يقدم هذا البروتوكول طريقة سريعة للتصوير الكمي للأوعية الدموية ثلاثية الأبعاد باستخدام الفحص المجهري الفلوري للصفائح الضوئية. يتم إثبات فعالية الطريقة باستخدام نظام الشريان المقوس البلعومي لنموذج جنين الفرخ ، مع تحديد القوى الديناميكية الدموية عبر ديناميكيات السوائل الحسابية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تصوير سريع عالي الدقة لأوعية الصغيرة للدراسات الكمية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
في النماذج الحيوانية الصغيرة لتطور القلب والأوعية الدموية والأمراض ، تتيح المحاكاة الحسابية الخاصة بالموضوع لتدفق الدم إجراء تقييمات كمية لمقاييس ديناميكا الدم التي يصعب قياسها تجريبيا. تسلط المحاكاة الديناميكية للسوائل الحسابية الضوء على الأدوار الحاسمة للميكانيكا في وظيفة القلب والأوعية الدموية وتطور المرض. يعد الحصول على صور حجمية عالية الجودة للسفن ذات الأهمية أمرا أساسيا لدقة وقابلية تكرار نتائج القياس المورفولوجي وقياس التدفق. تقترح هذه الدراسة طريقة سريعة وفعالة من حيث التكلفة ويمكن الوصول إليها للتصوير عالي الدقة الكامل لأوعية الدموية الحيوانية الصغيرة باستخدام الفحص المجهري الفلوري للصفائح الخفيفة. يتضمن بروتوكول تحضير عينة الورقة الخفيفة iDISCO + (التصوير ثلاثي الأبعاد المدعوم بالملصقات المناعية للأعضاء التي تم تطهيرها بالمذيبات) (1) وضع العلامات على الأوعية الدموية بعامل فلورسنت ، (2) الحفاظ على العينة ، و (3) جعل العينة شفافة. على عكس iDISCO + الكلاسيكي ، الذي يستخدم تلطيخ كيميائي مناعي ، يقوم المؤلفون بتسمية بطانة الأوعية الدموية باستخدام poly-L-lysine الموسومة ب FITC ، وهي صبغة فلورية غير محددة بأسعار معقولة ومقاومة عالية للتبييض الضوئي ، في عملية تسمى "الطلاء الداخلي". يقلل وضع العلامات السريع من وقت تحضير العينة من حوالي أربعة أسابيع إلى أقل من 3 أيام. علاوة على ذلك ، فإن استخدام المذيب الإيثيل سينامات (ECi) كعامل مقاصة وحل تصوير يجعل العينات أكثر أمانا في التعامل معها ومتوافقة مع مجموعة واسعة من مرافق التصوير. يتم تطبيق البروتوكول المقترح للحصول على أكوام صور مجهرية مضان للصفائح الضوئية عالية الدقة لنظام القلب والأوعية الدموية في أجنة الكتاكيت تتراوح من اليوم 3 (HH18) إلى اليوم 8 (HH34). توضح هذه الدراسة أيضا مدى ملاءمة هذه الطريقة لقياس كمية الأوعية الدموية من خلال إعادة البناء ثلاثية الأبعاد والنمذجة الديناميكية الدموية الحسابية لجنين الكتكوت في اليوم 5 (HH 26).
المقدمة
التصوير الحجمي ضروري لإجراء دراسات دقيقة لفسيولوجيا القلب والأوعية الدموية وأمراضها. ينتج التصوير الكمي مجموعات صور عالية الدقة ذات أبعاد حجمية سليمة. يجب الحفاظ على العينات للحفاظ على مورفولوجيتها في الجسم الحي وحجم التجويف بالإضافة إلى تصويرها بسعة موحدة عالية الدقة. من مكدسات التصوير عالية الدقة ، يمكن للمستخدم إنشاء عروض وعائية ثلاثية الأبعاد عالية الدقة تسمح بعرض كامل لأشكال الأوعية وهيكلهاواتصالها 1.
تمتلك هياكل القلب والأوعية الدموية ميزات تشريحية معقدة ثلاثية الأبعاد لا يمكن التقاطها بدقة عند فحصها من خلال عدسة ثنائية الأبعاد مفككة. التصوير المورفولوجي واسع المجال وا....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
يفسر مكتب رعاية المختبر سياسة خدمة الصحة العامة على أنها تنطبق على نموذج الكتكوت على أنه "فقاري" فقط بعد الفقس. هذه الأجنة معفاة بالمثل من اختصاص اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدامها (IACUC). يمكن الوصول إلى الأسئلة المتداولة ذات الصلة بالمعاهد الوطنية للصحة على: http://grants.nih.gov/grants/olaw/faqs.htm#ApplicabilityofthePHSPolicy.
