مقالة منهجية

تحضير الميتوكوندريا من الخلايا الدبقية الصغيرة لتحليل الجليكان

DOI:

10.3791/68179

⸱

مايو 30, 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1School of Health Professions, University of Alabama at Birmingham, 2Department of Chemistry, North Carolina State University, 3Department of Pathology, Division of Molecular and Cellular Pathology, University of Alabama at Birmingham, 4Department of Biomedical Engineering, University of Alabama at Birmingham

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تطوير بروتوكول لتحضير الميتوكوندريا المنقاة من الخلايا الدبقية الصغيرة ، وعزل بروتينات الميتوكوندريا لإطلاق N-glycan ، والكشف السريع عن الجليكانات الميتوكوندريا تحت الخلوية باستخدام تأين الرش الكهربائي للامتصاص بالليزر بمساعدة مصفوفة الأشعة تحت الحمراء إلى جانب قياس الطيف الكتلي الدقيق لمحلل الكتلة عالي الدقة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعد فهم أنماط الارتباط بالجليكوزيل لبروتينات الميتوكوندريا في الخلايا الدبقية الصغيرة أمرا بالغ الأهمية لتحديد دورها في الأمراض التنكسية العصبية. نقدم هنا منهجية جديدة وعالية الإنتاجية لتحليل السكر السكري لبروتينات الميتوكوندريا المعزولة من الخلايا الدبقية الصغيرة المستزرعة. تتضمن هذه الطريقة عزل الميتوكوندريا عن المزارع الدبقية الصغيرة ، وتقييم جودة عينات الميتوكوندريا ، متبوعا باستخراج البروتين الأمثل لزيادة اكتشاف الجليكان ، وتأين الرش الكهربائي بالامتصاص بالليزر بمساعدة مصفوفة الأشعة تحت الحمراء (IR-MALDESI) قياس الطيف الكتلي عالي الدقة (HRAM) لتوفير ملامح مفصلة لغليكوزيلات الميتوكوندريا.

يؤكد هذا البروتوكول على أهمية الحفاظ على سلامة الميتوكوندريا أثناء العزل ويستخدم رقابة صارمة على الجودة لضمان التكاثر ، بما في ذلك قياس نقاء الميتوكوندريا بعد الاستخراج. يسمح هذا النهج بالتنميط الشامل لتغيرات الارتباط بالجليكوزيل في الميتوكوندريا الدبقية الصغيرة في ظل ظروف تجريبية مختلفة في المختبر ، مما يوفر نظرة ثاقبة لتغيرات الميتوكوندريا المرتبطة بالأمراض التنكسية العصبية. يمكن تكييف هذا النهج مع العلاجات الأخرى في المختبر أو أنواع الخلايا المستنبتة الأخرى أو الخلايا الأولية. من خلال هذا النهج الموحد ، نهدف إلى تعزيز فهم جليكان الميتوكوندريا الدبقية الصغيرة ، مما يساهم في المجال الأوسع للأبحاث التنكسية العصبية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الخلايا الدبقية الصغيرة هي الخلايا المناعية الفطرية المقيمة المهيمنة في الدماغ وتمثل 10-15٪ من الخلايا في الدماغ البالغ1،2. يستخدمون ذخيرة المستقبلات الخاصة بهم لمراقبة البيئة المكروية للدماغ ديناميكيا وتنظيم وظيفة الدماغ الطبيعية للحفاظ على توازن الدماغ3. الخلايا الدبقية الصغيرة حساسة للغاية للتغيرات في بيئتها المكروية وتخضع لتغييرات في مورفولوجيا الخلية ، والنمط المناعي ، والوظيفة مع الحالات المرضية أو المحفزات المختلفة. تتأثر حالات تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة بمتطلبات الطاقة الخلوية المطلوبة لوظيفتها ، مثل البلعمة أو إنتاج السيتوكين أو إصلاح الأنسجة. لذلك ، يلعب استقلاب الطاقة الخلوية دورا مهما في تنظيم التغيرات في وظيفة الخلايا الدبقيةالصغيرة 4. يؤدي عدم تنظيم الخلايا الدبقية الصغيرة إلى الإفراط في إطلاق السيتوكينات المؤيدة للالتهابات (على سبيل المثال ، IL-1β و TNF-α) وأنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) ، مما يهيئ الدماغ للالتهاب العصبي5،6. يضع خلل تنظيم الخلايا الدبقية الصغيرة المزمن والبيئة الالتهابية العصبية الناتجة عن ذلك أساسا للتنكس العصبي7.

يمثل الدماغ 2٪ فقط من وزن الجسم ولكن 20٪ من إجمالي استهلاك الطاقة في الجسم. الميتوكوندريا هي المصدر الأساسي للطاقة في خلايا الدماغ وتعمل كلاعبين رئيسيين في التسبب في كل من اضطرابات الدماغ الحادة والمزمنة8. أثبتت الدراسات السابقة وجود علاقة قوية بين تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة والخلل الأيضي في الشيخوخة9 والاضطرابات المرتبطة بالعمر مثل مرض الزهايمر10،11 ، مما يسلط الضوء على الدور المحوري للميتوكوندريا في الشيخوخة الخلوية والتنكس العصبي. يؤدي ضعف وظيفة الميتوكوندريا إلى انخفاض إنتاج الطاقة ، وارتفاع الإجهاد التأكسدي ، وزيادة الالتهاب العصبي أثناء الشيخوخة والأمراض المرتبطة بالعمر.

