يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

تواتر وتوزيع عمليات الانتقال في Caenorhabditis elegans الانقسام الاختزالي عن طريق التنميط الجيني SNP باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي

1.2K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/68183

⸱

يوليو 11, 2025

 ,  ,  , 
1Graduate School of Biology-Oriented Science and Technology, Kindai University, 2Department of Genetic Engineering, Faculty of Biology-Oriented Science and Technology, Kindai University, 3Graduate School of Frontier Biosciences, Osaka University

في هذه المقالة

ملخص

يوفر هذا البروتوكول طريقة لقياس ترددات التقاطع والتوزيع أثناء الانقسام الاختزالي في Caenorhabditis elegans. تم استخدام التنميط الجيني لتعدد الأشكال أحادي النوكليوتيدات مع تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي لتحديد أصل الكروموسومات. سمح رسم الخرائط المكون من 4 نقاط بتحديد توزيعات التقاطع لمناطق الذراع الأيسر والوسط والذراع الأيمن لكل كروموسوم.

الملخص

Caenorhabditis elegans هو كائن حي نموذجي ممتاز لدراسة الانقسام الاختزالي. بالإضافة إلى المزايا العامة ، مثل الدورة الإنجابية القصيرة ، والعديد من النسل ، والجسم الشفاف للتصوير ، هناك ستة أزواج من الكروموسومات المتجانسة الثلاثية المركز. هناك تداخل قوي للتقاطع وتنظيم توزيع التقاطع. لقياس تردد التقاطع ، تم تطوير رسم خرائط العلامات المرئية ، ورسم خرائط snip-SNP ، والقياس الكمي للعلامات الخلوية كسلائف لتكوين التقاطع. هنا ، نقدم طريقة التنميط الجيني المعدلة ل SNP لقياس تردد التقاطع والتوزيع في C. ايليجانس تكوين البويضات. يمكن أن تحذف هذه الطريقة الخطوات الشاقة لتقييد الهضم والرحلان الكهربائي للهلام وتجنب الحكم الغامض على نطاقات الحمض النووي غير المقطوعة. يتم إجراء التنميط الجيني لتعدد الأشكال أحادي النوكليوتيدات (SNP) باستخدام سلالة بريستول / هاواي الهجينة. يتيح لنا عبور الخنثى مع myo-3p :: الذكور المعبرين عن GFP التركيز على تكوين البويضات. ينتج محلل دودة واحدة قالب DNA كاف لجميع الكروموسومات الستة. تسمح مجسات كيمياء TaqMan القائمة على نوكلياز خارجي مقاس 5 بوصات ومجسات رابطة الأخدود الثانوي (MGB) الخاصة ب SNP بالكشف الدقيق عن SNP بمعدل التنميط الجيني يبلغ حوالي 97.7٪. نحن نستخدم الكشف الدقيق عن تعدد الأشكال لقياس تردد التقاطع في C. ايليجانس. يمكن أيضا تطبيق هذه الطريقة لتحديد تردد التقاطع في الطفرات الذكرية أو المعيبة المتقاطعة ، وكذلك لفترات كروموسومية أكثر تحديدا.

المقدمة

يعد التكوين المتقاطع بين الكروموسومات المتجانسة أمرا ضروريا للفصل الصحيح للكروموسومات وأيضا لتوليد التنوع الجيني1. تسبب الأخطاء في تكوين التقاطع اختلال الصيغة الصبغية ، مما قد يؤدي إلى العقم والإجهاض والعيوبالخلقية 2. يختلف تردد التقاطع حسب منطقة الكروموسوم ونوع الطافرة والعمر والجنس ، مما يؤكد الحاجة إلى قياس تردد التقاطع بدقة في ظل كل من هذه الشروط3،4،5. الهدف العام من هذه الطريقة هو قياس تردد التقاطع لكل مجال كروموسومي بدقة وبالتالي تحديد توزيع عمليات الانتقال بدقة على كامل طول C. ايليجانس كروموسوم.

