مقالة منهجية

نموذج جزر جديد للدراسة ثلاثية الأبعاد لتفاعلات البطانة والخلايا β: الصلة بفحص العوامل الواقية للخلايا

DOI:

10.3791/68220

⸱

أبريل 17, 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Regenerative Nanomedicine (RNM), UMR 1260, INSERM (French National Institute of Health and Medical Research), University of Strasbourg, 2Department of Emergency, The First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University, 3Research Center, CHU de Québec -Laval University, 4Department of Microbiology-Infectiology and Immunology, Faculty of Medicine, Laval University, 5Department of Diabetes and Nutrition Endocrinology, University Hospital of Strasbourg, 6Faculty of Medicine, University of Strasbourg, 7Faculty of Pharmacy, University of Strasbourg

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوفر هذا البروتوكول إجراء تفصيليا لتوليد كرويدات مستقرة لجزر البنكرياس الصغيرة في الفأر، وطرقا مفصلة للتلوين ثلاثي الأبعاد، والتنظيف، والتركيب، مكيفة مع حجمها الصغير.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوضح هذا البروتوكول طريقة محسنة لإنتاج الكرويدات الصغيرة المستقرة، وزراعتها، والتصوير ثلاثي الأبعاد، لدراسة تفاعلات الخلايا β المنتجة للبطانة والأنسولين في نموذج ثلاثي الأبعاد لجزر البنكرياس. تم إعداد الكرويدات التي يبلغ طولها 150-200 ميكرومتر، والتي تعكس أدنى نطاق لأحجام الجزر، من نسبة مختارة تجمع بين خلية بطانية داخل الجزيرة (خلايا MS-1) و20 خلية تفرز الأنسولين (β-TC-6). تم تفصيل تحديات التلوين والتنظيف، والتراكم للكرويدات الصغيرة ومعالجتها باستخدام الأغاروز منخفض نقطة الانصهار وتقنية التنظيف المكعب، بالإضافة إلى نقاط رئيسية لتحليل فعال للبنية ثلاثية الأبعاد باستخدام مجسات مختلفة. تشير البيانات إلى أن NTPDASE-إكتونوكليوتيداز 3 لا يتطابق مع الأنسولين في نموذج الكروي، مما يشير إلى نضج ومستويات وظيفية متفاوتة ل β-TC6، وأن الإجراء الكامل يمكن تطبيقه أيضا على جزر البنكرياس المعزولة، مع فحص واضح للأوعية داخل الجزر. تؤكد هذه النتائج على فعالية بروتوكول التصوير ثلاثي الأبعاد في كشف تنظيم خلايا البنكرياس المعقد والتفاعلات داخل نموذج الجزر.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

غالبا ما تعقد زراعة جزر البنكرياس بسبب رد الفعل الالتهابي الفوري عبر الدم (IBMIR)، الذي يتلف بشكل كبير خلايا بطانة الطعم (IEC) ويؤثر على تروية الطعم ووظيفتها. على المدى الطويل، يتم وصف انخفاض كتلة الجزر الوظيفية وفقدان استقلالية الأنسولين لدى المرضى بعد 4 سنوات من الزراعة1. بينما تم تطوير نماذج زراعة الجزر من الفأر أو الفئران، فإن النماذج الموحدة للتحقيق في الأهداف الدوائية لتأهيل الجزر الصغيرة، والتي تهم بشكل خاص في سياق تلف الطعوم المدفوع بالسيتوكينات الناتج عن IBMIR، تفتقرإلى 2. في الواقع، فإن التركيب الكروي مناسب بشكل خاص لتحديد الأهداف الدوائية الجديدة وتقييم الجزيئات الواقية للخلايا ضد خلل الخلايا الناتج عن السيتوكين. علاوة على ذلك، يقدم نهجا بديلا للحد من استخدام نماذج الحيوانات لمرض السكري من النوع الأول وزراعة الجزر.

لا يزال إيجاد التلوين المناسب، والتطهير البصري، وظروف التثبيت للكرويدات الصغيرة من نطاق حجم الجزر أمرا صعبا. في الأدبيات، هناك عدد قليل جدا من الدراسات التي تصف التعامل مع الكريات الصغيرة وخصائصها الهيكلية الرئيسية. تنشأ الصعوبة أيضا من الحاجة إلى موازنة اختراق الأنسجة، والحفاظ على الإشارات، وسلامة البنيوية مع الحفاظ على الطبيعة الدقيقة لهذه الهياكل الصغيرة ثلاثية الأبعاد. بالإضافة إلى ذلك، غالبا ما تواجه طرق التلوين التقليدية صعوبة في تحقيق وسم موحد للكرويدات. تزداد هذه المشكلة سوءا بسبب التنظيم الخلوي الكثيف، الذي يمكن أن يعيق انتشار الكواشف بسبب محدودية اختراق الأجسام المضادة والأصباغ3،4. أخيرا، يجب تحسين عملية التنظيف البصري، التي تعتبر ضرورية لتقليل خلفية تشتت الضوء وتحسين عمق التصوير، بعناية لتجنب تعطيل بنية الكروي أو تغيير الخصائص البيولوجية5.