في حين أن الأبحاث المكثفة قد أوضحت دور الميتوكوندريا في استقلاب الطاقة والشيخوخة واضطرابات الدماغ ، فإن دور التعديلات الشائعة بعد الترجمة ، مثل الارتباط بالجليكوزيل ، في بيولوجيا الميتوكوندريا ووظيفتها لا يزال غير مستكشف بشكل كاف. الارتباط بالجليكوزيل ، وهو الإضافة الأنزيمية لشقوق السكر التي تسمى الجليكان إلى البروتينات بواسطة إنزيمات الجليكوزيل ، هو التعديل الأكثر شيوعا بعد الترجمة في معظم خلايا الدماغ ، بما في ذلك الخلايا الدبقية الصغيرة. تعدل الخلايا الدبقية الصغيرة المنشطة وظيفتها المناعية تحت المحفزات الالتهابية عن طريق تنظيم تعبير الجليكان داخل الخلايا أو سطحالخلية 12. يتم أيضا تنظيم الاستجابات المؤيدة والمضادة للالتهابات التي تظهرها الخلايا الدبقية الصغيرة بعد التحفيز بواسطة الجليكان13. تحتوي بروتينات الميتوكوندريا أيضا على تعديلات الجليكان هذه ، والتي تنظم وظيفتها وتوطينها. ومع ذلك ، فإن التحليل التفصيلي لأنماط الارتباط بالجليكوزيل في الميتوكوندريا الخاصة بالخلية في الخلايا الدبقية الصغيرة غير موجود بسبب التحديات التقنية في التحقيق في الارتباط بالجليكوزيل تحت الخلوي. على الرغم من الأدوار المميزة جيدا للارتباط بالجليكوزيل في تعديل النمط الظاهري للخلايا الدبقية الدقيقة ، فإن دور الجليكان في تعديل وظيفة الميتوكوندريا وبالتالي النمط المناعي الخلوي في الخلايا الدبقية الصغيرة لا يزال غير مفهوم جيدا.

ركزت الدراسات المحدودة التي تبحث في ارتباط بروتين الميتوكوندريا بشكل أساسي على تحديد أنماط الارتباط بالجليكوزيل القائم على الليكتين. الليكتين عبارة عن بروتينات مرتبطة بالجليكان تربط شقوق الجليكان الجزيئيةالحيوية 14،15 ، والتي تفتقر إلى الخصوصية والقدرة على تقديم معلومات مفصلة حول تكوين الجليكان. توفر طرائق القياس الطيفي الكتلي تحديدا مفصلا لتركيبات الجليكان للتغلب على التحديات التحليلية التي يقدمها تحليل الليكتين. إحدى هذه الطرائق ، تأين الرش الكهربائي بالامتصاص بالليزر بمساعدة مصفوفة الأشعة تحت الحمراء (IR-MALDESI) ، تستخدم استراتيجية تأين هجينة ، باستخدام ليزر منتصف الأشعة تحت الحمراء لإثارة الماء الموجود في العينات البيولوجية16 لامتصاص الأنواع المحايدة وإخضاعها لعمود الرش الكهربائي المتعامد ، متبوعا بالتحليل باستخدام مطياف كتلة أوربيتراب عالي الدقة. تم إثبات IR-MALDESI سابقا للتحليل المباشر لمستقلبات الأنسجة17 ، مع مزايا مميزة للتحليل السريع18 ، وطريقة التأين الناعم ، وإمكانية التنبؤ بمحتوى حمض السياليك للجليكان المرتبط ب N بناء على أنماط التوزيع النظيري لمقاربات الجليكان المكلورة19. ومع ذلك ، لم يتم إثبات تكييف هذه المنصة للتحليل المباشر للجليكانات دون الخلوية.

هنا ، نبلغ عن بروتوكول عالي الإنتاجية لعزل الميتوكوندريا من الخلايا الدبقية الصغيرة ، وعزل N-glycans في الميتوكوندريا ، واكتشاف N-glycan للميتوكوندريا وتحليله باستخدام قياس الطيف الكتلي IR-MALDESI. سيكون هذا البروتوكول أساسيا في الكشف عن رؤى جديدة حول دور الارتباط بالجليكوزيل في وظيفة الميتوكوندريا ، مما قد يحدد أهدافا علاجية جديدة للاضطرابات الالتهابية العصبية والتنكسية العصبية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. BV2 ثقافة خط الخلايا الدبقية الصغيرة

