Method Article

التجميع المعياري القياسي لمشغلات Polycistronic مع الاستنساخ المعياري (MoClo) باستخدام مجموعة أدوات الاستنساخ

DOI:

10.3791/68103

⸱

September 2nd, 2025

 ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Systems and Synthetic Biology (SSB), Wageningen University and Research, Agrotechnology and Food Sciences, 2Max Planck Institute for Terrestrial Microbiology, 3Center for Molecular Biology of Heidelberg University (ZMBH), 4Center for Synthetic Microbiology, Philipps-University Marburg

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تقدم هذه المقالة بروتوكولا خطوة بخطوة يوضح كيف يمكن تكييف الاستنساخ المعياري (MoClo) لاستنساخ الأوبرونات متعددة السترون.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تتيح مجموعات أدوات الاستنساخ المعياري (MoClo) التجميع السريع للتركيبات متعددة الجينات. وهي تستند إلى استنساخ Golden Gate ، والذي يستخدم إنزيمات تقييد من النوع IIS التي تقطع خارج موقع التعرف عليها. نظرا لفصل التعرف وتسلسل القطع ، يمكن اختيار الأجزاء المتدلية التي تم إنشاؤها بواسطة إنزيمات تقييد النوع IIS بشكل متعمد ، وعادة ما تمنع استراتيجيات الاستنساخ قطع شظايا الحمض النووي المرتبطة بشكل صحيح. يسمح ذلك بتجميعات عالية الكفاءة لأجزاء الحمض النووي المتعددة في تفاعل واحد. في MoClo ، يتم تعيين أجزاء الحمض النووي الوظيفية الفردية مثل المحفزات ، ومواقع الربط الريبوسومي ، وتسلسلات الترميز ، والنهي ، بالإضافة إلى التجميعات ذات الترتيب الأعلى ، إلى أجزاء متدلية موحدة ، بحيث يمكن إنشاء مكتبات أجزاء قابلة لإعادة الاستخدام. تم تصميم غالبية مجموعات أدوات MoClo البكتيرية لاستنساخ وحدات النسخ أحادية السترونيك ولا توفر مسارا منظما لتجميع الأوبرونات متعددة الأحادية. يوضح هذا البروتوكول تجميع وحدات النسخ متعددة السيسترونيك باستخدام مجموعة أدوات الاستنساخ In- & Out-Cloning . نفس النهج قابل للتحويل إلى مجموعات أدوات MoClo الأخرى.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الاستنساخ الجزيئي ، إدخال الحمض النووي المؤتلف في replicon مثل البلازميد ، هو منهجية تأسيسية في البيولوجيا الجزيئية. أصبحت طرق بناء وتجميع الحمض النووي متطورة بشكل متزايد في العقود الأخيرة. الآن ، يمكن للباحثين بناء كروموسومات اصطناعية كاملة وحتى جينومات من الحمض النوويالمركب 1. غالبا ما يعتمد الاستنساخ الجزيئي التقليدي على استراتيجيات الاستنساخ المخصصة ، ويمكن أن يكون شاقا ومكلفا بالنسبة للتركيبات الكبيرة متعددة الجينات2. في السنوات الأخيرة ، أصبح استنساخ Golden Gate (GG) ومجموعات أدوات الاستنساخ المعياري الهرمي (MoClo)2،3 حلولا شائعة للسماح بتجميع الحمض النووي بالوقت والتكلفة

