يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

التحول الجيني بوساطة Agrobacterium tumefaciens في Solanum nigrum

907 مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/68212

⸱

يونيو 24, 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1College of Agriculture and Life Science, Liaocheng University

في هذه المقالة

ملخص

تقدم هذه المقالة بروتوكولا مفصلا لطريقة التحول الجيني بوساطة Agrobacterium tumefaciens لإنتاج Solanum nigrum المعدلة وراثيا.

الملخص

Solanum nigrumهو أحد أقارب الباذنجان اليتيم للبطاطس والطماطم ، وثماره الطازجة هي توت مغذي ولذيذ. يمكن استخدام نبات S . nigrum بالكامل كدواء. ومع ذلك ، فإن S. nigrum البري يحمل بعض السمات غير المرغوب فيها. لحسن الحظ ، توفر تقنيات الهندسة الوراثية ، وخاصة تقنيات تحرير الجينات مثل CRISPR / Cas9 ، فرصا قيمة لتحسين S. nigrum بسرعة من خلال معالجة أوجه القصور هذه. في معظم النباتات ، يتم تحسين النبات من خلال تقنية التحرير الجيني من خلال التحول الجيني بوساطة Agrobacterium tumefaciens. في هذه المقالة ، قمنا بتفصيل بروتوكولات التحول الجيني بوساطة A. tumefaciens في S. nigrum. الفلقات والفلقات من S. nigrum الشتلات تم استخدامها كنباتات للتحول الجيني. نظرا لأن S. nigrum مقاوم للكاناميسين ، فقد تم استخدام جين DsRed كعلامة بصرية لتحديد النباتات المعدلة وراثيا. يمكن إكمال التحول الجيني للمبلويات السوداء بكفاءة وفقا لبروتوكولات التشغيل هذه. يمكن تحديد اكتشاف النباتات المعدلة وراثيا T1 مباشرة من خلال ما إذا كانت تنبعث منها مضان أحمر ، دون الحاجة إلى تحديد تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR).

المقدمة

Solanum nigrum (المعروف باسم الباذنجان الأسود ، 2n = 6x = 72) هو أحد أقارب الباذنجان للبطاطس والطماطم1. الثمرة عبارة عن توت كروي يتحول إلى اللون الأسود بعد النضج. الفاكهة الطازجة هي توت مغذي ولذيذ. يمكن استخدام نبات S . nigrum بالكامل كدواء ، مع تأثيرات تشتيت ركود الدم ، وتقليل التورم ، وإزالة الحرارة ، وإزالة السموم. S. nigrum يصنع فئتين متميزتين من المستقلبات المتخصصة من سلائف الكوليسترول الشائعة: الصابونين الستيرويدي في أوراقه والغليكولالويد الستيرويدي (SGAs) في التوت. أوتروسايد ب ، وهو صابونين ستيرويدي مشتق من S. nigrum ، تمت الموافقة عليه مؤخرا من قبل إدارة الغذاء والدواء الأمريكية كدواء يتيم لعلاج سرطان الخلايا الكبدية2. أدت الضربة القاضية لجين GAME15 في S. nigrum إلى افتقار النباتات إلى كل من الصابونين والقلويدات الستيرويدية ، وكشف أيضا أن الصابونين الستيرويدي يتحكم في الآفات الحشرية الزراعيةالخطيرة 2. مادة البوليفينول في S. nigrum تقلل من الوزن والدهون في الجسم عن طريق التأثير على الخلايا الشحمية والتمثيل الغذائيللدهون 3. S. nigrum يمكن أن تثري الكادميوم وتستخدم كنبات نموذجي لدراسة تخصيب الكادميوم4،5. S. nigrum هو نبات غير مستأنس ، وأسسه البحثي ضعيف نسبيا. إنه لأمر ملهم أن البحث عن S. nigrum يتزايد تدريجيا في السنوات الأخيرة. تم تجميع جينوم سداسي الصبغيات S. nigrum مؤخرا ، و S. nigrum ربما تطور من ثنائي الصبغيات Solanum americanum (2n = 2x = 24) 6،7. لذلك ، S. nigrum هو نبات يمتلك قيمة طبية وصالية للأكل. لا تساهم الأبحاث حول S. nigrum في فهم أعمق لتطبيقاتها المحتملة في علاج الأمراض البشرية فحسب ، بل توفر أيضا رؤى قيمة حول تعزيز الإنتاج الزراعي. لذا ، فإن إنشاء نظام التحول الجيني في S. nigrum هو أساس التحسين الجيني من خلال تكنولوجيا التعديل الجيني والمعدل وراثيا.

