مقالة منهجية

تحديد أنواع المتفطرة بطريقة رقائق المصفوفة الدقيقة للحمض النووي

DOI:

10.3791/68234

⸱

يونيو 24, 2025

 ,  ,  ,  , 
1Quanzhou First Hospital Affiliated to Fujian Medical University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا ، نقدم طريقة رقاقة المصفوفات الدقيقة للحمض النووي لتحديد أنواع المتفطرة ، والتي ستعمل على تحسين دقة التشخيص وكفاءة الأمراض ذات الصلة للاستخدام السريري.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تقدم هذه الدراسة طريقة رقاقة المصفوفة الدقيقة للحمض النووي المصممة للتعرف الدقيق على أنواع المتفطرة . من خلال الاستفادة من مبادئ تضخيم وتهجين تفاعل البوليميراز المتسلسل غير المتماثل ، تستهدف هذه الطريقة 17 بكتيريا فطرية شائعة ، بما في ذلك تلك الموجودة في مركب المتفطرة السلية والعديد من البكتيريا الفطرية غير السلية. إنه قابل للتطبيق على مجموعة واسعة من العينات السريرية مثل البلغم ، والقيح ، والسائل الهوائي ، والسائل النخاعي ، والسائل البزلي من المرضى المشتبه في إصابتهم بأمراض الفطريات. يتضمن الاختبار تضخيم التسلسلات المستهدفة في جينوم المتفطرة من خلال تفاعل البوليميراز المتسلسل غير المتماثل ، متبوعا بالتهجين مع المجسات الموجودة على شريحة المصفوفة الدقيقة. يعزز الترتيب الفريد للمسبار (المتكرر 5x في مصفوفة دقيقة من 12 صفا × 10 أعمدة) واستخدام مجسات التحكم موثوقيته. أظهرت التجارب السريرية التي أجريت على 1,724 عينة أداء عاليا. حققت الطريقة خصوصية سريرية وحساسية وتوافق عام بنسبة 100٪ مقارنة بنتائج التسلسل ، باستثناء عينتين نادرتين من البكتيريا الفطرية غير السلية خارج نطاق اكتشافها. توفر طريقة رقاقة المصفوفات الدقيقة للحمض النووي هذه تحسنا كبيرا مقارنة بتقنيات التشخيص التقليدية ، مما يقلل من وقت التشخيص ويوفر اكتشافا أكثر شمولا ، وبالتالي تتمتع بإمكانيات كبيرة في تشخيص وإدارة الأمراض الفطرية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تشمل المتفطرة ، وهي جنس من البكتيريا ، مجموعة متنوعة من الكائنات الحية ذات الآثار الكبيرة على صحة الإنسان. والمتفطرة السلية، وهي العامل المسبب لمرض السل، هي آفة صحية عالمية طويلة الأمد. على الرغم من عقود من الجهود المبذولة في الوقاية والعلاج ، لا يزال السل يمثل تهديدا رئيسيا للصحة العامة ، وهو مسؤول عن عدد مذهل من الوفيات السنوية والإصابات الجديدة في جميع أنحاء العالم1،2. كما يتم التعرف على البكتيريا الفطرية غير السلية (NTM) بشكل متزايد كمسببات أمراض مهمة ، خاصة في مجموعات محددة من المرضى والبيئات البيئية.

التحديد الدقيق لأنواع المتفطرة هو حجر الزاوية في الإدارة الفعالة للمرض3،4. طرق التشخيص التقليدية لها قيود متأصلة. ومن المعروف أن التقنيات القائمة على الثقافة، التي تم الاعتماد عليها تاريخيا، تستغرق وقتا طويلا. يمكن أن تستغرق عملية عزل واستزراع البكتيريا الفطرية أسابيع إلى شهور ، وقد يعاني المرضى خلالها من تطور المرض والانتقال المحتمل إلى الآخرين. علاوة على ذلك ، يصعب للغاية استزراع بعض أنواع البكتيريا الفطرية ، مما يؤدي إلى نتائج سلبية كاذبة وتأخر أو علاج غير صحيح5،6.

يمكن أن يحدد التلوين الحمضي السريع ، وهو طريقة أخرى شائعة الاستخدام ، البكتيريا الفطرية بناء على خصائصها الفريدة لجدار الخلية التي تقاوم إزالة اللون. ومع ذلك ، فإنه يفتقر إلى الخصوصية للتمييز بين أنواع المتفطرة المختلفة ، مما يوفر فقط مؤشرا واسعا على وجود البكتيرياالفطرية 7. ظهرت الطرق الجزيئية مثل تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) كبدائل للتغلب على بعض هذه العيوب. يمكن لتفاعل البوليميراز المتسلسل اكتشاف الحمض النووي للبكتيريا الفطرية بسرعة أكبر من طرق الاستزراع ، مما يتيح تشخيصا أسرع. ومع ذلك ، فإن فحوصات تفاعل البوليميراز المتسلسل التقليدية تستهدف عادة عددا محدودا من الجينات وقد لا تقدم تحديدا شاملا للأنواع ، خاصة عند التعامل مع أنواع المتفطرة ذات الصلةالوثيقة 5.