تقليديا ، تم استخدام رسم الخرائط من نقطتين باستخدام العلامات المورفولوجية لقياس تردد التقاطع6،7،8،9،10. في C. ايليجانس، غالبا ما تستخدم الأنماط الظاهرية للجسم الدهني (Dpy) والحركة غير المنسقة (Unc) لإنشاء خرائط كروموسوم6. تتمثل مزايا هذه الطريقة في تكلفتها المنخفضة وقدرتها على تحليل العديد من النسل. تشمل عيوب هذه الأساليب تقييد اختيار مواقع الاهتمام وعدم القدرة على استخدام النسل القاتل لأن أنماطها الظاهرية غير مرئية. من أجل التغلب على إزعاج اختيار الموقع ، تم استخدام الينقولات Tc1 كعلامات للمواقع متعددة الأشكال ذات العلامات بالتسلسل (STS) 11،12. يمكن اكتشاف Tc1s باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل والرحلان الكهربائي. في حين أن سلالة Bristol N2 القياسية تحتوي على 30 نسخة من الينقولات Tc1 ، فإن C. ايليجانس المعزولة من Bergerac في فرنسا (RW7000 و DP13) تحتوي على 500 نسخة من Tc1. وبالتالي ، يختلف عدد وتوزيع الينقولات Tc1 بين العزلات ، ويستخدم هذا لتحليل كروموسومات ذرية الديدان الهجينة بين العزلات بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). بعد ذلك ، تم استخدام SNPs أيضا لقياس تردد التقاطع والتوزيع13،14. ظهر SNP بين سلالات Bristol N2 و Hawaiian CB4856 كل 1,000 نقطة أساس15,16. يتم الكشف عن تعدد الأشكال على أنها تعدد أشكال طول جزء التقييد (RFLP) باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل ، والهضم المقيد ، والرحلان الكهربائي. في الآونة الأخيرة ، تم اقتراح مواقع الإدراج / الحذف الصغيرة (InDel) بالإضافة إلى SNPs بين Bristol N2 و Hawaiian CB4856 كعلامات أكثر كفاءة17. ومع ذلك ، فإن قياس تردد التقاطع باستخدام Tc1 و RFLP و InDel يتطلب عمليات كثيفة العمالة مثل تفاعل البوليميراز المتسلسل ومعالجة إنزيم التقييد والرحلان الكهربائي. إذا لم يتم تحسين كل عملية في تحليل واسع النطاق ، فقد يساء تفسير النتائج بسبب عوامل مثل دقة تفاعل البوليميراز المتسلسل ، ونوع إنزيم التقييد المستخدم ، وكفاءة انقسام الحمض النووي ، ووضوح وفصل النطاقات أثناء الرحلان الكهربائي. في المقابل ، تستخدم الطريقة المقترحة التنميط الجيني SNP عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي لتسهيل القياس الكمي الدقيق والدقيق.

لا يتم توزيع عمليات الانتقال بشكل عشوائي على طول الكروموسومات. في C. ايليجانس، تميل عمليات الانتقال الفردية إلى التشكل بشكل متكرر في الذراعين ويتم قمعها في الوسط3،5. لا يمكن لرسم الخرائط المورفولوجية ذات النقطتين تحديد مكان حدوث عمليات الانتقال خارج جينات العلامات. على العكس من ذلك ، يسمح رسم خرائط SNP بزيادة العلامات وقد ثبت أنه يسهل تحديد المنطقة الدقيقة للتقاطع على طول الكروموسومبأكمله 5،14،18. في هذه الدراسة ، استخدمنا حدود مجال الكروموسومات التي اقترحها Rockman و Kruyglyak5 واخترنا أربعة تعدد الأشكال للتحليل: في طرفي الكروموسوم ، وفي طرفي حدود المركز / الذراع.

من خلال الاستفادة من الطرق السابقة ، اقترحنا طريقة دقيقة وسريعة للكشف عن SNP عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي باستخدام TaqMan ، 5 'nuclease19 لقياس التقاطع بين الذراع الأيسر والمركز والذراع الأيمن لكل كروموسوم. مزايا طريقتنا على التقنيات البديلة ، مقارنة بالدراسات السابقة20،21،22 ، هي الدقة والبساطة. هذه الطريقة هي طريقة تحليل كروس مطبقة على qPCR ل C. ايليجانس وهي مناسبة على نطاق واسع للباحثين الذين يدرسون الانقسام الاختزالي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. أول صليب جيني

  1. قم بإعداد ألواح التزاوج التي تتكون من ألواح طبيعية لوسط نمو الديدان الخيطية (NGM) مع بقعة صغيرة OP50 (قطر ~ 5 مم) في طبق 35 مم.
  2. أضف ثلاثة خنثى L4 من سلالة بريستول N2 (أو طفرات ذات خلفية بريستول) وتسعة ذكور شباب بالغين من سلالة هاواي CB4856 على صفيحة التزاوج (الشكل 1 أ).
    ملاحظة: لتحليل الطفرات ذات الفتك الجنيني العالي ، من الضروري استخدام طفرات متوازنة ذات خلفيات بريستول وهاواي في هذا الصليب. للحصول على المسوخ من خلفية هاواي ، يجب تجاوز طفرات بريستول مع سلالة هاواي ست مرات على الأقل حتى يكون لجميع مواقع SNP ذات الأهمية خلفية هاواي. نتيجة لذلك ، يحتوي متحولة هاواي على خلفية بريستول فقط في المنطقة المتحولة وكروموسوم الموازن.
  3. احتضان اللوحة لمدة 1.5 يوم عند 20 درجة مئوية لتزاوج السلالتين. انقل كل خنثى إلى لوحة NGM فردية جديدة باستخدام OP50.
  4. ضع الأطباق في حاضنة 20 درجة مئوية لمدة يوم واحد للسماح لها بوضع البيض المخصب. انقل كل خنثى إلى لوحة NGM فردية جديدة باستخدام OP50.
  5. ضع الأطباق في حاضنة 20 درجة مئوية لمدة يوم واحد للسماح بوضع البيض المخصب مرة أخرى. قم بإزالة الخنثى. احتفظ بالصفائح لمدة 0.5 - 1 يوم في حاضنة 20 درجة مئوية لتنمية النسل إلى L4.