هناك العديد من التقارير التي تركز على التحول الجيني بوساطة Agrobacterium tumefaciens ل S. nigrum8،9،10،11. في عملنا السابق ، أنشأنا A. tumefaciens LBA4404 نظام التحول الجيني بوساطة S. nigrum ، وقمنا بتحويل AcMYB110 إلى S. nigrum ، والحصول على مادة وراثية جديدة من S. nigrum مع زيادة محتوى الأنثوسيانين1. تم الحصول على نباتات S. nigrum المعدلة وراثيا مع A. tumefaciens التحول الجيني بوساطة EHA10510. تحتوي البروتينات الفلورية المختلفة على انبعاثات مضان أخضر وأحمر وأصفر وبرتقالي وزرق وتستخدم على نطاق واسع في الإشارة إلى أنشطة الحياة الخلوية12. في عملية التحول الجيني للنباتات ، غالبا ما تستخدم جينات الفلورسنت الحمراء كجينات مراسل لتمييز الأحداث المعدلة وراثيا عن الأحداث غير المعدلةوراثيا 13. يسمح استخدام جين DsRed كجين مراسل بالتمييز المريح للأحداث المعدلة وراثيا ، بينما قد يتأثر استخدام عامل النسخ R2R3-MYB كجين مراسل بالنمط الجيني للنباتات14. في النسل المعدلة وراثيا ، يمكن أيضا تمييز النباتات المعدلة وراثيا بسهولة عن النباتات غير المعدلة وراثيا باستخدام الأدوات البصرية (على سبيل المثال ، المجاهر المضان أو أنظمة التصوير) ، مما يلغي الحاجة إلى تحديد الهوية المستندة إلى تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). من خلال دمج جين مراسل البروتين الفلوري مع تقنية تحرير الجينات CRISPR ، تم حذف جينات الخصوبة في الذرة بدقة ، مما أدى إلى إنشاء خط معقم نووي وخط صيانة معقم نووي خاضع للرقابة15. سينتج التلقيح الذاتي والإثمار لنباتات الصيانة 1: 1 ذرية من خطوط الصيانة والمعقمة. بناء على خصائص الإنارة المختلفة ، يمكن تحقيق الفرز غير المدمر لبذور المشرف وخط القطع المعقم من خلال التعرف البصري أو الآلي15. وبالتالي ، فإن استخدام جين البروتين الفلوري كجين مراسل يبسط تحديد البذور أو النباتات المعدلة وراثيا دون الحاجة إلى تحليل تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). يمثل هذا ميزة كبيرة في مجال التحول الجيني. تهدف هذه الطريقة إلى وصف بروتوكول التحول الجيني بوساطة Agrobacterium tumefaciens في S. nigrum ، باستخدام جين الفلورسنت الأحمر ، DsRed ، كجين مراسل.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. زراعة الشتلات المعقمة

ملاحظة: يتم تنفيذ الخطوات التالية على مقعد فائق النظافة.

  1. اجمع البذور البرية ل S. nigrum في مدينة Liaocheng ، الصين ، وقم بتسميتها Snlc1. خذ 50 بذرة برية من S. nigrum وضعها في أنبوب طرد مركزي سعة 2 مل. بعد النقع في 1 مل من 5٪ جبرلين لمدة 30 دقيقة ، تخلص من محلول الجبرلين.
  2. أضف 1 مل من 75٪ من الإيثانول ، ورجه لمدة 1 دقيقة ، ثم تخلص من الإيثانول.
  3. أضف 1 مل من محلول هيبوكلوريت الصوديوم 2٪ وقم بتطهير سطح البذور لمدة 10 دقائق. هز أنبوب الطرد المركزي جيدا لتعقيم سطح البذور. بعد 10 دقائق ، تخلص من هيبوكلوريت الصوديوم.
  4. اغسل البذور 5 مرات بالماء المعقم لإزالة هيبوكلوريت الصوديوم المتبقي. ضع البذور في أطباق بتري بقطر 90 مم تحتوي على 1/2 مللي ثانية من الوسط الصلب. استزراع الصفائح في غرفة نمو النبات تحت فترة ضوئية تبلغ 16 ساعة ضوء / 8 ساعات مظلمة عند 25 درجة مئوية (الشكل 1 أ).