أحدثت تقنية المصفوفات الدقيقة للحمض النووي ثورة في مجالات علم الأحياء الدقيقة والتشخيص. يوفر القدرة على تحليل أهداف وراثية متعددة في وقت واحد ، مما يوفر رؤية أكثر شمولا وتفصيلا للسكان الميكروبيين 8,9. وقد سلطت الأبحاث الحديثة في هذا المجال الضوء على إمكانات وأهمية التقنيات الجزيئية المتقدمة لتحديد المتفطرة. على سبيل المثال ، أظهرت دراسة أجراها Wang et al.10 الحساسية والخصوصية المحسنة لشريحة مصفوفة دقيقة للحمض النووي المعدلة في الكشف عن أنواع المتفطرة النادرة في بيئة سريرية. أكدت النتائج التي توصلوا إليها على قيمة التحسين المستمر لتقنية المصفوفات الدقيقة. ركزت دراسة أخرى أجراها وانغ وزملاؤه11على تكامل بيانات المصفوفات الدقيقة للحمض النووي مع النتائج السريرية في مرضى السل. قدمت النتائج نظرة ثاقبة للقيمة التنبؤية للتحديد الدقيق لأنواع المتفطرة وإمكانية الطب الشخصي.

مبدأ الاختبار
تستخدم هذه المجموعة تقنية رقاقة المصفوفات الدقيقة للحمض النووي ، جنبا إلى جنب مع تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل غير المتماثل (PCR) ومبادئ التهجين ، لتحديد أنواع المتفطرة. تشتمل المجموعة على شريحة تحديد أنواع المتفطرة وكواشف تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل غير المتماثلة. يتم إصلاح الرقاقة بمجسات خاصة بالأنواع للكشف عن أنواع المتفطرة وتحديدها. تشمل أهداف الكشف 17 نوعا أو مجموعة شائعة سريريا ، مثل مركب المتفطرة السلية ، المتفطرة داخل الخلايا ، المتفطرة الطيرة ، المتفطرة القرية ، المتفطرة البكتيريا الأجنبية ، المتفطرة الكونساسي ، المتفطرة القوية ، المتفطرة البكتيريا العصبي ، المتفطرة المتفطرة الفلفيسكينز ، المتفطرة الأرضية ، المتفطرة شيلوناي والمتفطرة الخراج ، المتفطرة الفلي ، المتفطرة غير الكروموجينيكية ، المتفطرة المارينوم و المتفطرة القرحة ، المتفطرة الذهبية ، المتفطرة زولغاي والميتوبكتيريا مالموينية ، المتفطرة زينوبي ، والمتفطرة اللطاخة.

يعد اكتشاف هذه الأنواع ال 17 من المتفطرة أمرا بالغ الأهمية للتشخيص السريري الدقيق وإدارة المرضى المخصصة. يتم إعطاء الأولوية لمركب المتفطرة السلية (MTBC) نظرا لدوره في مرض السل ، مما يستلزم عزلا فوريا وعلاجا متعدد الأدوية للحد من انتقال العدوى ومعالجة مقاومة الأدوية. تؤثر الأنواع الموجودة داخل مركب المتفطرة الطيورية داخل الخلية (MAC) ، مثل M. avium و M. intracellulare ، في الغالب على الأفراد الذين يعانون من نقص المناعة (مثل فيروس نقص المناعة البشرية / الإيدز) أو أولئك الذين يعانون من أمراض الرئة المزمنة ، مما يتطلب أنظمة طويلة تعتمد على الماكروليد. تشتهر البكتيريا الفطرية سريعة النمو (RGMs) مثل M. abscessus و M. fortuitum بمقاومة المضادات الحيوية وغالبا ما تسبب التهابات شديدة في الجلد أو الأنسجة الرخوة أو الرئة ، مما يتطلب مجموعات عدوانية من الجراحة والمضادات الحيوية المستهدفة (على سبيل المثال ، أميكاسين ، ماكروليدات). الأنواع البيئية مثل M. gordonae أو M. smegmatis هي ملوثات متكررة ولكنها قد تسبب التهابات انتهازية في سياقات محددة ، مما يتطلب ارتباطا سريريا دقيقا لتجنب العلاج غير الضروري. مسببات الأمراض مثل M. marinum (المرتبطة بالتعرض المائي) و M. ulcerans (التي تسبب قرحة بورولي) لها منافذ وبائية مميزة ، توجه تقييمات تاريخ التعرض. الأنواع النادرة ولكنها ذات صلة سريريا (على سبيل المثال ، M. szulgai ، M. malmoense) تحاكي السل وتتطلب أنظمة خاصة بالأنواع. يعد التحديد الدقيق أمرا بالغ الأهمية ، حيث أن مدة العلاج ، واختيار الدواء (على سبيل المثال ، حساسية ريفامبين في M. kansasii مقابل المقاومة الجوهرية في NTMs) ، والتشخيص يختلف اختلافا كبيرا. يعد التشخيص الجزيئي واختبار الحساسية لمضادات الميكروبات ضروريين لتحسين النتائج ، لا سيما في السكان الذين يعانون من نقص المناعة أو العدوى المعقدة.