1. جمع الأجنة ووضع العلامات والتثبيت
- سحبت الموضة قضبان شعرية زجاجية بقطر داخلي 0.75 إلى إبر دقيقة مقطوعة باستخدام microforge1،12.
ملاحظة: يعتمد حجم الطرف المطلوب على عمر / معدل التدفق المطلو....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
ينتج بروتوكول التصوير السريع عالي الدقة المثبت بالكامل المقدم هنا (الشكل 1 ، الجدول 1) تجويف الأوعية الدموية المحددة بوضوح كما هو موضح في الشكل 2 والشكل 3 والشكل 4 ، حيث تكون بطانة الأوعية الدموية لجنين الكتاكيت عبارة عن فلورسنت GFP وبالتالي تم تحديدها باللون الأخضر عبر مراحل الجنين من نمو القلب المبكر إلى الناضج (الشكل 4). من المهم العثور على التركيبة الصحيحة من تركيز بولي.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
تعد القدرة على دراسة علم الأحياء ثلاثي الأبعاد أمرا بالغ الأهمية لفهم دقيق للتعقيد المورفولوجي وبنية الأعضاء الداخلية وروابط الأوعية الدموية. تعد الصور الوعائية ثلاثية الأبعاد الدقيقة والموثوقة أيضا أساسية لمحاكاة ديناميكية الدم الحسابية الخاصة بالموضوع ، والتي غالبا ما تكون الوسيلة الوحيدة الموثوقة لقياس المعلمات الديناميكية الدموية الرئيسية مثل إجهاد قص الجدار وتوزيع الضغط. هنا ، يقدم المؤلفون طريقة سريعة ويمكن الوصول إليها لإعداد العينة لتصوير الأوعية الدموية ثلاثية الأبعاد عالي الدقة.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
تم دعم هذا العمل من خلال جائزة التطوير الوظيفي لجمعية القلب الأمريكية ، وجائزة Burroughs Wellcome Fund المهنية في الواجهة العلمية ، وصندوق أبحاث البطين الفردي الإضافي للمشاريع ، وكلية الطب بجامعة كاليفورنيا في سان فرانسيسكو (Grant P30 NS047101). يشكر المؤلفون الدكتور بوبي طومسون على مقدمته للرسم الداخلي ، وكلية الطب بجامعة كاليفورنيا في سان فرانسيسكو ، وروبرت بورتر (UCSD) للدعم التجريبي.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| # 5 ملقط | أدوات العلوم الدقيقة | 11252-30 | |
| # 55-ملقط | أدوات العلوم | الدقيقة 11295-51 | |
| 0.03 بوصة أنابيب سيليكون ذات القطر الداخلي | VWR | 32829-182 | |
| 20 & أطراف ماصة L | VWR | 76322-134 | |
| 35 مم طبق بتري | VWR | 10799-192 | |
| حقنة بلاستيكية سعة 5 مل | VWR | BD 309646 | |
| ثنائي كلورو الميثان (DCM) | سيجما ألدريتش | 270997 | الرجوع إلى MSDS. مخزنة في خزانة جانبية تحت غطاء الدخان |
| إيثيل سينامات (ECi) | سيجما ألدريتش | 112372 | مخزنة عند 4 درجات ؛ C |
| مقص منحني ناعم | أدوات العلوم الدقيقة | 14061-09 | |
| FITC-poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P3069 | تخزين عند -20 درجة ؛ C (مسحوق ، محلول مخزون) ، 4 & ordm ؛ C (حل العمل) |
| مجهر الفلورسنت | CLEAR SCIENTIFIC | MVX10 | |
| أنابيب شعرية زجاجية (معرف 0.75 مم) ؛ | أداة سوتر | FG-GB100-75-10 | |
| مجهر ورقة ضوئية | Zeiss | Z.1 | |
| الميثانول | سيجما-ألدريتش | M1775 | الرجوع إلى MSDS. مخزنة في خزانة قابلة للاشتعال تحت غطاء الدخان |
| Microforge | Narishige International USA، Inc. | MF2 | |
| Micromanipulator | World Percision Instrrument | M3301R | |
| Paraformaldehyde (PFA) 4٪ | Thermo Scientific | J19943. K2 | الرجوع إلى MSDS. مخزنة في -20 درجة ؛ C (مسحوق) ، 4 درجة ؛ C (محلول عمل 4٪) |
| محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) | Cytiva | SH30256.01 | مخزنة على برنامج |
| SimVascular | مفتوح المصدر www.simvascular.org | ||
| Tyrode s الحل | صنع داخليا |
المراجع
- Lindsey, S. E., Butcher, J. T., Vignon-Clementel, I. E. Cohort-based multiscale analysis of hemodynamic-driven growth and remodeling of the embryonic pharyngeal arch arteries. Development. 145 (20), dev162578(2018).
- Lindsey, S. E., Vignon-Clementel, I. E., Butcher, J. T.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