إنزيمات تقييد النوع IIS هي نوكليازات داخلية تتعرف على تسلسل اتجاهي (غير مجانس) وتشقق خارج تسلسل التعرفهذا 4. نتيجة لذلك ، لا تعتمد التسلسلات المتدلية التي تم إنشاؤها بواسطة الانقسام على موقع التعرف ، ولكن يمكناختيارها 4. علاوة على ذلك ، يمكن تصميم شظايا الحمض النووي الوظيفية ، والتي تسمى هنا "الأجزاء" ، بحيث يزيل الانقسام موقع التعرف من نهايات الأجزاءالمراد ربطها 2. تستفيد استراتيجيات استنساخ GG من هذا للسماح بتجميعات الحمض النووي متعددة الأجزاء الفعالة في تفاعلات وعاءواحد 5. تعتمد مجموعات أدوات MoClo على استنساخ GG ، وتهدف إلى توفير طريقة معيارية وهرمية لتجميع التركيبات متعددة الجينات. يتم توحيد الأجزاء المتدلية المستخدمة لتجميع الأجزاء ، مما يسمح بإنشاء مكتبات أجزاء قابلة لإعادة الاستخدام وقابلة للتبديل. تعتمد مجموعات أدوات MoClo على البلازميدات المستقبلة ، والتي تم تصميمها لقبول تسلسلات الحمض النووي المتعددة وإطلاق المنتج المجمع. يحتوي كل بلازميد متقبل على موقعين للتعرف على إنزيمين مختلفين من النوع IIS ، حيث يتم استخدام أحدهما لقبول شحنة الحمض النووي والآخر لإطلاق الحمض النووي المجمع3،6. يظهر توضيح لهذا المبدأ في الشكل 1 لاستنساخ جزء فردي ، فاصل ، في بلازميد متقبل MoClo (المستوى 0). يتم قطع كل من البلازميد المتقبل والملحق بواسطة إنزيم التقييد BbsI ، بطريقة تترك نتوءات متوافقة وتزيل مواقع التعرف على BbsI. وبالتالي ، لم يعد يتم قطع البلازميدات المربوطة بشكل صحيح بواسطة BbsI بعد الآن. يؤدي قطع البلازميد الناتج باستخدام إنزيم IIS SapI إلى إطلاق الجزء الذي تم إدخاله مسبقا في خطوة التجميع التالية (المستوى 1).

في هذا البروتوكول ، يتم استخدام صندوق أدوات MoClo In - وOut-Cloning 7. هنا ، تحتوي البلازميدات من المستوى 0 على أجزاء وراثية أساسية محددة مثل المحفزات ذات المناطق غير المترجمة 5 بوصات (UTRs) ، وتسلسلات الترميز ، والنهي مع 3'UTRs ، يوضح الشكل 1 نظرة عامة تخطيطية على المستوى 0. في المستوى 1 ، يتم تجميع أجزاء متعددة في وحدة نسخ (TU) ، يوضح الشكل 2 نظرة عامة تخطيطية على أجزاء المستوى 1 والاستنساخ. الاستنساخ الداخلي والخارج تم تصميم MoClo للتجميع الخالي من الندوب لوحدات النسخ في المستوى 1 باستخدام إنزيم من النوع IIS الذي يخلق 3 نوكليوتيدات. وهذا يسمح للأجزاء المتدلية بأن تكون بالكامل ضمن البيانات النقطية الكودون لتسلسل التشفير، باستخدام كودونات بدء تشغيل ATG وإيقاف TGA للتجميع. تستخدم المستويين M و P لتجميع وحدات نسخ متعددة تم إطلاقها من بلازميدات المستوى1 3،8. يوضح الشكل 3 نظرة عامة تخطيطية على أجزاء الاستنساخ في المستوى M و P ، وتجميع أوبرون bicistronic في المستوى M (المشغل bicistronic هو وحدة نسخ تعبر عن تسلسلات ترميز متعددة (CDSs)). تم تصميم المستويين P و M للسماح بالتنقل التكراري من واحد إلى آخر ، بحيث لا يوجد حد نظري لعدد الأجزاء التي يمكن تجميعها ، ومع ذلك لم يتم وصف هذا في هذا البروتوكول ، حيث أن التركيز الرئيسي لهذا البروتوكول هو إظهار تجميع مشغل ثنائي الصوت. على الرغم من عدم وجود حد لعدد الأجزاء التي يمكن تجميعها ، إلا أن هناك حدا لحجم البناء الذي يمكن تجميعه ؛ تم تجميع ما يصل إلى 100,000 نقطة أساس باستخدام مجموعة MoClo9. علاوة على ذلك ، قد تسبب التركيبات أو التركيبات الكبيرة التي تحتوي على جينات سامة عبئا على الخلية. في هذه الحالات ، تم نشر البروتوكولات المعدلة10.

لم يصف الاستنساخ الداخلي والخارجي في البداية مخططا لتجميع وحدات النسخ متعددة السترونيك. تعد مشغلات Polycistronic وضعا شائعا جدا لتنظيم الجينات في البكتيريا11،12،13 ، وبالتالي ، هناك اهتمام ملحوظ بتجميعها من أسفل إلى أعلى بطريقة معيارية14. هنا ، يتم وصف مخطط منظم لتجميع مشغلات polycistronic باستخدام الاستنساخ الداخلي والخارجي. يسمح المخطط المقدم بالتبديل السهل لموضع تسلسلات الترميز داخل وحدات النسخ متعددة السترونيك ، بالإضافة إلى التجميعات التي تتكون من نسخ أحادي ومتعدد الأحاد.

