مقالة منهجية

اللدائن المغناطيسية الريولوجية الممنقوشة لدفع التغييرات في محاذاة خلايا عضلة القلب

DOI:

10.3791/68271

⸱

يونيو 10, 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, University of Delaware, 2Cardiovascular Institute, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, 3Department of Materials Science and Engineering, University of Delaware, 4Nemours/Alfred I. duPont Hospital for Children

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نقدم منصة فحص صلابة ديناميكية وقابلة للانعكاس مصنوعة باستخدام مطاط أسطوانة سيليكون فائق النعومة (بولي ثنائي ميثيل سيلوكسان ، PDMS) مع جزيئات الحديد المدمجة. هذا الاختبار الجديد مناسب لدراسة التغيرات الفيزيائية الناشئة المعتمدة على الوقت في الأنماط الظاهرية للخلايا ، بما في ذلك توجيه الاتصال. هنا ، نقيس محاذاة خلايا عضلة القلب للفئران حديثي الولادة عند تصلب المصفوفة باستخدام المغناطيسية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تؤثر الإشارات المرتبطة بالركيزة ، مثل الميكانيكية والطبوغرافية ، بشكل عميق على الاستجابة الخلوية. ومع ذلك ، فإن الكثير من الأبحاث التأسيسية تستخدم تأثيرات ثابتة أو معزولة. لا يزال اتجاه ومقياس زمني لهذه التأثيرات الميكانيكية على الاستجابات الخلوية الناشئة غير مستكشف إلى حد كبير. يمكن لأدوات لفحص كيف أن المحفزات المرتبطة بالركيزة المتغيرة بمرور الوقت تقود العمليات الفسيولوجية والمرضية يمكن أن تفتح المستوى التالي من البصيرة البيولوجية الميكانيكية. هنا ، نستخدم اللدائن المغناطيسية ذات النمط الدقيق (MREs) التي يمكن أن تصلب وتنعم بسرعة استجابة لمجال مغناطيسي خارجي ، مما يسمح بإجراء تحقيق أكثر صرامة لتأثيرات التحفيز الميكانيكي (الصلابة) والموجه بالتلامس (الطبوغرافي) على اتجاه ومحاذاة خلايا عضلة القلب لدى الفئران حديثي الولادة. من خلال دمج التحكم الديناميكي في الصلابة الميكانيكية التي يمكن ضبطها وعكسها مؤقتا ، يمكننا اختبار تأثيرات الحمل بدقة عن طريق (1) التكييف المسبق في ظل ظروف متطابقة و (2) التغيير الحاد في الميكانيكا الحيوية في المختبر لتقليد الظواهر ذات الصلة سريريا ، مثل احتشاء عضلة القلب بشكل صحيح. يسمح لنا هذا النهج بدراسة تأثير الحمل على الاستجابات الخلوية بطريقة أكثر واقعية وتحكما.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعتمد قدرة القلب على ضخ الدم بكفاءة على البنية والخصائص الميكانيكية (الصلابة) لعضلة القلب ، حيث يكون التنظيم الدقيق للخلايا والأنسجة ضروريا للتقلص المنسق والوظيفة العامة. يتكون عضلة القلب بشكل أساسي من خلايا عضلة القلب (CMs) ، والتي تظهر ، في البالغين ، مورفولوجيا ممدودة تشبه القضيب تقريبا مع قسط ساركومير (الوحدة الانقباضية ل CMs) محاذاة على طول الخلية. في المقابل ، تختلف الخلايا الجذعية الجنينية أو المستحثة متعددة القدرات (iPSC) بشكل كبير عن CMs البالغين. تميل إلى أن يكون لها شكل أكثر استدارة ، ونواة واحدة ، وبنية ساركوميرية غير منظمة أو غير محاذاة ، وتردد ضرب غير منتظم. يسمح التشابه الهيكلي للتنظيم في الجسم الحي لعضلة القلب بتزامن الانكماش ونقل القوة. هذا أمر بالغ الأهمية وضروري لتلخيص عضلة القلب الطبيعية من خلال نموذج في المختبر . لتوليد CMs ذات خصائص هيكلية مشابهة لعضلة القلب الناضجة ، أظهرت الدراسات السابقة استراتيجيات ناجحة لتعزيز النضج ، بما في ذلك التلاعب بصلابة الركيزة1،2 ، أو تطبيق الإجهاد الميكانيكي3 ، أو استخدام توجيه الاتصال4،5 ، أو استخدام السرعة الكهربائية6،7.