  1. الحفاظ على خلايا BV-2 (الخلايا الدبقية الصغيرة المشتقة من الفئران C57BL / 6) في وسائط الجلوكوز المنخفضة DMEM المكملة بمصل الأبقار الجنينية بنسبة 10٪ (FBS) ، و 1٪ بنسليوم ستربتومايسين (PenStrep) ، و 1٪ من الأحماض الأمينية غير الأساسية (NEAA).
  2. قم بزراعة الخلايا في قوارير T-175 واسمح لها بالوصول إلى 70-80٪ من التقاء.
  3. قم بتقسيم الخلايا عن طريق الحضانة مع إنزيمات تفكك الخلية لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2 ، متبوعا بتعطيل الإنزيمات ذات الحجم المتساوي من وسائط الخلية ، والطرد المركزي للخلايا لمدة 5 دقائق عند 500 × جم في درجة حرارة الغرفة (RT).
    ملاحظة: إنزيمات تفكك الخلايا المستخدمة هنا ألطف على خلايا BV2 من التربسين ويمكن استخدامها لحماية تعبير مستضد سطح الخلية.
  4. قم بشفط الوسائط ، وأعد تعليق حبيبات الخلية في 1 مل من وسائط النمو ، واحسب الخلايا باستخدام تريبان الأزرق (انظر جدول المواد).
    ملاحظة: استخدمنا عداد خلايا آلي لهذه الخطوة لحساب الخلايا.
  5. لتنفيذ عزل الميتوكوندريا ، تابع إذا كانت حبيبات الخلية تحتوي على 2 × 107 (20 مليون خلية / بيليه).

2. عزل الميتوكوندريا عن الخلايا الدبقية الصغيرة

ملاحظة: اعمل بسرعة ، مع الحفاظ على كل شيء على الجليد طوال العملية. تتكون مجموعة عزل الميتوكوندريا المستخدمة لعزل الميتوكوندريا من ثلاثة مكونات: الكواشف A (المخزن المؤقت لتحلل الخلية) ، والكاشف B (مخزن مؤقت للتثبيت) ، والكاشف C (مخزن غسيل الميتوكوندريا). أضف مثبطات الإنزيم البروتيني إلى الكاشف A والكاشف C مباشرة قبل الاستخدام.

  1. بيليه 2 × 107 خلايا عن طريق الطرد المركزي للخلايا المحصودة في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 2.0 مل عند 500 × جم لمدة 5 دقائق. استنشق بعناية وتخلص من المادة الطافية.
  2. أضف 800 ميكرولتر من كاشف عزل الميتوكوندريا A (المخزن المؤقت لتحلل الخلية) ، ودوامة بسرعة متوسطة لمدة 5 ثوان ، واحتضن الأنبوب على الجليد لمدة دقيقتين بالضبط.
    ملاحظة: لا تتجاوز الحضانة لمدة 2 دقيقة.
  3. أضف 10 ميكرولتر من كاشف عزل الميتوكوندريا B (عازلة التثبيت) ، والدوامة بأقصى سرعة لمدة 5 ثوان ، واحتضن الأنبوب على الجليد لمدة 5 دقائق ، مع الدوامة بأقصى سرعة كل دقيقة.
  4. أضف 800 ميكرولتر من كاشف عزل الميتوكوندريا C (المخزن المؤقت لغسيل الميتوكوندريا) ، واقلب الأنبوب عدة مرات للخلط ، وقم بالطرد المركزي للأنبوب عند 700 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: لا تدوام.
  5. انقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد سعة 2.0 مل وقم بالدوران عند 3,000 × جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
  6. انقل المادة الطافية (أجزاء العصارة الخلوية) إلى أنبوب جديد. تحتوي الحبيبات على الميتوكوندريا المعزولة.
  7. أضف 500 ميكرولتر من كاشف عزل الميتوكوندريا C إلى الحبيبات ، وجهاز الطرد المركزي عند 12,000 × جم لمدة 5 دقائق.
  8. استخدم الحبيبات لقياس كمية البروتين ومعالجته أو قم بتخزين الحبيبات عند -80 درجة مئوية حتى الاستخدام الآخر.

3. تقدير البروتين باستخدام مقايسة microBCA

ملاحظة: يمكن إجراء تقدير البروتين لهذا البروتوكول باستخدام كواشف ومقايسات مختلفة. يمكن إجراء القياس الكمي لبروتينات العصارة الخلوية أو الميتوكوندريا عن طريق التطبيع مقابل إجمالي تركيز البروتين المستخدم في الفحص.

  1. إعداد معايير ألبومين مصل الأبقار (BSA) بين 0 ميكروغرام / مل و 200 ميكروغرام / مل (0 ميكروغرام / مل ، 0.5 ميكروغرام / مل ، 1 ميكروغرام / مل ، 2.5 ميكروغرام / مل ، 5 ميكروغرام / مل ، 10 ميكروغرام / مل ، 20 ميكروغرام / مل ، 40 ميكروغرام / مل ، 200 ميكروغرام / مل) والفراغات مع محلول التحلل فقط.
  2. أضف 150 ميكرولتر من كل معيار إلى الصفيحة المسطحة القاع المكونة من 96 بئرا والتي تحتوي على العينات.
  3. امزج 25 جزءا من كاشف BCA الصغير MA (محلول حمض البيسينشونيني (BCA)) و 24 جزءا من الكاشف MB (محلول كبريتات النحاس) مع جزء واحد من الكاشف MC (المخزن المؤقت للتثبيت) (25: 24: 1 ، الكواشف MA: MB: MC) لإنشاء كاشف عامل. أضف 150 ميكرولتر من كاشف BCA المختلط إلى كل عينة ومعيار.
  4. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين.
  5. استخدم قارئ الألواح لقياس الامتصاص عند 562 نانومتر وتحديد تركيز البروتين بالمنحنى القياسي. اطرح الامتصاص القياسي الفارغ من قياس الامتصاص لجميع المعايير الفردية الأخرى وتكرار العينة غير المعروفة للحصول على تركيزات بروتين العينة.

