مقالة منهجية

تحديد مورفولوجيا الميتوكوندريا في الخلايا الحية باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر

DOI:

10.3791/68167

⸱

يوليو 3, 2025

 ,  ,  ,  , 
1NMPA Key Laboratory for Research and Evaluation of Drug Metabolism & Guangdong Provincial Key Laboratory of New Drug Screening, School of Pharmaceutical Sciences, Southern Medical University, 2Central Laboratory, Southern Medical University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذه الدراسة ، نصف بروتوكولا خطوة بخطوة ونؤكد على التفاصيل الأساسية لتحديد الخصائص المورفولوجية للميتوكوندريا في الخلايا الحية ، بما في ذلك تحضير العينات والحصول على الصور وتحليل البيانات. تستخدم هذه الطريقة بشكل شائع لفحص مورفولوجيا الميتوكوندريا لدراسة الحالات المختلفة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يساهم التوازن الديناميكي لاندماج الميتوكوندريا وانشطارها بشكل مباشر في توازن الميتوكوندريا ، مما يؤثر على العديد من الوظائف الخلوية بالإضافة إلى توازن الأدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP). لذلك ، يعد تقييم مورفولوجيا الميتوكوندريا في ظل ظروف الإجهاد أمرا ضروريا للبحث الميكانيكي. تصف هذه الدراسة بروتوكولا مفصلا لتحليل مورفولوجيا الميتوكوندريا ، بما في ذلك تحضير محلول MitoTracker ، وتلوين الميتوكوندريا ، وتحسين معلمات التصوير ، والكشف عن السمات المورفولوجية. تستخدم MitoTrackers بشكل شائع وأصباغ خاصة بالميتوكوندريا وفعالة من حيث التكلفة. ومع ذلك ، قد تحدث بعض التغييرات في مورفولوجيا الميتوكوندريا بسبب المعالجة غير المناسبة ، والتي يمكن أن تكون غير مدركة وتفشل في عكس الحالة الحقيقية للميتوكوندريا. لذلك ، من الضروري فهم كيفية تحليل التغييرات في مورفولوجيا الميتوكوندريا باستخدام MitoTrackers. استخدم البروتوكول خلايا SH-SY5Y المحفزة باستخدام يوديد 1-ميثيل -4-فينيل بيريدينيوم (MPP +) لتوضيح بروتوكول التحليل المورفولوجي للميتوكوندريا. بالمقارنة مع خلايا التحكم ، أظهرت الخلايا المحفزة MPP + ميتوكوندريا أصغر وأكثر تجزئة ، مع معلمات مورفولوجية تشير إلى انخفاض بصمة الميتوكوندريا. تشير هذه النتائج إلى أن تلطيخ MitoTracker هو طريقة فعالة ومجدية للتحليل المورفولوجي للميتوكوندريا والتي يمكن تطبيقها (مع تعديلات طفيفة) لدراسة الظروف المختلفة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم الحفاظ على مورفولوجيا الميتوكوندريا من خلال التوازن الديناميكي لاندماج الميتوكوندريا والانشطار ، وبالتالي ، يؤثر على توازن الطاقة والعديد من الوظائف الخلوية الأخرى ، مما يؤدي إلى أمراض مختلفة مثل الأمراض التنكسية العصبية والسرطان والالتهابات1،2،3،4،5. لمراقبة مورفولوجيا الميتوكوندريا ، تم تطوير العديد من البقع الانتقائية للميتوكوندريا ، بما في ذلك المجسات والأجسام المضادة ، للاستخدام مع المجهر متحد البؤر. تعمل بعض المجسات الخاصة بالميتوكوندريا ، مثل رباعي ميثيل روزامين والرودامين 123 ، على أساس إمكانات غشاء الميتوكوندريا (MMP) ، مما يحد من قابليتها للتطبيق في دراسات ظروف اضطراب MMP6،7. على العكس من ذلك ، يوفر تلطيخ الأجسام المضادة تقييما مورفولوجيا مستقلا عن MMP لفحص مورفولوجيا الميتوكوندريا في الخلايا الثابتة. على الرغم من أن البقعة المناسبة تسمح بتقييم مورفولوجيا الميتوكوندريا في الخلايا الثابتة ، إلا أن فحص مورفولوجيا الميتوكوندريا في الخلايا الحية التي تضعفها بعض المحفزات لا يزال يمثل تحديا. يقدم MitoTracker ، وهو مسبار فلوري كاتيوني وخاص بالميتوكوندريا ، حلا لهذا التحدي ، مما يسمح بتلوين كل من الخلايا الحية والثابتة. تم استخدام هذا المسبار على نطاق واسع لفحص مورفولوجيا الميتوكوندريا في دراسات الأمراض المختلفة8،9،10،11. ومع ذلك ، فقد أبلغت بعض الدراسات عن مشكلات مثل إشارة الخلفية العالية والربط غير المحدد ، حتى عندما يتم استخدام المسبار بما يتفق بدقة مع المبادئ التوجيهية التي تقدمها الشركة المصنعة. تسلط هذه الملاحظات الضوء على أهمية الفهم الشامل لإعداد العينات والحصول على الصور من أجل التحليل الناجح لمورفولوجيا الميتوكوندريا.