أولا ، يتم تضخيم التسلسلات المستهدفة في جينوم المتفطرة من خلال تفاعل البوليميراز المتسلسل غير المتماثل. بعد ذلك ، يتم تهجين المنتجات المضخمة مع المجسات الموجودة على الشريحة. إذا كانت المتفطرة المستهدفة موجودة في العينة ، فسوف ترتبط المنتجات المضخمة على وجه التحديد بالمجسات المقابلة على الشريحة. أخيرا ، من خلال مسح إشارات التهجين على الرقاقة ، يمكن تحديد أنواع المتفطرة في العينة.

باستخدام تقنية المصفوفة الدقيقة لرقائق الجينات ، يتم تثبيت مجسات محددة للكشف عن الجينات المذكورة أعلاه ومجسات التحكم المختلفة على الركيزة. يتم تكرار كل مسبار كشف ومسبار تحكم 5x ، لتشكيل مصفوفة دقيقة من 12 صفا × 10 أعمدة. يظهر ترتيب المسبار في الشكل 1. تحتوي كل شريحة على أربع مصفوفات دقيقة متطابقة ، ويمكن لكل مصفوفة دقيقة اكتشاف عينة واحدة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت الموافقة على هذه الدراسة من قبل لجنة الأخلاقيات في مستشفى تشيوانتشو الأول التابع لجامعة فوجيان الطبية (الموافقة رقم 2024-K035). تم الحصول على الموافقة المستنيرة من جميع المرضى قبل جمع العينات السريرية. تم إبلاغ المرضى بالغرض من الدراسة والإجراءات المتضمنة وحقهم في الانسحاب في أي وقت دون التأثير على رعايتهم الطبية.

1. متطلبات العينة

ملاحظة: عند جمع عينات من المرضى المشتبه سريريا في إصابتهم بالسل وأمراض الفطريات غير السلية (NTM) لاختبارها باستخدام هذه المجموعة ، اتبع الخطوات التالية:

  1. جمع عينات مثل البلغم أو القيح أو الإفرازات ، والسائل الغسيل القصبي السنخي ، والسائل البزلي (بما في ذلك السائل النخاعي ، والسائل الجنبي والبريتوني ، والسائل التامور ، وسوائل المفاصل ، والصفراء) ، والبول من المرضى.
    1. لعينات البلغم:
      1. اطلب من المريض شطف الفم بالماء النظيف في الصباح ثم سعال البلغم العميق في حاوية تخزين عينات معقمة وإغلاقها وإرسالها للاختبار.
      2. أضف 1-2 ضعف حجم 4٪ هيدروكسيد الصوديوم ، ورجه واخلطه بالتساوي.
      3. بعد 15-20 دقيقة ، أضف حجما متساويا من محلول الفوسفات 6.8 درجة الحموضة واخلطه بالتساوي.
      4. في درجة حرارة الغرفة ، جهاز الطرد المركزي عند 2,000 × جم لمدة 15 دقيقة وتخلص من المادة الطافية. أضف 1 مل من 0.9٪ كلوريد الصوديوم عبر ماصة واخلطها جيدا. استخدم للكشف.
    2. لعينات القيح أو الإفراز:
      1. اشطف السطح بمحلول ملحي عادي معقم. اجمع القيح أو الإفراز بمسحة معقمة ، وأغلقها وأرسلها للاختبار.
      2. أضف 3 أضعاف حجم 4٪ هيدروكسيد الصوديوم ورجه جيدا حتى يمتزج جيدا.
      3. اتركه في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة (رجه يدويا مرتين خلال هذه الفترة) ، وجهاز الطرد المركزي عند 2,000 × جم في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة ، ثم تخلص من المادة الطافية. أضف 1 مل من 0.9٪ كلوريد الصوديوم عبر ماصة واخلطها بالتساوي ؛ استخدم للكشف.
    3. لسائل غسيل القصبات الهوائية:
      1. حقن 10-20 مل من المحلول الملحي العادي من خلال أنبوب غسيل قصبي هوائي محمي (PBAL).
      2. اجمع العينة في زجاجة معقمة عن طريق شفط الضغط السلبي وأرسلها للاختبار.
    4. للسائل الدماغي النخاعي:
      1. اجمع ما لا يقل عن 2 مل من العينة باستخدام تقنية التعقيم.
      2. جهاز طرد مركزي عند 2,000 × جم لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تخلص من المادة الطافية. أضف 1 مل من محلول كلوريد الصوديوم 0.9٪ عبر ماصة ، واخلطها جيدا ، واستخدمها للاختبار.
    5. لعينات البول:
      ملاحظة: ينصح باستخدام أول كمية كاملة من البول في الصباح أو البول في منتصف الليل وفي وقت متأخر. يمكن أيضا جمع البول عن طريق القسطرة.
      1. اجمع العينة في وعاء معقم واترك عينة البول التي تم جمعها تقف لمدة 4-5 ساعات.
      2. جهاز طرد مركزي عند 2,000 × جم لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تخلص من المادة الطافية. أضف 1 مل من محلول كلوريد الصوديوم 0.9٪ عبر ماصة ، واخلطها جيدا ، واستخدمها للاختبار.
  2. تخزين العينات
    ملاحظة: لا ينبغي تخزين العينات على وسط صلب مجمدة، لأن التجميد قد يؤثر على العمليات اللاحقة.
    1. قم بتخزين العينات الموجودة في الوسط السائل عند -70 درجة مئوية لمدة لا تزيد عن 5 سنوات.
    2. قم بتخزين جميع العينات في درجة حرارة 2-8 درجة مئوية لمدة لا تزيد عن شهرين.
  3. نقل العينات
    1. عند نقل عينات عزل الاختبار ، تأكد من استخدام حاوية مغلقة تلبي متطلبات السلامة الحيوية وفقا للشروط التي تسمح بها اللوائح.