لقد كان من المفهوم منذ فترة طويلة أن صلابة البيئة خارج الخلية تؤثر على الخلايا. يوجد تنوع كبير في الصلابة في جميع أنحاء جسم الإنسان ، بدءا من مئات الباسكال (Pa) في الدماغ وحتى عشرات الجيجاباسكال (GPa) في العظام8،9،10. لقد وجد أنه أثناء التطور ، تغير الأنسجة تصلبها ، وهذا التغيير ينظم تمايز المستوى الخلوي ونضجه إلى الأنماط الظاهرية للبالغين اللازمة للوظيفة الطبيعية11،12،13،14. كما تم ربط التغييرات في الصلابة بحالات المرض وتطور أمراض معينة15،16،17،18. على وجه التحديد ، يتغير تصلب عضلة القلب مع تطور الأمراض وتطورها. على سبيل المثال ، يحتوي عضلة القلب السليمة على معامل مرونة يبلغ ~ 10 كيلو باسكال على عكس القلب الفاشل ، الذي يحتوي على معامل مرونة من 35-70 كيلو باسكال أو أكثر19. بالإضافة إلى ذلك ، أفادت العديد من الدراسات في المختبر أن خلايا عضلة القلب المزروعة على ركيزة مشابهة لتصلب عضلة القلب الأصلية كان لها تنظيم أفضل للقود العضلي20 ، وولدت انكماشا مثاليا1،19 ، وكان لها أطول مدة محتملةللفعل 21.

بالإضافة إلى ذلك ، أصبح من المعروف جيدا أن الخلايا في الجسم الحي تتعرض لمجموعة متنوعة معقدة من الإشارات الطبوغرافية داخل بيئتها المكروية التي تدفع الشكل والوظيفة. تأتي هذه الإشارات الطبوغرافية بأحجام وأشكال هندسية مختلفة ، من الترتيب العشوائي للإنتجرينات على المستوى الجزيئي إلى محاذاة الخلايا على مستوى الميكرون في الأنسجة العضلية22،23. على غرار المنظمين الميكانيكيين الآخرين ، فإن التضاريس مهمة لتشكل الخلايا ، مثل الانتشار ، والاستطالة ، والمحاذاة ، والحركة ، والتمايز ، وموت الخلايا المبرمج24،25،26. مع إدخال ركائز الاستزراع الاصطناعية ، تم تطوير طرق لإنشاء تضاريس سطحية خاضعة للرقابة لزراعة الخلايا والأنسجة27،28،29. على سبيل المثال ، تم استخدام الأخاديد النانوية والصغرى ذات الأنماط الدقيقة لتوفير إرشادات الاتصال لخلايا الثدييات بحيث تقوم الخلايا بتوجيه وإعادة تشكيل هيكلها الخلوي لمتابعة الهياكل الطبوغرافية لركيزة الاستزراع.

هنا ، نقدم طريقة للثقافة في المختبر تدمج كلا من التوجيه الهيكلي (إشارة الاتصال) والميكانيكية (الصلابة) باستخدام ركيزة المطاط الصناعي المغناطيسي المزخرف (MRE) ، وهي مادة قابلة للضبط يمكن تقويتها أو تليينها عن طريق ضبط قوة المجال المغناطيسي17،30،31،32. من خلال وضع المغناطيس بالقرب من ركيزة الثقافة ، يمكن زيادة الصلابة ، مع درجة التصلب القابلة للتعديل عن طريق تغيير المسافة بين العينة والمغناطيس. على العكس من ذلك ، يمكن تقليل الصلابة عن طريق إزالة المغناطيس تماما. يوفر هذا النهج طريقة قوية وديناميكية ويمكن التحكم فيها لتكرار الظروف الميكانيكية الشبيهة بالجسم الحي ، بينما يقدم النمط الدقيق السطحي تباين الخواص ، مما يتيح إنشاء ركائز ثقافة خلايا ثنائية الأبعاد أكثر محاكاة حيوية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. إعداد ختم PDMS منقوش