تركيب الكرويدات الصغيرة للمجهر ثلاثي الأبعاد يمثل تحديا آخر. قد لا توفر وسائط التركيب التقليدية دعما كافيا لهذه الهياكل الحساسة، مما قد يؤدي إلى تشوهها أو انهيارها أثناء التصوير. علاوة على ذلك، يجب التحكم بدقة في مطابقة معامل الانكسار المطلوبة للحصول على جودة تصوير مثالية لضمان الرؤية الدقيقة في عمقالكروي 6,7. يتعقد تطوير بروتوكولات مخصصة للكرويدات الصغيرة بسبب تنوع أنواع الخلايا والظروف التجريبية المستخدمة في الزراعة الكروية3. أخيرا، الحاجة إلى أساليب متخصصة للحفاظ على سلامة مجموعات الخلايا المتعددة طوال عمليات التلوين والتنظيف أمر بالغ الأهمية لتقييم استجابات الخلايا.

لمعالجة التحديات المحددة في دراسة إجهاد الجزر التي تتوسط IBMIR، تم تصميم نموذج كروي لخلية 2000، يجمع بين خلايا IEC في الفأر وخلايا β التي تفرز الأنسولين، مع نسبة 1:20 من خلايا IEC إلى β خلايا مشابهة لتلك التي لوحظت في جزر البنكرياس. بالإضافة إلى ذلك، أثبتت تجارب سابقة أن الهيكل يحافظ على قابلية البقاء لمدة 96 ساعة، مما يوفر نموذجا ثلاثي الأبعاد ذو صلة فسيولوجيا لملاحظة استجابات الخلايا القصيرة (مدى الساعة) أو الأطول الناتجة عن الإجهاد (الأيام) وتعديلها الدوائي. يتكون نموذج الكروي من خلايا بطانة الجزيرة داخل الجزيرة في المورس MS-1، وخصائص الأوعية الدموية الدقيقة للجزيرة، والخلايا β التي تفرز الأنسولين المكون β-TC-68. تم تصميمه ليحاكي عن كثب أصغر نطاق أبعاد لجزر البنكرياس الصغيرة (قطرها 50-200 ميكرومتر) ومتوسط عدد خلاياها9.

تم الإبلاغ عن منهجية جديدة للحصاد والتلوين مصممة خصيصا للتعامل مع الكرويدات الصغيرة (قطرها بين 150-200 ميكرومتر)، مما يتيح اختراق مثالي للأصباغ الفلورية والأجسام المضادة في جميع أنحاء البنية الكروية والخلفية الصغيرة. يتضمن البروتوكول إجراء تركيب باستخدام أجاروز منخفض نقطة الانصهار (LMPA) لتوفير دعم هيكلي لطيف للكرويدات الحساسة مع السماح بمطابقة معامل الانكسار الأمثل. LMPA هو شكل معدل من الأجاروز مع تقليل التليين (حوالي 27 درجة مئوية) ودرجة حرارة انصهار (حوالي 65 درجة مئوية) يحافظ على سلامة العينة أثناء التضمين، وينشئ مصفوفة شفافة بصريا مع تألق ذاتي أدنى 4,6. وأخيرا، تستخدم طريقة التصوير الشفاف للدماغ/الجسم والتحليل الحاسوبي (CUBIC)10 للتنظيف البصري لتمكين أقصى تصور للهياكل الداخلية والحفاظ على سلامة التفاعلات الدقيقة بين الخلايا 5,6,10.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت الموافقة على استخدام أنسجة البنكرياس البشرية وجميع البروتوكولات التجريبية من قبل وزارة التعليم العالي والبحوث في الحكومة الفرنسية (المديرية العامة للبحث والابتكار، وحدة الأخلاقيات الحيوية) وتم تسجيله تحت الرقم DC-2019-3439. تم الحصول على موافقة مستنيرة من الأوصياء القانونيين على جميع الموضوعات.

1. تحضير الكروي

ملاحظة: تم زراعة خط IEC الفأر MS-1 وخط خلايا البنكرياس β الفأر β-TC6 في نفس الوقت للحصول على كمية كافية من الخلايا لزراعة الكرويد. تم زراعة MS-1 في قوارير خلايا ملتصقة T75 في وسط عالي الجلوكوز DMEM يحتوي على 4.5 جرام/لتر جلوكوز، مع 5٪ مصل بقري جنيني و1٪ بنسلين/ستربتوميسين في جو رطب عند 37 درجة مئوية. تم إجراء الممرات عند التقاء (مزرعة لمدة يومين) بعد الانفصال باستخدام تريبسين EDTA مرة واحدة وثلاث غسلات في محلول هانك المتوازن (HBSS). تم زراعة β-TC6 في T75 لخلايا ملتصقة صعبة في وسط DMEM عالي الجلوكوز يحتوي على 4.5 جرام/لتر جلوكوز، مع 15٪ مصل أبقار جنيني و1٪ بنسلين/ستربتوميسين في جو رطب عند 37 درجة مئوية. تم إجراء الممرات عند التقاء β-TC6 (زراعة لمدة 10 أيام) بعد الانفصال بواسطة تريبسين EDTA مرة واحدة وثلاث غسلات في محلول هانك المتوازن (HBSS).