2. ثقافة A. tumefaciens LBA4404

  1. قم بتحويل المتجه الثنائي pRed130516 الذي يحتوي على جين فلوري أحمر ، DsRed2 ، إلى A. tumefaciens LBA4404 عن طريق التثقيب الكهربائي باستخدام MicroPulser مع المعلمات: الجهد 1800 فولت ، السعة 25 درجة فهرنهايت ، المقاومة 200 Ω ، كوفيت 1 مم. استزراع البكتيريا على وسط LB صلب مع 50 مجم / لتر كاناميسين و 50 مجم / لتر ريفامبيسين عند 28 درجة مئوية لمدة 48 ساعة.
  2. التقط استنساخا واحدا من LBA4404 الذي يؤوي pRed1305 وزرعه في 1 مل من وسط LB السائل مع 50 مجم / لتر كاناميسين و 50 مجم / لتر ريفامبيسين في أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل في مكثف طاولة مع 180 دورة في الدقيقة عند 28 درجة مئوية لمدة 12 ساعة.
  3. أضف 50 مل من LB السائل مع نفس المضاد الحيوي إلى 1 مل من المحلول البكتيري ثم زراعته في مكثف طاولة بمقدار 200 دورة في الدقيقة عند 28 درجة مئوية لمدة 6 ساعات.
  4. توقف عن الاستزراع عندما يكون OD600 لوسط الثقافة البكتيرية 0.4 ، ثم قم بالطرد المركزي للمحلول البكتيري عند 2200 × جم لمدة 10 دقائق عند 25 درجة مئوية.
  5. قم بتعليق البكتيريا بالطرد المركزي بمحلول العدوى (IS: M519 4.43 جم / لتر ، سكروز 30 جم / لتر ، 6-BA 2 مجم / لتر ، AS ، 100 ميكرولتر / لتر ، درجة الحموضة 5.8) واضبط تركيز المحلول البكتيري على OD600 = 0.6 باستخدام مقياس الطيف الضوئي.

3. استئصال العدوى ب A. tumefaciens

ملاحظة: يتم تنفيذ الخطوات التالية على مقعد فائق النظافة.

  1. ازرع البذور لمدة 7 أيام حتى تتكشف فلقات الشتلات (الشكل 1 ب). قم بقص الفلقات والفلقات بطول حوالي 1 سم من الشتلات بمشرط معقم وحاد في طبق استزراع بورق ترشيح مبلل بمثبت الصور البكتيري وتخلص من الجذور الأولية. كن حذرا عند استخدام مشرط.
  2. نقع النباتات في محلول العدوى لمدة 30 دقيقة. ضع المصانع على ورق ترشيح جاف للسماح بامتصاص المحلول البكتيري الموجود على سطح المصنع المبعوض.
  3. ضع النباتات الخارجية في وسط صلب IS (0.7٪ أجار ؛ الشكل 1 ج). ضع النباتات الخارجية في غرفة نمو النبات بدون ضوء عند 19 درجة مئوية وزراعتها لمدة 3 أيام.

4. تمايز النباتات المسبدة

ملاحظة: يتم تنفيذ الخطوات التالية على مقعد فائق النظافة.

  1. التقط النباتات المكثفة من حجرة نمو النبات عند 19 درجة مئوية. اغسل النباتات باستخدام الماء المعقم 5 مرات وضع المخططات على ورق ترشيح جاف ومعقم.
  2. ضع المخططات في وسط تمايز البراعم (SD) (SD: M519 4.43 جم / لتر ، سكروز 30 جم / لتر ، 6-BA 2 مجم / لتر ، ZT 0.5 مجم / لتر ، Cef 100 مجم / لتر ، كربوهيدرات 100 مجم / لتر ، 0.7 جم / لتر أجار ، درجة الحموضة 5.8) ، والثقافة عند 25 درجة مئوية لمدة 4 أسابيع (الشكل 1D ، E).
  3. قم بقطع الكالس / براعم النباتات الخارجية التي تظهر التألق الأحمر تحت ضوء الإثارة الأخضر لمصباح الفلورسنت المحمول باستخدام مشرط ، ثم انقلها إلى وسط SD جديد ، واستمر في الاستزراع لمدة 4 أسابيع عند 25 درجة مئوية (الشكل 1F ، G).

5. التجذير والزرع

  1. اقطع البراعم التي تظهر مضان أحمر باستخدام مصباح فلورسنت محمول باليد ، وانقلها إلى وسط التجذير (RM: M519 4.43 جم / لتر ، سكروز 30 جم / لتر ، 6-BA 2 مجم / لتر ، ZT 0.5 مجم / لتر ، Cef 100 مجم / لتر ، كربوهيدرات 100 مجم / لتر ، 0.7 جم / لتر أجار ، درجة الحموضة 5.8) ، وزرعها لمدة 2-4 أسابيع عند 25 درجة مئوية لتعزيز إنتاج الجذور.
  2. زرع الشتلات التي تظهر مضان أحمر بطول جذر يزيد عن 2 سم في التربة (الشكل 1H-K). قبل الزرع ، قم بإزالة الأجار من الجذور يدويا لتجنب النمو المفرط للبكتيريا في الجذور.

6. اختبار نباتات T0 المعدلة وراثيا مع تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل

  1. استخرج الحمض النووي الجيني لخط معدلة وراثيا مستقل باستخدام طريقة سيتيل ثلاثي ميثيل الأمونيوم بروميد (CTAB)17.
  2. تضخيم جين DsRed مع مجموعة التمهيدي ، RedF (5'-TGGCCTCCTCCGAGAAC-3') و RedR (5'-CGGAGGGGAAGTTCACG-3') باستخدام 10 نانوغرام من الحمض النووي الجيني كقالب في حجم تفاعل 15 ميكرولتر يحتوي على 7.5 ميكرولتر من 2x PCR Master Mix و 0.3 ميكرولتر من كل برايمر (10 ميكرولتر / لتر). كان جزء الحمض النووي المتوقع 393 نقطة أساس. قم بإخضاع منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل للرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز بنسبة 1٪ لتحديد ما إذا كانت نباتات معدلة وراثيا.

7. تحديد النباتات المعدلة وراثيا في جيل T1 باستخدام مصباح الفلورسنت

  1. احصد ثمار T0 النباتات المعدلة وراثيا من S. nigrum التي تحولت إلى اللون الأسود والأرجواني تماما ثم اعصر البذور داخل الفاكهة يدويا. جفف البذور بالهواء بشكل طبيعي في درجة حرارة الغرفة لمدة أسبوع تقريبا.
  2. استزراع البذور المجففة في وسط 1/2 مللي ثانية وفقا للخطوات من 1.1 إلى 1.4 من هذا البروتوكول وضعها في غرفة نمو النبات لمدة أسبوع واحد. يميز الشتلات المعدلة وراثيا والشتلات غير المعدلة وراثيا باستخدام مصباح الفلورسنت المحمول.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

التحول الجيني بوساطة Agrobacterium tumefaciens لإنتاج S. nigrum.
بعد إصابة الفلقات والفلقات من S. nigrum الشتلات ب A. tumefaciens ، يمكننا تحديد ما إذا كانت عدوى Agrobacterium ناجحة منذ استخدام DsRed كجين مراسل. ظهر التألق الأحمر في موقع الجرح بعد الإصابة 3-4 أسابيع (الشكل 1D ، E) ، مما يشير إلى أن عدوى...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

حتى الآن ، طرق التحول الجيني ل S. nigrum بوساطة A. tumefaciens تم إنشاؤها في مختبرات مختلفة8،9،10،11. تستخدم معظم طرق التحويل هذه الكاناميسين كمادة اختيار8،9،10،11. ومع ذلك ، فإن S. nigrum ليس حساسا للكانامي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل من قبل صندوق البحوث التابع لجامعة لياوتشنغ (318012028) ومؤسسة العلوم الطبيعية في مقاطعة شاندونغ (ZR2020MC034).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
2X SanTaq PCR Master Mix (مع صبغة زرقاء)Sangon Biotech (شنغهاي) المحدودةB532061يشتمل مزيج 2X SanTaq PCR على MgCl و dNTPs و Taq DNA Polymerase و PCR buffer وصبغة التحميل ومحسن PCR.
6-بكالوريوسسانغون للتكنولوجيا الحيوية (شنغهاي) المحدودةC14819266السيتوكينين الاصطناعي
AgarTianjin Damao مؤسسة شراكة الكاشف الكيميائي (شراكة محدودة)رقم CAS: 9002-18-0Solids
ASSangon Biotech (Shanghai) Co.، Ltd.K914BA0002تحفيز التعبير الفعال عن Agrobacterium
CarbSangon Biotech (Shanghai) Co.، Ltd.المضادات الحيوية
CefSangon Biotech (شنغهاي) المحدودةI526BA0010المضادات الحيوية
gibberellinSangon Biotech (Shanghai) Co.، Ltd.K514BA0009يعزز إنبات البذور
kanamycinSangon Biotech (Shanghai) Co.، Ltd.I614BA0013المضادات الحيوية
LB المتوسطةسانغون للتكنولوجيا الحيوية (شنغهاي) المحدودةB540113تنمو البكتيريا
MicroPulser (Gene Pulser Xcell)Bio-Rad ، الولايات المتحدة617BR1 06783Gene Pulser Xcell
MS الصلبة المتوسطةphytotech Co.، Ltd. ، الولايات المتحدةHCA0519228A  ؛ Murashige & Skoog Basal Medium مع الفيتامينات ، صندوق بلاستيكي M519
LiaoSu ، الصينT909Hصندوق زراعة النبات
rifampicinSangon Biotech (Shanghai) Co.، Ltd.S180305السكروز المضاد الحيوي
سانغون للتكنولوجيا الحيوية (شنغهاي) المحدودةرقم سجل المستخلصات الكيميائية:57-50-1     كمصدر للكربون
Tanon-5200Multi machineTanon Co.، Ltd. ، الصين5200MultiAccelerated
Selanum wilderation solanum nigrumالتي تم جمعها
ZTSangon Biotech (Shanghai) Co.، Ltd.J921BA0014منظمات نمو النبات
في مدينة Liaocheng