ملاحظة: يعد ختم PDMS ضروريا لمرونته، مما يسمح بمعالجة سهلة واتصال دقيق عند تحضير سطح التصوير بالرنين المغناطيسي المزخرف. تتيح الطبيعة المرنة للطابع أيضا الإزالة بسهولة من طبقة نظام إدارة مخاطر الألغام (PDMS) دون الإضرار بالنمط، مما يضمن نقل النمط بدقة والحفاظ على سطح التوعية بمخاطر الألغام.

  1. تحضير 10 جم من 10: 1 (قاعدة: عامل معالجة) 184 PDMS.
  2. صب 5 جم من 184 PDMS في طبق بتري مقاس 35 مم وقم بإزالة الغازات في مجفف لمدة ~ 5-10 دقائق ، حتى تتبدد جميع الفقاعات.
  3. اترك 184 PDMS تجف جزئيا في فرن على حرارة 60 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  4. عندما يتبقى 5 دقائق حتى يتم علاج 184 PDMS جزئيا ، أضف طبقة رقيقة من 184 PDMS الإضافي إلى شبكة الحيود وإزالة الغاز في المجفف لمدة ~ 5 دقائق.
  5. أخرج الطبق مقاس 35 مم مع 184 PDMS المقدد جزئيا من الفرن.
  6. اقلب شبكة الحيود باستخدام PDMS على 184 PDMS المعالجة جزئيا في طبق 35 مم.
    ملاحظة: تأكد من أن شبكة الحيود متجهة لأسفل في 184 PDMS المعالجة جزئيا في الطبق 35 مم.
  7. اضغط برفق على شبكة الحيود حتى تحيط كمية صغيرة من 184 PDMS بالشبكة.
  8. استخدم 184 PDMS المتبقية غير المعالجة لردم الطبق المحيط بالشبكة لضمان بقائها في مكانها أثناء المعالجة.
  9. ضع الطبق الذي يحتوي على شبكة الحيود في الفرن على حرارة 60 درجة مئوية لمدة 1.5 ساعة.
  10. بعد معالجة 184 PDMS بالكامل ، قم بإزالة الطبق مقاس 35 مم مع شبكة الحيود من الفرن.
  11. سجل حول شبكة الحيود بمشرط.
  12. ضع كمية صغيرة من كحول الأيزوبروبيل (IPA) للتغلغل تحت شبكة الحيود.
  13. اسحب الشبكة من 184 PDMS في الاتجاه الموازي للأنماط.
  14. قم بإزالة 184 PDMS الزائدة ، مع ترك القسم المزخرف فقط.
  15. قص ختم 184 PDMS بالحجم المطلوب.
    ملاحظة: تستخدم هذه الدراسة ختما بطول 1 سم × 1 سم للأجهزة.

2. طلاء السطح لختم PDMS

ملاحظة: تخلق معالجة السيلان طبقة سطحية تمنع الالتصاق غير المرغوب فيه بين طبقات PDMS أثناء الختم، مما يضمن الفصل السلس ويحافظ على جودة نقل النمط.