2. إعداد التجربة

  1. تحضير حلول غسيل الرقائق
    ملاحظة: قم بإعداد محلول غسيل الرقائق الأول ومحلول غسيل الرقائق II وفقا لعدد الرقائق. يجب أن يكون الحجم بحيث يمكن غمر الرقائق بالكامل أثناء الغسيل. امزجها بالتساوي وقم بتوازنها مع درجة حرارة الغرفة (10-30 درجة مئوية). التركيز النهائي ل SSC هو 2x ، والتركيز النهائي ل SDS هو 0.2٪.
    1. لتحضير محلول غسيل الرقائق الأول ، امزج 20x SSC والماء المقطر (أو الماء النقي) و 10٪ SDS بنسبة 10:88: 2 بالتسلسل لتحضير محلول غسيل الرقائق I. على سبيل المثال ، عند تحضير حجم إجمالي قدره 600 مل ، قم أولا بقياس 60 مل من 20x SSC و 528 مل من الماء المقطر (أو الماء النقي) وضعهما في دورق سعة 1 لتر واخلطهما بالتساوي باستخدام قضيب التحليب. ثم أضف 12 مل من 10٪ SDS واخلطها بالتساوي مرة أخرى.
    2. لتحضير محلول غسيل الرقائق II: التركيز النهائي ل SSC هو 0.2x. امزج 20x SSC والماء المقطر (أو الماء النقي) بنسبة 1:99 للحصول على محلول غسيل الرقائق II. بأخذ حجم إجمالي قدره 600 مل كمثال ، قم بقياس 6 مل من 20x SSC و 594 مل من الماء المقطر (أو الماء النقي) وضعها في دورق سعة 1 لتر واخلطها بالتساوي.
      ملاحظة: إذا كان محلول SDS بنسبة 10٪ ينتج عنه رواسب ندفية بيضاء ، فقم بتسخينه عند 50 درجة مئوية ، واخلطه جيدا ، ثم قم بإعداد مخزن الغسيل microarray المؤقت. إذا كان Washing Buffer I يطور رواسب ندفية بيضاء ، فقم بتسخينها عند 50 درجة مئوية ، واخلطها جيدا ، وتوازن مع درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام.
  2. تحضير 350 مل من خليط الماء المثلج.
  3. جهز الماء المقطر (أو الماء النقي).

3. تحضير الأدوات والمواد

  1. اختيار الأداة وإعدادها
    1. تحديد وإعداد الماسح الضوئي لشريحة المصفوفات الدقيقة ، والتأكد من معايرتها وجاهزيتها للاستخدام.
    2. قم بإعداد أداة استخراج الحمض النووي ، والتحقق من وظائفها وتحميل الكواشف اللازمة.
    3. ضع صندوق تهجين رقاقة المصفوفات الدقيقة للجينات في الموقع المناسب وتأكد من حالة عمله المناسبة.
  2. تحضير أدوات السحب
    1. اجمع الماصات الدقيقة بمواصفات 0.1-10 ميكرولتر و2-20 ميكرولتر و20-200 ميكرولتر، جنبا إلى جنب مع أطراف الماصات النظيفة والمعقمة المقابلة لها. تأكد من معايرة الماصات الدقيقة بدقة وتركيب الأطراف بشكل صحيح.
  3. ترتيب المعدات المساعدة
    1. قم بإعداد حمام مائي بدرجة حرارة ثابتة واضبطه على درجة الحرارة المطلوبة (50 درجة مئوية).
    2. ضع جهاز الطرد المركزي الدقيق القادر على الطرد المركزي أنابيب الطرد المركزي سعة 1.5 مل وتحقق من إعدادات التوازن والسرعة.
    3. قم بتنظيم أنابيب الطرد المركزي النظيفة والمعقمة (200 ميكرولتر و 1.5 مل) وشرائط اختيارية نظيفة ومعقمة من ثمانية آبار (200 ميكرولتر) على رفوف أنابيب أجهزة الطرد المركزي.
  4. جاهزية معدات مناولة العينات
    1. ضع شاكر درجة حرارة ثابتة في مكان مناسب وقم بتعيين معلمات الاهتزاز المناسبة.
    2. ضع حاويتين جانبا لغسل الرقائق وتأكد من نظافتهما وجفافهما.
    3. رتب رفوف منزلقة وجهاز طرد مركزي ، واحصل على حاوية للطرد المركزي وتجفيف الرقائق في متناول اليد.
  5. تحضير مكبر للصوت PCR
    1. قم بتشغيل مضخم تفاعل البوليميراز المتسلسل وبرمجته وفقا للبروتوكول التجريبي ، مما يضمن أنه جاهز لإجراء تفاعلات التضخيم.

