التحليل متعدد الوسائط للبلاستيك الدقيق في مياه الشرب باستخدام خط أنابيب تحليل أغشية السيليكون النانوية

Summary

هنا ، نقدم بروتوكولا يعرض ركيزة شفافة ومسطحة بصريا لالتقاط وتحليل الجسيمات الملوثة في مياه الشرب. يتم تقديم خط أنابيب تحليل أغشية السيليكون النانوية (SNAP): خط أنابيب مرن لالتقاط الجسيمات في الوسائط السائلة وقياسها وتحديدها.

Abstract

التأثير البيولوجي للتلوث البلاستيكي الدقيق في مصادر الغذاء والمياه البشرية غير معروف إلى حد كبير ، ومصادر مياه الشرب ليست معفاة من هذا التلوث باللدائن الدقيقة. هنا ، نوضح نهجا مبسطا لالتقاط وقياس وتحديد اللدائن الدقيقة في مياه الشرب. نقدم سير عمل تحليلي يسمى خط أنابيب تحليل أغشية السيليكون النانوية (SNAP) الذي يستفيد من الأغشية النانوية الجديدة لنيتريد السيليكون التي تمكن من "عامل تركيز" كبير ، والذي يدمج الجسيمات العالقة في منطقة مراقبة مستوية لتحليل الجسيمات الفردية والقابلة للقياس الكمي ومتعددة الوسائط على نفس الركيزة. تنبع المزايا الأساسية ل SNAP من استخدامها لأغشية فائقة النحافة القائمة على نيتريد السيليكون موجودة في أقراص مرشح ذات حجم تقليدي ، مما يتيح الالتقاط المباشر وتحليل MPS البوليمرية على خلفية غير بوليمرزية. تم جمع عينات مياه الشرب التي تم الحصول عليها من منطقة روتشستر بولاية نيويورك من مصادر الصنابير السكنية وتحليلها باستخدام SNAP. تميزت الجسيمات في كل عينة بالفحص المجهري الإلكتروني البصري والماسح (SEM) ، والتحليل الطيفي رامان ، والتحليل الطيفي للأشعة السينية المشتتة للطاقة (EDX) ، وتم تحديد العديد من المكونات المحددة بما يتناسب مع إجمالي الجسيمات الملتقطة.

Introduction

تعرف اللدائن الدقيقة بأنها بوليمرات اصطناعية بحجم أصغر من خمسة ملليمترات^1،2. يعد تلوث البلاستيك الدقيق (MP) مصدر قلق متزايد لصحة الإنسان وبيئته وبيئيا. تم العثور على تلوث MP في مصادر المياه بجميع أنواعها ؛ المياه العذبة والمحيطات وحتى مصادر مياه^{الشرب 3}. يتم إنشاء النواب من انهيار المصادر البلاستيكية^{الأولية 4} ، وكذلك المنسوجات الاصطناعية^5،6،7. ينتشر النواب في كل مكان وقد تم العثور عليه في الأنسجة البشرية ، مثل المشيمة البشرية والبراز والدم^8،9،10. هناك اهتمام متزايد بأبحاث MP ، كما يتضح من أكثر من 4,100 و 4,600 منشور في عامي 2023 و 2024 ، على التوالي (بيانات PubMed ؛ الكلمة الرئيسية "اللدائن الدقيقة") ، بالإضافة إلى القلق العام المتزايد بشأن التعرض البشري للنواب. استجابة للقلق العام المتزايد ، العديد من الهيئات التنظيمية الحكومية مثل ولاية كاليفورنيا¹¹ والعديد من دول الاتحاد الأوروبي¹²، (أو سيكونون) تنفذ اللوائح المتعلقة بمستويات MP في مياه الشرب. بالنظر إلى كل ما سبق ، أعلنت وكالة حماية البيئة الأمريكية مؤخرا أن النواب ملوثون جديدان مثيرا للقلق. ومع ذلك ، فإن تقييم المخاطر البشرية يعوقه بشدة الافتقار إلى طرق الكشف الموثوق به والقابل للتكرار للنواب.

يعتمد توصيف أعضاء البرلمان على طرق تحليلية مثل المجهر البصري والإلكترون¹³ ، وتقنيات التحليل الطيفي والقياس^{الطيفي 1،14،15} لفهم الخصائص البصرية ل MPS⁷ وتكوينها ، على التوالي. يجب أن تتضمن العينات التي تحتوي على أعضاء البرلمان تحليلات متعددة لتوصيف أعضاء البرلمان وتحديدهم وتحديدهم كميا ، وعلى الأقل تتطلب التحليل الطيفي / قياس الطيف (على الأقل ، التحليل الطيفي رامان ، أو التحليل الطيفي بالأشعة تحت الحمراء ، أو كروماتوغرافيا غاز الانحلال الحراري - قياس الطيف الكتلي ، وما إلى ذلك) وفقا لبعض المتطلبات الدنيا للمجلات لقياس البلاستيك في العينات البيئية ، مثل علم البيئة الكلية¹⁶. يعد التحليل الطيفي رامان أكثر تنوعا من التحليل الطيفي بالأشعة تحت الحمراء (IR) ، خاصة فيما يتعلق بتحديد المواد في العينات البيولوجية. التحليل الطيفي رامان هو تقنية تشتت الضوء ، تمكنها من تحليل الجسيمات الأصغر بسهولة أكبر من الأشعة تحت الحمراء ، وهي تقنية لامتصاص الضوء تتطلب جزيئات أكبر ولديها قيود أكبر على وضع^{العينة 17}. لقد تم اقتراح سابقا أن ركائز التحليل الطيفي رامان التي تشتمل على السيليكون أو أكسيد السيليكون يمكن أن تسفر عن نتائج موثوقة مع الحد الأدنى من ضوضاء الخلفية¹⁸.

غالبا ما لا تتوافق ركائز بعض التقنيات التحليلية التي تتوافق عادة مع نوع واحد من التحليل (أي الركائز المطلية بالذهب المطلوبة للتحليل الطيفي بالأشعة تحت الحمراء) مع الفحص المجهري الضوئي للإرسال و / أو الانعكاس. بعد ذلك ، أصبح أخذ العينات الفرعية المكررة شائعا بين الباحثين لإنتاج عينات مناسبة لكل تحليل منفصل ، لكن أخذ العينات الفرعية يستغرق وقتا طويلا ويمكن أن يستبعد الجسيمات منخفضة الوفرة^1،2،6. عادة ما يكون النقل اليدوي للجسيمات من ركيزة إلى أخرى ضروريا لتحليل نفس الجسيم للتوصيف والتعرف عليه من خلال طرائق تحليلية مختلفة ، لكن عمليات النقل اليدوية البطيئة هذه تزيد من احتمالية التحيز والتلوث والخسارة ، بالإضافة إلى قصر تحليل أعضاء البرلمان على الجسيمات الأكبر حجما فقط التي يمكن التلاعب بها^{يدويا 13}. تقدم مهام سير العمل دون المستوى الأمثل هذه العديد من التحديات ومشكلات الموثوقية ، مما يساهم في التباين الكبير في القياس الكمي MP المبلغ عنه في الأدبيات^3،7.

هنا ، نقدم سير عمل تحليلي نسميه خط أنابيب تحليل أغشية السيليكون النانوية (SNAP) لالتقاط وتوصيف وتحديد وتحديد كمية أعضاء البرلمان ، وإظهار فائدة SNAP من خلال تحليل عينات مياه الشرب التي يتم الحصول عليها من منطقة روتشستر ، نيويورك. يتم تمكين SNAP بواسطة أقراص مرشح بقطر 25 مم بحجم تقليدي مع أغشية نانوية مدمجة من السيليكون (انظر الجدول التكميلي S1 لخصائص الغشاء) ، والتي توفر ركيزة موحدة لتركيز وتحليل MPS من مياه الشرب باستخدام تقنيات متعددة^15،19. بعد التركيز بالتتابع والتقاط MPS على الأغشية النانوية ذات أحجام القطع المتناقصة (20 ميكرومتر نيتريد السيليكون الصغير الذي يسهل اختراقه (MPSN) مع مسام أسطوانية و 8.0 ميكرومتر نيتريد السيليكون المجهري (MSSN) مع مسام منشورية مستطيلة) ، يسهل SNAP ثلاث خطوات تحليلية متتالية: 1) تلطيخ العينة ، والفحص المجهري البصري ، والقياس الكمي MP ، 2) تحديد الجسيمات عبر التحليل الطيفي رامان ، متبوعا ب 3) توصيف الجسيمات عن طريق المجهر الإلكتروني الماسح (SEM) ، تمكين تحليلات متعددة لنفس الجسيمات التي تم التقاطها على ركيزة غشاء نانوي واحدة.

نعرض العديد من خطوط أنابيب SNAP من خلال استخدام كل من أقراص الترشيح غير المطلية بالغشاء النانوي السيليكوني (SiN) وأقراص مرشح غشاء السيليكون النانوي المطلي بالذهب (Au-SiN): خط الأنابيب أ) SNAP الذي يتم إجراؤه على SiN وتوصيف نفس MPS بالتتابع من خلال تقنيات تحليلية متعددة ؛ خط الأنابيب ب) SNAP الذي تم إجراؤه على Au-SiN مع التحليل الطيفي رامان. وخط الأنابيب ج) SNAP الذي تم إجراؤه على Au-SiN مع SEM المجهز بالتحليل الطيفي للأشعة السينية المشتتة للطاقة (EDX) (الشكل 1). وبالتالي فإن أشكال SNAP هي مهام سير عمل تحليلية مرنة ومبسطة يمكن استخدامها لعدد من أنواع العينات والتقنيات التحليلية. على عكس الطرق المنشورة سابقا والتي تعتمد على الأغشية البوليمرية¹¹ ، تستمد مزايا SNAP من استخدامها لأغشية السيليكون النانوية ، حيث يتم التقاط البوليمر الاصطناعي MPS على غشاء غير بوليمري قائم على السيليكون ، مما يتيح التعرف التركيبي ل MPS على خلفية غير بوليمرزية. علاوة على ذلك ، توفر أغشية السيليكون النانوية مستويات بؤرية موحدة على عكس الأغشية البوليمرية ، التي تميل إلى التجعد ، مما يتيح العديد من تقنيات الفحص المجهري والتحليل الطيفي الآلي.