  1. علاج السيلان (الطريقة المفضلة)
    1. ضع ختم 184 PDMS المصنع في منظف البلازما O2 بحيث يكون السطح المزخرف متجها لأعلى. عالج سطح PDMS ب 45 واط من O2 البلازما لمدة 30 ثانية.
      ملاحظة: بمجرد إزالته من منظف البلازما ، ضع غطاءا (أو غطاء) فوق الطوابع على الفور لضمان عدم استقرار أي حطام على الطوابع التي تم تنظيفها.
    2. ضع 184 طابعا PDMS في مجفف في غطاء الدخان.
    3. قم بتمزيق غطاء أنبوب الطرد المركزي الدقيق.
    4. ضع غطاء أنبوب الطرد المركزي الدقيق بجوار 184 طابع PDMS في المجفف.
    5. أضف 20 ميكرولتر من سيلان ثلاثي الكلورو (1H ، 1H ، 2H ، 2H-perfluorooctyl) إلى غطاء أنبوب الطرد المركزي الدقيق.
      تنبيه: هذه المادة الكيميائية خطرة على الصحة وبالتالي يجب استخدامها فقط في غطاء الدخان الكيميائي.
    6. أغلق المجفف واسحب الفراغ.
    7. اسمح للسيلان بتغطية الطوابع من 1 ساعة إلى ليلة كاملة.

3. تحضير اللدائن المغناطيسية

ملاحظة: لإنشاء MRE قابلة للضبط وقابلة للانعكاس، تتيح نسبة دقيقة من جزيئات الحديد الكربونيل والمطاط الصناعي، جنبا إلى جنب مع تطبيق المجال المغناطيسي، ضبط الصلابة عبر مجموعة من القيم. من خلال تغيير جزء الجسيمات ومعامل المطاط الصناعي الأساسي وشدة المجال المغناطيسي ، يمكن ضبط صلابة المادة بدقة لتلبية متطلبات محددة.