يوضح البروتوكول التالي خطوة بخطوة تصميم واستنساخ مشغل متعدد السترونات باستخدام الاستنساخ الداخلي والخارجي. يمكن بسهولة تكييف الاستراتيجية المقدمة لاستنساخ وحدات النسخ متعددة السيسترونيك مع مجموعات أدوات MoClo الأخرى.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: يصف هذا البروتوكول تصميم وتجميع مشغل متعدد السترونات من خلال ثلاثة مستويات من معيار الاستنساخ (0 و 1 و M). يبدأ المشغل متعدد السيسترونيك الذي تم تجميعه هنا بمحفز ، يليه موقع ربط الريبوسومي (RBS) ، وتسلسل الترميز (CDS) ، و RBS ثان ، و CDS ثان ، وأخيرا فاصل (الشكل S1). ينصح بشدة باستخدام برنامج الاستنساخ الجزيئي لمحاكاة الاستنساخ في السيليكو ، لضمان صحة استراتيجية الاستنساخ المصممة. مثال على تجميع المروج كجزء من المستوى 0 ، وتجميع RBS بتسلسل ترميز وفاصل في وحدة نسخ من المستوى 1 ، وتجميع مشغل ثنائي في المستوى M موصوف هنا ، ويتم عرض نظرة عامة تخطيطية على التجميع بأكمله في الشكل S1.

1. المستوى 0: تدجين الأجزاء

ملاحظة: يستخدم مصطلح "التدجين" للإشارة إلى أن جزءا جزيئيا قد تم دمجه في مكتبة أجزاء MoClo ويمكن تجميعه في جميع أنحاء مستويات مجموعة MoClo. عادة ، تتم إزالة جميع مواقع التعرف على إنزيمات تقييد النوع IIS المستخدمة داخل المجموعة من الجزء المستأنس ، على سبيل المثال ، عن طريق إعادة الترميز المترادف.