4. استخراج الحمض النووي

ملاحظة: قم بإجراء العملية في منطقة تحضير العينة واتبع الخطوات التالية:

  1. اعداد
    1. أضف 80 ميكرولتر من محلول استخلاص الحمض النووي إلى أنبوب استخراج الحمض النووي وأضف 1 مل من 0.9٪ كلوريد الصوديوم.
  2. جمع عينات معزولة
    1. لبدء جمع العينات ، افحص مصدر العينات ، سواء كانت من وسط صلب أو وسط سائل.
    2. لجمع عينات متوسطة صلبة ، استخدم حلقة تلقيح معقمة لاختيار مستعمرة مرئية من الوسط الصلب المناسب. إذا نمت البكتيريا لتغطي الوسط بأكمله ، فاختر كمية مقابلة من العشب البكتيري. ضعه بحذر في أنبوب استخراج الحمض النووي الذي يحتوي على محلول استخلاص الحمض النووي ، مع الحرص على تجنب التقاط الوسط الصلب قدر الإمكان.
    3. بالنسبة للعينات المتوسطة السائلة ، قم بشفط 10-20 ميكرولتر من المعلق البكتيري بتعكر يساوي أو يزيد عن معيار 1 ماكفارلاند. حقنه في أنبوب استخراج الحمض النووي الذي يحتوي على محلول استخراج الحمض النووي.
      ملاحظة: بعد جمع العينات ، سواء من وسط صلب أو سائل ، تكون العينات جاهزة لعملية استخراج الحمض النووي اللاحقة.
  3. استخراج الحمض النووي
    1. بعد إضافة العينات المعالجة مسبقا أو عزل العينات من الخطوة 1.1 المذكورة أعلاه ، استخدم أداة الاستخراج السريع للحمض النووي لاستخراج الأحماض النووية. ضع الأحماض النووية المستخرجة عند -20 درجة مئوية للتخزين المؤقت.
      ملاحظة: كمؤشر على كفاءة الاستخراج ، يمكن للمستخرج الأوتوماتيكي استخراج عينات ذات حمولة حمض نووي فيروسي أكبر من 100 نسخة / مل. يجب ألا يتجاوز وقت التخزين المؤقت 2 أشهر.

5. تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل

  1. تحضير نظام تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل
    1. في منطقة تخزين الكاشف وتحضيره ، قم بإعداد أنابيب طرد مركزي سعة 200 ميكرولتر أو شرائط ذات ثمانية آبار وفقا لعدد العينات المراد اختبارها ، وقم بتمييز أرقام العينات مسبقا. أخرج كواشف تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل من المجموعة ، واتركها تذوب وتذوب بشكل طبيعي ، ورجها برفق وتخلط بالتساوي ، ثم قم بالطرد المركزي بسرعة لجعل الكواشف تتجمع في قاع الأنابيب.
    2. وفقا لعدد العينات ، قم بتقسيم كواشف تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل إلى أنابيب طرد مركزي سعة 200 ميكرولتر أو شرائط ذات ثمانية آبار بحجم 18 ميكرولتر لكل أنبوب. أغلق أغطية الأنبوب بإحكام ثم انقلها إلى منطقة تحضير خليط تفاعل التضخيم وتضخيمها.
    3. أضف 2 ميكرولتر من قالب الحمض النووي (الحمض النووي للعينة المراد اختبارها (أي المادة الطافية في أنبوب استخراج الحمض النووي) ، أو منتجات التحكم الإيجابي ، أو منتجات التحكم السلبية) في منطقة تحضير العينة. تأكد من أن الحجم الإجمالي لكل نظام تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل يصل إلى 20 ميكرولتر.
      ملاحظة: استخدم منتجات التحكم الإيجابي ومنتجات التحكم السلبي في كل مرة أثناء التضخيم. يمكن استخدام منتج التحكم الإيجابي لمراقبة الجودة في عمليات تضخيم وتهجين تفاعل البوليميراز المتسلسل ، ويمكن استخدام منتج التحكم السلبي لمراقبة البيئة وعملية التشغيل.
  2. التضخيم
    1. ضع أنابيب الطرد المركزي أو شرائط الآبار الثمانية التي تحتوي على الكواشف في أداة تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). تأكد من تسخين الجهاز مسبقا إلى درجة الحرارة المطلوبة. إجراء تفاعل تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل وفقا لبرنامج التدوير الحراري التالي: التمسخ الأولي عند 94 درجة مئوية لمدة 600 ثانية (دورة واحدة) ؛ 35 دورة من التمسخ عند 94 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، والتلدين عند 60 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، والتمديد عند 72 درجة مئوية لمدة 40 ثانية ؛ تمديد نهائي عند 72 درجة مئوية لمدة 420 ثانية (دورة واحدة) ؛ عقد في 4 درجات مئوية إلى أجل غير مسمى (دورة واحدة).