2. الصليب الثاني

  1. اختر ستة خنثى متقاطعة L4 (هجينة بريستول / هاواي) و 12-15 ccIs4251 [(pSAK2) myo-3p :: GFP :: LacZ :: NLS + (pSAK4) myo-3p :: الميتوكوندريا GFP + dpy-20 (+)] I (TTS24) ذكور بريستول على صفيحة تزاوج جديدة (الشكل 1 ب).
    ملاحظة: يتم الحصول على السلالة التي تم إدخالها ccIs4251 من مركز Caenorhabditis Genetics Center ، ويجب أن تتفوق عليها سلالة N2 من النوع البري أكثر من ست مرات.
  2. احتفظ بالطبق لمدة 1.5 يوم عند 20 درجة مئوية في حاضنة للتزاوج. انقل كل خنثى إلى لوحة NGM جديدة باستخدام OP50.
  3. ضع الأطباق في حاضنة 20 درجة مئوية لمدة يوم واحد للسماح لها بوضع البيض المخصب. انقل كل خنثى إلى لوحة NGM فردية جديدة باستخدام OP50.
  4. احتفظ بالأطباق لمدة يوم واحد في حاضنة 20 درجة مئوية للسماح لها بوضع البيض المخصب مرة أخرى. انقل كل خنثى أبوي إلى أنبوب PCR مع 3 ميكرولتر من محلول التحلل للتحقق مما إذا كان التهجين الأول ناجحا.
  5. تحقق من الأنماط الجينية للوالدين على أنها هجين بريستول / هاواي بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل في منطقة من الكروموسوم V. افصل العصابات عن طريق الرحلان الكهربائي لجل الاغاروز بنسبة 2.5٪.
    1. في SNP ، WBVar01973670 ، يبلغ طول أمبليكون تفاعل البوليميراز المتسلسل من جينوم بريستول 220 نقطة أساس ، ومن جينوم هاواي هو 196 نقطة أساس. إذا أشارت نتائج تفاعل البوليميراز المتسلسل إلى أن الوالدين متماثل الزيجوت في بريستول ، فهذا يرجع إلى الإخصاب الذاتي للصليب الأول. لا تستخدم ذرية هذه الديدان لمزيد من التحليل.

3. أخذ العينات

  1. قم بإعداد المخزن المؤقت لتحلل الدودة على النحو التالي: 50 ملي مولار KCL ، 10 ملي مولار ثلاثية الرقم الهيدروجيني 8.2 ، 2.5 ملي ملليجرامكلوريد 2 ، 0.45٪ IGEPAL CA-630 (NP-40) ، 0.45٪ توين 20 ، و 0.01٪ جيلاتين. تعقيم عن طريق الترشيح وتخزينها في درجة حرارة الغرفة. قبل الاستخدام مباشرة ، أضف 3 ميكرولتر من 20 مجم / مل من بروتيناز K (في H2O) إلى 1 مل من محلول التحلل وخزنها في حصص عند -20 درجة مئوية.
  2. تحقق من تعبير GFP في عضلة جدار الجسم لذرية الصليب الثاني بواسطة مجهر تشريح الفلورسنت قبل إضافة الديدان إلى أنابيب تفاعل البوليميراز المتسلسل الفردية. التكبير هو 6.1-55x ، والطول الموجي المستخدم هو 440-460 نانومتر.
  3. اختر دودة مفردة إيجابية GFP وأضفها إلى كل أنبوب تفاعل البوليميراز المتسلسل يحتوي على 3 ميكرولتر من محلول تحلل الدودة (الشكل 1 ج). اجمع ما مجموعه 360 (90 × 4 مكررات بيولوجية) ذرية متقاطعة من الذكور البالغين في كل من أنابيب PCR البالغ عددها 360.
    ملاحظة: لتجنب قطف النسل المخصب ذاتيا ، يجب اختيار الديدان الموجبة ل GFP لأخذ العينات. الخنثى غير المتزاوجة الأصغر من L4 متاحة أيضا لتحليل الجسيمات الجسدية ، ولكن نظرا لاحتوائها على أعداد مختلفة من الكروموسومات X ، يجب تحديد الذكور والخنثى بعد النمو إلى L4 وأخذ عينات منها عند تحليل الكروموسوم X.
  4. ضع العينات في فريزر -80 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. يمكن تخزين العينات عند -80 درجة مئوية حتى يبدأ التحلل.
  5. عند تحليل الطفرات ذات الفتك الجنيني العالي ، اجمع الأجنة الميتة بدلا من اليرقات الحية للحصول على نتائج غير متحيزة. لجمع الأجنة ، استخدم طرف ماصة يحتوي على 0.5 ميكرولتر من محلول الكيتيناز (20 مجم / مل كيتيناز ، 50 ملي كلوريد الصوديوم ، 70 ملي كلوريد كلوريد ، 2.5 ملي ملي كلوريدالمغنيد 2 ، 2.5 ملي كلوريدالمنظومات 2). اجمع الأجنة في غضون 4 ساعات من وضعها.
    ملاحظة: الأجنة الميتة التي تم وضعها منذ أكثر من 4 ساعات غير مناسبة لتحليل تفاعل البوليميراز المتسلسل ، ربما بسبب تدهور الحمض النووي الجيني.

