لزرع صفيحة واحدة من 12 بئر ، يلزم 3 × 106 خلايا.
  2. طلاء الكولاجين من transwells
    1. تحضير محلول الكولاجين
      1. قم بإذابة 10 مجم من الكولاجين من النوع الرابع في 20 مل من ddH2O مع 50 ميكرولتر من حمض الخليك الجليدي.
      2. احتضن عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ، مع التحريك من حين لآخر ، حتى يذوب تماما.
      3. عقم المحلول عن طريق الترشيح من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر.
      4. Aliquot 1.5 مل من المحلول في أنابيب 15 مل وتخزينها في -20 درجة مئوية.
    2. طلاء مرشحات ترانسويل بالكولاجين من النوع الرابع
      1. قم بإذابة أنبوب واحد من الكولاجين من النوع الرابع (50 ميكروغرام / مل) من -20 درجة مئوية.
      2. أضف 150 ميكرولتر من الكولاجين إلى كل مرشح Transwell.
        ملاحظة: فقط الألواح المكونة من 12 بئرا متوافقة مع نظام التعريض الضوئي.
      3. اترك الأطباق ذات الأغطية المفتوحة في خزانة السلامة الحيوية (BSC) لمدة 18 ساعة حتى تجف.
      4. تعقيم عن طريق التعرض للأشعة فوق البنفسجية (UV) لمدة 30 دقيقة.
    3. قم بتخزين الأطباق في درجة حرارة 4 درجات مئوية ، ملفوفة في بارافيلم ، لمدة تصل إلى 30 يوما.
    4. قبل طلاء الخلايا ، اشطف جانبي المرشحات بمحلول ملحي معقم مخزن بالفوسفات (PBS).
  3. بذر الخلايا في الإدخالات والانتقال إلى ALI
    1. تحضير تعليق اللوحة والخلية
      1. ماصة 1.5 مل من الوسائط المحضرة الدافئة مسبقا في كل بئر من اللوحة المكونة من 12 بئرا.
      2. ضع اللوحة في الحاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2.
      3. قم بإعداد معلق خلوي بتركيز 5 × 105 خلايا / مل في الوسائط المعدة.
    2. بذر الخلايا في الإدخالات
      1. قم بإزالة لوحة زراعة الخلايا المحضرة من الحاضنة وضعها تحت خزانة السلامة الحيوية المعقمة.
      2. ماصة 0.5 مل من تعليق الخلية (2.5 × 105 خلايا / إدراج) على الجزء العلوي من الغشاء في الملحق.
      3. قم بتغطية اللوحة بغطاء اللوحة وضعها مرة أخرى في الحاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2.
    3. تأسيس ALI
      1. قم بإزالة الوسائط القمية بعد 24 ساعة من بذر الخلايا.
      2. استبدل الوسائط القاعدية الجانبية ب 0.6 مل من الوسائط المحضرة. في هذه المرحلة ، تتعرض الخلايا للهواء قمي ، مما يؤدي إلى إنشاء ALI.
      3. استزراع خلايا A549 في ALI لمدة تصل إلى أسبوعين ، وتغيير الوسائط كل يومين للسماح للخلايا بالتمايز كما تم تمييزهسابقا 4.

2. تقييم قياس الجرعات للتعرض لبخار القنب باستخدام LC / MS

ملاحظة: في هذا الجزء من البروتوكول ، تم استخدام طرق خالية من الخلايا لتوصيف جرعة بخار القنب المودعة داخل كل بئر من خلال تحليل تركيزات Δ9-THC. يلتصق Δ9-THC بالمواد البلاستيكية ، لذلك يجب استخدام القوارير الزجاجية فقط لجمع العينات. تتطلب هذه الطريقة أن يحتوي صنف القنب المختار على Δ 9-THC.