4. مراقبة جودة تحضير الميتوكوندريا (اللطخة الغربية)

  1. أعد تعليق حبيبات الميتوكوندريا في المخزن المؤقت لمقايسة الترسيب المناعي الإشعاعي (RIPA) لإجراء القياس الكمي للبروتين. حدد تركيز البروتين لكل عينة باستخدام مقايسة BCA الدقيقة.
  2. قم بتغيير طبيعة العينات في المخزن المؤقت للعينة عند 94 درجة مئويةلمدة 5 دقائق.
  3. قم بتحميل كميات متساوية (20 ميكروجرام) من بروتين الميتوكوندريا إلى المواد الهلامية مسبقة الصب (انظر جدول المواد) ، جنبا إلى جنب مع علامة الوزن الجزيئي.
  4. قم بتشغيل الجل لمدة 50 دقيقة عند 100 فولت.
    ملاحظة: قد يختلف وقت التشغيل ، لذا تأكد من إيقاف الجل عندما تصل البروتينات إلى نهاية الجل المشار إليه بالصبغة الموجودة في المخزن المؤقت للعينة.
  5. انقل البروتينات من الجل إلى غشاء فلوريد البولي فينيلدين (PVDF) باستخدام بروتوكول النقل الجاف في نظام نقل اللطخة الغربية لمدة 7 دقائق عند 20 فولت.
  6. أخرج الغشاء وقم بحظر محلول الحجب (الجدول 1) لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
  7. أضف التخفيفات المناسبة للجسم المضاد الأولي إلى الغشاء في سد المخزن المؤقت بين عشية وضحاها عند 4 درجاتمئوية (COXIV = 1: 3,000 ، GAPDH = 1: 3,000).
    ملاحظة: يمكن اختبار عدم وجود تلوث للشبكة الإندوبلازمية النووية (ER) في تحضير الميتوكوندريا باستخدام علامات إضافية مثل lamin (علامة نووية) و ERp57 (علامة ER) في البقع الغربية.
  8. اغسل الغشاء لمدة 3 × 15 دقيقة باستخدام مخزن الغسيل (الجدول 1).
  9. احتضان الغشاء بالتخفيف المناسب للجسم المضاد الثانوي المترافق ب HRP في حجب المخزن المؤقت في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة
  10. اغسل الغشاء لمدة 3 × 15 دقيقة باستخدام مخزن الغسيل.
  11. للتطوير ، استخدم مجموعة الركيزة المضيئة الكيميائية.
  12. امسح الغشاء باستخدام جهاز تصوير هلام وغشاء.

5. عزل بروتين الميتوكوندريا لاستخراج N -glycan من الخلايا الدبقية الصغيرة

  1. أعد تعليق الميتوكوندريا المعزولة في 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت لعزل البروتين (الجدول 1) واتركه على الجليد لمدة 20 دقيقة.
  2. استنشق واستخرج ثلاث مرات واتركه لمدة 20 دقيقة على الثلج (دوامة قبل الاستخدام). إذا لم يتم إذابة حبيبات الميتوكوندريا تماما ، أضف 50 ميكرولتر أخرى من عازلة العزل وتجمع في نفس الأنبوب.
  3. جهاز طرد مركزي عند 13,000 × جم لمدة 10 دقائق.
  4. استرجع المادة الطافية ، وقم بتجميدها عند -80 درجة مئويةلمدة لا تقل عن 1 ساعة ، وجففها قدر الإمكان في مكثف فراغ.
  5. أعد التعليق قبل عزل الجليكان باستخدام المخزن المؤقت لهضم PNGase (الجدول 1) ل IR-MALDESI.

6. تحضير الميتوكوندريا N - جليكان ل IR-MALDESI

  1. قم بتحميل 25-250 ميكروغرام من البروتين (في الحجم الأقصى 250 ميكرولتر) من بروتينات الميتوكوندريا المعزولة على مرشح قطع الوزن الجزيئي 10 كيلو دالتون (MWCO).
  2. قلل عينات البروتين لفضح شقوق الجليكان عن طريق إضافة 2 ميكرولتر من 1 M dithiothreitol (DTT) إلى كل عينة في الفلتر.
  3. خفف العينة ب 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت لهضم PNGase والدوامة برفق لتجنب إزعاج المرشح.
  4. قم بتغيير طبيعة بروتينات الميتوكوندريا عن طريق احتضان العينة عند 56 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  5. استخدم 50 ميكرولتر من 1 M يودوأسيتاميد لألكل الميتوكوندريا لإعطاء تركيز نهائي ~ 200 ملي مولار ، واحتضانه عند 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة.
  6. لمزيد من التركيز على طرق الميتوكوندريا المشوهة ، قم بالطرد المركزي للعينات عند 14,000 × جم لمدة 40 دقيقة. تجاهل التدفق.
  7. اغسل العينة ب 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت لهضم PNGase.
  8. ركز البروتين السكري على الفلتر عند 14,000 × جم لمدة 20 دقيقة وتخلص من التدفق. كرر خطوة الغسيل والتركيز 2x ، ليصبح المجموع 3x ، مما ينتج عنه تركيز في الحجم الميت للمرشح (~ 5 ميكرولتر). تجاهل كل التدفق.
  9. تخلص من قارورة التجميع بمجرد اكتمال الغسيل. استخدم قارورة مجموعة جديدة لجميع المواد المزيئة والغسول المستقبلية.
  10. لشق الجليكان من الأنماط السكرية للميتوكوندريا المشوهة ، انقلها إلى قارورة تجميع جديدة وأضف 2 ميكرولتر من PNGase الخالي من الجلسرين (75,000 وحدة / مل) إلى الفلتر. أضف 98 ميكرولتر من المخزن المؤقت لهضم PNGase، ليصل الحجم الإجمالي إلى 100 ميكرولتر واخلطه عن طريق سحب العينات برفق لأعلى ولأسفل على الفلتر.
  11. احتضان العينات عند 37 درجة مئوية لمدة 18 ساعة لشق جميع N-glycans من بروتينات الميتوكوندريا إنزيميا.
  12. قم بإزالة N-glycans الميتوكوندريا المنبعثة عن طريق الطرد المركزي للعينة عند 14,000 × جم لمدة 20 دقيقة عند 20 درجة مئوية.
  13. اغسل جليكان الميتوكوندريا بإضافة 100 ميكرولتر من محلول هضم PNGase إلى الفلتر وجهاز الطرد المركزي عند 14,000 × جم لمدة 20 دقيقة عند 20 درجة مئوية. اجمع الغسيل الذي يحتوي على أي N-glycans متبقية في نفس قارورة التجميع مثل مادة المزاء. كرر 2x وقم بإزالة الفلتر من قارورة التجميع.
  14. احتضان عينات جليكان الميتوكوندريا في الفريزر -80 درجة مئوية حتى تتجمد (30-60 دقيقة) وتجف حتى تكتمل في درجة حرارة الغرفة في مكثف فراغ (4-6 ساعات لمدة 400 ميكرولتر).
    ملاحظة: يمكن تخزين N-glycans عند -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر قبل التحليل.
  15. أعد تعليق الجليكان المجفف المرتبط ب N في 50 ميكرولتر من الماء من الدرجة LC / MS مباشرة قبل تحليل IR-MALDESI.

7. الكشف عن الجليكان المنبعثة عن طريق قياس الطيف الكتلي IR-MALDESI

  1. قم بإجراء معايرة الكتلة كل يوم من أيام التجربة. قم بتحميل محلول المعايرة على مضخة حقنة وادفعها بمعدل 1.2 ميكرولتر / دقيقة. قم بتطبيق جهد 3.5 كيلو فولت لتحقيق عمود رش كهربائي مستقر لمعايرة الكتلة في كل من الوضعين الموجب والسالب.
  2. ماصة 5 ميكرولتر من جليكان الميتوكوندريا المعلقة على بقعة عينة على شريحة تفلون ميكروويل.
  3. استخدم ليزر منتصف الأشعة تحت الحمراء يعمل بطول موجي يبلغ 2.97 ميكرومتر للاستئصال بطاقة 1.8 مللي جول لكل رشقة.
  4. تأين واكتشاف N-glycans في وضع التأين السابب. استخدم مذيب الرش الكهربائي الذي يتكون من 60٪ أسيتونيتريل و 1 ملي مولار من حمض الأسيتيك لإنشاء عمود رش كهربائي مستقر بمعدل تدفق 2 ميكرولتر / دقيقة بجهد 3.2 كيلو فولت.
  5. لإجراء التحليل ، قم بإقران IR-MALDESI بمطياف كتلة HRAM تم ضبطه على قوة حل كتلة تبلغ 240,000FWHM عند m / z 200 ، وتحليل ما بين 500 و 2,000 م / z في وضع التأين السالب.
  6. قم بإيقاف تشغيل التحكم التلقائي في الكسب (AGC) وتعيين وقت حقن ثابت يبلغ 90 مللي ثانية. استخدم مصدر EasyIC للمعايرة الداخلية في الوقت الفعلي لكل طيف لتحقيق دقة قياس الكتلة العالية (MMA).