  1. إعداد الميكروبات بمخاطر مخاطر الألغام ذات المدى الديناميكي الأكثر نعومة (انظر الجدول 1 للاطلاع على الأوزان على سبيل المثال)
    1. قم بقياس الكمية المطلوبة من مخفف السيليكون والجزء B من المطاط الصناعي البيئي واخلطه عند 2500 دورة في الدقيقة في خلاط السرعة لمدة 1 دقيقة.
    2. أضف المطاط الصناعي البيئي الجزء A وجزيئات الحديد الكربونيل إلى المحلول واخلطهم عند 2500 دورة في الدقيقة في خلاط السرعة لمدة 1 دقيقة.
      ملاحظة: ترتيب الخلط أمر بالغ الأهمية لضمان توقيت البلمرة المطلوب.
    3. باستخدام ماصة نقل مع قطع الطرف ، أضف 5 جم من التوعية بمخاطر الألغام إلى طبق بتري جديد مقاس 35 مم وقم بإزالة الغاز في مجفف لمدة ~ 5 دقائق ، ثم اتركه حتى يجف جزئيا في الفرن عند 60 درجة مئوية لمدة ~ 10 دقائق.
      ملاحظة: يعد التأكد من تسوية الفرن والمجفف بشكل صحيح أمرا ضروريا للحصول على عينة مسطحة ، وهو أمر بالغ الأهمية لسهولة التصوير.
    4. بمجرد بقاء 5 دقائق، استخدم ماصة النقل لإضافة التصلب الآلي الإضافي غير المعالج لتغطية سطح طابع 184 PDMS فقط. ضع الختم المطلي في المجفف حتى يتخلص منه لمدة 5 دقائق.
      ملاحظة: احرص على عدم استخدام الكثير من التوعية بالرنين المغناطيسي لأنه إذا كان يغطي حواف الطابع ، فسيجعل إزالة الختم أكثر صعوبة بمجرد معالجة التوعية بالرنين المغناطيسي تماما. تأكد أيضا من الإشارة إلى اتجاه النموذج خلال كل خطوة بحيث يمكن سحبه في الاتجاه الموازي للأنماط، عند إزالة الختم من التوعية بمخاطر الألغام.
    5. أخرجي التوعية بمخاطر الألغام من الفرن واستخدمي ملقطا لتحريك الختم المطلي بعناية. اقلبها ووجهها لأسفل على الميكروبات المعدة جزئيا واضغط برفق. ضع التوعية بمخاطر الألغام والختم المطلي مرة أخرى في الفرن على حرارة 60 درجة مئوية لمدة 25 دقيقة أخرى.
    6. بمجرد الشفاء التام ، استخدم مشرطا لتسجيل التوعية بمخاطر الألغام في الجزء السفلي من الختم ، عموديا على الأنماط.
    7. ضع كمية صغيرة من IPA على المنطقة المقطوعة حول الختم.
      ملاحظة: يجب أن يتسرب IPA إلى القطع ويبدأ في التحرك أسفل الختم.
    8. باستخدام الملقط ، اسحب الختم من التوعية بمخاطر الألغام في الاتجاه الموازي للأنماط.
  2. إعداد MRE ذو المدى الديناميكي الأكثر صلابة (انظر الجدول على سبيل المثال الأوزان)
    1. تحضير 30: 1 184 PDMS.
      ملاحظة: اصنع المزيد لأن البعض سيظل عالقا في حاوية الخلط.
    2. أضف الكمية المطلوبة من 527 PDMS الجزء A والجزء B ، ثم جزيئات الحديد الكربونيل و 30: 1 184 PDMS بنسب بناء على المثال الوارد في الجدول.
    3. امزجها عند 2500 دورة في الدقيقة في خلاط سريع لمدة 1 دقيقة.
    4. باستخدام ماصة نقل مع قطع الطرف، أضف 5 جم من التوعية بمخاطر الألغام إلى طبق بتري جديد مقاس 35 مم وقم بإزالة الغاز في مجفف لمدة ~ 5 دقائق، ثم اتركه لتجفي جزئيا في الفرن عند 60 درجة مئوية لمدة ~ 40 دقيقة.
    5. بمجرد بقاء 5 دقائق، استخدم ماصة نقل لإضافة MRE إضافي غير معالج لتغطية سطح ختم PDMS فقط. ضع الختم المطلي في المجفف حتى يتخلص منه لمدة 5 دقائق.
      ملاحظة: احرص على عدم استخدام الكثير من التوعية بالرنين المغناطيسي لأنه إذا كان يغطي حواف الطابع ، فسيجعل إزالة الختم أكثر صعوبة بمجرد معالجة التوعية بالرنين المغناطيسي تماما. تأكد أيضا من الإشارة إلى اتجاه النموذج خلال كل خطوة بحيث يمكن سحبه في الاتجاه الموازي للأنماط، عند إزالة الختم من التوعية بمخاطر الألغام.
    6. أخرجي التوعية بمخاطر الألغام من الفرن.
    7. استخدم زوجا من الملقط لتحريك الختم المطلي بعناية ، ثم اقلبه لأسفل على التوعية بمخاطر الألغام المعالجة جزئيا ، واضغط برفق.
    8. ضع التوعية بمخاطر الألغام مع الختم المطلي على الرف العلوي في الفرن على حرارة 60 درجة مئوية طوال الليل.
    9. بمجرد الشفاء التام ، استخدم مشرطا لقطع التوعية بمخاطر الألغام في الجزء السفلي من الختم ، عموديا على الأنماط.
    10. ضع IPA على منطقة القطع حول الختم.
      ملاحظة: يجب أن يتسرب IPA إلى القطع ويبدأ في التحرك أسفل الختم.
    11. باستخدام الملقط ، اسحب الختم من التوعية بمخاطر الألغام في الاتجاه الموازي للأنماط.
نطاق الصلابةالموادمثال على الوزن
أنعم10-80 كيلو باسكالصديق للبيئة (أ + ب)11.25 جرام (أ)11.25 جرام (ب)
سيليكون ترينر22.5 جرام
جزيئات الحديد45 جرام
اشد60-120 كيلو باسكال527 PDMS (أ + ب)18.75 جرام (أ)18.75 جرام (ب)
جزيئات الحديد37.5 جرام
184 PDMS (قاعدة + علاج)14.5 جم (قاعدة)0.5 جرام (علاج)

الجدول 1: أمثلة على أوزان جميع المواد لتصنيع التوعية بمخاطر الألغام الأكثر نعومة وصلابة. الأوزان الموجودة في الجدول مخصصة لصنع ما مجموعه 90 جم من مادة التوعية بمخاطر الألغام. يمكن تحقيق إعداد أقل عن طريق خلط جميع المكونات بنفس النسب مثل أوزان المثال في الجدول.