لقد قمنا سابقا بتمييز استخدام أغشية السيليكون النانوية لتحليلات MP من خلال النمذجة التحليلية ، وتحديات جسيمات النموذج ، وعينات مياه الشرب والهواء^19،20 ، وكذلك من خلال مقارنة خصائص الترشيح والفحص المجهري البصري باستخدام جزيئات النموذج مقابل أربعة أغشية مستخدمة على نطاق^{واسع 15}. في هذا البروتوكول ، نوضح بشكل إرشادي فائدة SNAP لتحليل النواب في أربع عينات من مياه الشرب. تم جمع العينات من أربعة مصادر مياه متميزة حول منطقة روتشستر الكبرى ، نيويورك. نشأت كل عينة مدرجة في هذه الدراسة من مصدر مياه سطحي مميز ، مثل بحيرة أونتاريو ، وبحيرة الشوكران ، ومزيج من الشوكران وأونتاريو ، وبحيرة كانانديغوا (الشكل 2). تضمنت الجسيمات الملتقطة من مصادر مياه الشرب هذه المواد البلاستيكية المنتشرة مثل البوليسترين (PS) والبولي إيثيلين (PE) والمعادن الثقيلة مثل الحديد والسيليكا والجزيئات غير الاصطناعية.

Protocol

1. إجراءات مراقبة الجودة ومستحضرات محلول Ultrapure

1. غطاء التدفق الصفحي وتنظيف القفازات
   1. Don PPE (معدات الحماية الشخصية): معطف مختبر قطني 100٪ وقفازات النتريل.
      ملاحظة: معدات الوقاية الشخصية مستمرة في جميع أنحاء البروتوكول.
   2. رش قفازات النتريل بنسبة 99٪ من كحول الأيزوبروبيل (IPA). افركي يديك معا ، ثم اشطفيه ب ~ 18 MΩ ، 0.22 ميكرومتر ماء مفلتر. افعل هذا 3x لإزالة عامل التحرير من القفازات.
   3. قم بطي مهمة حساسة من الألياف الطبيعية وامسحيها إلى أرباع ، ثم رشها بنسبة 70٪ IPA. امسح سطح غطاء المحرك من الخلف إلى الأمام بضربات طويلة، وأعد طي مسح المهمة الدقيق على سطح غير مستخدم كل مرتين. استمر في تنظيف الشفاط حتى يتم تنظيف جميع الأسطح ، واستبدل المنديل بآخر جديد بمجرد اتساخه.
   4. اكشف الغطاء عن حصيرة الأسطوانة المصنوعة من السيليكون ، ولفها عبر سطح غطاء المحرك لالتقاط أي جزيئات متبقية. لتنظيف أسطوانة السيليكون ، قم بالرش بنسبة 99٪ IPA وافركها بيد مرتدية قفازا ، ثم اشطفها بماء مفلتر 18 MΩ و 0.22 ميكرومتر. كرر 3 مرات ، ثم اتركه حتى يجف في الغطاء.
   5. أعد شطف القفازات كما في الخطوة 1.1.2.
2. مياه فائقة النقاء وتوليد IPA.
   1. املأ دورق سعة 1 لتر بماء 18 MΩ وضعه في الغطاء.
   2. قم بتجهيز حقنة سعة 60 مل وفلتر حقنة قطع 0.22 ميكرومتر عن طريق تصفية ما لا يقل عن 200 مل من الماء 18 MΩ من خلال المحقنة والفلتر المرفق.
      ملاحظة: ستوفر مضخة الحقنة الوقت ولكنها ليست شرطا لتنفيذ البروتوكول الموصوف.
   3. اشطف حاوية زجاجية ذات غطاء لولبي 3x بماء مفلتر 18 MΩ و 0.22 ميكرومتر. املأ ب 0.22 ميكرومتر من الماء المصفى بالحقنة 18 MΩ.
   4. كرر الخطوات 1.2.1-1.2.3 مع التركيز المطلوب من IPA بدلا من 18 MΩ ، 0.22 ميكرومتر من الماء المفلتر لتوليد IPA فائق النقاء.

2. التقاط الجسيمات من العينات السائلة عن طريق الترشيح

ملاحظة: يمكن استخدام البروتوكول أدناه مع عينات سائلة بخلاف الماء. يجب ترك طرق جمع العينات التي تم التحقق من صحتها لتقدير الباحث بناء على احتياجات دراستهم والعينة.

1. دون معدات الوقاية الشخصية.
   ملاحظة: تأكد من تنظيف القفازات وأسطح غطاء المحرك وفقا للخطوات 1.1.2-1.1.5.
2. رش حشية سيليكون ب Ultra Pure 99٪ IPA ، وافركها بأصابع القفازات ، ثم اشطفها بالماء عالي النقاء. كرر هذا 3x لكل حشية.
   ملاحظة: عدد الحشيات التي سيتم استخدامها في الترشيح يساوي عدد أقراص المرشح التي سيتم استخدامها، زائد 1. راجع الشكل 1 ب للحصول على رسم التجميع المرئي.
3. باستخدام المحقنة المعدة في الخطوة 1.1.2، اشطف المحقنة من الداخل سعة 60 مل بالماء فائق النقاء عن طريق امتصاص 30 مل من الماء عالي النقاء و 30 مل من الهواء في المحقنة. قم بلف مرشح المحقنة ، ثم رجها بقوة واستغرضها. كرر هذا 3x.
   ملاحظة: يمكن استخدام أي حقنة بحجم حسب الضرورة بناء على حجم العينة.
4. قم بتجميع جهاز الترشيح كما هو موضح في رسم التجميع المرئي في الشكل 1 ب.
   ملاحظة: استخدم ملاقط نظيفة للتعامل مع أقراص المرشح والحشيات أثناء التجميع والتفكيك.
   1. بالنسبة للترشيحات المتسلسلة ، تأكد من وجود حشية بين القرص وفريت الدعم ، وحشية بين كل قرص ، وحشية بين القرص وقمع الترشيح.
   2. تأكد من ترتيب الأقراص باستخدام أكبر مرشح قطع في الجزء العلوي من المكدس وأصغر مرشح قطع في الأسفل.
5. قم بتشغيل الفراغ على الجهاز بحيث يكون هناك تدفق سلبي عبر مكدس قرص المرشح.
6. قياس تلوث الخلفية
   ملاحظة: تتيح العملية التالية تقييم تنظيف المحقنة وتوليد الوسائط فائقة النقاء ، وتحديد جزيئات الخلفية التي تساهم بها مكونات النظام.
   1. باستخدام المحقنة المغسولة ، قم بتوزيع 50 مل من الماء عالي النقاء ببطء على الغشاء النانوي في وسط القرص العلوي لضمان ترشيح كل السائل الذي تم توزيعه.
      ملاحظة: في حالة تصفية أحجام عينات أكبر (أي >50 مل) ، يقترح قمع ترشيح زجاجي. قم بتنظيف قمع الترشيح الزجاجي كما في الخطوة 2.3. قد تتحمل أدوات المختبر الإضافية مخاطر تلوث الجسيمات الإضافية. حافظ على الاجتهاد في إجراءات التنظيف وتأكد دائما من النظافة باستخدام الترشيحات الفارغة قبل استخدام العينات ذات الأهمية.
   2. اسمح للمياه فائقة النقاء بالترشيح. احتفظ بالمكنسة الكهربائية لمدة دقيقة إضافية بعد الترشيح. بمجرد أن تجف العينة تماما ، قم بإيقاف تشغيل المكنسة الكهربائية.
   3. قم بإزالة أقراص المرشح بعناية من الحشيات باستخدام ملاقط نظيفة وضع الأقراص في الحاوية النظيفة المناسبة وذات العلامات للتخزين ، مثل طبق بتري الزجاجي أو الصندوق المظلم.
   4. قم بتصوير أقراص المرشح تحت المجهر للتحليل البصري ، وعد الجسيمات ، وما إلى ذلك.
7. بالنسبة للعينات السائلة ، قم بتنظيف حشية إضافية كما في الخطوة 2.2. احصل على حقنة جديدة لكل عينة وسائط سائلة فريدة وكرر الخطوة 2.3.
8. امتصاص الكمية المطلوبة من العينة وقم بتوزيع العينة ببطء على الغشاء النانوي في وسط القرص العلوي.
9. بمجرد اكتمال ترشيح العينة ، قم بإجراء شطف 3 مرات ب 1 مل من الماء فائق النقاء لضمان شطف جميع الجسيمات الموجودة في العينة بشكل كاف من جميع الأسطح على الغشاء الموجود في وسط قرص المرشح.
10. احتفظ بالمكنسة الكهربائية لمدة دقيقة إضافية لتجفيف العينة المغسولة 3 مرات بالكامل ، ثم قم بإيقاف تشغيل المكنسة الكهربائية.
    1. كرر الخطوات 2.7-2.10. لكل تكرار يتم إجراؤه للعينة محل الاهتمام.

3. تحضير صبغة الفلورسنت وتلوينها

ملاحظة: قد يتداخل تلطيخ الفلورسنت باللون الأحمر النيلي و / أو الأزرق التايبان مع ليزر التحليل الطيفي رامان ذي الأهمية.

