في هذه الدراسة ، نصف بروتوكولا خطوة بخطوة ونؤكد على التفاصيل الأساسية لتحديد الخصائص المورفولوجية للميتوكوندريا في الخلايا الحية ، بما في ذلك تحضير العينات والحصول على الصور وتحليل البيانات. تستخدم هذه الطريقة بشكل شائع لفحص مورفولوجيا الميتوكوندريا لدراسة الحالات المختلفة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تحديد مورفولوجيا الميتوكوندريا في الخلايا الحية باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يساهم التوازن الديناميكي لاندماج الميتوكوندريا وانشطارها بشكل مباشر في توازن الميتوكوندريا ، مما يؤثر على العديد من الوظائف الخلوية بالإضافة إلى توازن الأدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP). لذلك ، يعد تقييم مورفولوجيا الميتوكوندريا في ظل ظروف الإجهاد أمرا ضروريا للبحث الميكانيكي. تصف هذه الدراسة بروتوكولا مفصلا لتحليل مورفولوجيا الميتوكوندريا ، بما في ذلك تحضير محلول MitoTracker ، وتلوين الميتوكوندريا ، وتحسين معلمات التصوير ، والكشف عن السمات المورفولوجية. تستخدم MitoTrackers بشكل شائع وأصباغ خاصة بالميتوكوندريا وفعالة من حيث التكلفة. ومع ذلك ، قد تحدث بعض التغييرات في مورفولوجيا الميتوكوندريا بسبب المعالجة غير المناسبة ، والتي يمكن أن تكون غير مدركة وتفشل في عكس الحالة الحقيقية للميتوكوندريا. لذلك ، من الضروري فهم كيفية تحليل التغييرات في مورفولوجيا الميتوكوندريا باستخدام MitoTrackers. استخدم البروتوكول خلايا SH-SY5Y المحفزة باستخدام يوديد 1-ميثيل -4-فينيل بيريدينيوم (MPP +) لتوضيح بروتوكول التحليل المورفولوجي للميتوكوندريا. بالمقارنة مع خلايا التحكم ، أظهرت الخلايا المحفزة MPP + ميتوكوندريا أصغر وأكثر تجزئة ، مع معلمات مورفولوجية تشير إلى انخفاض بصمة الميتوكوندريا. تشير هذه النتائج إلى أن تلطيخ MitoTracker هو طريقة فعالة ومجدية للتحليل المورفولوجي للميتوكوندريا والتي يمكن تطبيقها (مع تعديلات طفيفة) لدراسة الظروف المختلفة.
المقدمة
يتم الحفاظ على مورفولوجيا الميتوكوندريا من خلال التوازن الديناميكي لاندماج الميتوكوندريا والانشطار ، وبالتالي ، يؤثر على توازن الطاقة والعديد من الوظائف الخلوية الأخرى ، مما يؤدي إلى أمراض مختلفة مثل الأمراض التنكسية العصبية والسرطان والالتهابات1،2،3،4،5. لمراقبة مورفولوجيا الميتوكوندريا ، تم تطوير العديد من البقع الانتقائية للميتوكوندريا ، بما في ذلك المجسات والأجسام المضادة ، للاستخدام مع المجهر متحد البؤر. تعمل بعض المجسات الخاصة بالميتوكوندريا ، مثل رباعي ميثيل روزامين ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. التحضير
- قم بإذابة MPP + مع ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) لعمل محلول مخزون 1 ملي مولار وتخزينه عند -30 درجة مئوية في الظلام (انظر جدول المواد).
- قم بإذابة 50 ميكروغرام من MitoTracker (MitoTracker Red CMXRos) في 94 ميكرولتر من DMSO لعمل محلول مخزون 1 ملليمتر. قم بتقسيم محلول المخزون في عدة أنابيب أجهزة الطرد المركزي الدقيقة وتخزينها محميا من الضوء عند -30 درجة مئوية حتى الاستخدام الإضافي.
- احتضان خلايا SH-SY5Y في قوارير باستخدام وسط النسر المعدل / خليط المغذيات F-12 من Dulbecco المكمل بمصل الأبقار الجنينية بنسبة 10٪ (v / v) في بيئة رطبة مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون<....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
يحدد هذا البروتوكول إجراء مفصلا خطوة بخطوة للتحليل المورفولوجي للميتوكوندريا من خلال ثلاث وحدات تحسين مترابطة: توحيد بروتوكولات تحضير العينات ، والتحسين المنهجي للمعلمات البصرية للتصوير المجهري متحد البؤر ، وإرشادات معالجة الصور الحسابية. يعد بروتوكول تحضير العينة الأمثل أمرا بالغ الأهمية للحصول على بيانات تصوير موثوقة للميتوكوندريا. أظهر التقييم المنهجي لتركيزات MitoTracker Red CMXRos خصائص مضان تعتمد على التركيز. نتج عن المعالجة 25 نانومتر إشارات مضان أضعف بشكل ملحوظ مقارنة بالتركيزات الأعلى (الشكل.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
تضع الدراسة الحالية منهجية منهجية لتحليل مورفولوجيا الميتوكوندريا في الخلايا الحية في ظل ظروف الإجهاد. تتضمن الخطوات الإجرائية الحاسمة في تصوير الميتوكوندريا ما يلي: تركيز مناسب من مجسات MitoTracker ، وغسل الأطباق متحد البؤر جيدا قبل الحصول على الصورة ، وتقليل الاضطرابات في الحالة الخلوية ، وتحديد معلمات التصوير المناسبة.
يمكن أن يؤدي استخدام تركيزات أعلى من MitoTracker إلى السمية الخلوية ، مما يجعل الميتوكوندريا حساسة لطاقة الليزر ويحتمل أن يتسبب في تلطيخ الص.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.
شكر وتقدير
تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (81974501).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 1-ميثيل -4-فينيل بيريدينيوم يوديد (MPP+< / sup>) | ماكلين | M875357 | تستخدم للحث على الإجهاد التأكسدي |
| طبق متحد البؤر | عش | 801001 | تستخدم لزراعة الخلايا |
| المجهر متحد البؤر | نيكون | ج2 | تستخدم لالتقاط الصور |
| خلطة النسر المتوسطة / المغذية المعدلة من دولبيكو F-12 | ثيرموفيشر العلمية | 11320033 | تستخدم لتوفير التغذية للخلايا |
| ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) | بيوتايم | معيار ST038 | تستخدم لإذابة مسبار mitotracker |
| مصل الأبقار الجنينية (FBS) | ثيرموفيشر العلمية | A3161001C | تستخدم لتوفير التغذية للخلايا |
| إيمج جي | المعاهد الوطنية للصحة | إيمج جي | تستخدم لتحليل مورفولوجيا الميتوكوندريا |
| MitoTracker أحمر CMXRos | ثيرموفيشر العلمية | م 7512 | تستخدم لتصور الميتوكوندريا |
| محلول ملحي عازلة للفوسفات (PBS) | ثيرموفيشر العلمية | C10010500BT | تستخدم لغسل الخلايا على أطباق متحد البؤر |
| خلية SH-SY5Y | ATCC | CRL-2266 | تستخدم لتوضيح سير عمل تحليل مورفولوجيا الميتوكوندريا |
| محول المرحلة TI-SH-U | نيكون | MEC59110 | تستخدم لتأمين العينات |
المراجع
- von der Malsburg, A., et al. Structural mechanism of mitochondrial membrane remodelling by human OPA1. Nature. 620 (7976), 1101-1108 (2023).
- Giacomello, M., Pyakurel, A., Glytsou, C., Scorrano, L. The cell biology of mitochondrial membrane dynamics. Nat Rev Mol Cell Biol
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