4. تحلل العينة

  1. اضبط أنابيب PCR في جهاز التدوير الحراري على 60 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة ، متبوعة ب 95 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. أضف 100 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكلياز إلى كل أنبوب واخلطه جيدا.
  2. قم بتخزين العينات عند -20 درجة مئوية حتى بدء التنميط الجيني SNP بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي.

5. التنميط الجيني SNP

  1. اصنع خليطا على النحو التالي (الشكل 2). في أنبوب سعة 1.5 مل ، أضف 125 ميكرولتر من Master Mix ، و 6 ميكرولتر من فحص التنميط الجيني SNP (40x) ، و 280 ميكرولتر من الماء المقطر (DW) ، والتمهيدي الأمامي (450 نانومتر) ، والتمهيدي العكسي (450 نانومتر) ، المسبار 1 (100 نانومتر) ، المسبار 2 (100 نانومتر).
    ملاحظة: يتم سرد المجسات والبادئات في الجدول 1.
  2. تخلط جيدا عن طريق سحب العينات عدة مرات لضمان تركيز موحد. أضف 4 ميكرولتر من الخليط إلى كل بئر من لوحة PCR سعة 96 بئرا على قاعدة الدعم باستخدام ماصة دقيقة ذات 12 قناة.
  3. أضف 1 ميكرولتر من المحللة التي تحتوي على كل حمض نووي جيني إلى كل بئر واخلطها عن طريق سحب العينة عدة مرات.
  4. قم بإعداد عناصر تحكم إيجابية ، مثل متماثل الزيجوت في بريستول ، ومتماثل الزيجوت في هاواي ، وهجينة بريستول / هاواي ، وثلاثة عناصر تحكم بدون قالب كعناصر تحكم سلبية (الشكل 3 أ).
  5. ختم اللوحة بغشاء لاصق بصري. اضغط على الفيلم مع التركيز على حواف كل بئر باستخدام قضيب.
  6. قم بالطرد المركزي للوحة لفترة وجيزة لتجميع السائل في الأسفل وإزالة فقاعات الهواء من السائل.
  7. قم بتحميل اللوحة على جهاز PCR في الوقت الفعلي. انقر فوق الزر إنشاء تجربة جديدة في البرنامج.
  8. في إعداد الخصائص، اضبط نوع الأداة على نظام QuantStudio 1، ونوع الكتلة إلى كتلة 96 بئر 0.2 مل، والنوع التجريبي إلى التنميط الجيني، والكيمياء إلى كواشف TaqMan، ووضع التشغيل على سريع.
  9. في إعداد الطريقة ، اضبط مستوى الصوت على 5 ميكرولتر (تأكد من أن حجم التفاعل الصحيح يطابق الإعداد) ، عدد الدورات إلى 40 دورة (افتراضي). اضبط إعدادات درجة الحرارة والوقت على النحو التالي: مرحلة ما قبل القراءة عند 25 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، ومرحلة الانتظار (تنشيط الإنزيم ، البدء الساخن) عند 95 درجة مئوية لمدة 20 ثانية ، ومرحلة PCR عند 95 درجة مئوية لمدة 1 ثانية ، و 60 درجة مئوية لمدة 20 ثانية ، ومرحلة ما بعد القراءة عند 25 درجة مئوية لمدة 30 ثانية.
  10. في إعداد اللوحة، قم بمطابقة مواضع العينات وعناصر التحكم مع كل بئر على شاشة البرنامج.
  11. احفظ التجربة في جهاز USB ، وقم بتحميلها في أداة PCR في الوقت الفعلي ، وانقر فوق الزر "تشغيل ".