1. تلطيخ باللون الأحمر النيلي (NR)
   1. دون معدات الوقاية الشخصية.
   2. نظف القفازات والغطاء كما في الخطوات 1.1.2-1.1.5.
   3. ترشيح العينة الكامل كما هو موضح في الخطوات 2.7-2.10.
   4. اشطف حاويتين من الغطاء اللولبي الزجاجي بالماء عالي النقاء 3x.
   5. قم بإعداد محلول 0.1 مجم / مل من NR في IPA فائق النقاء بنسبة 99٪ في وعاء زجاجي نظيف.
   6. اقلب برفق 10x للخلط.
   7. قم بتصفية محلول NR باستخدام مرشح حقنة 0.22 ميكرومتر في حاوية الغطاء اللولبي الزجاجي الثانية.
      ملاحظة: يجب أن يكون للمرشح المستخدم للتصفية المسبقة ل NR فتحة أصغر من المرشح المستخدم لتصفية العينات.
   8. ضع قرص المرشح المراد تلطيخه على فريت الدعم لقارورة تجميع الفراغ.
   9. الماصة 20 ميكرولتر من محلول 0.1 ملغم/مل NR على الغشاء النانوي في وسط قرص المرشح.
      ملاحظة: يجب أن تغطي البقعة السطح المسامي للغشاء النانوي بالكامل. إذا لم يكن 20 ميكرولتر كافيا ، أضف بقعة إضافية حتى يتم تغطية جميع المناطق المسامية من الغشاء النانوي بشكل مناسب بالبقع.
   10. احتضن البقعة لمدة 5 دقائق.
   11. قم بتصفية البقعة بالمكنسة الكهربائية بمجرد اكتمال الحضانة.
   12. اشطف 3 مرات ب 1 مل من Ultrapure 99٪ IPA لإزالة أي بقعة زائدة من NR.
       ملاحظة: انتقل إلى قسم تلطيخ Trypan Blue أدناه بعد هذه الخطوة إذا كان سيتم إجراء التلوين المضاد.
   13. اسمح لقرص المرشح بالجلوس على فريت الدعم مع تشغيل الفراغ لمدة 2 دقيقة لتصفية وتجفيف أي سائل متبقي. إذا لم يجف بعد دقيقتين ، انقل قرص الفلتر باستخدام طبق بتري زجاجي نظيف إلى فرن 70 درجة مئوية لمدة 2-5 دقائق.
   14. بمجرد أن يجف ، قم بإجراء الفحص المجهري الفلوري كما هو موضح في الخطوة 2.6.4 وانتقل إلى القسم 4.
2. تلطيخ باللون الأزرق (TB)
   1. دون معدات الوقاية الشخصية.
   2. نظف القفازات والغطاء كما هو موضح في الخطوات 1.1.2-1.1.5.
   3. أكمل ترشيح العينة من الخطوات 2.7-2.10 أو ابدأ بالخطوة 3.2.4.
   4. اشطف حاويتين من الغطاء اللولبي الزجاجي بالماء عالي النقاء 3x.
   5. تحضير 0.4٪ TB صبغة في وعاء واحد.
      ملاحظة: يجب أن يكون للمرشح المستخدم للتصفية المسبقة للسل قطع أصغر من المرشح المستخدم لتصفية العينات.
   6. اقلب برفق 10x للخلط.
   7. قم بتصفية محلول وصمة عار السل باستخدام مرشح حقنة 0.22 ميكرومتر في حاوية الغطاء اللولبي الزجاجي الثانية.
      ملاحظة: يجب أن يكون للمرشح المستخدم للتصفية المسبقة للسل قطع أصغر من المرشح المستخدم لتصفية العينات.
   8. ضع قرص المرشح المراد تلطيخه على فريت الدعم لقارورة تجميع الفراغ.
   9. الماصة 20 ميكرولتر من صبغة 0.4٪ TB على الغشاء النانوي في وسط قرص المرشح.
      ملاحظة: يجب أن تغطي البقعة السطح المسامي للغشاء النانوي بالكامل. إذا لم يكن 20 ميكرولتر كافيا ، أضف بقعة إضافية بالتنقيط حتى يتم تغطية جميع المناطق المسامية من الغشاء النانوي بشكل مناسب في البقعة.
   10. احتضن البقعة لمدة 5 دقائق.
   11. قم بتصفية البقعة بالمكنسة الكهربائية بعد الحضانة لمدة 5 دقائق.
   12. اشطفها بكميات 1 مل من الماء عالي النقاء 3x.
   13. اسمح لقرص المرشح بالجلوس على فريت الدعم مع تشغيل الفراغ لمدة 2 دقيقة لتصفية وتجفيف أي سائل متبقي. إذا لم يجف بعد دقيقتين ، انقل قرص الفلتر باستخدام طبق بتري زجاجي نظيف إلى فرن 70 درجة مئوية لمدة 2-5 دقائق.
   14. بمجرد أن يجف ، قم بإجراء الفحص المجهري الفلوري كما هو موضح في الخطوة 2.6.4 وانتقل إلى القسم 4.

4. القياس الكمي للجسيمات عن طريق المجهر الفلوري

1. التقاط صورة الفحص المجهري البصري
   1. قم بتثبيت قرص المرشح على شريحة المجهر باستخدام حشية سيليكون ، أو استخدم شريحة محاذاة خاصة باستخدام قرص التصفية مع مرحلة المجهر. انقل قرص المرشح المراد تصويره إلى مرحلة المجهر.
   2. قم بتصوير الغشاء النانوي باستخدام إضاءة المجال الساطع بحيث يكون الحد الأقصى للأعداد المكتشفة ~ 90٪ من الحد الأقصى لكاميرا الكاشف.
      ملاحظة: هذه القيمة 90٪ هي ~ 59,000 لكاشف 16 بت بمستويات بيضاء عند 65,535.
   3. قم بتصوير الغشاء النانوي باستخدام إضاءة الفلورسنت بحيث تكون شدة البكسل القصوى حوالي ~ 25٪ من الحد الأقصى لنطاق كاميرا الكاشف.
   4. احفظ الصورة بتنسيق TIFF مركب 16 بت.
2. القياس الكمي للجسيمات عن طريق المجهر الفلوري
   1. باستخدام منصة تحليل الصور ، افصل قناة (قنوات) الفلورسنت لوحدة TIFF المركبة التي تم إنشاؤها في 4.1.4 عن قناة المجال الساطع باستخدام وظيفة تقسيم القنوات .
   2. عتبة شدة البكسل باستخدام الدالة Threshold إلى قيمة 10,000.
      ملاحظة: إذا كان الإزهار موجودا على الجسيمات ، فإن العتبة منخفضة جدا ويجب رفعها.
   3. احفظ صورة منفصلة بتنسيق PNG.
   4. قم بإزالة بقع الصورة لإزالة وحدات بكسل التشويش باستخدام وظيفة Despeckle .
   5. مستجمعات المياه الصورة باستخدام وظيفة مستجمعات المياه .
      ملاحظة: تفصل هذه الوظيفة الجسيمات المجاورة ذات الحجم المماثل ، على حساب تفتيت الجسيمات الكبيرة المتجاورة إلى قطع أصغر. نظرا لوجود العديد من الجسيمات الصغيرة في كثير من الأحيان أكثر من الجسيمات الكبيرة الموجودة ، يمكن أن تكون هذه مقايضة جيدة ولكن يمكن أن يكون لها تأثيرات غير مقصودة ، مثل تكسير الألياف الطويلة إلى خيوط من الجسيمات الصغيرة. افحص نتائج الصورة قبل قبول البيانات.
   6. اضبط مقياس الصور الفلورية ذات العتبة عن طريق قياس عرض المسام في صورة المجال الساطع. استخدم عرض المسام المقاس لضبط المقياس بالبكسل/ميكرومتر.
      ملاحظة: بالنسبة للمسام المستطيلة ، يتطابق أصغر عرض مع ملصق المنتج. بالنسبة للمسام الدائرية ، سيتطابق القطر مع ملصق المنتج الذي يحدد حجم المسام (أي القطع) للغشاء النانوي.
   7. قم بتطبيق وظيفة Count Particles لمنصة تحليل الصور على صورة الفلورسنت ذات العتبة ، وتقييم المساحة والحد الأدنى والحد الأقصى.
   8. قم بمعالجة صور الفلورسنت والمجال الساطع لإنشاء مركبات تصور مجالات الفلورسنت.
   9. عتبة الصورة الفلورية باستخدام نفس القيمة كما في الخطوة 4.2.2.
   10. دمج القنوات باستخدام منصة تحليل الصور. قم بتعيين قناة الفلورسنت إلى القناة الحمراء وصورة الحقل الساطع إلى قناة Grays.
   11. احفظ المركب كملف PNG.