  1. جهز طبق زراعة الكرويدات
  2. اغسل الطبق بمحلول شطف مضاد للالتصاق بسعة 500 ميكرولتر من محلول الشطف المضاد للالتصاق الذي توفره الشركة المصنعة لمنع التصاق الخلايا وتعزيز تكوين الكروي.
  3. قم بطرد المركزي على اللوحة بضغط 1,300 × جرام لمدة 5 دقائق في دوار دلو متحرك مزود بحوامل ألواح في درجة حرارة الغرفة.
  4. راقب اللوحة تحت مجهر خفيف لضمان عدم بقاء فقاعات في الآبار الدقيقة. إذا كان الأمر كذلك، استخدم جهاز الطرد المركزي مرة ثانية عند 1,300 × جرام لمدة 5 دقائق.
  5. تخلص من شطف التصاق واغسل البئر ثلاث مرات بمحلول واحد من HBSS الدافئ.
  6. تخلص من HBSS واستبدل ب 500 ميكرولتر من وسط الكروي الدافئ: DMEM عالي الجلوكوز يحتوي على 4.5 جرام/لتر جلوكوز، 10٪ سيروم أبقار جنيني، و1٪ بنسلين/ستربتوميسين.
  7. حافظ على اللوحة عند 37 درجة مئوية في جو رطب أثناء تحضير نظام التعليق الكروي.
  8. حضن MS-1 و β-TC6 في نفس الوقت باستخدام محلول التربسين وعد الخلايا الحية في كل سلالة.
    ملاحظة: عند البذر، تتكون الكريات باستخدام نسبة 1 IEC إلى 20 β الخلية، وهي نموذجية لجزر البنكرياس. استخدم صفيحة زراعة كروية مكونة من 24 بئرا، حيث يحتوي كل بئر على 300 بئر دقيق يمكن أن يحتوي على كروي واحد مكون من 2000 خلية، ليصبح المجموع 600,000 خلية في كل بئر. في الدراسة الحالية، كشفت القياسات عن نفس الأحجام الكروية التي تشغلها خطوط الخلايا β-TC6 وMS1 المختارة بعد 48 ساعة من زراعة الكروي.
  9. اخلط خطي الخلية معا ليتوافقا بنسبة 1 إلى 20 ل 24 بئرا ثم علقهما في 24 مل من وسط كروي.
    ملاحظة: استخدم ماصة بحجم 10 مل أو 25 مل في حركة الشفط وتدفق السحب لتجانس نظام التعليق.
  10. مبطنة 1 مل لكل بئر واستمر في حركة شفط تدفق لتوزيع تعليق الخلية بشكل متساو في البئر.
  11. قم بطرد مركزي على اللوحة بحرارة 130 × g لمدة 5 دقائق في دوار دلو متحرك مزود بحوامل ألواح في درجة حرارة الغرفة.
  12. راقب اللوحة تحت المجهر لضمان توزيع الخلايا بالتساوي بين الآبار الدقيقة.
    ملاحظة: خلال هذه الخطوة الطرد المركزي، استخدم معدلات تسارع وتباطؤ عالية (70٪-90٪ من مقاييس التسارع والتباطؤ)، وإلا ستنتقل تجمعات الخلايا إلى جانب البئر الدقيق.
  13. حضن الصفيحة عند 37 درجة مئوية، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2.
  14. راقب تكوين ونمو الكروي باستخدام المجهر الضوئي.
    ملاحظة: يجب أن تبدأ الكرويدات β-TC6 / MS-1 في التكوين بعد 24 ساعة من الزرعة، وتحقق شكل كرة بعد 48 ساعة. يمكن مراقبة الصلاحية بواسطة تريبان بلو بعد اضطراب الكروي بواسطة التربسين في عينات مكررة، وقد تم الحفاظ عليها لأكثر من 96 ساعة (80٪-90٪).

2. حصاد وتلوين الكرويدات

  1. أعد تعليق الكرويدات بلطف باستخدام ماصة P1000 في وسطها.
  2. اطلق الكرويدات إلى أحجام صغيرة في جهاز فالكون وطرد مركزي بسعة 15 مل بقوة 130 × جرام لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة
  3. استنشق الوسط بلطف مع تجنب الحبيبات التي تحتوي على الكرويدات.
  4. اغسل الحبيبة مرتين بسعة 2 مل من HBSS برفق لتجنب أي انفصال في الكرويدات، واستخدم الطرد المركزي بقوة 130 x g لمدة 5 دقائق.
  5. تحت غطاء كيميائي، تخلص من HBSS وأعد تعليق الكرويدات في 1 مل من محلول PFA 4٪ طوال الليل عند 4 درجات مئوية لتثبيتها.
  6. قم بطرد المركزي للأنبوب بحرارة 130 x g لمدة 5 دقائق، تخلص من محلول PFA بنسبة 4٪، واغسله 3 مرات بسعة 2 مل من PBS 1x (محضر في ماء فائق النقاء في المختبر).
  7. أعد تعليق 2.5 مل من HBSS.
  8. قم بتوزيع نظام التعليق الكروي في صفيحة ذات 6 آبار.
  9. تحت عدسة مكبرة بمنظار، قم باختيار 20 إلى 30 كرويا باستخدام ماصة P200 وضعها يدويا في أنبوب بسعة 1.5 مل.
    ملاحظة: كل أنبوب بسعة 1.5 مل هو حالة صبغ تحتوي على 20 إلى 30 كرويا. عند وجود أقل من 20 كرويا محصودا، يصبح من الصعب رؤيتها عند إعادة تعليقها لاحقا.
  10. قم بضبط حجم أنابيب 1.5 مل وجهاز الطرد المركزي عند 800 × جرام لمدة 5 دقائق.
    ملاحظة: من هذه النقطة فصاعدا، يتم تنفيذ جميع خطوات شفط المحلول بمساعدة عدسة مكبرة. من الصعب جدا رؤية الكرويدات تحت الضوء الصناعي. قم دائما بتنفيذ الخطوات التالية خلال النهار، مع تثبيت الأنابيب ضد ضوء النهار. جميع الحلول مزودة بسحب مع رأس P1000 مع رأس P10 في نهايته.
  11. قم بإزالة أكبر قدر ممكن من HBSS دون إعادة تعليق الكرويد.
  12. أعد تعليق الكرويدات في محلول التبريد 400 ميكرولتر (0.5 مليون جلايسين في 1x PBS (pH 7-7.4)) لتجنب أي ضوضاء خلفية مستقبلية ناجمة عن الألدهيدات المتبقية من تثبيت PFA. حضانه عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين.
  13. الطرد المركزي بقوة 800 × g لمدة 5 دقائق ثم استخدم الماصة من محلول التبريد.
  14. أعد تعليق في 400 ميكرولتر من حاجز الاختراق (0.2٪ ترايتون X-100، 0.3 مليون جليسين، 20٪ DMSO في 1x PBS). سيساعد ذلك في تحسين اختراق الأجسام المضادة والمجسات النووية. حضانه عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين.
    ملاحظة: من هذه المرحلة فصاعدا، تستقر الكرويدات من تلقاء نفسها ولا تلتصق بجدار الأنبوب. لم يعد الطرد المركزي ضروريا إذا تم استنشاق الأحجامات بلطف دون إزعاج الحبيبات الكروية. إذا لزم الأمر، استخدم الطرد المركزي بقوة 800 × جرام لمدة 5 دقائق.
  15. تخلص من مخزن الاختراق وحضن في 400 ميكرولتر من محلول العزل (0.2٪ ترايتون X-100، 1٪ BSA، 10٪ DMSO، 5٪ مصل الماعز ب 1x PBS) طوال الليل عند 37 درجة مئوية.
  16. تخلص من المحلول الحاجز وحضانه طوال الليل عند حرارة 37 درجة مئوية في 300 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الأولية (0.2٪ في سن 20، 1٪ BSA، 5٪ DMSO، 5٪ مصل الماعز في 1x PBS).
    ملاحظة: الأجسام المضادة الأولية المستخدمة هي: مضادات CD31 (تركيز نهائي 2.2 ميكروغرام/مل)، مضاد إنتغرين β1 (1.43 ميكروغرام/مل)، مضاد الأنسولين (0.66 ميكروغرام/مل)، ومضاد للفئران NTPDase311 (تخفيف 1:1000) (انظر جدول المواد). يجب التحقق من IgG الضابط للأنواع المتطابقة على نفس البنية لضمان الوسم الإيجابي بواسطة المجهر الفلوري.
  17. تخلص من محلول الجسم المضاد الأساسي واغسل 3 مرات باستخدام 400 ميكرولتر من محلول الغسيل (0.2٪ في سن 20، 1٪ BSA في 1x PBS). اهز لمدة 5 دقائق بين الغسلات.
  18. حضن 300 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الثانوي (DAPI (2 ميكروغرام/مل)، 0.2٪ Tween 20، 1٪ BSA، 5٪ DMSO، 5٪ مصل الماعز في 1x PBS) طوال الليل عند 37 درجة مئوية. احم الأنابيب بورق الألمنيوم.
    ملاحظة: يجب دائما إضافة DAPI إلى ظروف التلوين، لأنه يسهل العثور على الكرويدات أثناء التصوير المجهر ويساعد على عدم تبييض الفلوروفورات/الأصباغ المختلفة. جميع الأجسام المضادة الثانوية لها تركيز نهائي يبلغ 2 ميكروغرام/مل (انظر جدول المواد).
  19. تخلص من محلول الأجسام المضادة الثانوية واغسل 3 مرات باستخدام 400 ميكرولتر من محلول غسيل ثان: 0.2٪ Tween 20، 1٪ BSA في 1x PBS. احتفظ بالغسل الأخير وخزن الأنابيب عند 37 درجة مئوية حتى يتم تركيبها في نفس اليوم.

3. تحضير المحلول

  1. تحضير محلول التصفية البصرية
    ملاحظة: يتبع حل التصفية البصرية إجراء CUBIC10 ، وقد أعد كما اقترحه غوناسينغ وآخرون4. تعطى نسب المكونات بنسب مئوية من وزن المحلول النهائي (باللون الأبيض والبيض)، لأن رباعي/N,N′,N′-TETRAKIS(2-HYDROXYPROPYL) إيثيلين ديامين لزجة جدا بحيث لا يمكن استخدامها بالماصة ويجب وزنها.
    1. في زجاجة زجاجية، يزن 9٪ (مع وزن/وضح) من النيتروجين والنيولن والنيولد والنروجين ونيترال تيتراكيس (2-هيدروكسي بروبيل) الإيثيلين ديامين، و22٪ (مع اليوريا إلى اللون)، و44٪ (مع الغرب/رغب) السكروز، و0.1٪ (مع الترايتون X-100)، و24.9٪ (مع الصفاء) من المياه فائقة النقاء المخصصة للمختبر.
      ملاحظة: حوالي 60 جراما من المحلول ضروري لتنظيف صفيحة ذات 24 بئر.
    2. أضف قضيبا مغناطيسيا متكيف مع قطر الزجاجة.
    3. سخن المحلول وحرك حتى درجة حرارة 56 درجة مئوية. احتفظ بزجاجة تحكم مملوءة بالماء على نفس الطبق لمراقبة ارتفاع درجة الحرارة.
    4. تحكم في سرعة التحريك للحفاظ على دوامة سائلة ناعمة وحرك المحلول حتى تذوب جميع المركبات تماما. يجب أن يكون المحلول سائلا وصافيا تماما. قد يستغرق هذا حتى ساعة واحدة.
    5. حافظ على درجة حرارة الغرفة، محميا من الضوء.
      ملاحظة: يجب تحضير محلول التنظيف قبل 24 ساعة على الأقل من التنظيف البصري، للسماح للمحلول بإزالة الغازات والقضاء على أي فقاعات قد تحتويها. لتجنب ظهور الفقاعات، لا تهز المحلول مرة أخرى. لا تخزن أبدا في التخزين البارد.
  2. تحضير محلول LMPA بنسبة 2٪
    1. ازن 0.5 جرام من LMPA على ميزان دقيق وضعه في قارورة إرلنماير بسعة 100 مل.
      تحذير: لا تأخذ قطعة إيرلنماير بحجم أصغر، لأن هناك خطر الحروق إذا فيضان.
    2. أذابه في 25 مل من 1x PBS في درجة حرارة الغرفة.
    3. ادمج المسحوق جيدا في زجاجة زبدة الفول السوداني 1x عن طريق تحريك قارورة إيرلينماير بلطف.
      تحذير: للخطوة التالية، من الضروري استخدام معدات وقائية: قفازات وقناع للعينين والوجه، للحماية من الرذاذ والحروق.
    4. سخن قارورة إيرلينماير في الميكروويف.
    5. راقب متى يبدأ المحلول بالغليان (وجود فقاعات في السائل)، وأزله فورا قبل أن يغلي.
    6. حرك إيرلنماير بلطف لدمج البودرة.
      تحذير: لا تحرك بقوة كبيرة، فقد يفيض السائل أو يغلي ويرش الماء.
    7. أعد جهاز إيرلنماير إلى الميكروويف، وكرر العملية حتى يذوب LMPA بالكامل.
    8. قم بإزالة إيرلنماير، وقبل أن يتصلب LMPA، قم بسرعة بجمع 1 مل من محلول 2٪ LMPA في أنابيب بحجم 1.5 مل. خزن في درجة حرارة الغرفة.
      ملاحظة: العملية تستغرق وقتا طويلا. حضر المحلول مسبقا وخزنه للاستخدام لاحقا.

4. التثبيت والتنظيف البصري

  1. سخن جهاز الطرد المركزي في اللوحة إلى درجة حرارة 40 درجة مئوية، مع تشغيل دورة طويلة لتحضير لوحة العينة.
    ملاحظة: LMPA يجلن عند 30 درجة مئوية. لا تشغل الطرد المركزي بدرجة حرارة أقل من 40 درجة مئوية. إذا سمح الطرد المركزي بذلك، ارفع الحرارة إلى 50 درجة مئوية.
  2. قم بمسيلة 2٪ LMPA في حمام ماء أو سخان أنبوبي عند 70 درجة مئوية لمدة 5 إلى 10 دقائق.
  3. خفض وحافظ على درجة حرارة 2٪ LMPA عند 55 درجة مئوية.
  4. ضع لوحة التصوير برفق على التسخين المسبق على درجة حرارة 50 درجة مئوية.
    ملاحظة: كن حذرا من كسر أو خدش البوليمر الهش المستخدم كقاعدة للآبار.
  5. كن حذرا من أن يكون الطبق ساخنا قبل إضافة 2٪ LMPA. يجب ألا يتناغم في هذه المرحلة.
  6. أنبوب 200 ميكرولتر من 2٪ LMPA في كل بئر. غط كامل قاع الدعامة للحصول على قاعدة سائلة أولى، مما يسمح بتوزيع أكثر سيولة للكرويدات.
  7. تخلص من مخزن الغسيل من الأنابيب، وأعد تعليق الكرويدات في 300 ميكرولتر من 2٪ LMPA، ثم قم بتركيبها مباشرة في البئر. دائما قم بإعادة التعليق بلطف لتجنب الفقاعات.
  8. غط اللوح بورق الألمنيوم لحماية الفلوروفورات.
  9. قم بوزن اللوحة بسرعة بدون ورق الألمنيوم وأعده إلى دفء اللوحة.
  10. جهز لوحا يحتوي على 24 بئرا، مع إضافة الماء للتوازن.
  11. قم بإزالة اللوحة بسرعة مع ورق الألمنيوم من سخان اللوحة لحماية الفلوروفورات المرتبطة بالأجسام المضادة الثانوية. احتفظ بيدك، ولا تضعه على سطح بارد.
  12. أزل ورق الألمنيوم وضعه في جهاز الطرد المركزي الصوحي.
  13. الطرد المركزي عند 1000 × جرام لمدة 15 دقيقة عند 40 درجة مئوية. تحقق من درجة حرارة الدوار، والتي يجب أن تكون عند درجة حرارة الغرفة.
  14. أثناء الطرد المركزي، حضر صينية ثلج: قم بتسطيح الثلج بحيث يمكن وضع اللوحة على سطح مستو.
  15. أزل الطبق وضعه على الثلج، وغط الصينية أو الطبق بورق الألمنيوم. اترك الطبق على الثلج لمدة 10 دقائق.
  16. أزل الطبق من الثلج واتركه في الألمنيوم ليثبت في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.
  17. اغسل محلول التصفية من 1 إلى 1.5 مل لكل بئر، غطيه بورق الألمنيوم، واتركه ليتم تطهيره بصريا في درجة حرارة الغرفة، محميا من الضوء، لمدة لا تقل عن 48 ساعة.
    ملاحظة: لا تخزن الطبق أبدا عند 4 درجات مئوية. قد ينكمش LMPA، وينفصل عن قاع البئر، ويطفو في محلول التنظيف. الصورة خلال أسبوع واحد من التصفية.

5. التصوير

  1. استخدم مجهر قرص دوار كونفوكالي، اختر (على الأقل) هدف 30x.
  2. احتفظ بمحاليل الشفافة، لأنها تساعد على توحيد معاملات الانكسار وتسهيل التصوير ثلاثي الأبعاد.
  3. اكتشف الكرويدات باختيار قناة DAPI لتجنب تبييض الفلوريدات الأخرى.
  4. احصل على الصور باستخدام دالة Z-stack. اختر الجزء العلوي والسفلي من الكروي وترك مسافة 10 ميكرومتر بين الشرائح البصرية.
    ملاحظة: تم إجراء عمليات التقاط الصور وتحليل الصور على منصة التصوير التابعة ل CRBS، PIC-STRA UMS 38، إنسيرم، يونيسترا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لتقييم فعالية الوسم والتنظيف، تم تعريض عدة نماذج لنفس البروتوكول وتم تثبيتها لاحقا (الشكل 1). تم زراعة الكرويدات بنسب 1 IEC إلى 20 خلية β و1 IEC إلى 50 خلية β وفقا للطريقة الموصوفة أعلاه. ومن الجدير بالذكر أن نسبة 1 IEC إلى 20 خلايا β تقارب نسبة الجزيرة الصغيرة في البنكرياس البشري. استخدام التربان الأزرق لتلوين الكرويدات المشوهة أكد أنها تحافظ على خلايا حية (80-90٪ من الخلايا الحية) على مدى 96 ساعة. تكتسب هذه الملاحظة أهمية خاصة لدراسة التغيرات الخلوية التدر...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تطوير نموذج كروي يجمع بين خلايا IEC لمورس MS-1 وخلايا β الفئران β-TC6 يحاكي البنية ثلاثية الأبعاد لجزر البنكرياس. هذا النموذج مناسب لتحليل خلل IEC الناتج عن الإجهاد على مدى 72 ساعة وتأثيره على بقاء ووظيفة خلايا β، مع الصلة بأبحاث زراعة الجزر. ومن المهم أن الكروية المكونة من خلايا الفأر كانت متجانسة بطبيعتها ولها سلالة بطانية ذات صلة داخل الجزر.

من الإنجازات البارزة تطوير والتحقق من بروتوكول لجمع وتلوين وتنظيف الكرويدات الصغيرة بصريا (150-200 ميكرومتر)، يعال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون أنهم لا يواجهون تضاربا في المصالح

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يشكر المؤلفون على باسكال كيسلر، من منصة التصوير PICSTRA، لمساعدته الخبيرة في مجهر الأقراص الدوارة واستخراج بيانات الوسم الخام من مكدس Z. يرغب المؤلفون في الاعتراف بالهدية الكريمة التي قدمها الدكتور و. بيتايغر، والدكتور أ. لانغلويس، والدكتور ك. بوزكري من المركز الأوروبي لدراسة السكري (CEED، ستراسبورغ، فرنسا)

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
µ-plate 24 بئر Black ID 14 مم IBIDI82426
أجر ويل 800 (24 بئرا)الخلايا الجذعية34815
حل شطف مكافحة الالتصاق الخلايا الجذعية7010
الأجسام المضادة المضادة لمادة CD31 [P2B1]أبكامAB24590التركيز النهائي 2.2 وميكرو؛ g/mL
Anti-Integrin & beta; 1 جسم مضاد، نسخة من MB1.2ميركMAB1997 التركيز النهائي 1.43 وميكرو؛ g/mL
قارورة زراعة الخلايا، T-75، سطح، سطح : خلية+، غطاء فلترسارستيدت83.3911.302β-TC6
قارورة زراعة الخلايا، T-75، السطح: قياسي، غطاء لولبي ذو وضعيتينسارستيدت83.3911.02ثقافة MS-1
دي هيدروكلوريد DAPIثيرموفيشر،D1306التركيز النهائي 2 وميكرو؛ g/mL
ثنائي ميثيل سلفوكسيد  سيغماD8418-250ML
DMEM، عالي الجلوكوز، جلوتا ماكس وتجارة؛ مكمل، بيروفاتثيرموفيشر العلمي31966047
دولاجلوتايد
دولاجلوتايدليليقلم Trulicity بسعة 1.5 ملغ
مصل الأبقار الجنينيبيوويستS1810-500
الجلايسينسيغماG7126-1KG
الجسم المضاد الثانوي المضاد لخنزير غينيا IgG (H+L) المضاد الثانوي عالي الامتصاص المقاطع، Alexa Fluor & trade؛ 555ثيرموفيشرA21435التركيز النهائي 2 وميكرو؛ g/mL
الجسم المضاد الثانوي المضاد للفئران IgG (H+L) الماعز المضاد العالي الممتص، Alexa Fluor & Trade؛ 488ثيرموفيشر  A-11029التركيز النهائي 2 وميكرو؛ g/mL
الجسم المضاد الثانوي المضاد للأرانب IgG (H+L) الماعز المضاد عالي الامتصاص، Alexa Fluor & Trade؛ 633ثيرموفيشرA-21071التركيز النهائي 2 وميكرو؛ g/mL
الجسم المضاد الثانوي المتقاطع IgG (H+L) المضاد للفئران في الماعز، أليكسا فلور وتجارة؛ 555ثيرموفيشرA21434التركيز النهائي 2 وميكرو؛ g/mL
مصل الماعزسيغماS26-100ML
HBSS بدون كالسيوم و المغنيسيوم  & الفينول الأحمركورنينغ21-022-CV
الأنسولين (C27C9) أرنب mABالإشارات الخلوية3014Sالتركيز النهائي 0.66 وميكرو؛ g/mL
جزيرة بنكرياس بشرية معزولة مركز أوروبا وأكوت؛ en d'Etude du Diabetese (CeeD)هدية كريمة من الدكتور كريم بوزاكري. درجة سريرية، معزول وفقا للإرشادات.
درجة حرارة الجل المنخفضة أغاروزميركA9414-10G
خلايا MS-1ATCCCRL-2279
محلول بارافورمالديهايد، 4٪ في PBS 1xفيشر العلمي15670799
PBS 10xيوروميديكسET330-Aمخفف مرة واحدة في مياه فائقة النقاء من الدرجة المختبرية
البنسلين-ستريبتوميسينPAN BiotechP06-07100
أجسام مضادة لفئران خنازير غينيا متعددة النسيال NTPDase3  mN3-1CI4; mN3-2C (I4,I5); mN3-3C(I4,I5) https://ectonucleotidases-ab.com/Antibodies.phpالتخفيف 1:1000
Quadrol/N,N,N′,N′-Tetrakis(2-Hydroxypropyl) إيثيلين ديامين  سيغما122262-1L
قرص دوار أوليمبوس IXplore SPIN حلول أوليمبوس العلمية
السكروز لعلم الأحياء الجزيئيسيغماS0389-1KG 
درجة مختبر الجودة الحيوية Triton X-100يوروميديكس2000-A
تربسن/إيدتا (10x)PAN BiotechP10-025100
توين-20يوروميديكس//
اليورياسيغماU-5128
خلايا β-TC6ATCCCRL-11506

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Langlois, A., Pinget, M., Kessler, L., Bouzakri, K. Islet transplantation: Current limitations and challenges for successful outcomes. Cells. 13 (21), 1783(2024).
  2. Li, X., Meng, Q., Zhang, L. The fate of allogeneic pancreatic islets following intraportal transplantation: Challenges and solutions. J Immunol Res. 2018, 1-13 (2018).
  3. Nürnberg, E., et al. Routine optical clearing of 3D-cell cultures: Simplicity forward. Front Mol Biosci. 7, 20(2020).
  4. Gunasingh, G., Browning, A. P., Haass, N. K. Rapid optical clearing for semi-high-throughput analysis of tumor spheroids. J Vis Exp. 2022 (186), e64103(2022).
  5. Paysan, J. The art of tissue clearing. , John Wiley & Sons Ltd. West Sussex. (2021).
  6. Costa, E. C., Silva, D. N., Moreira, A. F., Correia, I. J. Optical clearing methods: An overview of the techniques used for the imaging of 3D spheroids. Biotechnol Bioeng. 116 (10), 2742-2763 (2019).
  7. Vieites-Prado, A., Renier, N. Tissue clearing and 3D imaging in developmental biology. Development. 148 (18), dev199369(2021).
  8. Poitout, V., et al. Morphological and functional characterization of βTC-6 cells: An insulin-secreting cell line derived from transgenic mice. Diabetes. 44 (3), 306-313 (1995).
  9. Ionescu-Tirgoviste, C., et al. A 3D map of the islet routes throughout the healthy human pancreas. Sci Rep. 5 (1), 14634(2015).
  10. Susaki, E. A., et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nat Protoc. 10 (11), 1709-1727 (2015).
  11. Munkonda, M. N., et al. Characterization of a monoclonal antibody as the first specific inhibitor of human NTP diphosphohydrolase-3: partial characterization of the inhibitory epitope and potential applications. FEBS J. 276 (2), 479-496 (2009).
  12. Sbat, N. Study of the endothelial-to-mesenchymal transition of intra-islet endothelial cells in mice and its pharmacological modulation: Relevance for pancreatic islet transplantation. , Université Paris Cité. https://theses.hal.science/tel-03873595 (2021).
  13. Barillaro, M., Schuurman, M., Wang, R. β1-integrin: A key player in controlling pancreatic beta-cell insulin secretion via interplay with SNARE proteins. Endocrinology. 164 (1), bqac179(2023).
  14. Lavoie, E. G., et al. Identification of the ectonucleotidases expressed in mouse, rat, and human Langerhans islets: potential role of NTPDase3 in insulin secretion. Am J Physiol Endocrinol Metab. 299 (4), E647-E656 (2010).
  15. Giuliani, A. L., Sarti, A. C., Di Virgilio, F. Ectonucleotidases in acute and chronic inflammation. Front Pharmacol. 11, 619458(2021).
  16. Saunders, D. C., et al. Ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolase-3 antibody targets adult human pancreatic β cells for in vitro and in vivo analysis. Cell Metab. 29 (3), 745-754.e4 (2019).
  17. Syed, S. K., et al. Ectonucleotidase NTPDase3 is abundant in pancreatic β-cells and regulates glucose-induced insulin secretion. Am J Physiol Endocrinol Metab. 305 (10), E1319-E1326 (2013).
  18. Cheng, K., et al. High passage MIN6 cells have impaired insulin secretion with impaired glucose and lipid oxidation. PLoS One. 7 (7), e40868(2012).
  19. Rane, T. D., Armani, A. M. Two-photon microscopy analysis of gold nanoparticle uptake in 3D cell spheroids. PLoS One. 11 (12), e0167548(2016).
  20. Alzeeb, G., et al. Gastric cancer multicellular spheroid analysis by two-photon microscopy. Biomed Opt Express. 13 (5), 3120(2022).
  21. Diosdi, A., et al. Single-cell light-sheet fluorescence 3D images of tumour-stroma spheroid multicultures. Sci Data. 12 (1), 492(2025).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

CUBIC

مقالات ذات صلة