8. تحليل بيانات الميتوكوندريا N- glycan

  1. حدد الجليكان المرتبط ب N يدويا من خلال البحث عن الكتل أحادية النظير وتأكيد التوزيعات النظيرية باستخدام تباعد m / z لتحديد الأيونات المشحونة المزدوجة والثلاثية التي لها حد أدنى من التدفق الأيوني يبلغ 1,000 أيون / ثانية.
  2. تحويل أطياف الكتلة الخام من نسب m / z إلى كتل أحادية النظير محايدة.
  3. قم بتحميل الكتل أحادية النظير إلى أداة التنبؤ ببنية السكريات قليلة السكاريد عبر الإنترنت لتحديد تركيبات الجليكان المحتملة. تأكيد التعليقات التوضيحية باستخدام قاعدة بيانات السكريات المنسقة تجريبيا20 ؛ تأكد من أن كل تعريف يقع ضمن هامش 2.5 جزء في المليون MMA ، ويحتوي على بنية الجليكان الأساسية المرتبطة ب N (Hex3HexNAc2) ، وتستثني البنتوز أو KDN أو السكريات الأحادية HexA.
  4. ارسم هياكل الجليكان المؤكدة باستخدام تسمية SNFG21.
  5. احصل على الوفرة النسبية للجليكان من أطياف الكتلة الخام وقم بتطبيعها مقابل كمية بروتين الميتوكوندريا في ميكروغرام للحصول على الأيونات / ثانية / ميكروغرام.
  6. استخدم تحليل مربع كاي لاختبار جودة التوافق بين التوزيعات النظرية والتجريبية للجليكانات المرتبطة ب N لتحديد عدد مقاربات الكلور. هذا يسمح بالتحديد المباشر لعدد أحماض السياليك19.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمثل الشكل 1 مخططا تخطيطيا للخطوات المتضمنة في عزل الميتوكوندريا عن خط الخلايا الدبقية الصغيرة BV2 لتحليل الجليكان الطيفي الكتلي. يتم تمثيل قابلية استنساخ عزل بروتين الميتوكوندريا بين مستحضرات الميتوكوندريا المختلفة من نفس كثافة البداية للخلايا الدبقية الصغيرة في الشكل 2 ، والذي لا يظهر فرقا كبيرا بين تركيز بروتين الميتوكوندريا المقدر باستخدام مقايسة BCA الدقيقة.

يمثل الشكل 3 نقاء عزلات الميتوكوندريا باست...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الخلايا الدبقية الصغيرة هي الخلايا المناعية المقيمة في الدماغ ، وتعديلات الجليكان تعدل النمط المناعي ووظيفة الخلايا الدبقية الصغيرة. تتطلب هذه الوظائف المناعية طاقة خلوية كبيرة ، والتي يتم توفيرها في الغالب بواسطة الميتوكوندريا. والجدير بالذكر أن بروتينات الميتوكوندريا تقدم أيضا تعديلات جليكان ، والتي ظلت غير مدروسة بشكل كبير بسبب التحديات التكنولوجية في التحقيق في الارتباط بالجليكوزيل دون الخلوي. تعتمد معظم الدراسات التي تبحث في الارتباط بالجليكوزيل في الميتوكوندريا على التحديد القائم ع...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإعلان عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يود المؤلفون أن يشكروا سيث أيزنبرغ ، طالب الدراسات العليا في مختبر موديمان في NCSU ، لمساعدته في تسجيل الفيديو لبروتوكول الطيف الكتلي. تم دعم هذا البحث جزئيا من قبل برنامج زمالة كلية الابتكار الهندسي في جامعة ألاباما في برمنغهام ، AG068309 إلى DJT و R01GM087964-12 إلى DCM. تم رسم المخططات في هذه المخطوطة باستخدام BioRender.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
Equipment
Amersham 600 imagerCytvia 29194217تصوير الجل والغشاء
الكونتيسة 3 عداد الخلايا الآليفيشر العلميX003SZ1LY9
الحمام الجاف Stdrd 4 blck 100-120VThermofisher العلمي   ؛جهاز نقل الجل i-Blot2 88870003
اللطخة الغربيةInvitrogenIB21001
المجهر المقلوبمعالجة الخلية04355223EA
قارئصغيرة 82050-760
خزان هلام صغيرInvitrogenA25977
الهواء الطلق روكفيشر العلامة التجارية88861025
صبي Pipet BioTek229310
خلاط دوامةIntegra- VWR
strong> كواشف عزل الميتوكوندريا  < / em>< / strong>
طقم عزل الميتوكوندرياThermofisher العلمي   ؛89874
مثبط الفوسفوتازThermofisher علمي 1861274
مثبط البروتيازالحراري علمي 1861281
<قوي>N-glycan العزل وكواشف IR-MALDESI< / em>< / strong>
aceetic acid فيشر ScientificA1135050٪ في مذيب ESI
Acetonitrile سيجما ألدريتش34851-4L1 ملي مولار في ESI مذيب
بيكربونات الأمونيوم  فيشر A643500 علمي100 ملي
حل معايرةثيرموفيشر ScientificA39239بيرس فليكس ميكس
ديثيوثريتول  سيجما ألدريتشAC4263801001 م
يودوأسيتاميدسيجما ألدريتشA322-10VL
LC / MS درجة المياهThermofisher Scientific047146.M6
PNGase FBulldog BioNZPP01075000 U / mL ، إنزيم لإطلاق N-glycan   ؛
N-glycan العزل والمواد الاستهلاكية IR-MALDESI< / em>< / strong>
Amicon مرشحات الطرد المركزيفيشر العلمية UFC50102410 كيلو دالتون MWCO
مطياف الكتلةOrbitrap Exploris 240
Mid-IR LaserJGM Associates ، برلنغتون ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية
تفلون مايكروويل شريحةProsolia ، إنديانابوليس ، إنديانا ، الولايات المتحدة الأمريكية
strong>N-glycan Analysis Softwares< / em>< / strong>
GlycoMod  Expasy https://web.expasy.org/glycomod/
GlyConnectExpasy https://glyconnect.expasy.org/
<قوي>عزل البروتين والمواد الاستهلاكية الغربية للبقعة  < / em>< / strong>
Basix هلام تحميل نصائح (10 & micro; L) Basix13-611-102
نصائح تحميل هلام Basix (200 & micro; L) Basix13-611-116
مكشطة الخليةمختبرات VWR14-388-100
i-Blot NC المداخن العاديةInvitrogenIB23001
i-Blot2 PVDF المداخن العاديةInvitrogenIB24001
10   µ L ماصة دقيقةفيشر ScientificFBE00010
20 & micro; L ماصة دقيقةInvitrogenFBE00020
200   µ L ماصة دقيقة فيشر براندFBE00200
1000 & مايكرو; L micropipetteفيشر العلامة التجاريةFBE01000
10   µ L نصائح الماصة مختبرات VWR76322-528
20  µ L نصائح الماصةمختبرات VWR76322-134
200  µ L نصائح الماصة مختبرات VWR76322-150
1000  µ L نصائح الماصةمختبرات VWR76322-154
لوحة البئر العلامة التجارية فيشر14-388-100
عزل البروتين والكواشف اللطخة الغربية  < / em>< / strong>
الأكتين المضاد (المضيف : أرنب)تقنيات إشارات الخلية8457T
مكافحة الأرانب IgG HRP Linked  ؛تقنيات إشارات الخلية7074S
بولت 4-12٪ Bis-Tris PlusInvitrogenNW04120BOX
مصل الأبقار ألبومينفيشر الكواشف الحيويةBP9700-100
COXIV (المضيف: أرنب)تقنيات إشارات الخلية4844S
الجسم المضاد GAPDH (المضيف: أرنب)تقنيات إشارات الخلية2118S
مجموعة فحص البروتين MicroBCAThermofisher العلمية 23235
Nupage MOPS SDS Runing Buffer [20x]Thermofisher علمي NP0001
PAGE مسطرة سلم البروتينالملون Thermofisher العلمي 815-968-0747التخفيف = استخدام 7   µ L للتحميل على البئر
الأول من الفوسفات المخزنة الملحية   ؛Aniara DiagnosticsA12-9423-5تحضير 1x PBS من مسحوق 10x   ؛
بيرس ECL الركيزة النشاف الغربيThermofisher علمي 32106كيم الركيزة
RIPA BufferThermofisher علمي 89901
عينة عازلةNovexB0007يتم تحضير المخزن المؤقت لعينة LDS في نسبة 3: 1 من العينة إلى عينة عازلة
Tween-20MP BiomedicalsTWEEN201
مستهلكات ثقافة الأنسجة  < / em>< / strong> Countess
SlidesAvantor229411
EppendorfCell Treat414004-265612-5884
2 مل ماصة شفطVista lab5090-0010E
5 مل ماصة مصلية   ؛فيشر ساينتفيك13-678-11D
10 مل ماصة مصلية  Basix13-678-11E
25 مل ماصة مصليةمختبرفيستا FB012937
50 مل ماصة مصليةمختبرفيستا 14955233
15 مل أنبوب مخروطيأفانتور229225A
50 مل أنبوب مخروطيمعالجة الخلية4190-0050
T-75 سم 2< / sup> قارورة زراعة الأنسجةفيشر العلميFB012937
T-180 سم < سوب > 2 < / سوب> قارورة ثقافة الأنسجةفيشر العلميFB012939
كواشف زراعة الأنسجة   < / em>< / strong>
BV2 خط الخلايا الدبقية الصغيرة   ؛المصفوفة الحيوية الإبداعية CSC-I2227Zالدبقية الصغيرة الخالدة للفأر (BV2) المشتقة من الخلايا الدبقية الصغيرة لحديثي الولادة C57 / BL6 ؛
إنزيمات تفكك الخلايا Thermofisher العلمية 12563029TrypLE 
النسر المعدل (DMEM) من Dulbecco منخفض الجلوكوز الوسائط   ؛جيبكو10567014
مصل الأبقار الجنينيسيتيفاSH30071.03HI
الحد الأدنى من الأحماض الأمينية الأساسية (MEM)جيبكو11140050
البنسليوم ستربتومايسينسيتفياSV30010
عازل للفوسفاتكورنينج21-040-CV
تريبان بلو داغ 0.4٪Invitrogenتي 10282
نظام نقل صفيحة في < < الكيميائية الشكل الخلايا وسط محلول ملحي