  1. إعداد وإعداد نظام التعريض الضوئي
    1. قم بإعداد الأنبوب لنظام التعريض الضوئي وفقا لمسار التدفق المحدد (الشكل 1 أ ، ب): وحدة ENDS > مضخة نفخ > مكثف > مجموعة أخذ العينات متساوية القياس مع مضخة Aeroneb > expoCube مستشعر الرطوبة > مع مرشح > منفذ تدفق التعرض للكشف عن المكعب.
    2. قم بتشغيل أدوات التحكم في درجة الحرارة لتسخين النظام إلى 35 درجة مئوية و 50 درجة مئوية.
    3. قم بإجراء اختبارات التدفق للتأكد من خلو النظام من التسرب وضبط الضغوط بشكل صحيح (راجع SCIREQ Technote دليل لاستكشاف أخطاء التدفقات غير المتساوية وإصلاحها في expoCube).
    4. ابدأ تشغيل مضخات Aeroneb لتحقيق رطوبة نسبية تزيد عن 75٪.
  2. اختبار قياس الجرعات وتحضير المرذاذ
    1. تحضير مبخر القنب
      1. طحن زهرة القنب باستخدام مطحنة الأعشاب.
      2. قم بوزن 0.25 جم من الحبوب باستخدام فاصل حبوب منع الحمل لتنظيم كل جزء.
      3. ضع إدخالات من الفولاذ المقاوم للصدأ في صف التعريض الضوئي للوحة الآبار ذات 12 بئرا داخل نظام التعريض.
  3. تعرض إدخالات الفولاذ المقاوم للصدأ لبخار القنب
    1. بدء التعرض
      1. قم بتعبئة فرن المرذاذ ب 0.25 جرام من الحشيش.
      2. قم بتوصيل مبخر القنب بوحدة ENDS لنظام التعرض بحشية آمنة وابدأ نظام النفخ المطلوب. اضبط المرذاذ على إعداد درجة حرارة Smart Path Level 2 .
        ملاحظة: يحتوي نظام التعريض الضوئي المستخدم في هذه الدراسة على أربعة مستويات مسار ذكية للاختيار من بينها ، بما في ذلك المستوى 1 (176-188 درجة مئوية) ، والمستوى 2 (188-199 درجة مئوية) ، والمستوى 3 (199-210 درجة مئوية) ، والمستوى 4 (210-221 درجة مئوية).
      3. قم بإنشاء ملف تعريف نفخ في برنامج flexiWare (برنامج الحصول على البيانات ؛ راجع SCIREQ Technote: دليل لإنشاء ملفات تعريف ل flexiWare 8). بالنسبة لهذا البروتوكول ، استخدم حجم نفخة 70 مل بتردد 4 نفث / دقيقة.
      4. قم بتشغيل مبخر الأعشاب الجاف لمدة 5 دقائق قبل تبديل القنب عن طريق إزالة زهرة القنب من فرن المرذاذ وإضافة 0.25 جرام من القنب الطازج إلى المرذاذ. قم بالتبديل بين اثنين من المبخرات للتعرض المستمر.
      5. تابع الخطوات 2.3.1.1-2.3.1.4 حتى يتم الوصول إلى وقت التعريض الضوئي المطلوب.
    2. بعد كل تعرض ، قم بإزالة الإدخالات بعناية من نظام التعريض الضوئي باستخدام الملقط وقم بإعدادها لجمع العينات كما هو موضح أدناه.
  4. جمع وإعداد العينات لتحليل LC / MS
    1. باستخدام الملقط ، ضع المرشحات المقابلة لكل تعرض في قارورة زجاجية تحمل علامة تحتوي على 10 مل من الميثانول من الدرجة LC / MS (على سبيل المثال ، التعرض 1 ، التعرض 2 ، التعرض 3).
    2. اغسل الملحق.
      1. ضع كل ملحق مكشوف من الفولاذ المقاوم للصدأ في قارورة زجاجية تحمل علامة تحتوي على 10 مل من الميثانول LC / MS.
      2. قم بتسمية القوارير حسب التعرض (على سبيل المثال ، التعرض 1 جيدا 1-4).
    3. استخراج Δ 9-THC
      1. استخدم حمام صوتي لصوتنة القوارير مع إدخالات لمدة 10 دقائق لاستخراج Δ9-THC.
      2. انقل الإدخالات إلى مجموعة ثانية من القوارير الزجاجية مع 10 مل من الميثانول الطازج والسونيكات لمدة 10 دقائق إضافية.
    4. أرسل جميع العينات المحضرة (الآبار والغسيل والتصفية) لتحليل LC / MS لتحديد مستويات Δ9-THC.
  5. حسابات قياس الجرعات
    1. باستخدام نتائج تحليل LC / MS ، احسب كمية Δ 9-THC المودعة لتحديد قياس جرعات تدفق التعرض (الكمية المودعة في المرشح) وقياس الجرعات في البئر.
    2. احسب النسبة بين مرشح تدفق التعرض وترسيب البئر ل Δ9-THC.
    3. استخدم هذه النسبة لتحديد الجرعة التي سيتم توصيلها إلى الخلايا أثناء التعرض.

3. تقييم قياس الجرعات للتعرض لبخار القنب باستخدام التوازن الدقيق لبلورات الكوارتز

ملاحظة: توضح هذه الطريقة بالتفصيل إعداد ومعايرة التوازن الدقيق لبلورات الكوارتز (QCM) لتقييم كتلة جزيئات بخار القنب المترسبة أثناء التعرض. يوفر كل QCM قياسات في الوقت الفعلي ، مما يتيح قياس الجرعات الدقيق للتعرض لبخار القنب.