6. تهجين رقاقة

ملاحظة: قبل انتهاء تفاعل تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل ، قم بإجراء العمليات التالية:

  1. اضبط درجة حرارة الحمام المائي بدرجة حرارة ثابتة على 50 درجة مئوية وقم بتسخينه مسبقا.
  2. تحضير الرقائق
    1. أضف 200 ميكرولتر من الماء المقطر (أو الماء النقي ، كما هو موضح في الشكل 2 أ) إلى الجزء السفلي من صندوق تهجين رقاقة المصفوفات الدقيقة للجينات. ضع القوس بين عمودي تحديد المواقع داخل المربع.
    2. ضع الشريحة بحذر مع الجانب الأمامي لأعلى على الحامل ، وقم بتغطية الشريحة بزلة الغطاء بحيث يكون رؤسائها الأربعة متجها لأسفل (كما هو موضح في الشكل 2 ب).
      ملاحظة: تأكد من اتجاه الموضع الصحيح لزلة الغطاء بحيث تتماشى نهايته مع الملصق الموجود في نهاية الشريحة.
  3. تحضير وتمسخ وتبريد خليط تفاعل التهجين
    1. قم بإعداد أنابيب طرد مركزي سعة 200 ميكرولتر أو شرائط ذات ثمانية آبار وفقا لعدد العينات وقم بتسميتها بشكل صحيح.
    2. أخرج المخزن المؤقت للتهجين من المجموعة وقم بتسخينه عند 50 درجة مئوية حتى يذوب تماما. بعد الخلط الشامل ، قم بالطرد المركزي بسرعة في جهاز طرد مركزي دقيق. Aliquot 9 ميكرولتر من مخزن التهجين في كل أنبوب طرد مركزي محضر 200 ميكرولتر أو شريط ثمانية آبار. ثم أضف 6 ميكرولتر من منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل المقابل إلى كل أنبوب ، مما ينتج عنه حجم إجمالي قدره 15 ميكرولتر لكل خليط تفاعل تهجين.
    3. قم بتسخين خليط تفاعل التهجين (بما في ذلك المخزن المؤقت للتهجين ومنتج PCR) إلى 95 درجة مئوية (في جهاز تفاعل البوليميراز المتسلسل أو حمام مائي) وقم بتغيير طبيعته لمدة 5 دقائق. أخرج خليط تفاعل التهجين الذي خضع لمعالجة التمسخ في الخطوة السابقة ، واغمره على الفور في خليط ماء مثلج لمدة 3 دقائق.
  4. تفاعل التهجين
    1. أخرج خليط تفاعل التهجين من الحمام الجليدي ، وقم بتثبيته لأعلى ولأسفل 2 مرة باستخدام ماصة دقيقة لخلطه بالتساوي. بعد اختفاء الراسب الندفي الأبيض (إن وجد) ، أضف 13.5 ميكرولتر من خليط تفاعل التهجين من خلال فتحة التحميل الخاصة بزلة الغطاء (كما هو موضح في الشكل 2 ج) ، وقم بتغطية صندوق التهجين بسرعة ، وأغلقه (كما هو موضح في الشكل 2 د). سجل رقم الرقاقة وموضع المصفوفة الدقيقة ورقم العينة المقابل.
      ملاحظة: يمكن إضافة عينة واحدة فقط إلى كل صفيف صغير.
    2. ضع صناديق التهجين المختومة على الفور أفقيا في حمام الماء بدرجة حرارة ثابتة تم تسخينه مسبقا إلى 50 درجة مئوية. ابدأ المؤقت لمدة 120 دقيقة بعد وضع جميع صناديق التهجين.
      ملاحظة: تجنب إدخال فقاعات الهواء أثناء عملية التحميل. في جميع الخطوات من بداية التحميل حتى تجف الرقائق ، تجنب تعرض السائل الموجود على المصفوفات الدقيقة للرقاقة مباشرة للهواء لفترة طويلة لمنع خلفية الرقاقة من أن تصبح عالية جدا بسبب التجفيف والتدخل في تفسير النتيجة.
  5. غسل وتجفيف الرقائق
    1. بعد اكتمال تفاعل التهجين ، أخرج صناديق التهجين أفقيا ، وقم بتفكيكها ، وأخرج الرقائق للغسيل. ضع الرقائق على الفور على رف الشرائح في الحاوية (مثل الدرق) المملوءة بمحلول غسيل الرقائق I الذي تم مواصفته بدرجة حرارة الغرفة (10-30 درجة مئوية). اغسلها بسرعة 80-100 دورة في الدقيقة على شاكر درجة حرارة ثابتة لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    2. اغسل الرقائق باستخدام محلول غسيل الرقائق II المتوازنة مع درجة حرارة الغرفة بسرعة 80-100 دورة في الدقيقة على شاكر درجة حرارة ثابتة لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    3. ضع الرقائق في جهاز طرد مركزي وجهاز طرد مركزي على حرارة 100 × جم في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. مسحها ضوئيا بعد التجفيف.
      ملاحظة: لا تسمح للرقائق بالاصطدام أو الاحتكاك ببعضها البعض.

