يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
يوفر هذا البروتوكول طريقة لقياس ترددات التقاطع والتوزيع أثناء الانقسام الاختزالي في Caenorhabditis elegans. تم استخدام التنميط الجيني لتعدد الأشكال أحادي النوكليوتيدات مع تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي لتحديد أصل الكروموسومات. سمح رسم الخرائط المكون من 4 نقاط بتحديد توزيعات التقاطع لمناطق الذراع الأيسر والوسط والذراع الأيمن لكل كروموسوم.
Caenorhabditis elegans هو كائن حي نموذجي ممتاز لدراسة الانقسام الاختزالي. بالإضافة إلى المزايا العامة ، مثل الدورة الإنجابية القصيرة ، والعديد من النسل ، والجسم الشفاف للتصوير ، هناك ستة أزواج من الكروموسومات المتجانسة الثلاثية المركز. هناك تداخل قوي للتقاطع وتنظيم توزيع التقاطع. لقياس تردد التقاطع ، تم تطوير رسم خرائط العلامات المرئية ، ورسم خرائط snip-SNP ، والقياس الكمي للعلامات الخلوية كسلائف لتكوين التقاطع. هنا ، نقدم طريقة التنميط الجيني المعدلة ل SNP لقياس تردد التقاطع والتوزيع في C. ايليجانس تكوين البويضات. يمكن أن تحذف هذه الطريقة الخطوات الشاقة لتقييد الهضم والرحلان الكهربائي للهلام وتجنب الحكم الغامض على نطاقات الحمض النووي غير المقطوعة. يتم إجراء التنميط الجيني لتعدد الأشكال أحادي النوكليوتيدات (SNP) باستخدام سلالة بريستول / هاواي الهجينة. يتيح لنا عبور الخنثى مع myo-3p :: الذكور المعبرين عن GFP التركيز على تكوين البويضات. ينتج محلل دودة واحدة قالب DNA كاف لجميع الكروموسومات الستة. تسمح مجسات كيمياء TaqMan القائمة على نوكلياز خارجي مقاس 5 بوصات ومجسات رابطة الأخدود الثانوي (MGB) الخاصة ب SNP بالكشف الدقيق عن SNP بمعدل التنميط الجيني يبلغ حوالي 97.7٪. نحن نستخدم الكشف الدقيق عن تعدد الأشكال لقياس تردد التقاطع في C. ايليجانس. يمكن أيضا تطبيق هذه الطريقة لتحديد تردد التقاطع في الطفرات الذكرية أو المعيبة المتقاطعة ، وكذلك لفترات كروموسومية أكثر تحديدا.
يعد التكوين المتقاطع بين الكروموسومات المتجانسة أمرا ضروريا للفصل الصحيح للكروموسومات وأيضا لتوليد التنوع الجيني1. تسبب الأخطاء في تكوين التقاطع اختلال الصيغة الصبغية ، مما قد يؤدي إلى العقم والإجهاض والعيوبالخلقية 2. يختلف تردد التقاطع حسب منطقة الكروموسوم ونوع الطافرة والعمر والجنس ، مما يؤكد الحاجة إلى قياس تردد التقاطع بدقة في ظل كل من هذه الشروط3،4،5. الهدف العام من هذه الطريقة هو قياس تردد التقاطع لكل مجال كروموسومي بدقة وبالتالي تحديد توزيع عمليات الانتقال بدقة على كامل طول C. ايليجان....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
1. أول صليب جيني
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
اكتشفنا مواقع SNP الأربعة على الكروموسوم الثاني في C. ايليجانس عن طريق فحص التنميط الجيني SNP لتحديد تكوين التقاطع لكل طول كامل للكروموسوم ، في الذراع الأيسر ، في المنطقة الوسطى ، وفي الذراع اليمنى. يتم الكشف عن تعدد الأشكال وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. يحتوي المزيج الرئيسي على Taq DNA Polymerase و Heat-labile uracil-N-glycosylase (UNG) و dNTP مع dUTP وصبغة ROX المرجعية السلبية. يتم تنشيط بوليميراز الحمض النووي Taq عند 95 درجة مئوية ، مما يتيح تثبيط التضخيم غير المحدد في درجات حرارة منخفضة. تسمح UNG و dUTP بتده.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
هنا ، قدمنا طريقة لقياس تردد التقاطع والتوزيع في C. ايليجانس الانقسام الاختزالي بناء على التنميط الجيني SNP للذريات المتقاطعة من الأنواع الهجينة في بريستول / هاواي. في حين أن طريقة snip-SNP التقليدية (RFLP) تتطلب الرحلان الكهربائي للهلام بعد تفاعل البوليميراز المتسلسل ، ويتطلب الكشف عن نطاقات الحمض النووي نظام توثيق هلام14،18 ، فإن التنميط الجيني SNP عن طريق مقايسة النوكلياز 5 بوصات باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل في.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.