  1. تحضير وإعداد QCM في نظام التعريض الضوئي
    1. قم بتكوين نظام التعريض الضوئي كما هو موضح سابقا.
    2. قم بتوصيل كل QCM بوحدة الإلكترونيات الخاصة بها باستخدام موصل المشبك ، وقم بتوصيل الوحدة بمدخلات وحدة inExposure (منصة التعرض للاستنشاق) بموصل 7 سنون.
    3. ضع إدخالات QCM في لوحة بئر على جانب التعريض الضوئي لنظام التعريض الضوئي ، مما يضمن محاذاة QCM جيدا.
    4. قم بتسخين نظام التعريض الضوئي مسبقا باستخدام QCMs المرفقة حتى يستقر النظام عند درجات الحرارة المستهدفة البالغة 35 درجة مئوية و 50 درجة مئوية.
    5. تنشيط التدفقات الدقيقة وتدفقات التعرض وفقا للإعدادات التجريبية.
  2. معايرة QCM
    1. استخدم معالج معايرة برنامج الحصول على البيانات لمعايرة QCM قبل كل تشغيل تعريض ضوئي.
    2. انتظر حتى يستقر شريط المعايرة الأزرق، ثم حدد التالي لتسجيل تردد رنين QCM لحسابات الكتلة الدقيقة.
      ملاحظة: نطاق المعايرة المتوقع هو -15٪ إلى 15٪. قد تشير الانحرافات إلى مشكلات مثل QCM المتسخ أو موصل LEMO غير المتصل.
  3. المراقبة في الوقت الحقيقي لإشارات QCM
    1. مراقبة مخرجات QCM ؛ يقوم النظام بإخراج الكتلة المتراكمة المودعة. يتم عرض القيمة في برنامج الحصول على البيانات كجزء من الرسم البياني والقيمة الحالية الفعلية.
      ملاحظة: لكل تشغيل تجريبي، يتم أيضا الإبلاغ عن الحد الأقصى والحد الأدنى للترسيب في البرنامج.
  4. تنظيف QCM
    1. للحفاظ على الدقة، قم بتنظيف QCM بعد كل تجربة.
    2. أضف 1 مل من كحول الأيزوبروبيل بنسبة 70٪ داخل كل ملحق QCM.
    3. قم بتمرير محلول الكحول لأعلى ولأسفل 2-3 مرات لإذابة البقايا.
    4. قم بإزالة محلول الكحول واترك QCM يجف تماما في الهواء في بيئة خالية من الغبار قبل الاستخدام التالي.

4. نتائج تعريض الخلايا لبخار القنب

ملاحظة: تم تصميم هذا البروتوكول لتقييم تأثيرات بخار القنب على خلايا الجهاز التنفسي المزروعة في ALI باستخدام نظام expoCube. توفر فحوصات ما بعد التعرض ، بما في ذلك 3- (4 ، 5-dimethylthiazol-2-yl) -2،5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) ونازعة هيدروجين اللاكتات (LDH) ، نظرة ثاقبة حول السمية الخلوية المعتمدة على الجرعة والنشاط الأيضي.

  1. توصيل بخار القنب
    1. قم بإعداد نظام التعريض الضوئي كما هو موضح أعلاه: تأكد من وصول النظام إلى 35 درجة مئوية ودرجة حرارة 50 درجة مئوية ومستويات رطوبة نسبية أعلى من 75٪.
    2. إذا كنت تستخدم QCM ، فقم بتوصيل الجهاز بوحدة الإلكترونيات الخاصة به باستخدام موصل المشبك ، وقم بتوصيل الوحدة بمدخلات وحدة التعرض للاستنشاق بموصل 7 سنون. ضع ملحق QCM المفرد في لوحة بئر على جانب التعريض الضوئي من expoCube ، مما يضمن محاذاة QCM بشكل جيد.
    3. افتح نظام التعريض ووضع لوحة زراعة الخلية بالداخل.
    4. ابدأ نظام النفخ للمدة المطلوبة بناء على القسم 2. سيسمح استخدام QCM بالتتبع في الوقت الفعلي لإجمالي البخار المودع.
    5. بعد التعرض ، أعد الخلايا إلى الحاضنة حتى النقطة الزمنية المطلوبة للفحص.
    6. اجمع العينات حسب الحاجة من مقصورات مختلفة ، بما في ذلك الحيز القاعدي الوحشي ، وغسل المقصورة القمية (للفاعل بالسطح أو المخاط) ، ومحللة الخلية.
    7. فحوصات اختيار الجرعة: استخدم فحوصات LDH و MTT للمساعدة في تحديد الجرعة المثلى والسمية الخلوية المحتملة.
  2. اختبار LDH للخلايا في ALI
    1. جمع الوسائط: في النقطة الزمنية المطلوبة بعد التعرض، اجمع الوسائط من الحجرة القاعدية الجانبية.
    2. انقل 100 ميكرولتر من الوسائط المجمعة إلى صفيحة دقيقة شفافة مكونة من 96 بئرا.
    3. أضف 100 ميكرولتر من خليط تفاعل LDH الطازج إلى كل بئر.
    4. احتضان اللوحة في درجة حرارة الغرفة (15-25 درجة مئوية) لمدة 30 دقيقة ، لحمايتها من الضوء.
    5. قم بقياس الامتصاص عند 490-492 نانومتر ، باستخدام طول موجي مرجعي يزيد عن 600 نانومتر.
    6. احسب السمية الخلوية باستخدام الصيغة التالية:
      السمية الخلوية (٪) = (القيمة التجريبية - التحكم السلبي) / (التحكم الإيجابي - التحكم السلبي) × 100
  3. اختبار MTT للخلايا في ALI
    1. زراعة خلايا A549 في ALI كما تم إنشاؤها سابقا.
    2. بعد تسليم التعرض في نظام التعريض ، أعد الخلايا إلى الحاضنة حتى النقطة الزمنية المطلوبة للفحص.
    3. قم بإذابة 1 مجم من MTT في 1 مل من PBS لعمل محلول MTT.
    4. أضف 500 ميكرولتر من محلول MTT إلى الجانب القمي للخلايا و 500 ميكرولتر من محلول MTT إلى الحيز القاعدي الجانبي.
    5. أعد الخلايا إلى الحاضنة 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
    6. قم بإزالة جميع الوسائط بعناية.
    7. أضف 500 ميكرولتر من ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) إلى الجانب القمي و 1,000 ميكرولتر من DMSO إلى الجانب القاعدي الجانبي.
    8. احتضان لمدة 1 ساعة لإذابة بلورات الفورمازان.
    9. اجمع المحلول وامزجه من الجانبين القمي والقاعدي.
    10. قم بقياس الامتصاص عند 540 نانومتر (OD540) مع مرجع عند 690 نانومتر (OD690).
    11. احسب صلاحية الخلية باستخدام الصيغة التالية:
      بقاء الخلية (٪) = 100 × (متوسط OD_exposure / متوسط التحكم OD_negative)

النتائج

أثناء التجارب مع نظام expoCube ، تتلقى أربعة آبار التعرض لبخار القنب ، وتتعرض أربعة آبار للهواء المكيف كأدوات تحكم في المركبات ، والآبار الأربعة المتبقية مغلقة بالكامل كعناصر تحكم سلبية (الشكل 1 ج) 17. يتيح هذا الإعداد مقارنة دقيقة بين الحالات المعالجة والمركبة والسلبية. يتم ترطيب النظام لخلق بيئة مناسبة لمزارع الخلايا (الشكل 2) ، ويعزز تنظيم درجة الحرارة داخل النظام ترسب الجسيمات من خلال الرحلان الحراري ، مما يسمح بالتوصيل الفعال للمركبات المتبخرة إلى الخلايا18. لتحديد كمية التعرض ، نقيس كمية Δ 9-THC كعلامة على ترسب بخار القنب في موقع التعرض للخلية. يعد هذا القياس الكمي أمرا بالغ الأهمية لتحسين أوقات التعرض والجرعات ، مما يمكن الباحثين من ضبط فترات التعرض النشط لتحقيق الجرعات المرغوبة في تجارب زراعة الخلايا (الشكل 3). من خلال حساب نسبة Δ 9-THC التي تم جمعها في مرشح تدفق التعرض إلى الكمية المودعة في الآبار الفردية ، يمكننا تقدير الجرعة الفعلية التي يتم تسليمها إلى الخلايا (الجدول 1). تعلم هذه الجرعة المحسوبة نطاق التعرض المطلوب ، مما يساعد في تحديد المعلمات المثلى لدراسة الاستجابات الخلوية لبخار القنب بطريقة متسقة وقابلة للقياس. يمكن إجراء ذلك للقنب الآخر ، اعتمادا على ملف تعريف القنب لسلالة القنب المحددة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن إجراء تحليل QCM لقياس ترسب بخار القنب في الوقت الفعلي. يوضح الشكل 4 ترسب بخار القنب على مدار 30 دقيقة حيث تم تغيير المرذاذ ومادة القنب كل 5 دقائق. أظهر كل بئر زيادة ثابتة في الكتلة بمرور الوقت ، مما يشير إلى ترسب فعال ومستمر لجزيئات بخار القنب الكاملة.

figure-results-1
الشكل 1: تخطيطي لنظام التعرض ALI / Transwell في المختبر / خارج الجسم الحي للتعرض لبخار القنب في ALI. (أ) تم استخدام مبخر DaVinci MIQRO لتوليد بخار القنب. يتم ترطيب هذه العينة ونقلها عبر جهاز أخذ العينات متساوي الحركة إلى موقع التعرض. تسمح وحدة التحكم بإجراء تعديلات على مخرجات تدفق الهواء وتدرجات درجة الحرارة. (ب) صور فوتوغرافية لإعداد نظام التعريض الضوئي. (ج) يتم تقسيم الجزء الداخلي من expoCube إلى ثلاثة صفوف: صف اختبار للتعرض لبخار القنب ، وصفا للتحكم في السيارة من الهواء المكيف ، وصفا للتحكم السلبي المغلق الذي يظل دون أن يمسه أي تدفق هواء. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: ملف تعريف الرطوبة النسبية (٪) المسجل بمرور الوقت. توضح هذه البيانات مستويات الرطوبة النسبية عند تنشيط Aeronebs ، وتصل إلى متوسط رطوبة يبلغ 75٪ وتحافظ عليها. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3: القياس الكمي لترسب Δ 9-THC عبر تحليل LC / MS بعد التعرض لمدة 30 دقيقة لبخار القنب. (أ-ج) تم قياس ترسبΔ 9-THC في كل بئر بعد ثلاث مرات تعرض مستقلة للبخار لمدة 30 دقيقة ، كل منها يستخدم 1.5 جم من صنف القنب عالي THC. Δ تم قياس مستويات9-THC بواسطة LC / MS. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4
الشكل 4: قياسات QCM لترسب بخار القنب في نظام التعرض في المختبر / Transwell على مدى نظام تعرض مدته 30 دقيقة. (A-D) يمثل كل رسم بياني الترسيب التراكمي لجزيئات بخار القنب في الآبار 1-4 ، مع قياس الكتلة بالميكروغرام (ميكروغرام) بمرور الوقت. يظهر معدل الترسيب تراكما ثابتا عبر جميع الآبار. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

ترسيب مرشح التدفق الأولي (ميكروغرام)ترسبات الآبار (ميكروغرام)النسبة المئوية للتدفق الأولي المودع في البئر (٪)
تعرض 12142.34.70.22
4.40.2
4.60.22
4.40.21
تعرض 22726.54.10.15
3.90.14
4.40.16
4.60.17
تعرض 324003.60.15
3.80.16
50.21
40.17
متوسط2422.94.30.18
الانحراف المعياري292.80.40.03

الجدول 1. مقارنة بين ترسيب Δ9-THC في نظام التعرض ALI / Transwell في المختبر / خارج الجسم الحي بين مرشح تدفق التعرض وموقع التعرض للخلية.

المناقشة

تعد زراعة الخلايا في ALI طريقة مهمة في أبحاث الجهاز التنفسي نظرا لقدرتها على تمثيل ظروف مجرى الهواء في الجسم الحي بشكل أكثر دقة مقارنة بالثقافات التقليدية المغمورة19. تسمح الزراعة في ALI للخلايا الظهارية للرئة بالتعرض مباشرة للهواء على سطحها القمي مع الحفاظ على العناصر الغذائية الأساسية من وسط الاستزراع على الجانب القاعدي. يمكن هذا الإعداد الخلايا من إنتاج الفاعل بالسطح أو المخاط ، وهي مكونات رئيسية لآلية الدفاع التنفسي والتي تعتبر ضرورية لاحتجاز وإزالة الجسيمات المستنشقة ومسبباتالأمراض 20،21،22. تستخدم خلايا A549 بشكل شائع في الدراسات المختبرية ولكنها ليست سوى واحدة من العديد من مزارع الخلايا الظهارية التنفسية التي يمكن استخدامها ل ALI قام Silva et al. بمراجعة خطوط الخلايا والثقافات الأولية لظهارة الجهاز التنفسي ل ALI من تجويف الأنف إلى الحويصلاتالهوائية 22. تسمح مرونة نظام التعرض ALI المقدم بتكييفه مع خطوط الخلايا المختلفة والخلايا الأولية.

ينظر إلى مزارع ALI بشكل متزايد على أنها "المعيار الذهبي" لدراسات الاستنشاق في المختبر ، لا سيما للأبحاث حول ملوثات الهواء والجسيمات والعوامل الأخرى القابلة للاستنشاق23. تكمن الميزة الأساسية لنماذج ALI في قدرتها على تقديم رؤى أكثر قابلية للترجمة إلى التأثيرات البشرية في الجسم الحي . ومع ذلك ، فإن العيب الملحوظ هو عدم وجود بروتوكولات موحدة للتعرض ل ALI ، مما يؤثر على قابلية التكاثر والمقارنة عبر الدراسات. تتمثل إحدى الثغرات في سير عمل التعريض الضوئي القياسي. من خلال تعريض الخلايا لبخار القنب في ALI ، يمكن تقييم تأثيرات القنب على الوظيفة الخلوية وقابليتها للحياة والسمية الخلوية. تسمح هذه التعرضات بإجراء تقييم مفصل للنتائج البيولوجية ، بما في ذلك علامات السمية الخلوية والالتهاب والإجهاد التأكسدي. يتيح القياس الكمي الدقيق للقنب المودع إجراء دراسات قابلة للتكرار حول التأثيرات الخلوية لبخار القنب (وأشكال أخرى من منتجات القنب) ، مما يعزز فهمنا لآثاره الصحية المحتملة في بيئة معملية خاضعة للرقابة.

تعالج أنظمة التعرض المتقدمة القيود في الثقافات التقليدية المغمورة من خلال تمكين ترسب الجسيمات المباشر على سطح الخلية ، وبالتالي توفير تعرضات أكثر صلة من الناحية الفسيولوجية. هذا يقلل أيضا من الآثار المحتملة للمذيبات أو الناقلات. من خلال السماح بترسيب الجسيمات المباشر دون الحاجة إلى هذه المذيبات ، تساعد أنظمة التعرض في تقليل التأثيرات المتعلقة بالسيارة. ومع ذلك ، لا تزال هناك بعض الاعتبارات المتعلقة بالمركبات. على سبيل المثال ، يمكن أن تتسبب مستويات الرطوبة غير المنضبطة في إجهاد الخلية غير المرغوبفيه 24 ، مما قد يؤثر على النتائج التجريبية. يعد التأكد من تنظيم الرطوبة بعناية للوصول إلى المستويات المثلى أمرا ضروريا للحفاظ على استقرار الخلية ودقتها في النتائج. بالإضافة إلى ذلك ، فإن كل خليط من الجسيمات أو الهباء الجوي أو الغاز له خصائصه الفيزيائية والكيميائية الفريدة ، والتي يمكن أن تغير الترسيب على سطحالخلية 25. لذلك ، من المهم توصيف نظام التعرض لكل منتج فريد. تشمل العوامل التي يمكن أن تؤثر على ترسب الجسيمات الرحلان الحراري ، وحركة الجسيمات من منطقة ذات درجة حرارة أعلى إلى أقل26. يساعد الرحلان الحراري في توجيه الجسيمات نحو الخلايا ويعزز كفاءة الترسيب.

يعد اتساق الجرعات ودقتها من التحديات الإضافية عند العمل مع أنظمة التعرض في ALI ، خاصة عند استخدام الهباء الجوي أو الجسيمات. ترسب الجسيمات في الجسم الحي في الرئة هو عملية معقدة تتأثر بحجم الجسيمات وشكلها وكثافتها وقابليتها للذوبان ، بالإضافة إلى المنطقة المحددة من الرئة التي تتعرضلها 27. تؤدي هذه العوامل إلى معدلات ترسيب متنوعة يصعب تكرارها في المختبر. النماذج الرياضية ، مثل قياس جرعات الجسيمات متعددة المسيرات (MPPD) ، هي أدوات مفيدة لتقدير معدلات الترسيب في الجسم الحي وتوجيه ترجمة الجرعة المختبرية 28. ومع ذلك ، فإن مطابقة الجرعات في المختبر مع سيناريوهات التعرض في الجسم الحي لا تزال تمثل تحديا ، خاصة بالنسبة للهباء الجوي المعقد ذي التركيبات غير المتجانسة.

لتوصيف الجرعة الخالية من الخلايا ، من المهم ملاحظة أن غسالات الإدخال المصنوعة من الفولاذ المقاوم للصدأ تميل إلى المبالغة في تقدير الترسيب ، حيث يمكن أن تلتصق المركبات بكل من جدران الإدخال والقاعدة حيث توجد الخلايا عادة. يوفر QCM ميزة هنا من خلال قياس الكتلة المترسبة مباشرة في موقع زراعة الخلية فقط ، مما يوفر تقييما أكثر دقة للترسيب ذي الصلة على وجه التحديد بالتعرض للخلايا.

مع تحرك علم السموم نحو نماذج أكثر صلة من الناحية الفسيولوجية ، سيكون اعتماد بروتوكولات التعرض الموحدة ل ALI أمرا أساسيا في سد الفجوة بين النتائج في المختبر والاستجابات البشرية في الجسم الحي ، مما يدعم في النهاية تقييمات أكثر موثوقية للمواد السامة التنفسية وتأثيراتها على الصحة.

الإفصاحات

تعمل PG و BU في SCIREQ - Scientific Respiratory Equipment، Inc. أكملت ETW تدريبا داخليا في SCIREQ - Scientific Respiratory Equipment، Inc. من خلال برنامج Mitacs Accelerate. المؤلفون الآخرون ليس لديهم أي تعارضات للإفصاح عنها

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل من قبل مشروع منحة المعاهد الكندية للبحوث الصحية (CIHR) 162273. تم دعم CJB من قبل Fonds de Recherche du Québec -Santé (FRQS). تم دعم هذه الدراسة أيضا من خلال منحة Mitacs #IT34076 إلى ETW.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
أنبوب الطرد المركزي سعة 15 مل ، رف (رف البوليسترين) ، شركةمونتريال للتكنولوجيا الحيوية المعقمةMBI601051C
30 مل قوارير زجاجيةتوماس ساینتفيك1755F32
A549 خلاياATCCCCL-185
مضاد حيوي مضاد للفطريات (100x)Wisent450-115-EL
مطحنة أعشاب القنب   ؛Genchihttps://www.amazon.ca/Genchi-Grinder-Crystal-Threads-Premium/dp/B094WX443Y/ref=sr_1_10?crid=A1EV93N8PW1V&dib=eyJ2Ijo
iMSJ9.WX_vMBLeAHzc6JplZiba8i
w7k_cGpHrEm0VunfiDZqO0U1mT
NA0Tr8j5nGMqrGq1BW75hAV8Fr3
SDCGH7O7zwsmmCWOxvdAEN4
97Npj07w0FHMuNDtuKZ3hKv9d8
vauHRtueWaDqYEPOCIAy956bGf
PwXu2Gp9nCWVhFCo1gHqgeh1N
nrWwD3lJ_r_wx2GoauoNdVw9eH
A2QYc1tx3XKMidd2YkVRF_ABYL
ZJd0EIDxi22hBnzaM4KklLO6Ep0v
OGb1QifhM062KUvTTY9PAOUn8F
-O1V0qNYQiRk6SQo2WId2wOHS
Mz_zo4YCbkDQf2rNGy81iXhuBzV
qu9LhvOcI1xnPUd-JPLx_4rZdSC92
Q_QZODiSxBhH-ellca78LW2iV4XXU
vIr-fVWIKdhrS49MD7KV1lCjdBcT_
K3l4bT0mBgZB1_Qpgf_5tmrj-kf.-ctY
GDLXKn-ovr6On-5g1G0_oK5mrHdj
CN3LXumyu8Q& dib_tag=se&
الكلمات الرئيسية = عشب٪ 2Bgrinder & QID = 1736346511 &
sprefix = عشب٪ 2Bgrinder٪ 2 أغطية٪
2C168 & ريال سعودي = 8-10 و ال = 1
الكولاجين من المشيمة البشرية ، النوع الرابعSigma-AldrichC7521
Costar 12 مم transwell ، 0.4 & micro ؛ غشاء بوليستر مسام إدراجتقنيات الخلايا الجذعية38023
طقم الكشف عن السمية الخلوية (LDH)روش11644793001
دافينشي MIQRO-C مبخر الأعشاب الجافةدافينشيhttps://davincivaporizer.com/products/davinci-miqro-c
ثنائي ميثيل سلفوكسيدسيجما ألدريتش34869
DMEM متوسطWisent319-005-CL
زهرة القنب المجففةSoci & eacute; ر & إيكوت; qu & eacute; ب & إيكوت; coise du cannabishttps://www.sqdc.ca/en-CA/dried-cannabis?&fn1=CannabinoidBalanceLookup
Value&fv1 = THC		محتوى القنب: 17 &ndash ؛ 23٪ THC < 0.1٪ CBD 
مصل الأبقار الجنينWisent080-150FBS
flexiWare SCIREQhttps://www.scireq.com/downloads/الإصدار 8.4.1
GentamycinWisent450-134-XL
حمض الخليك الجليديSigma-Aldrich100063 
GlutamaxThermoFisher Scientific35050061
inExpose expoCube في حزمة التعرض في المختبر    SCIREQIX-XCP 
Infinite 200 PROTECAN30125944
LC / MS درجة الميثانولSigma-Aldrich106035
ملحي مخزن بالفوسفاتThermoFisher Scientific10010-023
T175 EasYFlask ، سطح TC ، غطاء مرشحThermoFisher Scientific159910
T75 EasYFlask ، سطح TC ، غطاء مرشحThermoFisher Scientific156499
ثيازوليل الأزرق تيترازوليوم بروميدسيجما ألدريتشM 2128MTT
تريتون X-100سيجما ألدريتش108603
حمام منظف بالموجات فوق الصوتيةVWR18303سونيكاتور حمام
منظم حبوب منع الحمل الأسبوعيHealthSmart640-8223-0000
محلول

المراجع

  1. Graves, B. M., et al. Comprehensive characterization of mainstream marijuana and tobacco smoke. Sci Rep. 10 (1), 7160(2020).
  2. Lanz, C., Mattsson, J., Soydaner, U., Brenneisen, R. Medicinal cannabis: in vitro validation of vaporizers for the smokefree inhalation of cannabis. PLoS One. 11 (1), e0147286(2016).
  3. Arlen, M., et al. Cannabis vaping elicits transcriptomic and metabolomic changes in inflammatory, oxidative stress and cancer pathways in human bronchial epithelial cells. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. , (2025).
  4. Wu, J., et al. Characterization of airliquid interface culture of A549 alveolar epithelial cells. Braz J Med Biol Res. 51 (2), e6950(2017).
  5. Kaur, K., et al. Comparison of biological responses between submerged, pseudoairliquid interface, and airliquid interface exposure of A549 and differentiated THP1 cocultures to combustionderived particles. J Environ Sci Health A Tox Hazard Subst Environ Eng. 57 (7), 540-551 (2022).
  6. Adekola, M. B., et al. Invitro antioxidant and antiinflammatory activities of ethanol stembark extract of Blighia sapida K.D. Koenig. J Pharm Anal. 12 (2), 350-354 (2022).
  7. Final report on the safety assessment of capsicum annuum extract, capsicum annuum fruit extract, capsicum annuum resin, capsicum annuum fruit powder, capsicum frutescens fruit, capsicum frutescens fruit extract, capsicum frutescens resin, and capsaicin. Int J Toxicol. 26 (Suppl 1), 3-106 (2007).
  8. Daltro, S. R. T., et al. In vitro and in vivo immunomodulatory activity of Physalis angulata concentrated ethanolic extract. Planta Med. 87 (1-02), 160-168 (2021).
  9. Araujo, J., et al. Antioxidant and in vitro cytogenotoxic properties of Amburana cearensis (Allemão) A.C.Sm. leaf extract. Drug Chem Toxicol. 46 (1), 104-112 (2023).
  10. Spósito, L., et al. In vitro and in vivo antihelicobacter pylori activity of Casearia sylvestris leaf derivatives. J Ethnopharmacol. 233, 1-12 (2019).
  11. Ngulde, S. I., et al. Ethanol extract of Securidaca longipedunculata induces apoptosis in brain tumor (U87) cells. Biomed Res Int. 2019, 9826590(2019).
  12. Phuwajaroanpong, A., et al. In vitro and in vivo antimalarial activities and toxicological assessment of Pogostemon cablin (Blanco) Benth. J Evid Based Integr Med. 25, (2020).
  13. Upadhyay, S., Palmberg, L. Airliquid interface: relevant in vitro models for investigating air pollutantinduced pulmonary toxicity. Toxicol Sci. 164 (1), 21-30 (2018).
  14. Lenz, A. G., et al. Inflammatory and oxidative stress responses of an alveolar epithelial cell line to airborne zinc oxide nanoparticles at the airliquid interface: a comparison with conventional, submerged cellculture conditions. Biomed Res Int. 2013, 652632(2013).
  15. Ritter, D., et al. In vitro inhalation cytotoxicity testing of therapeutic nanosystems for pulmonary infection. Toxicol In Vitro. 63, 104714(2020).
  16. Loret, T., et al. Airliquid interface exposure to aerosols of poorly soluble nanomaterials induces different biological activation levels compared to exposure to suspensions. Part Fibre Toxicol. 13 (1), 58(2016).
  17. Detlef, R., et al. In vitro inhalation cytotoxicity testing of therapeutic nanosystems for pulmonary infection. Toxicol In Vitro. 63, 104714(2020).
  18. Ritter, D., et al. Development and evaluation of an in vitro test system for toxicity screening of aerosols released from consumer products and first ap-plication to aerosols from a hair straightening process. Appl In Vitro Toxicol. 4 (2), 180-192 (2018).
  19. Silva, S., Bicker, J., Falcão, A., Fortuna, A. Airliquid interface (ALI) impact on different respiratory cell cultures. Eur J Pharm Biopharm. 184, 62-82 (2023).
  20. Fahy, J. V., Dickey, B. F. Airway mucus function and dysfunction. N Engl J Med. 363 (23), 2233-2247 (2010).
  21. Kingma, P. S., Whitsett, J. A. In defense of the lung: surfactant protein A and surfactant protein D. Curr Opin Pharmacol. 6 (3), 277-283 (2006).
  22. Soraia, S., Joana, B., Amílcar, F., Ana, F. Airliquid interface (ALI) impact on different respiratory cell cultures. Eur J Pharm Biopharm. 184, 62-82 (2023).
  23. Graf, J., TrautmannRodriguez, M., Sabnis, S., Kloxin, A. M., Fromen, C. A. On the path to predicting immune responses in the lung: modeling the pulmonary innate immune system at the airliquid interface (ALI). Eur J Pharm Sci. 191, 106596(2023).
  24. Zavala, J., et al. Regulating temperature and relative humidity in airliquid interface in vitro systems eliminates cytotoxicity resulting from control air exposures. Toxicol Res (Camb). 6 (4), 448-459 (2017).
  25. Speen, A. M., et al. Benchmark dose modeling approaches for volatile organic chemicals using a novel airliquid interface in vitro exposure system. Toxicol Sci. 188 (1), 88-107 (2022).
  26. Seidel, S. A., et al. Microscale thermophoresis quantifies biomolecular interactions under previously challenging conditions. Methods. 59 (3), 301-315 (2013).
  27. Morawska, L., Buonanno, G., Mikszewski, A., Stabile, L. The physics of respiratory particle generation, fate in the air, and inhalation. Nat Rev Phys. 4 (11), 723-734 (2022).
  28. Kuempel, E. D., Sweeney, L. M., Morris, J. B., Jarabek, A. M. Advances in inhalation dosimetry models and methods for occupational risk assessment and exposure limit derivation. J Occup Environ Hyg. 12 (Suppl 1), S18-S40 (2015).

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

التعرض لبخار القنبسمية الاستنشاقنظام التعرض للمبخرالميزان البلوري الكوارتزي الدقيقزراعة الخلايا التنفسيةقياس الجرعات في الوقت الفعليقياس ترسيب البخارنموذج الرئة قبل السريري
في المختبر تعرض القنب للخلايا الظهارية الرئوية في واجهة الهواء السائل
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.