المراجع

  1. Wang, X., et al. Ectopic overexpression of AcMYB110 causes significantly increased content of anthocyanins in Solanum nigrum. Biologia plant. 67, 200-203 (2023).
  2. Boccia, M., et al. A scaffold protein manages the biosynthesis of steroidal defense metabolites in plants. Science. 386 (6728), 1366-1372 (2024).
  3. Peng, C. H., et al. Solanum nigrum polyphenols reduce body weight and body fat by affecting adipocyte and lipid metabolism. Food Funct. 11 (1), 483-492 (2020).
  4. Wang, J., et al. Influence of Cd toxicity on subcellular distribution, chemical forms, and physiological responses of cell wall components towards short-term Cd stress in Solanum nigrum. Environ Sci Pollution Res. 28 (11), 13955-13969 (2021).
  5. Wang, J., et al. Comparative cytology combined with transcriptomic and metabolomic analyses of Solanum nigrum L. in response to Cd toxicity. J Hazardous Mater. 423, 127168(2022).
  6. Lee, E. S., et al. Engineering homoeologs provide a fine scale for quantitative traits in polyploid. Plant Biotech J. 21 (12), 2458-2472 (2023).
  7. Lin, X., et al. Solanum americanum genome-assisted discovery of immune receptors that detect potato late blight pathogen effectors. Nat Genetics. 55 (9), 1579-1588 (2023).
  8. Bhattacharya, A., et al. Engineering gibberellin metabolism in Solanum nigrum L. by ectopic expression of gibberellin oxidase genes. Plant Cell Rep. 31 (5), 945-953 (2012).
  9. Chhon, S., Jeon, J., Kim, J., Park, S. U. Accumulation of Anthocyanins through Overexpression of AtPAP1 in Solanum nigrum Lin (Black Nightshade). Biomolecules. 10 (2), 277(2020).
  10. Park, S., et al. Rapid generation of transgenic and gene-edited Solanum nigrum plants using Agrobacterium-mediated transformation. Plant Biotech Rep. 14 (4), 497-504 (2020).
  11. Peng, W., et al. A convenient, reliable and directly visual selection marker for identifying transgenic lines of Solanum nigrum. Plant Cell Tiss Organ Cult. 152 (2), 369-375 (2023).
  12. Schlechter, R. O., et al. Chromatic Bacteria - A Broad Host-Range Plasmid and Chromosomal Insertion Toolbox for Fluorescent Protein Expression in Bacteria. Front Microbio. 9, 3052(2018).
  13. Hao, H., et al. High-efficiency Agrobacterium-mediated transformation of Lotus corniculatus using DsRed2 positive selection and vermiculite-based rooting method. Plant Cell Tiss Organ Cult. 156 (2), 58(2024).
  14. Fan, Y., et al. a novel and user-friendly reporter for convenient, non-destructive, low cost, directly visual selection of transgenic hairy roots in the study of rhizobia-legume symbiosis. Plant Meth. 16 (1), 94(2020).
  15. Qi, X., et al. Genome Editing Enables Next-Generation Hybrid Seed Production Technology. Mol Plant. 13 (9), 1262-1269 (2020).
  16. Fan, Y., et al. A fast, simple, high efficient and one-step generation of composite cucumber plants with transgenic roots by Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation. Plant Cell Tiss Organ Cult. 141 (1), 207-216 (2020).
  17. Schenk, J. J., Becklund, L. E., Carey, S. J., Fabre, P. P. What is the "modified" CTAB protocol? Characterizing modifications to the CTAB DNA extraction protocol. Appl Plant Sci. 11 (3), e11517(2023).
  18. Li, Q., et al. An Improved and Simplified Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation Protocol for Solanum nigrum with a Shorter Growth Time. Plants. 13 (15), 2015(2024).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

9 DsRed

تم نشر هذه المقالة

الفيديو قريباً

تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.