تم توفير السلالات من قبل مركز Caenorhabditis Genetics (CGC) ، بتمويل من مكتب المعاهد الوطنية للصحة لبرامج البنية التحتية للبحوث (P40 OD010440). ونشكر أعضاء مختبر سايتو على مناقشاتهم المفيدة بشأن هذا العمل. تم دعم هذا العمل من قبل الجمعية اليابانية لتعزيز العلوم (JSPS) KAKENHI JP23K05868 إلى TTS.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 101-1000 μ ل ماصة تلميح | QSP | 111-ن-كيو | |
| محلول 0.5 مول / I-EDTA (الرقم الهيدروجيني 8.0) | ناكالاي تيسك | 14347-21 | |
| محلول هيدروكسيد الصوديوم 10mol / I | ناكالاي تيسك | 94611-45 | |
| 10X DreamTaq جرين عازلة | ثيرمو فيشر العلمي | EP0713 | |
| 10μ L ، طرف طويل ، محبب | فوكاكاسي ، واتسون | 110-207 ج | |
| 200 μ L ، نصيحة قياسية ، متخرج | فوكاكاسي ، واتسون | 110-705 درجة مئوية | |
| مسحوق أجار | ناكالاي تيسك | 01028-14 | |
| الاغاروز | PH اليابان | PH108 | |
| معقم البخار عالي الضغط الأوتوكلاف TOMY موديل ES-215 | تومي سيكو | ES-215 | |
| باكتو الببتون الهضم الأنزيمي للبروتين | ثيرمو فيشر العلمي | 211677 | |
| حمض البوريك | ناكالاي تيسك | 05215-05 | |
| Caenorhabditis elegans بريستول وايلد من النوع ؛ | مركز علم الوراثة لالتهاب الوراء السرطاني | ن2 | |
| Caenorhabditis elegans هاواي نوع البرية | مركز علم الوراثة لالتهاب الوراء السرطاني | سي بي 4856 | |
| كلوريد الكالسيوم | ناكالاي تيسك | 06729-55 | |
| ccIs4251 [(pSAK2) myo-3p :: GFP :: LacZ :: NLS + (pSAK4) myo-3p :: GFP الميتوكوندريا + dpy-20 (+)] أنا | مختبر سايتو | TTS24 | أصلي من PD4251 |
| كولسترول | ناكالاي تيسك | 08721-62 | |
| فحوصات التنميط الجيني المخصصة TaqMan SNP | ثيرمو فيشر العلمي | 4332077 | |
| مزيج محلول ديوكسي نوكليوتيد (dNTP) | نيو إنجلاند بيولابس | رقم 04470 | |
| الكمبيوتر اللوحي DigPrint Doc DP-T130z | الأدوات الحيوية | DP-T130z | |
| ثنائي البوتاسيوم هيدروجين فوسفات | ناكالاي تيسك | 28726-05 | |
| تشريح المجهر | نيكون | SMZ-745 سي دي اس | |
| دريم تك DNA بوليميراز | ثيرمو فيشر العلمي | EP0713 | |
| محلول بروميد الإيثيديوم | ناكالاي تيسك | 14631-94 | |
| التمهيدي الأمامي ل WBVar01973670 | IDT | 103988736 | atgtctcacccaaggttgaa |
| الجيلاتين | ناكالاي تيسك | 166-31 | |
| جيلسون بيبتمان ماصة كلاسيكية | ثيرمو فيشر العلمي | ||
| إيجيبال CA-630 | سيجما ألدريتش | 18896 | |
| كبريتات المغنيسيوم سباعي | ناكالاي تيسك | 21003-75 | |
| مايكرو أمبير بصرية 96 بئر لوحة مفاعل | ثيرمو فيشر العلمي | N8010560 | |
| فيلم MicroAmp البصري اللاصق | ثيرمو فيشر العلمي | 4311971 | |
| MiniAmp دورة حرارية | ثيرمو فيشر العلمي | مضخم صوت صغير | |
| نظام الرحلان الكهربائي الأفقي Mini-Sub Cell GT ، صينية 7 × 10 سم | مختبرات بيو راد | 1704466 | |
| نيتشيبيت EXII | نيشيريو | 00-NPX2-2 | |
| نيتشيبيت EXII MULTI | نيشيريو | 00 نيوتن في الدقيقة -12 في الدقيقة | |
| ماتي الماصة نيو | نيشيريو | 00-PMNEO | |
| كلوريد البوتاسيوم | ناكالاي تيسك | 285-38 | |
| ثنائي هيدروجين فوسفات البوتاسيوم | ناكالاي تيسك | 28720-65 | |
| البروتيناز ك | ثيرمو فيشر العلمي | طراز EO0491 | |
| نظام كوانت ستوديو 1 في الوقت الحقيقي PCR ، 96 بئر ، 0.2 مل | ثيرمو فيشر العلمي | أ40426 | |
| سلم أرجواني سريع التحميل 1 كيلو بايت بالإضافة إلى سلم الحمض النووي | نيو إنجلاند بيولابس | N0550S | |
| التمهيدي العكسي ل WBVar01973670 | IDT | 103988737 | tggctactcctagtcactga |
| كلوريد الصوديوم | ناكالاي تيسك | 31319-45 | |
| TaqPath ProAmp ماستر ميكس | ثيرمو فيشر العلمي | أ 30866 | |
| طبق TC 35 ، قياسي | سارستيدت | 83.3900 | |
| تريس (هيدروكسي ميثيل) أمينوميثان | ناكالاي تيسك | 35406-75 | |
| قاعدة تريزما | سيجما ألدريتش | T1503-1 كجم | |
| المراهقين 20 | كاشف يونياما | 03706 | |
| دودة WormStuff اختيار | جينيسي العلمية | 59-AWP | |
| نصائح اختيار دودة WormStuff (90/10٪ Pt / IR ، مقياس 30) | جينيسي العلمية | 59-30PI36 |
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