5. رامان التحليل الطيفي

1. قم بتشغيل أداة Raman والكمبيوتر المرتبط بها ، مما يسمح لكل منها ببدء التشغيل.
2. افتح البرنامج على الكمبيوتر المتصل بأداة رامان.
3. عند تهيئة البرنامج ، تأكد من أن حالة نشاط النظام الحالي وكاشف على الشريط السفلي من شاشة البرنامج تقرأ جاهز واللون الأخضر ، على التوالي.
4. إذا كان زر المعايرة التلقائية (AC) في الجزء السفلي من الشاشة أحمر، فقم بتشغيل المعايرة التلقائية المطلوبة واتركها تنتهي قبل المتابعة.
5. إذا كنت تستخدم ليزر واحد فقط وشبكة واحدة:
   1. انقر فوق خروج على شاشة المعايرة التلقائية ، ثم حدد الليزر المطلوب والشبكة من القوائم المنسدلة الخاصة بكل منهما ضمن إعداد الأداة في علامة التبويب اكتساب .
   2. ارجع إلى زر التيار المتردد الأحمر في الجزء السفلي من الشاشة وانقر فوق الليزر الحالي / الشبكة واسمح بتشغيل روتين المعايرة.
6. إذا كنت تستخدم جميع أشعة الليزر والحواجز شبكية ، فما عليك سوى تحديد جميع أشعة الليزر وشبكات والسماح للنظام بالتشغيل.
7. إذا كنت تستخدم أكثر من ليزر و / أو صريف ، فحدد الليزر / المشابك المخصصة وحدد جميع الإعدادات المطلوبة. ثم اسمح للمعايرة بالتشغيل.
8. حدد هدف مسافة العمل الطويلة (LWD) 20x على برج الجهاز ، وداخل البرنامج ضمن إعدادات الأداة في علامة التبويب الاستحواذ .
9. إذا لم يكن هذا الهدف متاحا، فاستخدم هدفا بديلا للتكبير المنخفض (على سبيل المثال، 5x أو 10x) مع مسافة عمل تستوعب ارتفاع قرص المرشاح.
   ملاحظة: ابدأ بهدف تكبير أقل لتسهيل التنقل الأولي عبر الغشاء النانوي لقرص المرشح.
10. ضع قرص المرشح على مرحلة المجهر بحيث يكون داخل المسار البصري.
11. انقر فوق اكتساب الفيديو في الشريط العلوي لتشغيل بصريات المرئيات.
12. استخدم عجلات التركيز البؤري الخشنة والناعمة على الجهاز لتركيز الغشاء النانوي لقرص المرشح.
13. قم بتربيع المسام تقريبا باستخدام خطوط المؤشر النقطية على شاشة الكمبيوتر.
14. إما أن تقوم بتدوير قرص المرشح برفق على المسرح لتحقيق هذه المحاذاة المربعة ، أو استخدم شريحة محاذاة خاصة لاستخدام قرص المرشح في مرحلة المجهر.
15. ضمن علامة التبويب Acquisition في أعلى اليمين ، تأكد من أن وضع الإضاءة المحدد هو حقل Dark للحصول على أفضل النتائج.
16. للحصول على صورة مخيطة، انتقل إلى علامة التبويب فيديو في شريط علامات تبويب البيانات.
17. انتقل إلى مجال الرؤية الأول المطلوب ، ثم انقر فوق الزر Mosaic في الجزء العلوي الأيمن من نافذة الفيديو وأضفه إلى الخريطة. انتقل إلى الزاوية الخارجية المقابلة للمنطقة المطلوبة باستخدام عصا التحكم في الأداة وأضفها إلى الخريطة.
18. قم بتشغيل عملية الاستحواذ على الفسيفساء باستخدام ViewSharp للتأكد من أن جميع المناطق في التركيز بشكل صحيح في الصورة النهائية.
    ملاحظة: ستستغرق أهداف التكبير المنخفضة وقتا أقل للحصول على فسيفساء الصور، بينما ستستغرق أهداف التكبير الأعلى وقتا أطول.
19. بمجرد إنشاء فسيفساء الصورة ، انقر بزر الماوس الأيمن فوق الصورة واضغط على إرسال إلى ParticleFinder.
20. انتقل إلى علامة التبويب ParticleFinder في الشريط العلوي الأيمن للتفاعل مع إعدادات العتبة.
21. للتأكد من تحديد الجسيمات المناسبة، انقر بزر الماوس الأيسر فوق الصورة ضمن علامة التبويب بيانات ParticleFinder للتحقق من مربعات المركز والجسيمات والشفافية. قم بتعيين شريط تمرير الشفافية إلى 50٪، وحجم البكسل في Center إلى 2 بكسل.
    ملاحظة: سيضع تحديد المركز نقطة في مركز كل جسيم، وسيضع تحديد الجسيمات تراكبا على كل منطقة تم تحديدها على أنها جسيم، بشفافية بنسبة 50٪. ستحدد هذه الإعدادات موقع كل جسيم وتحدد حواف كل جسيم.
22. إذا لزم الأمر ، قم بتحرير معلمات عتبة الجسيمات والمورفولوجيا / الحجم ضمن علامة التبويب ParticleFinder على الجانب الأيمن من البرنامج لضمان تحديد جميع الجسيمات ومعلمات الحجم / الشكل بشكل صحيح. راجع الجدول التكميلي S2 للحصول على مثال على كيفية تطبيق المعلمات المورفولوجية.
    1. إذا لم يكن الكشف التلقائي عن الجسيمات كافيا، فقم بالتبديل إلى الدليل وضبط قيم العتبة بشكل تدريجي حتى يتم تحديد غالبية الكائنات الصحيحة كجسيمات.
    2. إذا كانت مورفولوجيا الجسيمات المكتشفة بحاجة إلى مزيد من التحسين ، فحدد المربع بجوار تطبيق المرشحات المورفولوجية. حدد المعلمات المناسبة وكثافتها في القوائم المنسدلة الناتجة.
       ملاحظة: يمكن أن يؤثر الترتيب الذي يتم به تحديد المعلمات على الإخراج.
23. إذا كان الحجم أو الشكل أو الصفات المورفولوجية الأخرى للجسيمات من العوامل الحرجة ، فحدد المربع بجوار تطبيق المرشح المسبق للجسيمات ، ثم حدد المعلمات وقم بتحريرها حسب الحاجة.
24. بمجرد تحديد الجسيمات وقبول الأشكال/الحواف المحددة ، انتقل إلى قائمة المعاينة القابلة للتمرير لصور الجسيمات ضمن قسم النتائج . حدد الجسيمات (الجسيمات) ذات الأهمية بالنقر فوق صورة الجسيمات المقترنة.
25. قم بتشغيل المنظر المباشر باستخدام زر كاميرا الفيديو أعلى الشاشة.
26. قم بالتبديل إلى هدف 50x LWD بالنقر فوق رقم التكبير وتحديد الهدف المقابل في القائمة المنسدلة، داخل التطبيق في الشريط السفلي.
27. أعد التركيز على الجسيمات (الجسيمات) باستخدام مقبض الضبط الدقيق ، إذا لزم الأمر.
28. التقاط صور للجسيمات الفردية ليتم تحليلها باستخدام التحليل الطيفي رامان ، وحفظ الصور كملفات منفصلة بأسماء مناسبة.
29. تأكد من وضع المنطقة المطلوبة من الجسيم المراد تحليله باستخدام التحليل الطيفي رامان بشكل صحيح تحت موقع شعاع الليزر.
30. بمجرد تحديد المنطقة المناسبة من الجسيم للتحليل ، اضغط على إيقاف الكل زر في الجزء العلوي من النافذة لإيقاف تشغيل بصريات التصور.
31. اضبط الليزر على 532 نانومتر ، بقوة 1٪ للجزيئات غير الملوثة ، وعند 785 نانومتر أو 830 نانومتر للجزيئات الملطخة بالفلورسنت.
32. اضبط وقت الاستحواذ على 10 ثوان والتراكمات على 5.
33. حدد علامة التبويب Spectra من قائمة علامات تبويب البيانات ، ثم اضغط على زر التشغيل لتشغيل Real Time Display (RTD).
    ملاحظة: استخدم المعلومات التي تم الحصول عليها أثناء RTD لتحسين الإعدادات.
34. بمجرد الرضا عن الإعدادات والنتائج ، اضغط على إيقاف الكل لإيقاف RTD.
35. يمكن الآن جمع الاستحواذ النهائي بالضغط على زر دائرة Spectrum Aquisition بجانب زر RTD.
36. احفظ الأطياف التي تم جمعها كملفات منفصلة بأسماء مناسبة.
37. كرر الخطوات 5.28-5.36. لكل جسيم محل اهتمام.
38. عند الانتهاء من العينة ، قم بإزالة قرص المرشح وأعد الهدف إلى 20X LWD يدويا على النطاق وداخل البرنامج.
39. كرر الخطوة 5.10-5.37 للعينات الجديدة.

6. تحديد طيفي

1. إذا لم تكن قاعدة بيانات رامان الطيفية المشتراة أو المبنية ذاتيا متوفرة ، فانتقل إلى مكتبة التحليل الطيفي مفتوحة المصدر على: https://www.openanalysis.org/openspecy/
   ملاحظة: OpenSpecy هي قاعدة بيانات طيفية مفتوحة المصدر Raman و IR تتضمن 636 طيفا من ثلاث مكتبات مختلفة من 276 بوليمر ومواد قابلة للتطبيق لتحديد MPS والألياف البيئية²¹. البيانات الطيفية المعالجة مسبقا واللاحقة قابلة للتطبيق بنفس القدر للاستخدام مع هذا المورد.
2. احفظ أطياف رامان كملفات .csv فردية.
   1. قم بتسمية العمود A كرقم موجي متبوعا بالأرقام الموجية للأطياف ، ويجب تسمية العمود B بالكثافة متبوعا بقيم كثافة الذروة لكل رقم موجي.
3. افتح الأطياف عن طريق سحب ملف .csv وإفلاته في شريط التصفح في أعلى اليسار.
4. فعل المعالجة المسبقة وتحديد الهوية.
5. ضمن المعالجة المسبقة، قم بتشغيل ضوضاء إشارة العتبة، والحد الأدنى لحد أقصى للتطبيع، والتنعيم/المشتق، والأرقام الموجية المطابقة، وتصحيح خط الأساس.
   ملاحظة: يمكن ضبط الإعدادات المحددة فيها اعتمادا على الخصائص الفردية للأطياف التي يتم تحليلها.
6. ضمن التعريف، حدد رامان كنوع الطيف والمشتق كتحويل المكتبة.
   ملاحظة: يمكن استخدام هذه المكتبة للتحليل الطيفي بالأشعة تحت الحمراء أيضا. ستظهر نافذة التحليل طيفا أبيض ، والطيف الذي تم تحميله للتحليل ، والطيف الأحمر ، وهو تطابق التعريف المشتبه به.
7. مع أي أطياف لا ترجع تطابقا r > 0.70 ، أو ارتباطات معقولة لشكل الذروة ، استخدم أهم 5 نتائج مقترحة كمكان لبدء البحث عن التطابقات المحتملة حسب الرغبة.
8. تأكد من أن قيم الذروة المقاسة تقع ضمن ±10 أرقام موجية من ذروة مقابلة في الأطياف المرجعية المحددة قبل تأكيد تطابق تلك الذروة.
9. سجل الارتباطات الطيفية وقيم الارتباط الخاصة بها وقاعدة البيانات التي نشأ منها المطابقة المشتبه بها.
10. قم بتنزيل الملفات وفقا للاحتياجات الفردية.

7. مسح المجهر الإلكتروني

ملاحظة: إذا لم يكن قرص المرشح مغطى بالمعدن قبل تحليل SEM ، فانتقل إلى القسم 7.2.

