Method Article

تحسين عزل وتنقية الخلايا المتوسطة الكبيبية الفئرانية

DOI:

10.3791/68144

⸱

March 7th, 2025

 ,  ,  , 
1Department of Hematology/Institute of Hematology, West China Hospital, Sichuan University, 2Chengdu NO. 7 High School

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

طورت هذه الدراسة بروتوكولا محسنا لعزل الخلايا المتوسطة الفئران (MCs) وزراعة الخلايا خارج الجسم الحي . يمكن تمرير هذه الخلايا عدة مرات وتجميدها وإحيائها وزراعتها دون المساس بنمو الخلايا أو التعبير عن البروتين.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الخلايا المتوسطة (MCs) هي خلايا لحمية تقع في الفضاء الأوسط من الكبيبة ، مع وظائف محورية في التوازن الكبيبي. تم تطوير طرق عزل وتنقية واستزراع MCs الكبيبية وتحسينها منذ الثمانينيات لاستخدامها في البحوث الطبية الحيوية ، لا سيما في مجال أمراض الكلى. الفئران هي النماذج الحيوانية التجريبية الأكثر استخداما في الأبحاث حول أمراض الكلى. في هذه الدراسة ، قمنا بتطوير بروتوكول محسن لعزل MCs الفئران وزراعة الخلايا خارج الجسم الحي . يمكن تمرير هذه الخلايا عدة مرات وتجميدها وإحيائها وزراعتها دون المساس بنمو الخلايا أو التعبير عن البروتين. يقلل هذا النهج الأمثل بشكل كبير من مدة الدراسة للباحثين ويتيح الحفاظ على الخلايا على المدى الطويل. يمكن الوصول بسهولة إلى المعدات اللازمة للإجراءات في مختبر الطب الحيوي الأساسي ، والخطوات الإجرائية واضحة. يتطلب اكتساب الخلايا المستهدفة 2-3 أسابيع فقط ، أي انخفاض لمدة أسبوع واحد على الأقل مقارنة بالطرق الحالية.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكبيبة هي شبكة من الشعيرات الدموية تؤدي المهمة الأساسية المتمثلة في تصفية الدم لتكوين البول1. الخلايا المتوسطة (MCs) مضمنة في المصفوفة المتوسطة ، وتقع بين الشعيرات الدموية الكبيبية ، وهي في وضع فريد للتأثير على ديناميكيات الكبيبات من خلال وظائفها المتنوعة2. تلعب MCs أدوارا حاسمة في الكبيبة ، بما في ذلك التطور الكبيبي ، والدعم الهيكلي للشعيرات الدموية الكبيبية ، والبلعمة ، وإنتاج مصفوفة الغشاء القاعدي الكبيبي3. تعتبر دراسة الخلايا المتوسطة محورية لتعزيز فهمنا لفسيولوجيا الكلى وعلم الأمراض.

من الجدير بالملاحظة أيضا أن مشاركة الخلايا المتوسطة في الحالات المرضية. استجابة لإصابة أو مرض الكبيبات ، مثل اعتلال الكلية السكري أو التهاب كبيبات الكلى ، يمكن للخلايا المتوسطة أن تتكاثر وتفرز مكونات مصفوفة زائدة خارج الخلية ، مما يؤدي إلى تصلب الكبيبات وضعف وظائف الكلى4،5. لذلك ، فإن فهم وظائف الخلايا المتوسطة وآلياتها التنظيمية أمر ضروري لتطوير استراتيجيات علاجية لأمراض الكلى.