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dos Santos, S. E., et al. Similar microglial cell densities across brain structures and mammalian species: Implications for brain tissue function. J Neurosci. 40 (24), 4622-4643 (2020).
  2. Shao, F., Wang, X., Wu, H., Wu, Q., Zhang, J. Microglia and neuroinflammation: Crucial pathological mechanisms in traumatic brain injury-induced neurodegeneration. Front Aging Neurosci. 14, 825086(2022).
  3. Arcuri, C., Mecca, C., Bianchi, R., Giambanco, I., Donato, R. The pathophysiological role of microglia in dynamic surveillance, phagocytosis and structural remodeling of the developing cns. Front Mol Neurosci. 10, 191(2017).
  4. Cheng, J., et al. Early glycolytic reprogramming controls microglial inflammatory activation. J Neuroinflammation. 18 (1), 129(2021).
  5. Cătălin, B., Cupido, A., Iancău, M., Albu, C. V., Kirchhoff, F. Microglia: First responders in the central nervous system. Rom J Morphol Embryol. 54 (3), 467-472 (2013).
  6. Cai, Y., Liu, J., Wang, B., Sun, M., Yang, H. Microglia in the neuroinflammatory pathogenesis of alzheimer's disease and related therapeutic targets. Front Immunol. 13, 856376(2022).
  7. Hickman, S., Izzy, S., Sen, P., Morsett, L., El Khoury, J. Microglia in neurodegeneration. Nat Neurosci. 21 (10), 1359-1369 (2018).
  8. Norat, P., et al. Mitochondrial dysfunction in neurological disorders: Exploring mitochondrial transplantation. NPJ Regen Med. 5 (1), 22(2020).
  9. Picca, A., et al. Age-associated glia remodeling and mitochondrial dysfunction in neurodegeneration: Antioxidant supplementation as a possible intervention. Nutrients. 14 (12), 2406(2022).
  10. Mcavoy, K., Kawamata, H. Glial mitochondrial function and dysfunction in health and neurodegeneration. Mol Cell Neurosci. 101, 103417(2019).
  11. Fairley, L. H., Wong, J. H., Barron, A. M. Mitochondrial regulation of microglial immunometabolism in alzheimer's disease. Front Immunol. 12, 624538(2021).
  12. Starossom, S. C., et al. Galectin-1 deactivates classically activated microglia and protects from inflammation-induced neurodegeneration. Immunity. 37 (2), 249-263 (2012).
  13. Puigdellívol, M., Allendorf, D. H., Brown, G. C. Sialylation and galectin-3 in microglia-mediated neuroinflammation and neurodegeneration. Front Cell Neurosci. 14, 162(2020).
  14. Gerlach, J. Q., Kilcoyne, M., Eaton, S., Bhavanandan, V., Joshi, L. Non-carbohydrate-mediated interaction of lectins with plant proteins. Adv Exp Med Biol. 705, 257-269 (2011).
  15. Cummings, R. D., Pierce, J. M. The challenge and promise of glycomics. Chem Biol. 21 (1), 1-15 (2014).
  16. Robichaud, G., Barry, J. A., Muddiman, D. C. IR-MALDESI mass spectrometry imaging of biological tissue sections using ice as a matrix. J Am Soc Mass Spectrom. 25 (3), 319-328 (2014).
  17. Barry, J. A., Groseclose, M. R., Robichaud, G., Castellino, S., Muddiman, D. C. Assessing drug and metabolite detection in liver tissue by uv-maldi and ir-maldesi mass spectrometry imaging coupled to ft-icr ms. Int J Mass Spectrom. 377, 448-155 (2015).
  18. Pace, C. L., Muddiman, D. C. Direct analysis of native N-linked glycans by IR-MALDESI. J Am Soc Mass Spectrom. 31 (8), 1759-1762 (2020).
  19. Palomino, T. V., Muddiman, D. C. Predicting sialic acid content of N-linked glycans using the isotopic pattern of chlorine. J Am Soc Mass Spectrom. 34 (7), 1392-1399 (2023).
  20. Mariethoz, J., et al. Glycomics@expasy: Bridging the gap. Mol Cell Proteomics. 17 (11), 2164-2176 (2018).
  21. Varki, A., et al. Symbol nomenclature for graphical representations of glycans. Glycobiology. 25 (12), 1323-1324 (2015).
  22. Yu, H., et al. Comparison of the glycopattern alterations of mitochondrial proteins in cerebral cortex between rat alzheimer's disease and the cerebral ischemia model. Sci Rep. 7 (1), 39948(2017).
  23. Dixit, B., Vanhoozer, S., Anti, N. A., O'Connor, M. S., Boominathan, A. Rapid enrichment of mitochondria from mammalian cell cultures using digitonin. MethodsX. 8, 101197(2021).
  24. Kalathil, A. A., et al. New pathway for cisplatin prodrug to utilize metabolic substrate to overcome cancer intrinsic resistance. central science. 9, 1297-1312 (2023).
  25. Hecht, E. S., McCord, J. P., Muddiman, D. C. Definitive screening design optimization of mass spectrometry parameters for sensitive comparison of filter and solid phase extraction purified, inlight plasma N-glycans. Anal Chem. 87 (14), 7305-7312 (2015).
  26. Hecht, E. S., McCord, J. P., Muddiman, D. C. A quantitative glycomics and proteomics combined purification strategy. J Vis Exp. (109), e53735(2016).
  27. Fischler, D. A., Orlando, R. N-linked glycan release efficiency: A quantitative comparison between NaOCl and PNGase F release protocols. J Biomol Tech. 30 (4), 58-63 (2019).
  28. Tu, A., Muddiman, D. C. Internal energy deposition in infrared matrix-assisted laser desorption electrospray ionization with and without the use of ice as a matrix. J Am Soc Mass Spectrom. 30 (11), 2380-2391 (2019).
  29. Barry, J. A., et al. Mapping antiretroviral drugs in tissue by IR-MALDESI MSI coupled to the Q exactive and comparison with LC-MS/MS SRM assay. J Am Soc Mass Spectrom. 25 (12), 2038-2047 (2014).
  30. Samal, J., Palomino, T. V., Chen, J., Muddiman, D. C., Segura, T. Enhanced detection of charged N-glycans in the brain by infrared matrix-assisted laser desorption electrospray ionization mass spectrometric imaging. Anal Chem. 95 (29), 10913-10920 (2023).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

N IR MALDESI

مقالات ذات صلة