1. طلاء معدني لعينات SEM
   1. قم بتركيب قرص المرشح على كعب SEM فولاذي باستخدام شريط كربوني.
   2. أدخلها في جهاز الرش وضخ الغرفة إلى 50 mTorr.
   3. افتح صمام عزل Ar (الأرجون) الاخرق.
   4. قم بتطهير النظام عن طريق إدخال Ar في الغرفة عبر صمام إبرة إلى ضغط 300 mTorr ، ثم قم بإخلاء الغرفة إلى 50 mTorr. كرر 3 مرات.
   5. اضبط الضغط النهائي إلى 100 mTorr عبر صمام الإبرة.
   6. باستخدام هدف Au ، قم بإيداع Au على قرص المرشح عن طريق الاخرق.
      ملاحظة: يمكن بدلا من ذلك استخدام مصادر مستهدفة أخرى (مثل Pt و IR و Si وما إلى ذلك) بدلا من Au ؛ ينتج تيار 20 مللي أمبير 0.1 أنجستروم / ثانية من الترسيب عند 100 mTorr.
   7. قم بتنفيس النظام وإزالة قرص التصفية. حافظ على قرص المرشح ملتصقا بكعب الفولاذ المقاوم للصدأ.
2. التقاط صورة التسويق عبر محرك البحث
   1. اربط كعب الروتين بحامل Zeiss Auriga متعدد المراحل باستخدام برغي مثبت.
   2. قم بتشغيل محرك البحث وأجهزة الكمبيوتر التي تقوم بتشغيله ، واسمح لكل منها ببدء التشغيل.
   3. افتح البرنامج المرفق بالتسويق عبر محرك البحث.
   4. تحقق من أن النظام تحت الفراغ (5e-6 Torr).
   5. قم بتنفيس قفل التحميل بالضغط على فتحة التهوية على الهيكل الرئيسي لغرفة قفل التحميل ، وافتح قفل التحميل.
   6. قم بتركيب الحامل متعدد المراحل على رقصة الإدخال المطلية بالتفلون وربط ذراع النقل باستخدام لوحة المسمار المرفقة.
   7. أغلق قفل التحميل ، وضخ قفل التحميل بالضغط على المخزن على الجسم الرئيسي لغرفة قفل التحميل.
      ملاحظة: يحدث الاكتمال عندما تتوقف الأضواء الخضراء عن الوميض على زر المتجر .
   8. قم بتحميل الحامل متعدد المراحل على المسرح في غرفة المراقبة الرئيسية عن طريق فتح بوابة النقل.
   9. اضغط على نقل على الجسم الرئيسي لقفل الحمل. سوف تسقط البوابة وتكشف الغرفة الداخلية.
   10. أدخل ذراع قفل التحميل (المثبت في الحامل متعدد المراحل) وقم بتثبيت الحامل متعدد المراحل على المسرح.
   11. قم بفك ذراع نقل قفل التحميل وسحب الذراع بالكامل بحيث يكون موجودا في قفل التحميل.
   12. أغلق بوابة النقل بالضغط على تحويل.
   13. افتح صمام العزل بالضغط على EHT في الزاوية اليمنى السفلية من البرنامج.
   14. اضبط مسافة العمل لتكون 5 مم في منطقة بيانات البرنامج ، والجهد المتسارع ليكون 20 كيلو فولت.
   15. قم بترجمة غشاء قرص المرشح باستخدام أذرع التحكم XY وZ.
   16. ارفع المسرح باستخدام عصا التحكم Z حتى يتم التركيز على الصورة.
   17. قم بتصحيح الاستجماتيزم عن طريق ضبط مقابض الوصمة XY وعجلة التركيز على الكونسول المركزي.
   18. عينة من جزيئات الصورة عند التكبير المطلوب عن طريق ضبط عجلة التكبير على الكونسول المركزي، والتقاط صور بدقة 2,048 × 1,536 بتنسيق tiff 8 أو 16 بت.
3. تحليل جسيمات EDX
   1. قم بإيقاف تشغيل ChamberScope CCD على سطح مكتب كمبيوتر SEM.
      ملاحظة: إذا لم تكتمل هذه الخطوة ، إغراق كاشف EDX بالإشارة ولن يتم تسجيل أي بيانات.
   2. قم بتبريد كاشف EDX عن طريق فتح برنامج APEX EDX على كمبيوتر EDX ، عن طريق تشغيل الكاشف في قائمة الزاوية اليمنى العليا.
   3. التقط صورة SEM منخفضة الدقة يمكن استخدامها لرسم الخرائط، بالنقر فوق التقاط صورة.
   4. افتح قائمة علامة تبويب التعيين في الجزء العلوي من شاشة البرنامج.
   5. ضمن الإعدادات، اضبط الدقة (256 × 256) ووقت بقاء البكسل (0.16 ميكرو ثانية)، ورقم الإطار (32-64) لتوفير وقت تقديري للالتقاط يجب أن يكون ~ 5 دقائق.
   6. انقر فوق إنشاء خريطة في الزاوية العلوية اليسرى من القائمة.
   7. حدد Confirm Element Preview لضبط البحث عن العنصر يدويا، أو اعتمد على القمم المحددة تلقائيا من البرنامج.
   8. قم بإنشاء تقرير باستخدام وظيفة "التقرير التلقائي" في القسم العلوي الأيسر من برنامج التعيين عند الانتهاء.

Results

معالجة الفراغات وتلوث الخلفية
النتيجة الفارغة المقبولة هي تلك التي لا تحتوي إما على جزيئات أو عدد قليل جدا من الجسيمات بحيث لا يؤدي تلوث الخلفية (أي العملية) (إن وجد) إلى احتمال كبير لإرباك أو تعطيل نتائج التجربة. النتيجة الفارغة دون المستوى الأمثل هي تلك التي تحتوي على العديد من الجسيمات التي يصعب تمييز الجسيمات ذات الأهمية عن تلوث الخلفية.

يجب أن يكون المستوى المقبول لتلوث العملية عند الصفر أو قريبا منه قدر الإمكان ، ولكن إذا تعذر تحقيق الصفر ، فإن الاتساق في عدد جسيمات الخلفية المرصودة هو المفتاح. قم بتشغيل عدة عينات فارغة لتحديد تناسق النتائج. يعد الاجتهاد في بروتوكولات مراقبة الجودة (راجع القسم 1) ، والتخفيف من التلوث ، والظروف البيئية المناسبة أثناء المعالجة أمرا بالغ الأهمية للحفاظ على مستويات منخفضة من التلوث في الخلفية. قد تعتمد نتائج التلوث في الخلفية وقبولها أيضا بشكل كبير على قطع الأغشية النانوية المستخدمة ، والنظافة العامة لظروف المختبر. ضع في اعتبارك أنه عند تحليل الجسيمات الأصغر ذات الأغشية المقطوعة المنخفضة (على سبيل المثال ، < 8 ميكرومتر) ، فإن الوفرة النسبية للجزيئات ذات الأهمية والملوثات الخلفية ذات الحجم المماثل ستزداد بشكل كبير ، مما يستلزم تطبيق مستويات أعلى من الصرامة في مراقبة الجودة²². في حين أن أي مستوى من التلوث غير مقبول ، طالما أن الظروف خاضعة لرقابة صارمة ويتم تحقيق درجة عالية من الاتساق ، فقد يستمر إجراء تحليلات جيدة للجدائن الدقيقة البيئية أو التحليلات ذات الأهمية.

ترشيح العينة
هناك حاجة إلى ترشيح مثالي للعينة لإنشاء تحليل متعدد الوسائط مخلص ، كما هو موضح في مثال تتالي البيانات في الشكل 3. سيؤدي ترشيح العينة هذا إلى جزيئات مشتتة جيدا عبر سطح الغشاء النانوي (على سبيل المثال ، مع ما يقرب من ثلث تغطية مساحة سطح الغشاء). ستؤدي الجسيمات المشتتة بشكل سيئ ، مثل حالة تجميع الجسيمات (كتل كبيرة من الجسيمات المتداخلة) ، إلى إرباك طرق عد الجسيمات اليدوية والآلية ، حيث لا يمكن تمييز الجسيمات المتداخلة بسهولة بثقة. وعادة ما تستبعد هذه البيانات من التحليل، مما قد يؤدي إلى فقدان المعلومات القيمة ذات الأهمية. تضمن الجسيمات المشتتة جيدا ، كما هو موضح في الشكل 4 أ ، ب ، أن أي تحليلات طيفية أو قياس كمي ليست معقدة بسبب الجسيمات المكدسة أو المتداخلة ذات التركيبات المختلفة ، والتي يمكن أن تعيد نتائج يصعب تفسيرها وتحديدها وتحديدها بدقة.

تلطيخ أحمر النيل والأزرق التربان
تظهر الصور التمثيلية لحالات تلطيخ الجسيمات الفلورية المثلى في الشكل 3 ب على قرص مرشح SiN مقطوع 20 ميكرومتر. قد يؤدي الشطف الناقص لصبغة NR أو السل من سطح الغشاء النانوي إلى نتائج إيجابية خاطئة. قد يتم تفسير الجسيمات المتبقية التي تتكون من أي من البقعة المحتجزة على سطح الغشاء بسبب عدم كفاية الشطف بشكل خاطئ على أنها جزيئات ملطخة. علامة على حدوث شطف غير كاف هي إذا كانت مناطق الغشاء النانوي بدون جزيئات أو أغشية / بقايا متبقية يمكن اكتشافها من العينة المفلترة تتألق أثناء المراقبة ، كما هو موضح في الشكل 5 أ. بعد التصوير ، طالما تم الحفاظ على قرص المرشح في ظروف نظيفة ، يمكن إجراء إعادة الشطف عن طريق وضع قرص مرشح الغشاء النانوي الفردي مرة أخرى على جهاز الترشيح الفراغي (مطروحا منه الحشوات) ، وتشغيل الفراغ ، وتصفية حجم آخر من Ultra نقاء 99٪ IPA (ل NR) أو الماء عالي النقاء (للسل) على الغشاء النانوي لقرص المرشح. سجل الحجم الإجمالي لوسائط الشطف الإضافية المستخدمة. للحصول على أفضل النتائج ، التقط صورا مجهرية لسطح الغشاء النانوي بالكامل قبل إجراء إعادة الشطف لمراعاة أي تلوث يحتمل أن يحدث بسبب خطوة إعادة الشطف.

التحليل الطيفي رامان
قد ينتج عن التحليل الطيفي رامان الذي يتم إجراؤه على SiN غير المطلي ذروة بارزة اعتمادا على الطول الموجي لليزر ، وقد تخفي هذه الذروة إشارات منخفضة الوفرة تقريبا داخل منطقة الرقم الموجي 520 سم ^{-1 23}. إذا تم فصل أطياف رامان ذات الأهمية بشكل كاف عن ذروة خلفية السيليكون أو نيتريد السيليكون ، فإن استخدام أقراص مرشح SiN غير المطلية يجب أن يؤدي إلى نتائج طيفية رامان كافية. في هذا التقرير، استخدم كل من خطوط الأنابيب B و C أقراص تصفية Au-SiN. يخفي الطلاء الذهبي ل Au-SiN ذروة Si المتأصلة ، مما يسمح بجمع أطياف الوفرة المنخفضة بشكل أكثر موثوقية بالقرب من أو عند الأرقام الموجية 520 سم ^-1 . بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام Au-SiN مع التحليل الطيفي بالأشعة تحت الحمراء إذا لم يكن رامان متاحا. ابدأ دائما بأقل إعدادات الطاقة (أي شدة الليزر) على الجهاز ثم قم بزيادته تدريجيا ، حيث يمكن أن تكون بعض الجسيمات ذات الأهمية هشة ، مثل الجسيمات المؤكسدة ، وقد تتلف أو تدمر بواسطة الليزر.

عند تحليل الجسيمات المختارة باستخدام التحليل الطيفي رامان ، يعد تحديد موثوقية الطيف المرتجع أمرا بالغ الأهمية. قد تتألق بعض الجسيمات تلقائيا ، وسيضيف هذا التألق ضوضاء إلى القياس الطيفي الذي قد يخفي أو يعقد تفسير إشارة الجسيمات. ستأخذ هذه الضوضاء شكل نطاق عالي الكثافة يمتد عبر نطاق واسع من الأرقام الموجية ، مما يخلط بين البيانات الأساسية. الأطياف المناسبة ، الموضحة في الشكل 3C والشكل 4C ، D ، حتى قبل تصحيح خط الأساس ، سيكون لها قمم محددة بوضوح عبر فترات أقصر من الأرقام الموجية. إذا لم تظهر قمم أكبر بثلاث مرات على الأقل من أي من الإشارات المحيطة ، فمن المحتمل أن تكون الأطياف المجمعة إما ضوضاء خلفية ، أو أن إعدادات أداة مختلفة مطلوبة لتحليل الجسيم المعني. تأكد من تحديد الطول الموجي المناسب لكل عينة. لا يمكن لليزر ذو الطول الموجي المنخفض ، مثل ليزر 532 نانومتر ، التعامل بشكل كاف مع الإشارة الناتجة عن التألق. يمكن لليزر ذو الطول الموجي الأعلى ، مثل ليزر 782 نانومتر أو 830 نانومتر ، أن يتجاهل ما يكفي من التألق لإرجاع الطيف. اعتمادا على نوع العينة ، ستكون أشعة الليزر المختلفة مناسبة لأنواع الجسيمات المختلفة ، وإذا أمكن ، يمكن تبادلها أثناء جمع البيانات على قرص مرشح واحد.

لتحديد تكوين الجسيمات ، تتم مقارنة أطيافها التي تم جمعها بتلك الموجودة في قاعدة بيانات الأطياف المرجعية. سيؤدي التحديد الموثوق لأطياف جسيمات معينة إلى معامل بيرسون (r) أكبر من 70٪ (ص > 0.70). يتم عرض بيانات رامان دون المستوى الأمثل في الشكل 5 ب ، حيث < 0.70. تعد نتائج تحديد MP مفيدة في تحديد المصادر المحتملة لتلوث MP. لعرض نتائج تحديد الجسيمات ، يمكن عرض صورة وأطياف الجسيم الذي تم تحليله كما في الشكل 3C والشكل 4C.

مسح المجهر الإلكتروني
تتوافق كل من أقراص مرشح SiN و Au-SiN مع SEM مباشرة بعد التقاط الجسيمات عن طريق الترشيح. إذا لم تكن أقراص مرشح SiN مطلية ب Au أو Pt قبل SEM وبعد التقاط الجسيمات ، فقد يتم "شحن" بعض الجسيمات بسهولة أكبر بواسطة شعاع التأين ل SEM ، مما قد يتسبب في توهج الجسيم أو ظهوره ساطعا جدا في الصور. يمكن أن يتسبب هذا السطوع / التوهج في حدوث مشكلات في التصور بسبب ضعف التباين ، مثل إخفاء مورفولوجيا الجسيم. للتخفيف ، قم بإجراء الفحص المجهري البصري / الفلوري وتحليل رامان الطيفي قبل SEM لتحديد أي جزيئات يصعب تحليلها أو جزيئات صغيرة ذات أهمية لتحليل SEM / EDX لاحقا ، ثم قم بتغطية الغشاء النانوي ب Au أو Pt كما هو موضح في قسم البروتوكول 7 ، وقم بإجراء SEM / EDX.

يساعد طلاء SiN أو Au-SiN باستخدام Au أو Pt بعد التقاط الجسيمات وقبل تحليل SEM في منع تأثير الشحن هذا أثناء التصوير ، حيث لم تعد الجسيمات الآن عرضة للتأين تحت الطبقة المعدنية التي تم التخلص منها. يعمل هذا الطلاء على تحسين التباين والدقة ، لذلك يمكن الحصول على فهم مورفولوجي أكبر لجسيم معين ، كما هو موضح في الشكل 3D (الألياف مقابل الشظية) أو الأشكال السطحية ، مثل الحفر والشقوق على الجسيمات المؤكسدة. ستمنعها جزيئات الطلاء المعدني قبل تحليل SEM بشكل دائم من التحليل الإضافي باستخدام التحليل الطيفي أو التصوير الفلوري ، مما يجعل تحليلات SEM / EDX فقط لا تزال ممكنة. وبالتالي ، يجب أن يكون طلاء الجسيمات وأداء SEM / EDX هي الخطوات النهائية في أي عملية إذا كان ذلك مقصودا.

يمكن إجراء قياسات EDX على الجسيمات الملتقطة قبل وبعد الطلاء المعدني. يمكن أن يكشف EDX عن التركيب الأولي المحدد لجسيم أو منطقة معينة ، والتي تتزاوج جيدا مع أي جزيئات أصغر من حد حجم الكشف لتحليل رامان ، أو تركيبات عنصرية يصعب تحليلها باستخدام بعض الأطوال الموجية لليزر رامان مثل المعادن والسبائك والجسيمات المشبعة بالماء والجسيمات التي تتألق بقوة عند تعرضها لشعاع (حزمات) ليزر رامان المتاحة للاستخدام. في هذه الدراسة ، تم طلاء الجسيمات بطبقة بسمك 6 نانومتر من Au. تم إجراء تصوير SEM بين تكبير 200x-3,000x مع قوة شعاع 20 كيلو فولت وطول بؤري يبلغ 5 مم. تظهر صور SEM الخاصة بالجسيمات المحددة في الشكل 3D.

تظهر نتائج EDX التمثيلية في الشكل 3F. يمكن اعتبار العناصر المكتشفة بوزن نسبة مئوية أقل من 1٪ متتبعة أو غير موثوقة اعتمادا على حساسية الأداة ؛ لذلك ، وضعنا عتبة عند 1٪. إذا تم طلاء الجسيمات المختارة لتحليل EDX ، فستكون هناك كمية يمكن اكتشافها من الطلاء في تقرير بيانات العناصر. في حالة استخدام أقراص مرشح SiN غير المطلية ، ستلاحظ إشارات Si و N ، كما هو موضح في الشكل 3F. ستحتوي معظم جزيئات البوليمر الاصطناعية أيضا على العناصر C و H و O ، لسوء الحظ ، حيث أن معظم الجسيمات غير الاصطناعية من المصادر البيولوجية مصنوعة أيضا من نفس العناصر ، ولكن يمكن أن تشمل الجسيمات غير الاصطناعية أيضا عناصر مثل S ، كما في حالة البروتينات. هذا التشابه في التركيب هو السبب في أن طريقة التلوين المضادة مع Nile Red و Trypan Blue مفيدة للتمييز بين الجسيمات الاصطناعية مقابل الجسيمات غير الاصطناعية ، ولكنها ليست أداة تحديد شاملة ، حيث أن Nile Red قادر أيضا على تلطيخ الجسيمات غير الاصطناعية في حالات معينة أيضا. يجب استخدام معلمات التحليل الإضافية مثل تلك المقترحة أعلاه جنبا إلى جنب مع أي إجراءات تلطيخ لتأكيد النتائج. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن يكون EDX أداة مفيدة لتحديد الجسيمات المحتملة التي تقع خارج حد حجم الكشف عن التحليل الطيفي رامان (أي اللدائن النانوية التي يبلغ قياسها < 1 ميكرومتر).

الشكل 1: خطوط أنابيب SNAP. (أ) مخططات خطوط أنابيب SNAP ، توصيف نفس الجسيمات على نفس الغشاء النانوي عبر سلسلة من التقنيات التحليلية المختلفة. خط الأنابيب أ) يوضح 1) الجسيمات التي تم التقاطها ذات الأهمية من عينات مياه الشرب عن طريق الترشيح الفراغي هي 2) ملطخة بأحمر النيل والأزرق التربان للتمييز بين الجسيمات البوليمرية الاصطناعية مقابل الجسيمات البوليمرية غير الاصطناعية ، على التوالي ، متبوعة ب 3) تحديد الجسيمات عبر التحليل الطيفي رامان ، و 4) SEM / EDX لتوصيف مورفولوجيا الجسيمات وتحديد العناصر. خط الأنابيب ب) يوضح 1) التقاط الجسيمات على Au-SiN متبوعا ب 2) التحليل الطيفي رامان. خط الأنابيب ج) يوضح 1) التقاط الجسيمات على Au-SiN متبوعا ب SEM / EDX. (ب) تخطيطي لقرص المرشح وحشية السيليكون في إعداد الترشيح في جهاز التفريغ ، يصور الترشيح المتسلسل من خلال غشاء نانوي MSSN 20 ميكرومتر ، ثم 8.0 ميكرومتر MSSN ، مفصولة بحشوات سيليكون. الاختصارات: SNAP = خط أنابيب تحليل غشاء النانو السيليكون. SEM = مسح المجهر الإلكتروني ؛ EDX = التحليل الطيفي للأشعة السينية المشتتة للطاقة ؛ MPSN = نيتريد السيليكون الصغير الذي يسهل اختراقه. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: مصادر جمع عينات مياه الشرب. خريطة إقليمية نشرتها هيئة مياه مقاطعة مونرو تصور المواقع التي تم جمع كل من عينات مياه الشرب الأربع منها في منطقة روتشستر الكبرى ، نيويورك. نشأت العينات من مصادر المياه السطحية المختلفة: بحيرة أونتاريو (زرقاء) ، وبحيرة الشوكران (الأخضر) ، وبحيرة الشوكران وبحيرة أونتاريو (الصفراء) ، وبحيرة كانانديغوا (الأرجواني). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: ملخص التحليلات من خط أنابيب SNAP A الذي تم إجراؤه على الجسيمات التي تم التقاطها من عينات مياه الشرب. (أ) صورة ذات تدرج رمادي للجزيئات الملتقطة من عينة واحدة من مياه الشرب التمثيلية على SiN مقطوعة بمقدار 20 ميكرومتر. (ب) صورة تراكب ملونة زائفة للجسيمات الملطخة لتمثيل أحمر النيل (جزيئات حمراء زائفة اللون) و Trypan Blue (جزيئات زرقاء زائفة اللون). (ج) أطياف رامان المرجعية (باللون الأحمر) والمجمعة (الأبيض) التي تحدد جسيم النيل الملون باللون الأحمر على أنه بولي إيثيلين بقيمة بيرسون r تبلغ 0.97 ، مع تحليل صورة تمثيلية للجسيم. (د) صورة مجهرية إلكترونية لنوعين مختلفين من الجسيمات توضح تحليل مورفولوجيا الجسيمات للألياف (اللوحة العلوية) والجزء (اللوحة السفلية) ، وكلاهما يشغل بقعة Trypan Blue. (ه) القياس الكمي للجسيمات الملطخة باللون الأحمر النيلي التي تم التقاطها بالتتابع على كل من الأغشية النانوية المقطوعة 20 ميكرومتر و 8 ميكرومتر. (و) تحليل عنصر EDX الملخص لجزء تم اختياره عشوائيا والتفاصيل التحليلية للنتائج مع صورة SEM التمثيلية للجسيم الذي تم تحليله. الاختصارات: SNAP = خط أنابيب تحليل غشاء النانو السيليكون. SEM = مسح المجهر الإلكتروني ؛ EDX = التحليل الطيفي للأشعة السينية المشتتة للطاقة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4: ملخص التحليلات من خط أنابيب SNAP B التي تم إجراؤها على الجسيمات التي تم التقاطها من عينات مياه الشرب. تحليل رامان الطيفي لثلاثة جسيمات عشوائية من أربع عينات من مياه الشرب المنزلية تم التقاطها على أقراص ترشيح MPSN 20 ميكرومتر و 8.0 ميكرومتر MSSN Au-SiN. تظهر صور المجال المظلم التمثيلية لإجمالي مساحة الغشاء النشط ل 20 ميكرومتر و 8 ميكرومتر Au-SiN على التوالي في A و B. تظهر الجسيمات باللون الأصفر في وضع التصوير هذا بينما تظل الخلفية مظلمة ، مما يسمح بسهولة العد الآلي للجسيمات. أطياف رامان التمثيلية للجسيمات الاصطناعية وغير الاصطناعية على (C) 20 ميكرومتر و (D) 8.0 ميكرومتر Au-SiN. يتم تجميع إجمالي عدد الجسيمات ل (E) 20 ميكرومتر و (F) 8.0 ميكرومتر Au-SiN حسب نطاقات الحجم التي يحددها برنامج البحث الآلي عن الجسيمات. الاختصارات: SNAP = خط أنابيب تحليل غشاء النانو السيليكون. SEM = مسح المجهر الإلكتروني ؛ EDX = التحليل الطيفي للأشعة السينية المشتتة للطاقة ؛ MPSN = نيتريد السيليكون الصغير الذي يسهل اختراقه؛ MSSN = نيتريد السيليكون الصغير. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 5: التصوير الفلوري دون المستوى الأمثل ونتائج التحليل الطيفي رامان. (أ) صورة مضان دون المستوى الأمثل للجزيئات الملطخة (اللوحة اليسرى) ، حيث احتفظ الغشاء ببقعة النيل الأحمر ، على الأرجح من الشطف الخفيف. تم اختيار جسيمين ، ألياف Trypan Blue Stain وجزء من النيل الأحمر (اللوحة اليمنى) ، للتحليل الطيفي رامان. (ب) نتائج التحليل الطيفي رامان دون المستوى الأمثل حيث يكون معامل بيرسون (r) أقل من 70٪ (ص < 0.70). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول التكميلي S1: خصائص الأغشية النانوية المصنوعة من السيليكون داخل أقراص التصفية. موضحة في هذا الجدول خصائص الأغشية داخل أقراص مرشح SiN ، بما في ذلك الحد الأدنى لحجم المسام ، والنسبة المئوية للمسامية ، وسمك الأغشية مع وبدون طلاء Au ، والمنطقة النشطة للغشاء ، ونفاذية الغاز عبر الغشاء مع الضغط الإيجابي المطبق عند ضغط ثابت محدد. يتم تحديد القطع (أي حجم المسام) والمسامية والسمك ومساحة الغشاء عن طريق قياس الميزات على صور SEM. يتم الإبلاغ عن بيانات نفاذية الغاز كمتوسط ± الانحراف المعياري (ن = 10) للضغط الإيجابي N 2 المطبق عند 103.42 كيلو باسكال. الاختصارات: Au = ذهب ؛ Si_x N_y = نيتريد السيليكون غير المتكافئ. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الجدول التكميلي S2: عدد ومعلمات ParticleFinder. تم التقاط فسيفساء صورة منطقة الغشاء الكاملة لكل عينة ، وتم تحليل كل فسيفساء صورة لجمع إجمالي عدد الجسيمات. موضحة في هذا الجدول هي المعلمات المستخدمة وبأي ترتيب لتحديد إجمالي عدد الجسيمات لكل صورة عينة ، وعدد الجسيمات عند كسور حجم معينة. تختلف المعلمات من عينة إلى أخرى نظرا لنوع الجسيمات وكميتها وشكلها ، بالإضافة إلى الانعكاسية المحددة لكل غشاء أثناء التصوير. يتم تصور البيانات من هذا الجدول في الشكل 4. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

Discussion

يعد التخفيف من تلوث البلاستيك الدقيق موضوعا متزايدا للقلق. والخطوة الأولى في التخفيف هي تحديد وجود التلوث. تعد الطريقة المبسطة للالتقاط والتحليل الفوري أمرا بالغ الأهمية لتوفير وقت المحققين والحفاظ على مقاييس العينة الحساسة. يصف هذا التقرير تدفقات العمل المرنة بناء على الاختلافات في أساليب SNAP المطورة لدينا لتحليل مثل هذه النواب في العينات السائلة ، باستخدام ركيزة واحدة لجميع التحليلات التي يتم إجراؤها. يجب ترشيح العينة بالفراغ بحيث يتم التقاط الجسيمات وعزلها على غشاء نانوي من السيليكون موجود داخل قرص مرشح. يعد التخفيف الكافي من تلوث الخلفية أمرا بالغ الأهمية لتحقيق نتائج ذات مغزى. قد تؤدي أي جزيئات ملوثة على حقنة الاستغناء أو قمع التفريغ الزجاجي أثناء الترشيح إلى تلويث العينة ويتم التقاطها بشكل متزامن ، لذا فإن اتباع بروتوكولات مراقبة الجودة في القسم 1 بجد أمر بالغ الأهمية للحصول على نتائج دقيقة. يوصى بضوابط الوسائط فقط لإبلاغ المحققين بالتلوث في الخلفية الخاص بالعمليات الفردية والظروف المختبرية. يعتمد البروتوكول الموصوف هنا على الترشيح الفراغي لعينة سائلة ، بالإضافة إلى التقاط وعزل الجسيمات من العينة على قرصين مختلفين لمرشح SiN. بالنسبة لجميع خطوط الأنابيب ، يجب أن يسبق التقاط الجسيمات وعزلها الطرق الأخرى ، ولكن يمكن إجراء جميع طرق تحديد الهوية الأخرى بالترتيب الأنسب للمحقق.

تم استخدام مجهران فلوريتين لهذه الدراسة لإثبات قابلية تكرار النتائج عبر الأدوات. توضح الخطوات التعليمية بالتفصيل على وجه التحديد استخدام أوليمبوس BX61 للفحص المجهري الفلوري نظرا لغلبة استخدامه وتم تشغيله وفقا لتعليمات الأداة باستخدام المجال الساطع للتصوير الرمادي ، قناة TRITC (على سبيل المثال ~ 543 نانومتر ؛ م. ~ 593 نانومتر) لتصوير الجسيمات الملطخة ب NR ، وقناة Cy5 (على سبيل المثال ~ 649 نانومتر ؛ م. ~ 667 نانومتر) لتصوير الجسيمات الملطخة بالسل ، حسب الاقتضاء. لعرض نتائج التلوين ، نوصي بإنشاء تراكب لصور القناة (نستخدم FIJI / ImageJ لمعالجة الصور ، والتي يشار إليها لاحقا باسم منصة تحليل الصور) ، بدقة 2,048 × 2,040 بكسل وعمق 16 بت. يمكن عرض صور الأغشية النانوية الكاملة كما في الشكل 4 أ ، ب أو كمناطق اهتمام محددة كما هو موضح في الشكل 3 أ ، ب.

يستخدم النيل الأحمر بشكل شائع لتلطيخ البوليمرات الاصطناعية ولكن يمكن أن يلطخ البوليمرات غير الاصطناعية من مصادر بيولوجية بسبب طبيعته المحبة للدهون والكارهة للماء ، مما قد يؤدي إلى إيجابيات خاطئة تشوه نتائج القياس الكمي MP^24،25،26. يوصى باستخدام خطوة Trypan Blue المضادة ، كما هو موضح في القسم 3 من البروتوكول ، للمساعدة في التمايز بين الأحداث الإيجابية الكاذبة ولكنها ليست حلا شاملا ويجب إقرانها بمقاييس تحليل إضافية لتأكيد النتائج. يعد تألق الجسيمات الأحمر النيلي مصدر قلق في تحليل التحليل الطيفي رامان لأنه قد يزيد بشكل كبير من إشارة الخلفية. ومع ذلك ، في هذه الدراسة ، قمنا بمعالجة البوليمرات باستخدام Nile Red و Trypan Blue قبل التحليل الطيفي Raman باستخدام ليزر 830 نانومتر ، ولوحظ القليل من الضوضاء ، كما هو موضح في الشكل 3.

بعض الأطوال الموجية لليزر المناسبة للتحليل الطيفي رامان غير قادرة على تجاهل التألق من الجسيمات الملطخة ، مثل ليزر 532 نانومتر ، وبالتالي قد تقدم صعوبة كبيرة في التقدير الصحيح لتكوين الجسيم محل الاهتمام. يعد طلاء الجسيمات المعدنية بعد التقاطها مفيدا لتعزيز التباين أثناء تصوير SEM ولكنه غير متوافق مع أي تحليل طيفي أو فلوري لاحق. قم بتدوين جميع القياسات المطلوبة قبل الإعداد التجريبي للتأكد من أن تدفق العملية وأنواع الطلاء تؤخذ في الاعتبار بشكل صحيح. يمكن استخدام أقراص مرشح Au-SiN لجميع التحليلات المذكورة حيث لا يكون الفحص المجهري للإرسال حاسما لسير العمل ، أو عند استخدام التحليل الطيفي Raman أو IR.

يمكن تعديل الطرق الموضحة هنا ، بالإضافة إلى الأغشية النانوية المستخدمة لالتقاط وعزل الجسيمات ذات الأهمية ، لتناسب احتياجات المحققين الفرديين. الأغشية النانوية مناسبة لعدد من التحليلات الطيفية ، وقد يقوم المحقق بتبديل الوسائط التي يتم ترشيحها بوسائط عينة أخرى ذات أهمية ، بما في ذلك على سبيل المثال لا الحصر الأنسجة الحيوانية المهضومة²⁷ ، والمستحضرات الصيدلانية القابلة للحقن ، وعينات الزيت. تم استخدام جهازي رامان للتحليل الطيفي لهذه الدراسة ، وتوضح الخطوات التعليمية بالتفصيل على وجه التحديد استخدام أداة Horiba XploRA Plus Raman ، والتي جمعت وعالجت جميع البيانات الموضحة في الشكل 4. من المهم أيضا التعرف على حد حجم الكشف لكل مجهر رامان ، لضمان إمكانية تحليل الجسيمات ذات الأهمية بشكل مناسب مع حجم بقعة ليزر الجهاز. لعرض نتائج تحديد الجسيمات باستخدام رامان ، يمكن عرض الأطياف المرجعية والعينة ، بالإضافة إلى صورة للجسيم الذي تم تحليله ، كما في الشكل 3C والشكل 4C.

يوضح القسم 6 من البروتوكول تعليمات لتحديد الجسيمات باستخدام مكتبة طيفية مفتوحة المصدر. يتيح التقاط الجسيمات المستوي على غشاء مسطح بشكل موحد ، بالإضافة إلى مجموعة المسام المنتظمة للغشاء ، التصوير الآلي الذي يمكن التنبؤ به. يمنحهم كل من سمك 400 نانومتر أو 1,000 نانومتر من SiN وتركيبة نيتريد السيليكون الخاصة بهم شفافية بصرية ممتازة ولكنها قد تعيد أيضا ذروة سيليكون مكثفة في بعض معلمات الأدوات الطيفية. يجب توخي الحذر عند استخدام SiN العاري غير المطلي بالمعدن مع تحليل رامان. قد تعمل ذروة Si كإشارة معايرة ، لكن شدة الذروة قد تخفي أيضا إشارات الأطياف منخفضة الكثافة في نفس منطقة الرقم الموجي مثل إشارة Si. لم يتم ملاحظة قمم Si هذه عند استخدام ليزر 830 نانومتر في هذه الدراسة.

إن الطبيعة فائقة النحافة ل SiN (400 نانومتر أو 1,000 نانومتر سميكة) و Au-SiN (520 نانومتر أو 1,120 نانومتر) المستخدمة هنا منحتهم خصائص الترشيح والبصرية والطيفية الممتازة. ومع ذلك ، يجب حماية هذه الأغشية من التلف المادي ، مثل الضغط التفاضلي المفرط (أي ≥-206 كيلو باسكال) ، أو اللمس المباشر بالملاقط أو الأصابع ، أو عن طريق وضع الحشية بشكل غير صحيح. يحميها قرص المرشح الذي يحتوي على الأغشية ويتيح سهولة التعامل معها في ظل الاستخدام العادي. عند معالجة أقراص المرشح، المس الحلقة الخارجية السوداء فقط، ولا تلمس منطقة الغشاء النشطة أبدا. على الرغم من عدم الإبلاغ عنها كميا هنا ، إلا أن جمع الجسيمات الملتقطة على كمية صغيرة من مساحة سطح الغشاء (3 × 3 مم ل 20 ميكرومتر و 3 × 0.7 × 3 مم لأغشية قطع 8.0 ميكرومتر ، على التوالي) من المحتمل أن يقلل من إجمالي وقت تحليل العينة ، عن طريق تقليل الوقت اللازم للعثور على الجسيمات ذات الأهمية وتحليلها. هذا "عامل التركيز" يستحق الاستكشاف في المستقبل وقد يقدم فائدة فريدة من أقراص مرشح SiN للمحققين. بالاقتران مع معدلات التدفق الطبيعية لمساحة السطح العالية مقابل الأغشية الأخرى المستخدمة على نطاق واسع لتوصيف MP¹⁵ ، فإن إجراءات تصوير الجسيمات الآلية التي تحتاج فقط إلى تصوير مساحة أصغر نسبيا من SiN المسطح بشكل موحد وتحت التركيز قد تقلل من إجمالي أوقات التحليل. ومع ذلك ، لا تزال هناك حاجة إلى إثبات أي فوائد تتعلق بعامل التركيز المفترض تجريبيا من خلال مقارنة إجمالي أوقات المعالجة (من الترشيح إلى تحليل الصور) على أقراص مرشح SiN التقليدية.

لقد أظهرنا بشكل إرشادي فائدة اختلافات SNAP على عينات مياه الصنبور المحلية. يركز البروتوكول الموصوف هنا على التقاط MP من مصادر مياه الشرب حول روتشستر ، نيويورك. استمر جمع العينات على النحو التالي: لكل مجموعة عينات ، تم تشغيل لتر واحد على الأقل من الماء عبر الصنبور قبل بدء التجميع. تم نقل زجاجات البولي بروبلين الجديدة المختومة إلى صنبور التشغيل وفتحها مباشرة قبل التجميع. لم يتم شطف الزجاجات بمياه الشرب قبل الشروع في الجمع. تتكون كل عينة من زجاجتين سعة 500 مل تم جمعهما ، واحدة تلو الأخرى مباشرة. جاءت كل عينة مياه من نظام أنابيب منزلي مميز ، ولم تكن مادة الأنابيب متسقة طوال أخذ العينات. لا يمكن التحكم في متغيرات مثل كمية استخدام المياه مؤخرا ، ووقت التجميع ، وعمر الأنابيب ، وعمر المنزل الذي جاءت منه العينة. لم يكن هذا بروتوكول جمع عينات تم التحقق من صحته. يجب على كل محقق تطوير إجراءات التجميع الخاصة به والتحقق من صحتها. ومع ذلك ، من أجل الكشف الكامل عن الأساليب ، يتم تضمين الوصف أعلاه. تسمح أقراص المرشح بالتحليل المتكرر على نفس الركيزة لعدد من الطرق التحليلية. لا حاجة إلى أخذ عينات فرعية أو عينات متعددة خارج التكرارات التجريبية القياسية. يؤدي التخلص من الحاجة إلى أخذ عينات فرعية وعينات متعددة إلى زيادة الثقة في التقاط المعلومات حول أهداف الوفرة المنخفضة. بالإضافة إلى تمكين طرق التحليل متعددة الوسائط ، توفر أقراص مرشح SiN ميزة مميزة على وسائط الترشيح المماثلة الأخرى نظرا للجودة الموفرة للوقت لمعدل ترشيح أسرع لكل وحدة^{مساحة 15}.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 لتر دورق زجاجي	Pyrex	1000-1L
1 L قارورة جمع فراغ زجاجي	Millipore Sigma	Z290459-1EA
100٪ معطف مختبر قطني	Landau	LA-3172
100 مل قمع ترشيح زجاجي   ؛	Advantec	311000	https://www.sterlitech.com/glass-filter-holder-311000.html
99٪ كحول الأيزوبروبيل	فيشر Scientific	A416-20
APEX EDS	EDAX		EDX البرمجيات المستخدمة لإجراء تحليل EDX على الجسيمات الملتقطة.
نظام الاخرق الإعدادية	Denton Vacuum	DESK II: نظام طلاء الذهب 293618089
فيجي ، منصة تحليل الصور	ImageJ	V 1.54F	FIJI (FIJI هي مجرد ImageJ) - توزيع ImageJ & nbsp ؛
زجاجة زجاجية ذات غطاء	لولبي Corning	1395-250
Kimwipes	Kimtech	06-666-11C
LabSpec6	Horiba Scientific		Horiba Raman البرمجيات التي تحتوي على ParticleFinder و ViewSharp
Laminar flow hood	Air Science	VLF-72A
Microscope	أوليمبوس  / نيكون	BX61 / Ti2e	يمكن استخدام أي مجهر ذو مضان مناسب للفحص المجهري البصري.
مرشحات MPSN SiN	SiMPore Inc.	FD25-8.0-الاتحاد الافريقي ؛ FD25-8.0-NC FD25-20.0-Au ، FD25-20.0-NC
Monoject 60 مل محاقن	Coviden	8881560265
مسحوق النيل الأحمر	TCI	N0659
قفازات النتريل	Ansell Microflex	19-167-17
OpenSpecy	openanalysis.org		مفتوح المصدر ، مكتبة طيفية
فرن	VWR	1310	Gravity فرن الحمل
P20 الماصة	Brandtech	705872
طرف الماصة	قوارير قسط	GS 151140R
دعم Pourous frit	Advantec	311000	جزء من حزمة
رامان أداة	Horiba	Xplora PLUS
سدادة مطاطية	Advantec	311000	جزء من
حزمة أداة SEM	سلسلة Ziess	Auriga	Auriga ، محطة عمل معيارية Crossbeam
حشوات سيليكون	SiMPore	GASKET-25-R	حشوات PDMS مصبوبة بشكل شفاف ،
أسطوانة سيليكون	Sanyue	;( ASIN: B07XDTNPS3)	أسطوانة سيليكون -  8 × 5 × 2 بوصة
برنامج SmartSEM	Zeiss V8		SEM المستخدم لتشغيل مرشحات حقنة زجاجة رذاذ Zeiss Auriga
	Uline	S-7273
؛	الحرارة العلمية	CH2225-PES	0.22 & مايكرو; مرشحات حقنة قفل M Luer ، 25 مم & nbsp ؛
مضخة الحقنة	New Era Pump Systems، Inc.	NE-1000	اختياري ، ولكن موصى
به Trypan Blue - 0.4٪	Millipore Sigma	T8154-20ML
ملاقط	SiMPore	K6TWZR
مضخة فراغ	Welch	847-676-8800
فراغ	Grainger	ZUSA-HT-4037