7. مسح رقاقة وتفسير النتائج

ملاحظة: استخدم الماسح الضوئي لشريحة المصفوفة الدقيقة والبرنامج المقابل لقراءة الإشارات وتفسير النتائج. انظر أيضا الجدول 1 للحصول على نتائج غير طبيعية واستكشاف الأخطاء وإصلاحها. اتبع هذه الخطوات للتشغيل (راجع أدلة المستخدم الخاصة بالماسح الضوئي والبرنامج).

  1. قم بتشغيل الماسح الضوئي والبرنامج المقابل ، ثم انقر فوق زر التحكم بالليزر للسماح له بالتسخين المسبق لمدة 10 دقائق.
  2. أدخل أنواعا مختلفة من المعلومات المتعلقة بالعينات، مثل رقم العينة.
  3. بعد انتهاء الماسحة الضوئية من التسخين المسبق ، انقر فوق الزر إخراج ، ثم ضع الشريحة بثبات على قطعة الحامل الصغيرة. ادفع الشريحة برفق وأفقيا إلى فتحة حجرة الماسح الضوئي وانقر فوق الزر تحميل .
  4. أدخل رقم الشريحة، وانقر لتحديد منطقة الكشف (المصفوفة الدقيقة 1-4)، ثم انقر فوق تحديد عينة لاختيار العينات المقابلة لكل مصفوفة دقيقة. بعد ذلك ، انقر فوق بدء الكشف زر لإجراء مسح الشريحة. سيتم عرض نتائج المسح على الشاشة وحفظها تلقائيا.
  5. بعد مسح شريحة واحدة ضوئيا، كرر الخطوتين 7.3 و 7.4 لمسح الشريحة التالية. اتبع هذا الإجراء حتى يتم مسح جميع الرقائق.
  6. استخدم صفحة استعلام البيانات لإجراء عمليات الاستعلام عن البيانات والطباعة.
  7. بعد الانتهاء من جميع العمليات ، قم أولا بإيقاف تشغيل الليزر ، ثم اخرج من البرنامج ، وأخيرا قم بإيقاف تشغيل الماسح الضوئي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نتائج إيجابية
بالنسبة لمجسات جنس المتفطرة (المكافحة الداخلية ، IC) والمتفطرة السلية ، يتم تحديد قيم نتائجها الإيجابية بواسطة طريقة خاصية تشغيل المستقبل (ROC). بالنسبة للمجسات المستخدمة للكشف عن 16 NTM الأخرى ، يتم تحديد قيم نتائجها الإيجابية بواسطة طريقة النسبة المئوية.