لتسهيل تحليل مورفولوجيا الميتوكوندريا ، تم تطوير برامج وخوارزميات معالجة الصورالمختلفة 12،13،14،15،16. في هذه الدراسة ، استخدمنا أداة الماكرو تحليل شبكة الميتوكوندريا (MiNA) في ImageJ لتحليل مورفولوجيا الميتوكوندريا13. تحدد هذه الأداة بشكل فعال السمات المورفولوجية لشبكات الميتوكوندريا وتوصيفها من خلال حساب تسع معلمات وصفية ، بما في ذلك عدد الأفراد (الهياكل التي لا تحتوي على أي فروع) ، وعدد الشبكات (عدد الكائنات التي تحتوي على بكسل تقاطع واحد على الأقل) ، ومتوسط الطول (متوسط طول جميع القضبان والفروع) ، والطول المتوسط (متوسط الطول لجميع القضبان والفروع) ، والانحراف المعياري للطول (الانحراف المعياري للأطوال الفردية) ، متوسط حجم الشبكة (متوسط عدد الفروع لكل شبكة) ، ومتوسط حجم الشبكة (القيمة المتوسطة لعدد الفروع لكل شبكة) ، والانحراف المعياري لحجم الشبكة (الانحراف المعياري لعدد الفروع لكل شبكة) ، وبصمة الميتوكوندريا (إجمالي مساحة الإشارة بعد فصل الخلفية). في هذا البروتوكول ، تم اختيار بصمة الميتوكوندريا كمعامل تمثيلي.

الهدف من هذه الدراسة هو توفير بروتوكول خطوة بخطوة للتحليل المورفولوجي للميتوكوندريا ، مع التركيز على التفاصيل الرئيسية. استخدمنا خلايا SH-SY5Y المستحثة MPP + لإثبات هذا البروتوكول. MPP + يثبط المركب الأول من سلسلة الجهاز التنفسي للميتوكوندريا في الخلايا العصبية الدوبامينية ، مما يؤدي إلى تلف مورفولوجيا الميتوكوندريا ووظيفتها8،17. يتيح بروتوكول التحليل المورفولوجي الموصوف في هذه الدراسة الحصول على صور عالية الدقة وتقييم المعلمات ذات الصلة لتحديد السمات المورفولوجية لشبكات الميتوكوندريا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. التحضير

  1. قم بإذابة MPP + مع ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) لعمل محلول مخزون 1 ملي مولار وتخزينه عند -30 درجة مئوية في الظلام (انظر جدول المواد).
  2. قم بإذابة 50 ميكروغرام من MitoTracker (MitoTracker Red CMXRos) في 94 ميكرولتر من DMSO لعمل محلول مخزون 1 ملليمتر. قم بتقسيم محلول المخزون في عدة أنابيب أجهزة الطرد المركزي الدقيقة وتخزينها محميا من الضوء عند -30 درجة مئوية حتى الاستخدام الإضافي.
  3. احتضان خلايا SH-SY5Y في قوارير باستخدام وسط النسر المعدل / خليط المغذيات F-12 من Dulbecco المكمل بمصل الأبقار الجنينية بنسبة 10٪ (v / v) في بيئة رطبة مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 و 95٪ هواء عند 37 درجة مئوية. للمرور ، افصل الخلايا بمحلول التربسين بنسبة 0.05٪ لمدة 1 دقيقة وجهاز الطرد المركزي عند 100 × جم لمدة 3 دقائق.

تحفيز 2. MPP+

  1. قم بزرع خلايا SH-SY5Y على أطباق متحدة البؤر ذات قاع زجاجي وحفظها في وسط DMEM / F12 مكمل بنسبة 1٪ (v / v) FBS بين عشية وضحاها.
  2. استبدل وسط المزرعة ، ثم احتضن الخلايا مع أو بدون MPP + لمدة 24 ساعة.

3. تلطيخ MitoTracker

  1. قم بتسخين DMEM / F12 مسبقا ، ثم قم بتخفيف محلول مخزون MitoTracker باستخدام DMEM / F12 للحصول على حل عمل 50 نانومتر. حافظ على المحلول محميا من الضوء أثناء الإجراء بأكمله.
  2. قم بإزالة وسط زراعة الخلايا واغسل الأطباق متحدة البؤر مرتين باستخدام DMEM / F12 الطازج.
  3. احتضان الخلايا في كل طبق بسعة 1 مل من محلول عمل MitoTracker لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية في الظلام.
  4. قم بإزالة حل عمل MitoTracker واغسله 2x باستخدام DMEM / F12.
  5. أضف 1 مل من DMEM / F12 إلى كل طبق واحتضنه في حاضنة الخلية قبل التصوير.

4. معلمات التصوير للمجهر متحد البؤر

  1. موازنة المجهر مسبقا للعمليات اللاحقة. تحت لوحة الاستحواذ ، اضبط المعلمات المتعلقة بمسار الضوء عن طريق ضبط الأطوال الموجية للإثارة والانبعاث.
  2. اضبط المعلمات على النحو التالي: حجم الثقب ، 1.2 وحدة فلكية ؛ حجم مسح البكسل ، 1,024 × 1,024 ؛ وقت سكون البكسل ، 2.4 ميكرو ثانية (متوسط 2x)  (حافظ على اتساقه لأغراض المعايرة).

5. تحسين معلمات التصوير

تنبيه: تجنب تعرض العين لكل من الإشعاع المباشر والمبعثر من ليزر مرئي و / أو غير مرئي.

  1. استخدم ضوء الهالوجين للتركيز على الخلايا باستخدام عدسة موضوعية 60x (1.4 NA) لتجنب السمية الضوئية.
  2. اضبط طاقة الليزر والجهد العالي (HV) إلى أقل بقليل من مستوى التشبع ، واضبط عامل التكبير / التصغير على 3 ثم التقط الصور.
  3. حرك منطقة الاهتمام وركز على الخلايا لالتقاط الصور دون تغيير أي إعدادات.

6. تحليل البيانات

ملاحظة: تم تحليل البيانات باستخدام ImageJ المثبت مسبقا مع المكون الإضافيMiNA 13. للحصول على قياسات دقيقة ذات صلة ، يجب أن تلتقط الصور الميتوكوندريا التي تم حلها بشكل مستقل مع تلطيخ نظيف ومشرق.

  1. لتحسين جودة الصورة قبل التحويل الثنائي والهيكل العظمي، افتح الصورة وقم بإجراء المعالجة الأولية. استخدم أداة عائد الاستثمار لتحديد مساحة خلية واحدة. تطبيق العملية | الفلاتر | وظيفة Unsharp Mask لتحسين الوضوح ، واستخدام العملية | ميزة تحسين التباين لتقليل التضخيم المفرط للضوضاء. لإزالة ضوضاء الملح والفلفل على وجه التحديد ، استخدم ملف العملية | الفلاتر | متوسط الوظيفة (انظر الشكل التكميلي S1).
  2. لإنشاء نموذج مورفولوجي مبسط لحساب المعلمات الوصفية ، قم بتحويل الصورة إلى ثنائية عبر العتبة (انقر فوق عملية | ثنائي | اصنع ثنائيا) ، ثم قم بهيكل الصورة الثنائية باستخدام وظيفة الهيكل العظمي (انقر فوق عملية | ثنائي | الهيكل العظمي) (انظر الشكل التكميلي S2).
  3. قم بتجميع جميع وحدات البكسل داخل الهيكل العظمي باستخدام التحليل | هيكل عظمي | تحليل وظيفة الهيكل العظمي (2D / 3D). قم بتبسيط التحليل باستخدام أداة MiNA لحساب تسعة معلمات وصفية في الصورة الهيكلية (انظر الشكل التكميلي S3).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يحدد هذا البروتوكول إجراء مفصلا خطوة بخطوة للتحليل المورفولوجي للميتوكوندريا من خلال ثلاث وحدات تحسين مترابطة: توحيد بروتوكولات تحضير العينات ، والتحسين المنهجي للمعلمات البصرية للتصوير المجهري متحد البؤر ، وإرشادات معالجة الصور الحسابية. يعد بروتوكول تحضير العينة الأمثل أمرا بالغ الأهمية للحصول على بيانات تصوير موثوقة للميتوكوندريا. أظهر التقييم المنهجي لتركيزات MitoTracker Red CMXRos خصائص مضان تعتمد على التركيز. نتج عن المعالجة 25 نانومتر إشارات مضان أضعف بشكل ملحوظ مقارنة بالتركيزات الأعلى (الشكل...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تضع الدراسة الحالية منهجية منهجية لتحليل مورفولوجيا الميتوكوندريا في الخلايا الحية في ظل ظروف الإجهاد. تتضمن الخطوات الإجرائية الحاسمة في تصوير الميتوكوندريا ما يلي: تركيز مناسب من مجسات MitoTracker ، وغسل الأطباق متحد البؤر جيدا قبل الحصول على الصورة ، وتقليل الاضطرابات في الحالة الخلوية ، وتحديد معلمات التصوير المناسبة.

يمكن أن يؤدي استخدام تركيزات أعلى من MitoTracker إلى السمية الخلوية ، مما يجعل الميتوكوندريا حساسة لطاقة الليزر ويحتمل أن يتسبب في تلطيخ الص...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (81974501).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
1-ميثيل -4-فينيل بيريدينيوم يوديد (MPP+< / sup>)ماكلينM875357تستخدم للحث على الإجهاد التأكسدي
طبق متحد البؤرعش801001تستخدم لزراعة الخلايا
المجهر متحد البؤرنيكونج2تستخدم لالتقاط الصور
خلطة النسر المتوسطة / المغذية المعدلة من دولبيكو F-12ثيرموفيشر العلمية11320033تستخدم لتوفير التغذية للخلايا
ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)بيوتايممعيار ST038تستخدم لإذابة مسبار mitotracker
مصل الأبقار الجنينية (FBS)ثيرموفيشر العلميةA3161001Cتستخدم لتوفير التغذية للخلايا
إيمج جيالمعاهد الوطنية للصحةإيمج جيتستخدم لتحليل مورفولوجيا الميتوكوندريا
MitoTracker أحمر CMXRosثيرموفيشر العلميةم 7512تستخدم لتصور الميتوكوندريا
محلول ملحي عازلة للفوسفات (PBS)ثيرموفيشر العلميةC10010500BTتستخدم لغسل الخلايا على أطباق متحد البؤر
خلية SH-SY5YATCCCRL-2266تستخدم لتوضيح سير عمل تحليل مورفولوجيا الميتوكوندريا
محول المرحلة TI-SH-UنيكونMEC59110تستخدم لتأمين العينات

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. von der Malsburg, A., et al. Structural mechanism of mitochondrial membrane remodelling by human OPA1. Nature. 620 (7976), 1101-1108 (2023).
  2. Giacomello, M., Pyakurel, A., Glytsou, C., Scorrano, L. The cell biology of mitochondrial membrane dynamics. Nat Rev Mol Cell Biol. 21 (4), 204-224 (2020).
  3. Kalia, R., et al. Structural basis of mitochondrial receptor binding and constriction by DRP1. Nature. 558 (7710), 401-405 (2018).
  4. Cao, Y. L., et al. MFN1 structures reveal nucleotide-triggered dimerization critical for mitochondrial fusion. Nature. 542 (7641), 372-376 (2017).
  5. Chan, D. C. Mitochondrial dynamics and its involvement in disease. Annu Rev Pathol. 15, 235-259 (2020).
  6. Solaini, G., Sgarbi, G., Lenaz, G., Baracca, A. Evaluating mitochondrial membrane potential in cells. Biosci Rep. 27 (1-3), 11-21 (2007).
  7. Gan, Z., Audi, S. H., Bongard, R. D., Gauthier, K. M., Merker, M. P. Quantifying mitochondrial and plasma membrane potentials in intact pulmonary arterial endothelial cells based on extracellular disposition of rhodamine dyes. Am J Physiol-Lung Cell Mol Physiol. 300 (5), L762-L772 (2011).
  8. Zhong, J., et al. Roflupram exerts neuroprotection via activation of CREB/PGC-1α signalling in experimental models of Parkinson's disease. Br J Pharmacol. 177 (10), 2333-2350 (2020).
  9. Xu, B. T., et al. Mitofusin-2 mediates cannabidiol-induced neuroprotection against cerebral ischemia in rats. Acta Pharmacol Sin. 44 (3), 499-512 (2023).
  10. Hu, T., et al. PRDM16 exerts critical role in myocardial metabolism and energetics in type 2 diabetes induced cardiomyopathy. Metabolism. 146, 155658(2023).
  11. Reichardt, C., et al. DNA-binding protein-A promotes kidney ischemia/reperfusion injury and participates in mitochondrial function. Kidney Int. 106 (2), 241-257 (2024).
  12. Ahmad, T., et al. Computational classification of mitochondrial shapes reflects stress and redox state. Cell Death Dis. 4 (1), e461(2013).
  13. Valente, A. J., Maddalena, L. A., Robb, E. L., Moradi, F., Stuart, J. A. A simple imagej macro tool for analyzing mitochondrial network morphology in mammalian cell culture. Acta Histochem. 119 (3), 315-326 (2017).
  14. Hemel, I., Engelen, B., Luber, N., Gerards, M. A hitchhiker's guide to mitochondrial quantification. Mitochondrion. 59, 216-224 (2021).
  15. Vowinckel, J., Hartl, J., Butler, R., Ralser, M. Mitoloc: A method for the simultaneous quantification of mitochondrial network morphology and membrane potential in single cells. Mitochondrion. 24, 77-86 (2015).
  16. Dagda, R. K., et al. Loss of PINK1 function promotes mitophagy through effects on oxidative stress and mitochondrial fission. J Biol Chem. 284 (20), 13843-13855 (2009).
  17. Przedborski, S., Tieu, K., Perier, C., Vila, M. MPTP as a mitochondrial neurotoxic model of Parkinson's disease. J Bioenerg Biomembr. 36 (4), 375-379 (2004).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

MitoTracker StainingSH SY5Y CellsMitochondrial FusionMitochondrial FissionFluorescence ImagingSkeletonization AnalysisMPP StimulationImage Segmentation

مقالات ذات صلة