  1. تصميم الملحق
    1. اختر الأجزاء الجزيئية ، مثل المروج و CDS و Terminator ، ليتم تجميعها معا في المشغل.
      ملاحظة: في هذا البروتوكول ، يبدأ المشغل مع المحفز PLuxB ، والذي يمكن تنشيطه بواسطة بروتين LuxR في وجود مركب المحفز N- (β-Ketocaproyl) -L-homoserine lactone (OC6) 17. GFP هو أول CDS للأوبرون. RBS هو iGEM BBa_B0064. يتبع GFP رابط غير طرفي ، "جسر المنهي". CDS الثاني هو mTurquoise. تم تصميم RBS بواسطة آلة حاسبة RBS18. أخيرا ، ينتهي الأوبرون ب TerminatorL3S2P21 19.
    2. اختر الموضع الذي يجب تجميع الجزء فيه ، تظهر نظرة عامة في الشكل 1. بناء على الموضع ، اختر بلازميد المستقبل لاستخدامه في GG.
      ملاحظة: يمكن تدجين الأجزاء لاستخدامها لاحقا في أوضاع مختلفة. على سبيل المثال ، يمكن تجميع المروج كجزء واحد لاحقا عند الاتصال بجزء 5'UTR (pSL252) ، أو يمكن تدجينه باستخدام 5'UTR موجود بالفعل (pSL099). يمكن تجميع CDS في أربعة بلازميدات متقبلة ، ليتم تجميعها بدون علامة (pSL102) ، ليتم تجميعها بعلامة N-terminal (pSL104) ، ليتم تجميعها بعلامة C-terminal (pSL101) ، أو يتم تجميعها مع كل من علامة N-terminal وعلامة C-terminal (pSL103). في المثال المعطى ، يتم تدجين المحفز في pSL252 ، ويتم تدجين أول RBS في pSL253 ، ويتم تدجين أول CDS في pSL102 ، ويتم تدجين جسر المنهي في pSL106 ، ويتم تدجين RBS الثاني في pSL099 ، ويتم تدجين CDS الثاني في pSL102 ، ويتم تدجين المنهي في pSL106.
    3. أضف امتدادات إلى الملحق المصمم بناء على البلازميد المستقبل المختار. يقدم الجدول 1 لمحة عامة عن الامتداد المطلوب لتجميع GG لكل بلازميد مستقبل. يجب إضافة هذه الامتدادات أثناء تصميم الاشعال ل PCR ، أو تصميم oligos في حالة تلدين اثنين من oligos لبناء جزء ، أو أثناء تخليق الجينات.
      ملاحظة: من أجل تدجين جزء ما ، من الضروري التأكد من أن الجزء نفسه لا يحتوي على مواقع التعرف على إنزيمات النوع IIS المستخدمة في المجموعة ، SapI (5'-GCTCTTC-3 ') و BbsI (5'-GAAGAC-3') و BsaI (5'-GGTCTC-3'). يقلل وجود مواقع التعرف في الأجزاء بشكل كبير من كفاءة التجميع الصحيح لأنه يمكن قطع المنتج النهائي بواسطة إنزيم IIS المستخدم من النوع (انظر الشكل 1).
  2. تفاعل GG
    1. بالنسبة لتفاعل GG ، أضف 50 fmol من الإدخال المطلوب ، و 50 fmol من البلازميد المستقبل ، و 1 ميكرولتر من 10x T4 DNA ligase buffer ، و 1 ميكرولتر من T4 ligase ، و 1 ميكرولتر من BbsI. أضف الماء الخالي من النوكلياز إلى الحجم الإجمالي البالغ 10 ميكرولتر. بالإضافة إلى ذلك ، قم بتضمين عنصر تحكم سلبي بنفس التفاعل دون الإدخال المطلوب.
    2. قم بتشغيل البرنامج التالي في جهاز تدوير حراري: 25 دورة من 37 درجة مئوية لمدة 3 دقائق (37 درجة مئوية هي درجة الحرارة المثلى لإنزيم التقييد) و 16 درجة مئوية لمدة 4 دقائق (16 درجة مئوية هي درجة الحرارة المثلى ل T4 ligase) ، متبوعا بهضم نهائي عند 50 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة (عند 50 درجة مئوية ، يظهر T4 ligase نشاطا ضئيلا جدا أو معدوما ، في حين أن إنزيم التقييد لا يزال قادرا على العمل ، وبالتالي الحد من كمية البلازميد المستقبل غير المقطوع في المنتج النهائي) والتعطيل الحراري للإنزيمات عند 80 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة (عند 80 درجة مئوية ، يتم تعطيل جميع الإنزيمات بالحرارة ويتم إنهاء التفاعل)6.
    3. قم بتحويل تفاعل GG عن طريق إضافة 5 ميكرولتر من تفاعل GG في 50 ميكرولتر من خلايا الإشريكية القولونية المختصة كيميائيا وقم بإجراء تحويل صدمة حرارية بخطوة استرداد كما هو موضح في بروتوكول منشورسابقا 15.
    4. انشر 100 ميكرولتر من نتاج التحول على صفيحة أجار لوريا-بيرتاني (LB) مع 100 ميكروغرام / مل سبيكتينومايسين. احتضان الطبق طوال الليل عند 37 درجة مئوية.
    5. قارن كفاءة تحويل التحكم السلبي بكفاءة التجميع الكامل عن طريق حساب عدد المستعمرات البيضاء على كلا اللوحين انتقل إلى الخطوة التالية إذا كان التجميع يحتوي على حوالي 10 مرات (أو أكثر) مستعمرات بيضاء من التحكم السلبي.
      ملاحظة: يجب أن تكون غالبية المستعمرات الناتجة بيضاء ، مع جزء صغير فقط من المستعمرات الحمراء. تحتوي البلازميدات المستقبلة في مجموعة أدوات In-Cloning على كاسيت اختيار مزدوج ، يحتوي إما على mCherry (المستوى 0 والمستوى 1) أو LacZα (المستوى M والمستوى P) ، وجين ccdB ، يشفر مثبط الجيراس. يتم إجراء تحويل تفاعل GG في خلايا الإشريكية القولونية الحساسة ل ccdB ، وبالتالي ، يمكن فقط للخلايا التي تحتوي على البلازميد المجمع أن تنمو ، في حين لا يمكن نشر البلازميد المستقبل الأصلي. تشمل أمثلة السلالات الحساسة ل ccdB DH5α و TOP10. يسمح mCherry / LacZα بالتعرف البصري على الخلايا الهاربة من آلية ccdB 16.
    6. لكل مجموعة ، قم بزراعة مستعمرتين أبيضتين عن طريق التقاط بعض المواد من المستعمرة بطرف ماصة وإعادة تعليقها إلى 5 مل من وسط LB مع 100 ميكروغرام / مل من سبيكتينومايسين لكل منهما واحتضانها طوال الليل عند 37 درجة مئوية في حاضنة اهتزاز عند 250 دورة في الدقيقة. قم بإجراء استخراج البلازميد القائم على العمود وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. تحقق من أن البلازميد المستخرج يحتوي على التسلسل المتوقع عن طريق تسلسل Sanger.

2. المستوى 1: تحديد المناصب

ملاحظة: المستوى 1 هو المستوى بين تدجين الأجزاء وتجميع مشغل متعدد السترونيك (الشكل 2). هنا ، يتم تحديد مواضع التجميعات الوسيطة في البناء النهائي. يمكن تغيير موضع مجموعة المستوى 1 داخل الأوبرون باستخدام بلازميد متقبل مختلف من المستوى 1. يصف المثال المعطى تجميع وحدة bicistronic ، ولكن يمكن تكييف المخطط المحدد بسهولة لتجميع ما يصل إلى ستة تتابعات تشفير (مع RBS لكل منها). بالإضافة إلى ذلك ، يتطلب تجميع المزيد من تسلسلات الترميز التنقل بين المستوى P و M. مع الدوران التكراري بين المستوى P و M ، لا يوجد حد أعلى ثابت لعدد تتابعات التشفير التي يمكن تجميعها في مشغل واحد.

  1. اختيار الأجزاء والبلازميدات المستقبلة
    1. اختر أجزاء المستوى 0 المراد تجميعها في وحدة نسخ. كحد أدنى ، يجب أن تشمل هذه المروج و CDS و Terminator.
    2. اختر الموضع الذي يجب أن يتم فيه تجميع وحدة النسخ في المشغل. بناء على هذا الموضع ، اختر البلازميد المتقبل المناسب. تظهر نظرة عامة في الشكل 2.
      ملاحظة: يتم تجميع شظايا الحمض النووي السبعة لبناء الأوبرون البيسسترونيك الموضحة كمثال في بنيتين من المستوى 1. يتم تجميع المروج ، و RBS الأول ، و CDS الأول ، وجسر المنهي في pSL68 ؛ يتم تجميع RBS الثاني و CDS الثاني و Terminator في pSL69.
  2. تفاعل GG
    1. بالنسبة لتفاعل GG ، أضف 50 fmol من كل من الإدخالات المرغوبة ، و 50 fmol من البلازميد المستقبل ، و 1 ميكرولتر من 10x T4 DNA ligase buffere ، و 1 ميكرولتر من T4 ligase ، و 1 ميكرولتر من SapI. أضف الماء الخالي من النوكلياز إلى الحجم الإجمالي البالغ 10 ميكرولتر.
    2. قم بتشغيل البرنامج التالي في جهاز تدوير حراري: 25 دورة من 37 درجة مئوية لمدة 3 دقائق و 16 درجة مئوية لمدة 4 دقائق ، متبوعا بهضم نهائي عند 50 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة ، وتعطيل الحرارة للإنزيمات عند 80 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة6.
    3. اختياري: أضف 0.5 ميكرولتر من SapI إلى تفاعل GG واحتضانه عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
      ملاحظة: SapI ليست مستقرة مثل إنزيمات تقييد IIS الأخرى المستخدمة. لقد وجد أن خطوة الهضم مع SapI بعد تفاعل GG تقلل من كمية المستعمرات التي تحمل البلازميد المقبول المعاد ربطه. يحتوي SapI على إيزوشيزومر ، BspQI ، والذي قد لا يحتاج إلى خطوة الهضم النهائية هذه.
    4. قم بتحويل 5 ميكرولتر من تفاعل GG إلى 50 ميكرولتر من الخلايا الإشريكية القولونية المختصة كيميائيا وقم بإجراء تحويل الصدمة الحرارية ، ويفضل أن يكون ذلك مع خطوة الاسترداد كما هو مطبق في الخطوة 1.2.3.
    5. صفيحة 100 ميكرولتر من نتاج التحول على صفيحة أجار LB مع 100 ميكروغرام / مل أمبيسلين. احتضان الطبق طوال الليل عند 37 درجة مئوية.
    6. لكل منهما ، قم بزراعة مستعمرتين أبيضتين عن طريق التقاط بعض مواد المستعمرة بطرف ماصة وإعادة تعليقها في 5 مل من وسط LB مع 100 ميكروغرام / مل أمبيسلين لكل منهما. احتضن بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية في حاضنة اهتزاز عند 250 دورة في الدقيقة. قم بإجراء استخراج البلازميد القائم على العمود وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
    7. قم بتأكيد التجميع الصحيح من خلال ملخص التقييد باستخدام BbsI ، والتحقق من أن حجم الفتحة يطابق الحجم المتوقع للإدراج. هضم 1000 نانوغرام من الحمض النووي البلازميد عن طريق إضافة 1 ميكرولتر من المخزن المؤقت للهضم المناسب 10x و 1 ميكرولتر من BbsI. أضف الماء الخالي من النوكلياز إلى الحجم الإجمالي البالغ 10 ميكرولتر. احتضن التفاعل عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
    8. قم بإجراء الرحلان الكهربائي للهلام عن طريق تحميل البلازميد المهضوم على هلام الاغاروز بنسبة 1٪ ، وقم بتشغيل الجل عند 100 فولت لمدة 35 دقيقة.
      ملاحظة: يمكن إجراء هضم في السيليكو للبلازميد المتوقع لمحاكاة هلام الاغاروز للتنبؤ بالنتيجة.

3. المستوى M: تجميع أوبرون polycistronic

ملاحظة: في هذه الخطوة ، يتم تجميع عامل polycistronic. في الحالة المعروضة للأوبرون bicistronic ، يتم تجميع إدخالين من المستوى 1 في الموضعين 1 و 2. وفقا لذلك ، يتم اختيار البلازميد المتقبل pMA60. علاوة على ذلك ، يلزم وجود رابط طرفي. تحتوي جميع البلازميدات المستقبلة من المستوى M و P على GGGA المتدلي باعتباره الجزء المتدلي الثاني. تربط الروابط الطرفية بين البلازميد المدخل والمستقبل وتمكن من تجميع بنية المستوى P في المستوى M والعكس صحيح. بالنسبة لتجميع المستوى P من إدخالين من المستوى 1 ، يتم استخدام الرابط النهائي pMA668 وسيأخذ الموضع الثالث والأخير. يتم عرض نظرة عامة على المستويين M و P وتصور لخطوة الاستنساخ في الشكل 3. مع التجميع فقط على المستوى M (أو P) ، يمكن استنساخ المشغلات التي تصل إلى 6 تسلسلات تشفير (المواضع 1-6). يتم أخذ الموضع 7 بواسطة الرابط النهائي. من الممكن تجميع عدد أكبر من تسلسلات الترميز في الأوبرون ، ولكنه يتطلب الانتقال إلى المستوى M (أو P) ، وهو غير موصوف في هذا البروتوكول.

  1. بالنسبة لتفاعل GG ، أضف 50 fmol من كل إدخال مرغوب فيه ، و 50 fmol من البلازميد المستقبل ، و 1 ميكرولتر من 10x T4 DNA ligase buffer ، و 1 ميكرولتر من T4 ligase ، و 1 ميكرولتر من BbsI. أضف الماء الخالي من النوكلياز إلى الحجم الإجمالي البالغ 10 ميكرولتر.
  2. قم بتشغيل البرنامج التالي في جهاز تدوير حراري: 50 دورة من 37 درجة مئوية لمدة 3 دقائق و 16 درجة مئوية لمدة 4 دقائق ، متبوعا بهضم نهائي عند 50 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة وتعطيل الحرارة للإنزيمات عند 80 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة6.
  3. قم بتحويل 5 ميكرولتر من تفاعل GG إلى 50 ميكرولتر من خلايا الإشريكية القولونية المختصة كيميائيا وقم بإجراء تحويل صدمة حرارية مع خطوة استرداد كما هو موضح في الخطوة 1.2.3.
  4. انشر 100 ميكرولتر من نتاج التحويل على صفيحة أجار LB مع 100 ميكروغرام / مل سبيكتينومايسين. احتضان اللوحة طوال الليل عند 37 درجة مئوية ، أو عند 30 درجة مئوية إذا كنت تتوقع عبئا استقلابيا أو سمية للتجميع.
  5. لكل تجمع ، قم بعمل ثقافة من مستعمرتين أبيضتين. تحقيقا لهذه الغاية ، اغمس طرف ماصة في المستعمرة واستخدمه لتلقيح 5 مل من LB ب 100 ميكروغرام / مل سبيكتينومايسين. احتضن طوال الليل عند 37 درجة مئوية أو 30 درجة مئوية في حاضنة اهتزاز عند 250 دورة في الدقيقة. قم بإجراء استخراج البلازميد القائم على العمود وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
  6. قم بتأكيد التجميع الصحيح من خلال ملخص تقييد باستخدام BsaI، والتحقق من أن حجم الفتحة تتطابق مع الحجم المتوقع للإدراج، كما تم إجراؤه في الخطوة 2.2.7.
    ملاحظة: قد يكون البناء طويلا جدا بحيث لا يمكن تغطيته بتسلسل Sanger للتأكيد. يمكن بعد ذلك تأكيده عن طريق تسلسل البلازميد الكامل ، والذي يتوفر كخدمة تجارية من العديد من مزودي خدمات التسلسل.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا ، تظهر نتائج التجميع من أسفل إلى أعلى لمشغل متعدد السترونيك من المستوى 0 إلى المستوى M (الشكل S1). يبدأ الأوبرون مع المحفز PLuxB ، والذي يمكن تنشيطه بواسطة بروتين LuxR في وجود مركب المحفز N- (β-Ketocaproyl) -L-homoserine lactone (OC6) 17. GFP هو أول CDS للأوبرون ، RBS الخاص به هو iGEM BBa_B0064. يتبع GFP رابط غير طرفي ، "جسر المنهي". تم تصميم RBS الثاني بواسطة آلة حاسبة RBS18 ، والثاني CDS هو mTurquoise. أخير...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمكن أن يستغرق الاستنساخ الجزيئي وقتا طويلا ومرهقا ، خاصة مع استراتيجيات الاستنساخ المخصصة . يمكن لمجموعات أدوات MoClo تحسين الاستنساخ الجزيئي من خلال نمطيتها وتجميعها الهرمي وتفاعلات وعاء واحد عالية الكفاءة. يعتمدون على تجميع الحمض النووي من خلال تفاعلات البوابة الذهبية. بفضل الأجزاء المتدلية الموحدة ، يمكن إعادة استخدام مكتبات الأجزاء الجزيئية ومشاركتها مع الآخرين3،6. تسمح قابلية إعادة استخدام الأجزاء بإنشاء مكتبات اند...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم TAL و STdV و DS من قبل جمعية ماكس بلانك في إطار مشروع MaxGENESYS.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
الأمبيسيلينميرك لايف ساينسA9518
الأجار البكتيريفيشر ساينتفيك P0011B
BbsI-HFمختبرات نيو إنجلاند البيولوجيةR3539
BsaI-HF V2مختبرات نيو إنجلاند البيولوجيةR3733
E. coli DH5α الخلايا المختصة
إبندورف  ماسترسايكلر  نكسوس ثيرمال سيكلرزإبندورف6333000014
مطياف الفوتومتر الميكرو-حجم EzDrop 1000بلو-راي بيوتيكBRED-1000
مجموعة GeneJET Plasmid Miniprepثيرمو ساينتفيكK0503
<إم>في & مجموعة أدوات الاستنساخ< خارجية>
مخزن ليغازمختبرات نيو إنجلاند البيولوجيةB0216
NaClفيشر ساينتفيك BP358
نيو برونزويك إنوفا وريج؛   42/42R - هز الحاضنة القابل للتكديسإبندورفM1335-0080
فينوبوث+آلات المغنينPHB-007
سابيمختبرات نيو إنجلاند البيولوجيةR0569
سبيكتينوميسينميرك لايف ساينسS4014
برمجيات المختبر القياسية
ليغاز الحمض النووي T4مختبرات نيو إنجلاند البيولوجيةM0202
ثيرموميكس إم إمب. براون بيوتيك إنترناشونال
التريبتونفيشر ساينتفيك LP0042B
مستخلص الخميرةفيشر ساينتفيك LP0021B