مراقبة الجودة التجريبية
يجب أن تكون نتيجة الكشف عن منتج المكافحة الإيجابية "مركب المتفطرة السلية " (كما هو موضح في الشكل 3 أ) ؛ يج...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمكن لطريقة رقائق المصفوفة الدقيقة للحمض النووي التي تم تقديمها في هذه الورقة الكشف مباشرة عن الأحماض النووية في العينات السريرية (بما في ذلك البلغم ، والقيح ، والسائل القصبي السنخي ، والسائل النخاعي ، والسائل البزل) من المرضى المشتبه في إصابتهم بالسل والفطريات غير السلية ويمكن أن تقصر بشكل كبير من وقت التشخيص المؤكد. تمثل طريقة رقاقة المصفوفات الدقيقة للحمض النووي المقدمة في هذه الدراسة تقدما كبيرا في تحديد أنواع المتفطرة . إنه يوفر العديد من المزايا مقارنة بطرق التشخيص الجزيئي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من قبل مشروع مؤسسة العلوم الطبيعية لمقاطعة فوجيان (2024J011521) ومشروع خطة تشيوانتشو للعلوم والتكنولوجيا (2024NY006).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
0.9٪ حقن كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم)فوتشو هايوانغفوياH35020289
جهاز تضخيم الأنظمة الحيوية التطبيقيةثيرمو فيشر العلميفيريتي 96 بئر دورة حرارية
كابيتال بيو لوكسكان10 ألف / بكابيتال بيولوكسكان 10 ألف / ب
كابيتال بيو سلايد واشر 24  كابيتال بيوSlideWasher 24  
  أجهزة الطرد المركزي إيبندورف5424صأقصى سرعة 15000 دقيقة < >-1< / سوب>
المخزن المؤقت للتهجين
رقاقة وغطاء المصفوفات الدقيقة للجين HybSet
مجموعة تحديد أنواع المتفطرةكابيتال بيو301030
الضوابط السلبية ، الضوابط الإيجابية
مستخرج الحمض النوويتيانلونغجينروتكس 96
كاشف تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل
درجة الحموضة 6.8 الفوسفات العازلةشانغهاي يواني التكنولوجيا الحيويةالصف 20029-10
الماصات والنصائحثيرمو ساينتفيك0.1 - 10 μ L ، 2 - 20 &mu ؛ L ، و 20 - 200 &mu ؛ L ، 100-1000 &mu ؛ L
طقم استخراج أو تنقية الحمض النووي qEx-DNA / RNAتيانلونغqEx-DNA/RNA
الحزب الديمقراطي الصربيكابيتال بيو441060
هيدروكسيد الصوديوم (هيدروكسيد الصوديوم)XILONGS   ؛ علميXK13-011-00027
SSCكابيتال بيو441050
حمام مائي ثرموستاتيسورويإتش إتش - دبليو 600

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Primm, T. P., Lucero, C. A., Falkinham, J. O. III Health impacts of environmental mycobacteria. Trends Genet. 38 (8), 821-830 (2004).
  2. Sawyer, J., et al. Mycobacterium bovis and its impact on human and animal tuberculosis. Trends Genet. 39 (8), 587-592 (2023).
  3. Zhao, Q., et al. The impact of DNA microarray chip technology on the diagnosis and management of non-tuberculous mycobacterial infections in immunocompromised patients. Antimicrob Agents Chemother. 65 (12), e01500-e01500 (2021).
  4. Liu, S., et al. DNA microarray-based detection of drug-resistant Mycobacterium strains: a single-center experience. Clin Microbiol Infect. 26 (10), 1400-1407 (2020).
  5. Li, J., et al. Comparative evaluation of DNA microarray and next-generation sequencing for Mycobacterium identification. Int J Infect Dis. 118, 250-258 (2022).
  6. Chen, K., et al. Optimizing probe design for DNA microarray-based Mycobacterium identification: a computational biology approach. BMC Microbiol. 19 (2), 120-129 (2019).
  7. Michelet, L., Boschiroli, M. L. Mycobacterium uberis. Microorganisms. 8 (11), 1701(2020).
  8. Imran, M., et al. DNA microarray technology for the detection and identification of Mycobacterium species: a review. J Microbiol Biotechnol Res. 6 (2), 275-285 (2020).
  9. Garcia-Sanchez, L., et al. Advances in DNA microarray technology for Mycobacterium detection and characterization. J Mol Diagn. 24 (5), 650-662 (2022).
  10. Wang, L., et al. Machine learning analysis of SERS fingerprinting for the rapid determination of Mycobacterium tuberculosis infection and drug resistance. Comput Struct Biotechnol J. 26 (20), 5364-5377 (2022).
  11. Wang, X., et al. Integration of DNA microarray data with clinical outcomes in tuberculosis patients: implications for personalized medicine. Mol Diagn. 16 (3), 150-160 (2024).
  12. Wang, X., et al. Rapid identification of Mycobacterium tuberculosis complex and common non-tuberculous Mycobacteria by DNA microarray chip. BMC Microbiol. 21 (1), 242(2021).
  13. Smith, J. D., et al. DNA microarray insights into Mycobacterium epidemiology and control strategies. J Clin Microbiol. 60, e02033-e02121 (2022).
  14. Garcia, L. M., et al. Tracking Mycobacterial spread via DNA microarray: a community-based study. PLoS One. 18 (3), e0282123(2023).
  15. Li, H., et al. Economic evaluation of DNA microarray chip technology in Mycobacterium diagnosis. Diagnostics. 11 (12), 2235(2021).
  16. Wang, Z., et al. Cost-benefit analysis of implementing DNA microarray chip for Mycobacterium detection in clinical settings. J Med Econ. 25 (1), 113-122 (2022).
  17. Liu, Y., et al. False positives and false negatives in DNA microarray chip detection of Mycobacteria: a comprehensive analysis. Microb Pathog. 149, 104671(2020).
  18. Chen, L., et al. Validation and improvement of DNA microarray chip for Mycobacterium identification: coping with genetic variants. Front Cell Infect Microbiol. 11, 627923(2021).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة