تقدم هذه المقالة بروتوكولا خطوة بخطوة يوضح كيف يمكن تكييف الاستنساخ المعياري (MoClo) لاستنساخ الأوبرونات متعددة السترون.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
التجميع المعياري القياسي لمشغلات Polycistronic مع الاستنساخ المعياري (MoClo) باستخدام مجموعة أدوات الاستنساخ
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تتيح مجموعات أدوات الاستنساخ المعياري (MoClo) التجميع السريع للتركيبات متعددة الجينات. وهي تستند إلى استنساخ Golden Gate ، والذي يستخدم إنزيمات تقييد من النوع IIS التي تقطع خارج موقع التعرف عليها. نظرا لفصل التعرف وتسلسل القطع ، يمكن اختيار الأجزاء المتدلية التي تم إنشاؤها بواسطة إنزيمات تقييد النوع IIS بشكل متعمد ، وعادة ما تمنع استراتيجيات الاستنساخ قطع شظايا الحمض النووي المرتبطة بشكل صحيح. يسمح ذلك بتجميعات عالية الكفاءة لأجزاء الحمض النووي المتعددة في تفاعل واحد. في MoClo ، يتم تعيين أجزاء الحمض النووي الوظيفية الفردية مثل المحفزات ، ومواقع الربط الريبوسومي ، وتسلسلات الترميز ، والنهي ، بالإضافة إلى التجميعات ذات الترتيب الأعلى ، إلى أجزاء متدلية موحدة ، بحيث يمكن إنشاء مكتبات أجزاء قابلة لإعادة الاستخدام. تم تصميم غالبية مجموعات أدوات MoClo البكتيرية لاستنساخ وحدات النسخ أحادية السترونيك ولا توفر مسارا منظما لتجميع الأوبرونات متعددة الأحادية. يوضح هذا البروتوكول تجميع وحدات النسخ متعددة السيسترونيك باستخدام مجموعة أدوات الاستنساخ In- & Out-Cloning . نفس النهج قابل للتحويل إلى مجموعات أدوات MoClo الأخرى.
المقدمة
الاستنساخ الجزيئي ، إدخال الحمض النووي المؤتلف في replicon مثل البلازميد ، هو منهجية تأسيسية في البيولوجيا الجزيئية. أصبحت طرق بناء وتجميع الحمض النووي متطورة بشكل متزايد في العقود الأخيرة. الآن ، يمكن للباحثين بناء كروموسومات اصطناعية كاملة وحتى جينومات من الحمض النوويالمركب 1. غالبا ما يعتمد الاستنساخ الجزيئي التقليدي على استراتيجيات الاستنساخ المخصصة ، ويمكن أن يكون شاقا ومكلفا بالنسبة للتركيبات الكبيرة متعددة الجينات2. في السنوات الأخيرة ، أصبح استنساخ Golden Gate (GG) ومجموعات أدوات الاستنساخ المعياري الهرمي (MoClo)2،3
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
ملاحظة: يصف هذا البروتوكول تصميم وتجميع مشغل متعدد السترونات من خلال ثلاثة مستويات من معيار الاستنساخ (0 و 1 و M). يبدأ المشغل متعدد السيسترونيك الذي تم تجميعه هنا بمحفز ، يليه موقع ربط الريبوسومي (RBS) ، وتسلسل الترميز (CDS) ، و RBS ثان ، و CDS ثان ، وأخيرا فاصل (الشكل S1). ينصح بشدة باستخدام برنامج الاستنساخ الجزيئي لمحاكاة الاستنساخ في السيليكو ، لضمان صحة استراتيجية الاستنساخ المصممة. مثال على تجميع المروج كجزء من المستوى 0 ، وتجميع RBS بتسلسل ترميز وفاصل في وحدة نسخ من المستوى 1 ، وتجميع مشغل ثنائي في المستوى M موصوف هنا ، ويتم عرض نظرة عامة تخطيطية على التجميع بأكمله في الشكل S1
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
هنا ، تظهر نتائج التجميع من أسفل إلى أعلى لمشغل متعدد السترونيك من المستوى 0 إلى المستوى M (الشكل S1). يبدأ الأوبرون مع المحفز PLuxB ، والذي يمكن تنشيطه بواسطة بروتين LuxR في وجود مركب المحفز N- (β-Ketocaproyl) -L-homoserine lactone (OC6) 17. GFP هو أول CDS للأوبرون ، RBS الخاص به هو iGEM BBa_B0064. يتبع GFP رابط غير طرفي ، "جسر المنهي". تم تصميم RBS الثاني بواسطة آلة حاسبة RBS18 ، والثاني CDS هو mTurquoise. أخير.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
يمكن أن يستغرق الاستنساخ الجزيئي وقتا طويلا ومرهقا ، خاصة مع استراتيجيات الاستنساخ المخصصة . يمكن لمجموعات أدوات MoClo تحسين الاستنساخ الجزيئي من خلال نمطيتها وتجميعها الهرمي وتفاعلات وعاء واحد عالية الكفاءة. يعتمدون على تجميع الحمض النووي من خلال تفاعلات البوابة الذهبية. بفضل الأجزاء المتدلية الموحدة ، يمكن إعادة استخدام مكتبات الأجزاء الجزيئية ومشاركتها مع الآخرين3،6. تسمح قابلية إعادة استخدام الأجزاء بإنشاء مكتبات اند.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
تم دعم TAL و STdV و DS من قبل جمعية ماكس بلانك في إطار مشروع MaxGENESYS.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| الأمبيسيلين | ميرك لايف ساينس | A9518 | |
| الأجار البكتيري | فيشر ساينتفيك | P0011B | |
| BbsI-HF | مختبرات نيو إنجلاند البيولوجية | R3539 | |
| BsaI-HF V2 | مختبرات نيو إنجلاند البيولوجية | R3733 | |
| E. coli DH5α الخلايا المختصة | |||
| إبندورف ماسترسايكلر نكسوس ثيرمال سيكلرز | إبندورف | 6333000014 | |
| مطياف الفوتومتر الميكرو-حجم EzDrop 1000 | بلو-راي بيوتيك | BRED-1000 | |
| مجموعة GeneJET Plasmid Miniprep | ثيرمو ساينتفيك | K0503 | |
| <إم>في & مجموعة أدوات الاستنساخ< خارجية> | |||
| مخزن ليغاز | مختبرات نيو إنجلاند البيولوجية | B0216 | |
| NaCl | فيشر ساينتفيك | BP358 | |
| نيو برونزويك إنوفا وريج؛ 42/42R - هز الحاضنة القابل للتكديس | إبندورف | M1335-0080 | |
| فينوبوث+ | آلات المغنين | PHB-007 | |
| سابي | مختبرات نيو إنجلاند البيولوجية | R0569 | |
| سبيكتينوميسين | ميرك لايف ساينس | S4014 | |
| برمجيات المختبر القياسية | |||
| ليغاز الحمض النووي T4 | مختبرات نيو إنجلاند البيولوجية | M0202 | |
| ثيرموميكس إم إم | ب. براون بيوتيك إنترناشونال | ||
| التريبتون | فيشر ساينتفيك | LP0042B | |
| مستخلص الخميرة | فيشر ساينتفيك | LP0021B |
المراجع
- James, J. S., Dai, J., Chew, W. L., Cai, Y. The design and engineering of synthetic genomes. Nat Rev Genet. 1, 1-22 (2024).
- Weber, E., Engler, C., Gruetzner, R., Werner, S., Marillonnet, S. A modular cloning system for standardized assembly of multigene constructs. PLoS One. 6<....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