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. James, J. S., Dai, J., Chew, W. L., Cai, Y. The design and engineering of synthetic genomes. Nat Rev Genet. 1, 1-22 (2024).
  2. Weber, E., Engler, C., Gruetzner, R., Werner, S., Marillonnet, S. A modular cloning system for standardized assembly of multigene constructs. PLoS One. 6 (2), e16765(2011).
  3. Engler, C., Kandzia, R., Marillonnet, S. A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability. PLoS One. 3 (11), e3647(2008).
  4. Pingoud, A., Jeltsch, A. Structure and function of type II restriction endonucleases. Nucleic Acids Res. 29 (18), 3705-3727 (2001).
  5. Engler, C., Gruetzner, R., Kandzia, R., Marillonnet, S. Golden Gate shuffling: A one-pot DNA shuffling method based on type IIs restriction enzymes. PLoS One. 4 (5), e5553(2009).
  6. de Vries, S. T., Kley, L., Schindler, D. Use of a Golden Gate plasmid set enabling scarless MoClo-compatible transcription unit assembly. Golden Gate Cloning: Methods Protoc. 2850, 105-132 (2024).
  7. de Vries, S. T., Köbel, T. S., Sanal, A., Schindler, D. In-& Out-Cloning: Plasmid toolboxes for scarless transcription unit and modular Golden Gate acceptor plasmid assembly. Synth Biol. 9 (1), ysae016(2024).
  8. Schindler, D., Milbredt, S., Sperlea, T., Waldminghaus, T. Design and assembly of DNA sequence libraries for chromosomal insertion in bacteria based on a set of modified MoClo vectors. ACS Synth Biol. 5 (12), 1362-1368 (2016).
  9. Zumkeller, C., Schindler, D., Felder, J., Waldminghaus, T. Modular assembly of synthetic secondary chromosomes. Bacterial Chromatin: Methods Protoc. 2819, 157-187 (2024).
  10. Hoffmann, S. A. YeastFab cloning of toxic genes and protein expression optimization in yeast. Golden Gate Cloning: Methods and Protocols. , Springer, New York. (2025).
  11. Sun, G., et al. Cross-evaluation of E. coli's operon structures via a whole-cell model suggests alternative cellular benefits for low- versus high-expressing operons. Cell Syst. 15 (3), 227-245.e7 (2024).
  12. Zhao, J., et al. Multifaceted stoichiometry control of bacterial operons revealed by deep proteome quantification. Front Genet. 10, 1-12 (2019).
  13. Müntjes, K., et al. Establishing polycistronic expression in the model microorganism Ustilago maydis. Front Microbiol. 11, 1-10 (2020).
  14. Behrendt, G., Frohwitter, J., Vlachonikolou, M., Klamt, S., Bettenbrock, K. Zymo-Parts: A Golden Gate modular cloning toolbox for heterologous gene expression in Zymomonas mobilis. ACS Synth Biol. 11 (11), 3855-3864 (2022).
  15. Green, R., Rogers, E. J. Chemical transformation of E. coli. Methods Enzymol. 529, 329-336 (2013).
  16. Köbel, T. S., et al. An easy-to-use plasmid toolset for efficient generation and benchmarking of synthetic small RNAs in bacteria. ACS Synth Biol. 11 (9), 2989-3003 (2022).
  17. Meyer, A. J., Segall-Shapiro, T. H., Glassey, E., Zhang, J., Voigt, C. A. Escherichia coli "Marionette" strains with 12 highly optimized small-molecule sensors. Nat Chem Biol. 15 (2), 196-204 (2019).
  18. Salis, H. M., Mirsky, E. A., Voigt, C. A. Automated design of synthetic ribosome binding sites to control protein expression. Nat Biotechnol. 27 (10), 946-950 (2009).
  19. Chen, Y. J., et al. Characterization of 582 natural and synthetic terminators and quantification of their design constraints. Nat Methods. 10 (7), 659-664 (2013).
  20. Togna, A. P., Shuler, M. L., Wilson, D. B. Effects of plasmid copy number and runaway plasmid replication on overproduction and excretion of beta-lactamase from Escherichia coli. Biotechnol Prog. 9 (1), 31-39 (1993).
  21. Messerschmidt, S. J., et al. Optimization and characterization of the synthetic secondary chromosome synVicII in Escherichia coli. Front Bioeng Biotechnol. 4, 1-9 (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Modular CloningGolden Gate CloningPolycistronic OperonsType IIS EnzymesDNA AssemblyMultigene ConstructsStandardized OverhangsRibosome Binding SiteHeat Shock TransformationAgarose Gel Electrophoresis

Related Articles