تمكن الخلايا المتوسطة الفئران الباحثين من نمذجة واستكشاف العمليات الجزيئية والخلوية التي تنطوي عليها حالات مثل اعتلال الكليةIgA 6 ، واعتلال الكلية السكري7 ، وتصلب الكبيبات القطعي البؤري (FSGS) 8،9. نظرا لدورها في التليف الكلوي والالتهابات ، كثيرا ما تستخدم MCs الكبيبية الفئران في الدراسات السريرية لتقييم فعالية المركبات العلاجية9،10. بالإضافة إلى ذلك ، تعد الخلايا المتوسطة للفئران أداة مهمة لدراسة تأثيرات مسارات الإشارات المختلفة على وظائف الكلى ، بما في ذلك مسار RhoA / ROCK11 ومسار عامل النمو المحول بيتا (TGF-β)12. تساعد هذه الدراسات في توضيح كيف تساهم جزيئات الإشارات هذه في تطور أمراض الكلى. سواء تم استخدامها لنمذجة الأمراض أو التطوير العلاجي أو أبحاث نقل الإشارات ، تستمر MCs في الفئران في العمل كمورد حاسم لتعزيز فهمنا لصحة الكلى وأمراضها.

ماكاي وآخرون أنشأ طريقة لاكتساب خطوط الخلايا خارج الجسم الحي من الخلايا الظهارية الكبيبية والمتوسطة والبطانية من الفئران المعدلة وراثيا في عام 198813. طور ويلسون وستيوارت طريقة لعزل وتنقية MCs الأولية من أنسجة الكلى للمريض ، والتي تتضمن ثلاث جولات من الغربلة والغسيل المكثف بالوسائط14. اقترح Menè و Stoppacciaro أيضا طريقة لعزل MCs الأولية عن أنسجة الكلى للمريض أو الفئران. تتضمن هذه التقنية جولتين من الغربلة ، ودفعتين بإبرة ، وهضم الكولاجيناز. يتم طلاء الخلايا التي تم الحصول عليها من 4-8 كلى فئران على صفيحة من ستة آبار ، على الرغم من أن العائد منخفضنسبيا 15. تتطلب هذه الطرق تشريح الكلى إلى قطع صغيرة قبل المعالجة. بالإضافة إلى ذلك ، تستغرق هذه الأساليب حوالي 3-4 أسابيع لإنتاج MCs منقاة.

الفئران هي النماذج الحيوانية التجريبية الأكثر استخداما في الأبحاث حول أمراض الكلى. ومع ذلك ، لا تزال هناك طريقة منهجية لعزل MCs في الفئران. في هذه الدراسة ، قمنا بتطوير بروتوكول محسن لعزل MCs الفئران وزراعة الخلايا خارج الجسم الحي . يمكن استخدام هذه الطريقة عند استخدام MCs الأولية في كلى الفئران للبحث التجريبي. بالمقارنة مع الطرق السابقة ، فإن هذا النهج يلغي الحاجة إلى قطع الأنسجة والغربلة قبل الهضم. بدلا من ذلك ، يتم طحن كلية الفأر بأكملها باستخدام مطحنة خلوية وهضمها مباشرة باستخدام الكولاجيناز. ثم يتم غربلة محلول الهضم مرتين ، مع جمع جميع الخلايا على المنخل الثاني وإعادة تعليقها. تسمح هذه الطريقة لكليتين من الفأر بإنتاج خلايا كافية لزرع أطباق إلى ثلاثة أطباق استزراع 100 مم في غضون 10 أيام. يتم الحصول على MCs المنقاة لاحقا من خلال الاستزراع والتنقية باستخدام وسائط متخصصة تحتوي على D-valine. يمكن تمرير هذه الخلايا عدة مرات وتجميدها وإحيائها وزراعتها دون المساس بنمو الخلايا أو التعبير عن البروتين. المعدات المطلوبة لهذه الإجراءات متاحة بسهولة للمختبرات الطبية الحيوية الأساسية ، وتستغرق العملية برمتها 2-3 أسابيع فقط للحصول على الخلايا المستهدفة. هذه الطريقة مناسبة للدراسات التي تشمل MCs الفئران للتحقيق في الأمراض أو الآليات المتعلقة بالكلى ، لأنها فعالة وموفرة للوقت.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

امتثلت التجارب على لإرشادات ARRIVE ، وتم إجراء جميع الإجراءات الحيوانية وفقا للتشريعات الوطنية وتوجيه المفوضية الأوروبية (2010/63 / EU). تم إيواء الفئران وصيانتها في ظروف خالية من مسببات الأمراض ، وفقا لمتطلبات لجان رعاية واستخدامه في مستشفى غرب الصين بجامعة سيتشوان. تمت الموافقة على جميع الدراسات التجريبية التي أجريت على من قبل لجان رعاية واستخدامه في مستشفى غرب الصين بجامعة سيتشوان. تم استخدام ذكور الفئران C57BL / 6JGpt البالغة من العمر ثمانية أسابيع لعزل الخلايا المتوسطة في هذا الفحص. تفاصيل الكواشف والمعدات المستخدمة في هذه الدراسة مدرجة في جدول المواد. يوضح الشكل 1 إجراءات عزل وتنقية الخلايا المتوسطة الكبيبية في الفئران.

1. تحضير الكواشف لعزل MCs في الفئران

ملاحظة: تأكد من أن جميع الكواشف والمعدات معقمة.

  1. النوع الأول من الكولاجيناز (750 وحدة / مل): قم بوزن المسحوق وإذابته قبل وقت قصير من الاستخدام في RPMI 1640.
  2. وسائط زراعة الخلايا المتوسطة 1: امزج RPMI 1640 مع 2 ملي مولار من الجلوتامين ، و 17٪ FBS ، والمضادات الحيوية (100 وحدة / مل البنسلين بالإضافة إلى 10,000 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين) ، و 0.1 وحدة / مل الأنسولين.
  3. وسائط زراعة الخلايا المتوسطة 2: امزج RPMI 1640 (D-valine) مع 2 ملي مولار من الجلوتامين ، و 10٪ FBS ، والمضادات الحيوية (100 وحدة / مل من البنسلين بالإضافة إلى 10,000 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين) ، و ITS-G (الأنسولين ، الترانسفيرين ، محلول السيلينيوم 100x) ، و 0.1 U / مل الأنسولين. قم بتخزين وسائط زراعة الخلايا المتوسطة في درجة حرارة 4 درجات مئوية واستخدمها في غضون شهر واحد بعد التحضير.
  4. وسائط حفظ الخلية بالتبريد: قم بإعداد خليط من وسط RPMI 1640 والمصل و DMSO بنسبة 7: 2: 1.

2. عزل MCs الفئران

  1. التضحية الإنسانية بالفئران عن طريق اختناق ثاني أكسيد الكربون2 متبوعا بخلع عنق الرحم (باتباع البروتوكولات المعتمدة مؤسسيا). اغمر الجثث في دورق يحتوي على 75٪ كحول للتعقيم ، ثم انقل إلى سطح عمل معقم.
  2. قم بإزالة كليتي الفأر بشكل معقم باستخدام المقص والملاقط ، وضعها في طبق بتري ، واشطفها باستخدام EBSS (محلول إيرل المتوازن للملح) ، ثم قم بإزالة النسيج الضام وكبسولة الكلى بعناية باستخدام الملقط.
  3. قم بتقطيع الكلى إلى نصفين عموديا ، وأضف 3-4 مل من محلول الكولاجيناز الأول ، وطحنها بمدقة خلية بلاستيكية.
  4. ماصة جميع الأنسجة والمحلول من طبق بتري إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل. اشطف طبق بتري ب 1-2 مل من محلول الكولاجيناز I لضمان نقل جميع الأنسجة. ضع المحلول في الخلاط عند 37 درجة مئوية ، مع رجه عند 120 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة. ثم أضف حجما متساويا من محلول التوقف (وسائط الثقافة 1).
  5. ماصة المحلول من أنبوب الطرد المركزي سعة 15 مل ، وقم بتمريره عبر مصفاة خلية 100 ميكرومتر ، وجمع المرشح في أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل.
  6. مرر السائل من الخطوة 2.5 عبر مصفاة خلية 40 ميكرومتر ، مع الاحتفاظ فقط بالخلايا الموجودة على مصفاة الخلية 40 ميكرومتر. اشطف المصفاة بشكل متكرر باستخدام وسائط الثقافة 1 لضمان جمع أكبر عدد ممكن من الخلايا على المصفاة. انقل الخلايا المجمعة من المصفاة إلى أنبوب طرد مركزي جديد سعة 50 مل.
  7. قم بالطرد المركزي للتعليق عند 600 × جم لمدة 5 دقائق (في درجة حرارة الغرفة) ، ثم أعد تعليق الخلايا في طبق زراعة الخلايا وفقا لكثافة الخلية. بشكل عام ، قم بإعادة تعليق الخلايا من كليتين في طبقين أو ثلاثة أطباق مزرعة 100 مم (10 مل من وسائط الثقافة 1/100 مم). ضع الأطباق في حاضنة خلية 37 درجة مئوية مع 95٪ هواء / 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2.
  8. افحص مورفولوجيا الخلية والتصاقها تحت المجهر (40×) في اليوم التالي. في حالة وجود خلايا ميتة عائمة في وسط الاستزراع ، استخدم ماصة لإزالة الوسائط من قاع طبق المزرعة ، مع الحرص على عدم إزعاج الخلايا المرفقة.
  9. أضف 1-2 مل PBS على طول الحافة الداخلية لطبق الثقافة لشطف الخلايا. استخدم ماصة لإزالة كل PBS من قاع طبق الاستزراع، وأخيرا أضف 10 مل من وسائط الثقافة 1 على طول الحافة الداخلية لطبق الاستزراع.

3. تنقية MCs الفئران

  1. بعد يوم واحد من الانفصال، قم بإزالة الخلايا غير الملتصقة عن طريق غسل وسائط المزرعة برفق واستبدالها بوسائط مزرعة جديدة 1 كما هو موضح في الخطوة 2.8. راقب خلايا الكبيبة تحت مجهر تباين الطور (40×).
    ملاحظة: تمثل الأشكال الكروية الساطعة الكبيبة ، بينما تظهر الخلايا المحيطة سمات تشبه الحصى ، وهي سمة من سمات الخلايا الظهارية (الشكل 2 أ).
  2. راقب مورفولوجيا الخلية بعد 1-3 أيام (الشكل 2B-C). ستظهر خلايا على شكل نجمي وعلى شكل مغزل حول الخلايا المرصوفة بالحصى ، كما هو موضح في الشكل 2 د.
  3. عندما تصل الخلايا إلى 80٪ من التقاء (عادة في غضون 7-10 أيام) ، اغسل الخلايا مرتين باستخدام PBS معقم ، ثم قم بتربسين الخلايا بمحلول التربسين 0.25٪ (2 مل من محلول التربسين 0.25٪ لكل طبق 100 مم).
  4. قد تستغرق عملية التربسين الخلوية الأولية حوالي 20 دقيقة. عند إضافة التربسين ، ضع الطبق في حاضنة 37 درجة مئوية. راقب العملية في الوقت الفعلي تحت مجهر تباين الطور (40×) لتقييم التربسين في الخلايا.
  5. قم بإنهاء عملية التربسين عن طريق إضافة حجم متساو من الوسائط 2 عندما تظهر معظم الخلايا مورفولوجيا مستديرا وتنفصل عن سطح الطبق.
  6. الطرد المركزي للخلايا عند 600 × جم لمدة 5 دقائق (في درجة حرارة الغرفة) ، ثم أعد تعليقها في الوسائط 2. بشكل عام ، قم بإعادة تعليق الخلايا من طبق واحد مقاس 100 مم في طبقين للزراعة مقاس 100 مم (10 مل من الوسائط المزروعة 2/100 مم).
  7. قم بتغيير الوسائط الثقافية 2 في اليوم التالي. لاحظ العديد من الخلايا العالقة وشظايا الخلايا تحت المجهر (40×) ، حيث يمكن ل MCs فقط البقاء على قيد الحياة والتكاثر في وسائط D-valine16. قم بتغيير الوسائط كل 1-2 أيام لإزالة الخلايا الميتة. الخلايا الملتصقة في الثقافة هي MCs (الشكل 3A-D). تحديد معدل نمو MCs المعزولة (الشكل 3E).
  8. بمجرد أن تصل الخلايا إلى 80٪ من التقاء ، قم بالتربسين ومرورها. عادة ما تستغرق MCs حوالي 5-10 دقائق للتربسين.

4. الحفاظ على MCs الفئران على المدى الطويل

ملاحظة: نظرا لأن الخلايا الأولية قد تتمايز وتتحور بمرور الوقت والممرات المتعددة ، فقم بتجميد وتخزين MCs بعد تنقية الخلايا للحفاظ عليها على المدى الطويل.

  1. قم بإزالة المادة الطافية بعناية على طول الحافة السفلية للطبق باستخدام ماصة ، واغسل الخلايا مرتين باستخدام PBS معقم ، ثم قم بالتربسين بمحلول التربسين 0.25٪ (2 مل من محلول التربسين 0.25٪ لكل طبق 100 مم). اتبع خطوات التربسينية كما هو موضح في الخطوات 3.3-3.8.
  2. بعد التربسين ، أضف حجما متساويا من الوسائط 2 لإنهاء العملية ، وانقل السائل بالكامل إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل. قم بالطرد المركزي للخلايا عند 600 × جم لمدة 5 دقائق (في درجة حرارة الغرفة) ، وتخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق الخلايا في 1 مل PBS لحساب الخلايا.
  3. استخدم عداد الخلايا التلقائي لحساب الخلايا. خذ 20 ميكرولتر من 1 مل من محلول الخلية المعلق وأضفه إلى لوحة عد الخلايا المخصصة لتحديد العدد الإجمالي للخلايا. بناء على عدد الخلايا ، أعد تعليقها في وسائط الحفظ بالتبريد الخلوية (1 مل من وسائط الحفظ بالتبريد لكل 106 خلايا ).
  4. انقل محلول الخلية إلى أنابيب الحفظ بالتبريد (1 مل من وسائط الحفظ بالتبريد لكل 2 مل أنبوب الحفظ بالتبريد) وقم بإجراء التجميد البطيء إلى -80 درجة مئوية قبل نقله إلى النيتروجين السائل للحفظ.
    ملاحظة: قم بتعليق الخلايا وبذرها في أطباق زراعة الخلايا لتضخيمها حسب الحاجة. يجب استخدام الخلايا بين الممرات 3 و 8 بعد أن يتم تمييزهابالكامل 17.

5. تحديد MCs الفئران

ملاحظة: بعد مرور الخلايا مرتين ، حدد MCs الفئران باستخدام التقنيات التالية.

  1. لطخة غربية من MCs الفئران
    ملاحظة: الكواشف اللازمة لهذا الإجراء موصوفة في الجدول التكميلي 1.
    1. قم بتربسين الخلايا باتباع نفس الخطوات كما في 3.3-3.8 والخطوة 4.1.
    2. بعد جمع الخلايا ، قم بتحلل الخلايا لاستخراج البروتينات وقياس تركيز البروتين.
    3. خذ كمية مناسبة من العينة (عادة 20 نانوغرام) ، وأضف عازلة التحميل ، وقم بتغيير طبيعتها عند 100 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
    4. قم بحل البروتين (20 نانوغرام) باستخدام جل SDS-PAGE بنسبة 10٪ أو جل SDS-PAGE بنسبة 7.5٪ ، ثم انقله إلى غشاء السليلوز بجهد ثابت.
    5. قم بسد الغشاء بحليب خالي من الدسم بنسبة 5٪ ، ثم احتضن الجسم المضاد الأساسي عند 4 درجات مئوية على شاكر طوال الليل.
    6. احتضان الجسم المضاد الثانوي في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة بعد الغسيل باستخدام TBST (Tris Buffered Saline with Tween 20) ثلاث مرات.
    7. كشف الإشارات باستخدام نظام التصوير.
      ملاحظة: تضمنت الأجسام المضادة الأولية المستخدمة في هذه الدراسة الفأر المضاد ل αSMA (1: 500) ، والأرانب المضادة للفيمنتين (1: 2000) ، والأرانب المضادة للفيبرونيكتين (1: 2000) ، والفأر المضاد ل GAPDH (1: 50000). تضمنت الأجسام المضادة الثانوية المستخدمة في هذه الدراسة الماعز المترافق بالبيروكسيداز IgG (H + L) (1: 5000) والماعز المترافق بالبيروكسيداز المضاد للفأر IgG (H + L) (1: 5000).
  2. صبغة التألق المناعي ل MCs الفئران
    ملاحظة: الكواشف اللازمة لهذا الإجراء موصوفة في الجدول التكميلي 2.
    1. قم بتربسين الخلايا باتباع نفس الخطوات كما في الخطوات 3.3-3.8 والخطوة 4.1.
    2. أعد تعليق الخلايا وعدادها. خذ 1 × 105 خلايا وأضفها إلى طبق زراعة الخلية السفلي الزجاجي مقاس 15 مم (1 مل ، وسائط زراعة 2 لكل قاع زجاجي 15 مم).
    3. قم بإصلاح MCs بنسبة 4٪ بارافورمالدهيد لمدة 15 دقيقة (1 مل من 4٪ بارافورمالدهيد لكل قاع زجاجي 15 مم) ، ثم اغسلها ثلاث مرات باستخدام PBS.
    4. عالج MCs باستخدام 0.1٪ Triton X-100 لمدة 10 دقائق لاختراق أغشية الخلايا.
    5. بعد ثلاث غسلات أخرى باستخدام PBS ، قم بسد الخلايا في درجة حرارة الغرفة باستخدام محلول BSA PBS بنسبة 3٪ لمدة 30 دقيقة.
    6. اغسل الخلايا واحتضانها بالأجسام المضادة الأولية المضادة للفأر αSMA والأجسام المضادة للأرانب عند 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها.
    7. احتضن لمدة ساعة واحدة مع الحمار الثانوي المضاد للفأر IgG المقترن باللون الأحمر Alexa 594 والحمار المضاد للأرانب IgG المقترن ب FITC الأخضر في درجة حرارة الغرفة.
    8. استخدم DAPI للتلطيخ النووي لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    9. أضف وسائط الفلورو وقم بتغطيتها بشريحة زجاجية. تحليل الخلايا باستخدام مجهر متحد البؤر.
      ملاحظة: تضمنت الأجسام المضادة الأولية المستخدمة في هذه الدراسة الفأر المضاد ل αSMA (1: 200) والأرانب المضادة للفيمنتين (1: 200). تضمنت الأجسام المضادة الثانوية المستخدمة في هذه الدراسة الحمار IgG المضاد للفأر المترافق مع Alexa 594 الأحمر (1: 400) ، والحمار المضاد للأرانب IgG المترافق مع FITC الأخضر (1: 400) ، و DAPI (1: 1000).
  3. قياس التدفق الخلوي ل MCs الفئران
    1. قم بتربسين الخلايا باتباع نفس الخطوات كما في الخطوات 3.3-3.8 والخطوة 4.1.
    2. أعد تعليق الخلايا وعدادها. خذ 5 × 105 خلايا واغسلها مرة واحدة باستخدام 3 مل PBS.
    3. أعد تعليق الخلايا ب 100 ميكرولتر من PBS في أنبوب التدفق ، ثم أضف 1-2 ميكرولتر من الجسم المضاد PDGFRB المضاد للفأر (CD140b).
    4. احتضان الخلايا على الجليد لمدة 30 دقيقة في الظلام ، ثم قم بتحليلها عن طريق قياس التدفق الخلوي.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

طورت هذه الدراسة بروتوكولا محسنا لعزل MCs في الفئران وزراعة الخلايا خارج الجسم الحي . على حد علمنا ، لا توجد طريقة قياسية للتحقق من صحة MCs الأولية خارج الجسم الحي. وفقا للمنشورات السابقة ، تتميز MCs بالتعبير عن αSMA و Vimentin و Fibronectin3،14،15. تم استخدام تحليل اللطخة الغربية للكشف عن مستويات التعبير عن MCs. أظهرت MCs المعزولة في هذه الدراسة تعبيرا عاليا بشكل ملحوظ عن αSMA و Fibronectin و Vimentin (

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تنتشر الأمراض المرتبطة بالكلى بشكل كبير ، وتستخدم الفئران على نطاق واسع كنموذج حيواني أساسي لدراسة هذه الحالات نظرا لتشابهها الجيني مع البشر وتوافر نماذج مرضية راسخة. تلعب الخلايا المتوسطة دورا مهما في الحفاظ على الهيكل الطبيعي ووظيفة الكبيبة من خلال توفير الدعم الهيكلي ، وتنظيم الترشيح الكبيبي ، والمشاركة في الاستجابات المناعية. في حين أن هناك تقنيات تجريبية مختلفة لعزل الخلايا المتوسطة عن البشر والجرذان والدجاج14،15،...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون عدم وجود تضارب في المصالح ، مالية أو غير ذلك.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من خلال منح ل Y.Z. من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رقم 82470196 ورقم 82070219 ورقم 81870157) ، وصندوق بدء أعضاء هيئة التدريس بجامعة سيتشوان.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
100 وميكرو ؛ مصفاة خلية mBiosharpBS-100-CS
100 مم طبق بتريسورفا230301
15 مل أنبوب الطرد المركزيSorfa411000
15 مم طبق ثقافة الخلية السفليالزجاجي Sorfa201200
180 كيلو دالتون بالإضافة إلى علامة البروتين المصبغةVazymeMP201-01
2 ملي مولار L-glutamineBasalMediaS210JV
4٪ بارافورمالدهايدبيوشاربBL539A
40 & مايكرو ؛ مصفاة خلية mBiosharpBS-40-XBS
50 مل أنبوب الطرد المركزيSorfa41000
60 مم طبق بتريسورفا230201
75٪ كحولنولز64-17-5
96 لوحة ثقافة خلايا الآبار ، معالج TCServicebioCCP-96H
المضادات الحيوية (10 & mu ؛ جم / مل سيفترياكسون زائد 100 مو ؛ جم / مل جنتاميسين)NCMC100C5
BCA (حمض البيسينجونينيك) مجموعة فحص البروتينCWBIOCW0014S
مجموعة عد الخلايا -8OriscienceCB101
مجهر متحد البؤرFV-3000أوليمبوس
DMSOسيجماD2650
DMSOسيجماD2650
إيرلز محلول ملح متوازن (1x EBSS)  Beyotime  C0213
مصل الأبقار الجنينية (FBS)محلل الخلايا الفلورية ExcellFSP500
Mira FL & nbsp ؛Countstar
Fluoromount mediaSouthern Biotech0100-01
الأنسولين ، ترانسفيرين ، محلول السيلينيوم 100x (ITS -G)Gibco41400045
مجهر مضان مقلوبأوليمبوسIX83
عازلة التحللAdilabPP1101
طقم تحضير صفحة بخطوة واحدة (10٪)OrisciencePB102
طقم تحضير PAGE بخطوة واحدة (7.5٪)OrisciencePB101
PE مضاد للفأر CD140b الأجسام المضادةBiolegend323605
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)ServicebioG4202
الخلايا البلاستيكية PestleBiofil  CC-4090
مثبط البروتينازRoche4693159001
PVDF غشاءVazymeE802-01
الأنسولين البشري المؤتلفSolarbio11061-68-0
معهد روزويل بارك التذكاري (RPMI) 1640 MediumCorning10-040-CV
SDS-PAGE عازلة تحميل العينة (5x)ServicebioG2013
مخصص خصيصا معهد روزويل بارك التذكاري (RPMI) 1640 متوسط (D-valine بدلا من L-valine)ProcellWH3923U222
TBS (Tris Buffered Saline)  سيرفيس بيوG0001-2L
تريتون X-100بيوشاربBS084
تريبسين-EDTA (0.25٪)جيبكو25200072
توين 20بيوشاربBS100
النوع الأول كولاجينازسولاربيو  سي بي 140
كوكتيل

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pollak, M. R., Quaggin, S. E., Hoenig, M. P., Dworkin, L. D. The glomerulus: The sphere of influence. Clin J Am Soc Nephrol. 9 (8), 1461-1469 (2014).
  2. Mené, P., Simonson, M. S., Dunn, M. J. Physiology of the mesangial cell. Physiol Rev. 69 (4), 1347-1424 (1989).
  3. Avraham, S., Korin, B., Chung, J. J., Oxburgh, L., Shaw, A. S. The mesangial cell - the glomerular stromal cell. Nat Rev Nephrol. 17 (12), 855-864 (2021).
  4. Chadban, S. J., Atkins, R. C. Glomerulonephritis. Lancet. 365 (9473), 1797-1806 (2005).
  5. Qian, Y., Feldman, E., Pennathur, S., Kretzler, M., Brosius, F. C. 3rd From fibrosis to sclerosis: Mechanisms of glomerulosclerosis in diabetic nephropathy. Diabetes. 57 (6), 1439-1445 (2008).
  6. Zhu, Y., et al. Iga Gut microbiome regulates the production of hypoglycosilated iga1 via the tlr4 signaling pathway. Nephrol Dial Transplant. 39 (10), 1624-1641 (2024).
  7. Kong, L. -L., et al. Advances in murine models of diabetic nephropathy. J Diabetes Res. 2013, 797548(2013).
  8. Schiffer, M., et al. Inhibitory smads and tgf-beta signaling in glomerular cells. J Am Soc Nephrol. 13 (11), 2657-2666 (2002).
  9. Gyarmati, G., et al. Sparsentan improves glomerular hemodynamics, cell functions, and tissue repair in a mouse model of FSGS. JCI Insight. 9 (19), e177775(2024).
  10. Chafin, C. B., Regna, N. L., Hammond, S. E., Reilly, C. M. Cellular and urinary microRNA alterations in NZB/W mice with hydroxychloroquine or prednisone treatment. Int Immunopharmacol. 17 (3), 894-906 (2013).
  11. Lucero, C. M., et al. Tnf-α plus il-1β induces opposite regulation of cx43 hemichannels and gap junctions in mesangial cells through a rhoa/rock-dependent pathway. Int J Mol Sci. 23 (17), (2022).
  12. Schnaper, H. W., Hayashida, T., Hubchak, S. C., Poncelet, A. C. Tgf-beta signal transduction and mesangial cell fibrogenesis. Am J Physiol Renal Physiol. 284 (2), F243-F252 (2003).
  13. Mackay, K., et al. Glomerular epithelial, mesangial, and endothelial cell lines from transgenic mice. Kidney Int. 33 (3), 677-684 (1988).
  14. Wilson, H. M., Stewart, K. N. Glomerular epithelial and mesangial cell culture and characterization. Methods Mol Med. 107, 269-282 (2005).
  15. Menè, P., Stoppacciaro, A. Isolation and propagation of glomerular mesangial cells. Methods Mol Biol. 466, 3-17 (2009).
  16. Gilbert, S. F., Migeon, B. R. D-valine as a selective agent for normal human and rodent epithelial cells in culture. Cell. 5 (1), 11-17 (1975).
  17. Kreisberg, J. I., Venkatachalam, M., Troyer, D. Contractile properties of cultured glomerular mesangial cells. Am J Physiol. 249 (4 Pt 2), F457-F463 (1985).
  18. Adam, M., Potter, A. S., Potter, S. S. Psychrophilic proteases dramatically reduce single-cell rna-seq artifacts: A molecular atlas of kidney development. Development. 144 (19), 3625-3632 (2017).
  19. Sadovnic, M. J., Brand-Elnaggar, J., Bolton, W. K. Isolation and characterization of chicken mesangial cells. Nephron. 58 (1), 75-84 (1991).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Mesangial CellsGlomerular Mesangial CellsMurine Mesangial CellsCell IsolationCell PurificationPrimary Cell CultureCollagenase DigestionImmunofluorescent StainingAlpha SMA ExpressionKidney Research

Related Articles