6. تحليل البيانات

  1. احفظ النتائج على USB وانقلها إلى جهاز كمبيوتر لتحليل البيانات.
  2. قم بتحليل بيانات دلتا Rn (dRn) في الوقت الفعلي باستخدام الصيغة أدناه ، حيث Rn (المراسل الطبيعي) هي إشارة التألق من صبغة المراسل ، VIC و FAM ، التي يتم تطبيعها بالقسمة على إشارة التألق للصبغة المرجعية السلبية ، ROX.
    dRn = Rn - خط الأساس
  3. راجع مؤامرة التمييز الأليلية.
  4. تأكيد فصل المجموعات (الشكل 3 ب). في مخطط تمييز الأليل ، يتم تجميع متماثل الزيجوت في بريستول في الزاوية اليمنى السفلية ، ويتم تجميع الهجينة بريستول / هاواي في الزاوية اليمنى العليا ، ويتم تجميع متماثل الزيجوت في هاواي في الزاوية اليسرى العليا ، ويتم تجميع عناصر التحكم السلبية في الزاوية اليسرى السفلية. استخدم رموز الألوان التالية:
    الأحمر: أليل بريستول
    الأزرق: أليل هاواي
    الأخضر: متغاير الزيجوت
    الأسود: تحكم سلبي
  5. قم بتصدير النتائج إلى ملف جدول بيانات وقم بتجميع بيانات التنميط الجيني من جميع مواضع SNP الأربعة. إذا كانت هناك استدعاءات غير محددة في أربعة مواضع متتالية، فاستبعد البيانات من قيمة N. استخدم 90 عينة لكل طبق للتحليل.
    1. حدد عمليات الانتقال على النحو التالي: إذا كان SNP في الموضع # 1 هجينا من بريستول / هاواي ، والمواقف # 2- # 4 كلها متماثلة زيجوت بريستول [B / H] - [B / B] - [B / B] - [B / B] أو الموضع # 1 هو متماثل الزيجوت بريستول والموضع # 2- # 4 كلها هجينة بريستول / هاواي [B / B] - [B / H] - [B / H] - [B / H] ، تشير هذه النتائج إلى تقاطع واحد بين الموضعين # 1 و # 2 (في مكان ما على الذراع الأيسر للكروموسوم). وبالمثل ، في حالة [B / H] - [B / H] - [B / B] - [B / B] أو [B / B] - [B / B] - [B / H] - [B / H] ، يحدث تقاطع واحد بين # 2 و # 3 (في مكان ما في المنطقة الوسطى من الكروموسوم) ، وفي حالة [B / H] - [B / H] - [B / H] - [B / B] أو [B / B] - [B / B] - [B / B] - [B / H] ، يحدث تقاطع واحد بين # 3 و # 4 (في مكان ما على الذراع اليمنى للكروموسوم).
      ملاحظة: هناك ستة أنماط من عمليات الانتقال المزدوجة. اليسار واليمين: [B / B] - [B / H] - [B / H] - [B / B] و [B / H] - [B / B] - [B / B] - [B / H] ، اليسار والوسط: [B / B] - [B / H] - [B / B] - [B / B] و [B / H] - [B / H] - [B / H] - [B / H] ، الوسط واليمين: [B / B] - [B / H] - [B / H] و [B / H] - [B / H] - [B / H] - [B / H] - [B / H].

7. التحليل الإحصائي

  1. أدخل القيم في برنامج SPSS Statistics (IBM). لمقارنة توزيع التقاطع في الذراع الأيسر والمنطقة المركزية والذراع اليمنى للكروموسومات ، أدخل 82 كروموسوما مع تقاطع في الذراع الأيسر ، و 20 كروموسوما مع تقاطع في المنطقة الوسطى ، و 68 كروموسوما مع تقاطع في الذراع اليمنى.
  2. قم بإجراء تصحيح ANOVA و Bonferroni وتحديد الدلالة الإحصائية باستخدام قيمة p ثنائية الذيل. قم بإجراء العديد من المقارنات حسب المطلوب ، مثل الذراع الأيسر مقابل المركز أو WT مقابل المتحول.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

اكتشفنا مواقع SNP الأربعة على الكروموسوم الثاني في C. ايليجانس عن طريق فحص التنميط الجيني SNP لتحديد تكوين التقاطع لكل طول كامل للكروموسوم ، في الذراع الأيسر ، في المنطقة الوسطى ، وفي الذراع اليمنى. يتم الكشف عن تعدد الأشكال وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. يحتوي المزيج الرئيسي على Taq DNA Polymerase و Heat-labile uracil-N-glycosylase (UNG) و dNTP مع dUTP وصبغة ROX المرجعية السلبية. يتم تنشيط بوليميراز الحمض النووي Taq عند 95 درجة مئوية ، مما يتيح تثبيط التضخيم غير المحدد في درجات حرارة منخفضة. تسمح UNG و dUTP بتده...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

هنا ، قدمنا طريقة لقياس تردد التقاطع والتوزيع في C. ايليجانس الانقسام الاختزالي بناء على التنميط الجيني SNP للذريات المتقاطعة من الأنواع الهجينة في بريستول / هاواي. في حين أن طريقة snip-SNP التقليدية (RFLP) تتطلب الرحلان الكهربائي للهلام بعد تفاعل البوليميراز المتسلسل ، ويتطلب الكشف عن نطاقات الحمض النووي نظام توثيق هلام14،18 ، فإن التنميط الجيني SNP عن طريق مقايسة النوكلياز 5 بوصات باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل في...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

تم توفير السلالات من قبل مركز Caenorhabditis Genetics (CGC) ، بتمويل من مكتب المعاهد الوطنية للصحة لبرامج البنية التحتية للبحوث (P40 OD010440). ونشكر أعضاء مختبر سايتو على مناقشاتهم المفيدة بشأن هذا العمل. تم دعم هذا العمل من قبل الجمعية اليابانية لتعزيز العلوم (JSPS) KAKENHI JP23K05868 إلى TTS.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
101-1000 μ ل ماصة تلميحQSP111-ن-كيو
محلول 0.5 مول / I-EDTA (الرقم الهيدروجيني 8.0)ناكالاي تيسك14347-21
محلول هيدروكسيد الصوديوم 10mol / Iناكالاي تيسك94611-45
10X DreamTaq جرين عازلةثيرمو فيشر العلمي EP0713
10μ L ، طرف طويل ، محببفوكاكاسي ، واتسون110-207 ج
200 μ L ، نصيحة قياسية ، متخرجفوكاكاسي ، واتسون110-705 درجة مئوية
مسحوق أجارناكالاي تيسك01028-14
الاغاروزPH اليابانPH108
معقم البخار عالي الضغط الأوتوكلاف TOMY موديل ES-215تومي سيكوES-215
باكتو الببتون الهضم الأنزيمي للبروتينثيرمو فيشر العلمي 211677
حمض البوريكناكالاي تيسك05215-05
Caenorhabditis elegans بريستول وايلد من النوع   ؛مركز علم الوراثة لالتهاب الوراء السرطانين2
Caenorhabditis elegans هاواي نوع البريةمركز علم الوراثة لالتهاب الوراء السرطانيسي بي 4856
كلوريد الكالسيومناكالاي تيسك06729-55
ccIs4251 [(pSAK2) myo-3p :: GFP :: LacZ :: NLS + (pSAK4) myo-3p :: GFP الميتوكوندريا + dpy-20 (+)] أنامختبر سايتوTTS24أصلي من PD4251
كولسترولناكالاي تيسك08721-62
فحوصات التنميط الجيني المخصصة TaqMan SNPثيرمو فيشر العلمي 4332077
مزيج محلول ديوكسي نوكليوتيد (dNTP)نيو إنجلاند بيولابسرقم 04470
الكمبيوتر اللوحي DigPrint Doc DP-T130zالأدوات الحيويةDP-T130z
ثنائي البوتاسيوم هيدروجين فوسفاتناكالاي تيسك28726-05
تشريح المجهرنيكونSMZ-745 سي دي اس
دريم تك DNA بوليميرازثيرمو فيشر العلمي EP0713
محلول بروميد الإيثيديومناكالاي تيسك14631-94
التمهيدي الأمامي ل WBVar01973670IDT103988736atgtctcacccaaggttgaa
الجيلاتينناكالاي تيسك166-31
جيلسون بيبتمان ماصة كلاسيكيةثيرمو فيشر العلمي 
إيجيبال CA-630سيجما ألدريتش18896
كبريتات المغنيسيوم سباعيناكالاي تيسك21003-75
مايكرو أمبير بصرية 96 بئر لوحة مفاعلثيرمو فيشر العلمي N8010560
فيلم MicroAmp البصري اللاصقثيرمو فيشر العلمي 4311971
MiniAmp  دورة حراريةثيرمو فيشر العلمي مضخم صوت صغير
نظام الرحلان الكهربائي الأفقي Mini-Sub Cell GT ، صينية 7 × 10 سممختبرات بيو راد1704466
نيتشيبيت EXIIنيشيريو00-NPX2-2
نيتشيبيت EXII MULTIنيشيريو00 نيوتن في الدقيقة -12 في الدقيقة
ماتي الماصة نيونيشيريو00-PMNEO
كلوريد البوتاسيومناكالاي تيسك285-38
ثنائي هيدروجين فوسفات البوتاسيومناكالاي تيسك28720-65
البروتيناز كثيرمو فيشر العلمي طراز EO0491
نظام كوانت ستوديو 1 في الوقت الحقيقي PCR ، 96 بئر ، 0.2 ملثيرمو فيشر العلمي أ40426
سلم أرجواني سريع التحميل 1 كيلو بايت بالإضافة إلى سلم الحمض النووينيو إنجلاند بيولابسN0550S
التمهيدي العكسي ل WBVar01973670IDT103988737tggctactcctagtcactga
كلوريد الصوديومناكالاي تيسك31319-45
TaqPath ProAmp ماستر ميكسثيرمو فيشر العلمي أ 30866
طبق TC 35 ، قياسيسارستيدت83.3900
تريس (هيدروكسي ميثيل) أمينوميثانناكالاي تيسك35406-75
قاعدة تريزماسيجما ألدريتش  T1503-1 كجم
المراهقين 20كاشف يونياما03706
دودة WormStuff اختيارجينيسي العلمية59-AWP
نصائح اختيار دودة WormStuff (90/10٪ Pt / IR ، مقياس 30)جينيسي العلمية59-30PI36

المراجع

  1. Jones, G., Kleckner, N., Zickler, D. Meiosis through three centuries. Chromosoma. 133 (2), 93-115 (2024).
  2. Hassold, T. J., Hunt, P. A. Missed connections: Recombination and human aneuploidy. Prenat Diagn. 41 (5), 584-590 (2021).
  3. Barnes, T. M., Kohara, Y., Coulson, A., Hekimi, S. Meiotic recombination, noncoding DNA and genomic organization in caenorhabditis elegans. Genetics. 141 (1), 159-179 (1995).
  4. Lim, J. G., Stine, R. R., Yanowitz, J. L. Domain-specific regulation of recombination in Caenorhabditis elegans in response to temperature, age, and sex. Genetics. 180 (2), 715-726 (2008).
  5. Rockman, M. V., Kruglyak, L. Recombinational landscape and population genomics of Caenorhabditis elegans. PLoS Genet. 5 (3), e1000419(2009).
  6. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
  7. Li, W., Yanowitz, J. L. Atm and atr influence meiotic crossover formation through antagonistic and overlapping functions in Caenorhabditis elegans. Genetics. 212 (2), 431-443 (2019).
  8. Rose, A. M., Baillie, D. L. The effect of temperature and parental age on recombination and nondisjunction in Caenorhabditis elegans. Genetics. 92 (2), 409-418 (1979).
  9. Villeneuve, A. M. A cis-acting locus that promotes crossing over between X chromosomes in Caenorhabditis elegans. Genetics. 136 (3), 887-902 (1994).
  10. Youds, J. L., et al. Rtel-1 enforces meiotic crossover interference and homeostasis. Science. 327 (5970), 1254-1258 (2010).
  11. Emmons, S. W., Yesner, L., Ruan, K. S., Katzenberg, D. Evidence for a transposon in Caenorhabditis elegans. Cell. 32 (1), 55-65 (1983).
  12. Williams, B. D., Schrank, B., Huynh, C., Shownkeen, R., Waterston, R. H. A genetic mapping system in Caenorhabditis elegans based on polymorphic sequence-tagged sites. Genetics. 131 (3), 609-624 (1992).
  13. Hillers, K. J., Villeneuve, A. M. Chromosome-wide control of meiotic crossing over in C. elegans. Curr Biol. 13 (18), 1641-1647 (2003).
  14. Wicks, S. R., Yeh, R. T., Gish, W. R., Waterston, R. H., Plasterk, R. H. Rapid gene mapping in Caenorhabditis elegans using a high-density polymorphism map. Nat Genet. 28 (2), 160-164 (2001).
  15. Campos, T. L., Korhonen, P. K., Sternberg, P. W., Gasser, R. B., Young, N. D. Predicting gene essentiality in Caenorhabditis elegans by feature engineering and machine-learning. Comput Struct Biotechnol J. 18, 1093-1102 (2020).
  16. Fay, D., Bender, A. Snps: Introduction and two-point mapping. WormBook. , (2008).
  17. Hwang, H. Y., Wang, J. Fast genetic mapping using insertion-deletion polymorphisms in Caenorhabditis elegans. Sci Rep. 11 (1), 11017(2021).
  18. Davis, M. W., et al. Rapid single nucleotide polymorphism mapping in C. elegans. BMC Genomics. 6, 118(2005).
  19. Livak, K. J. Allelic discrimination using fluorogenic probes and the 5' nuclease assay. Genet Anal. 14 (5-6), 143-149 (1999).
  20. Li, Q., et al. The tumor suppressor BRCA1-BARD1 complex localizes to the synaptonemal complex and regulates recombination under meiotic dysfunction in Caenorhabditis elegans. PLoS Genet. 14 (11), e1007701(2018).
  21. Saito, T. T., Lui, D. Y., Kim, H. M., Meyer, K., Colaiacovo, M. P. Interplay between structure-specific endonucleases for crossover control during Caenorhabditis elegans meiosis. PLoS Genet. 9 (7), e1003586(2013).
  22. Saito, T. T., Youds, J. L., Boulton, S. J., Colaiacovo, M. P. Caenorhabditis elegans him-18/slx-4 interacts with slx-1 and xpf-1 and maintains genomic integrity in the germline by processing recombination intermediates. PLoS Genet. 5 (11), e1000735(2009).
  23. Longo, M. C., Berninger, M. S., Hartley, J. L. Use of uracil DNA glycosylase to control carry-over contamination in polymerase chain reactions. Gene. 93 (1), 125-128 (1990).
  24. Kutyavin, I. V., et al. 3'-minor groove binder-DNA probes increase sequence specificity at pcr extension temperatures. Nucleic Acids Res. 28 (2), 655-661 (2000).
  25. Hammarlund, M., Davis, M. W., Nguyen, H., Dayton, D., Jorgensen, E. M. Heterozygous insertions alter crossover distribution but allow crossover interference in Caenorhabditis elegans. Genetics. 171 (3), 1047-1056 (2005).
  26. Hodgkin, J., Horvitz, H. R., Brenner, S. Nondisjunction mutants of the nematode Caenorhabditis elegans. Genetics. 91 (1), 67-94 (1979).
  27. Meneely, P. M., Farago, A. F., Kauffman, T. M. Crossover distribution and high interference for both the X chromosome and an autosome during oogenesis and spermatogenesis in Caenorhabditis elegans. Genetics. 162 (3), 1169-1177 (2002).
  28. Nabeshima, K., Villeneuve, A. M., Hillers, K. J. Chromosome-wide regulation of meiotic crossover formation in Caenorhabditis elegans requires properly assembled chromosome axes. Genetics. 168 (3), 1275-1292 (2004).
  29. Phillips, C. M., Dernburg, A. F. A family of zinc-finger proteins is required for chromosome-specific pairing and synapsis during meiosis in C. elegans. Dev Cell. 11 (6), 817-829 (2006).
  30. Mancera, E., Bourgon, R., Brozzi, A., Huber, W., Steinmetz, L. M. High-resolution mapping of meiotic crossovers and non-crossovers in yeast. Nature. 454 (7203), 479-485 (2008).
  31. Qi, J., et al. Characterization of meiotic crossovers and gene conversion by whole-genome sequencing in Saccharomyces cerevisiae. BMC Genomics. 10, 475(2009).
  32. Miller, D. E., et al. A whole-chromosome analysis of meiotic recombination in Drosophila melanogaster. G3 (Bethesda). 2 (2), 249-260 (2012).
  33. Carlton, P. M., Farruggio, A. P., Dernburg, A. F. A link between meiotic prophase progression and crossover control. PLoS Genet. 2 (2), e12(2006).
  34. Tsai, C. J., et al. Meiotic crossover number and distribution are regulated by a dosage compensation protein that resembles a condensin subunit. Genes Dev. 22 (2), 194-211 (2008).
  35. Bhalla, N., Wynne, D. J., Jantsch, V., Dernburg, A. F. Zhp-3 acts at crossovers to couple meiotic recombination with synaptonemal complex disassembly and bivalent formation in C. elegans. PLoS Genet. 4 (10), e1000235(2008).
  36. Yokoo, R., et al. Cosa-1 reveals robust homeostasis and separable licensing and reinforcement steps governing meiotic crossovers. Cell. 149 (1), 75-87 (2012).
  37. Almanzar, D. E., et al. Meiotic DNA exchanges in C. elegans are promoted by proximity to the synaptonemal complex. Life Sci Alliance. 6 (4), e202301906(2023).
  38. De Los Santos, T., et al. The mus81/mms4 endonuclease acts independently of double-holliday junction resolution to promote a distinct subset of crossovers during meiosis in budding yeast. Genetics. 164 (1), 81-94 (2003).
  39. Saito, T. T., Colaiacovo, M. P. Regulation of crossover frequency and distribution during meiotic recombination. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 82, 223-234 (2017).
  40. Zalevsky, J., Macqueen, A. J., Duffy, J. B., Kemphues, K. J., Villeneuve, A. M. Crossing over during Caenorhabditis elegans meiosis requires a conserved mutS-based pathway that is partially dispensable in budding yeast. Genetics. 153 (3), 1271-1283 (1999).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

تردد العبورإعادة الاندماج الميوزيرسم خرائط الكروموسوماتكيمياء TaqManتحليل تكوين البويضاتالطفرات الجينيةتوزيع العبور
تواتر وتوزيع عمليات الانتقال في Caenorhabditis elegans الانقسام الاختزالي عن طريق التنميط الجيني SNP باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.