4. تحضير ثقافة الخلايا

ملاحظة: يتضمن تحضير زراعة الخلايا اختيار خط الخلايا المناسب ، وإعداد وسائط الاستزراع بالعناصر الغذائية الضرورية وعوامل النمو ، وضمان ظروف معقمة لمنع التلوث. يتم طلاء الخلايا في أوعية الاستزراع وتحضينها في الظروف المثلى (عادة 37 درجة مئوية مع ثاني أكسيد الكربون2 المتحكم فيه). يتم إجراء المراقبة المنتظمة والتغييرات المتوسطة والمرور للحفاظ على نمو الخلايا الصحي.

  1. عقم سطح التوعية بمخاطر الألغام عن طريق غسله بنسبة 70٪ من الإيثانول 3 مرات واترك الغسيل الثالث لمدة 20 دقيقة.
  2. اغسل سطح التوعية بمخاطر الألغام 3 مرات بمحلول ملحي معقم مخزن بالفوسفات (PBS) عن طريق إضافة حجم كاف لتغطية الطبق بالكامل ، متبوعا بشفط كل السائل.
  3. قم بتغطية سطح التصوير بالرنين المغناطيسي بالفبرونيكتين (10 ميكروغرام / مل) في PBS لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية لتعزيز التصاق الخلية بالجهاز.
  4. اغسل سطح التصفية ومخاطر الألغام 3 مرات باستخدام PBS، على غرار الخطوة 4.1.2.
  5. زرع خلايا عضلة القلب للفئران حديثي الولادة بكثافة 20,000 خلية/سم2.
  6. أضف مغناطيسات إلى الأجهزة مؤقتا لتقوية المصفوفة أثناء زراعة الخلايا.
    ملاحظة: كن حذرا عند وضع الأجهزة المزودة بمغناطيس في الحاضنة. يجب وضع الأجهزة بعيدا عن بعضها البعض لضمان عدم تفاعل المغناطيس. توصي هذه الدراسة باستخدام حاضنات مبطنة بالفولاذ المقاوم للصدأ على حاضنات مبطنة بالنحاس نظرا لوجود تفاعل أقل.

5. تلطيخ وتصوير

  1. تصوير الخلايا الثابتة
    ملاحظة: يتضمن تصوير الخلايا الثابتة عدة خطوات رئيسية لتصور مكونات خلوية معينة. أولا ، يتم إصلاح الخلايا للحفاظ على بنيتها. بعد ذلك ، يتم اختراق غشاء الخلية للسماح باختراق البقع ، متبوعا بخطوة حجب لمنع الارتباط غير المحدد للأجسام المضادة أو البقع بالمواقع غير المقصودة ، مثل البروتينات الأخرى أو الحطام الخلوي. ثم يتم تلطيخ الخلايا بالأصباغ أو الأجسام المضادة التي تستهدف جزيئات معينة ، ويتم إزالة أي بقعة زائدة من خلال الغسيل. أخيرا ، يتم تصوير الخلايا الملطخة باستخدام المجهر الفلوري لتحليل الهياكل الخلوية.
    1. اغسلها مرة واحدة باستخدام 1x PBS عن طريق إضافة حجم كاف لتغطية الطبق بالكامل ، متبوعا بشفط كل السوائل.
    2. قم بإصلاح الخلايا باستخدام 4٪ (حجم / حجم) بارافورمالدهيد لمدة 10 دقائق.
    3. اغسل ثلاث مرات باستخدام 1x PBS (على غرار الخطوة 5.1.1).
    4. أضف 0.1٪ Triton X (في 1x PBS) واحتضنه لمدة 5 دقائق حتى يتخلل النفاذ.
    5. اغسل ثلاث مرات باستخدام 1x PBS (على غرار الخطوة 5.1.1).
    6. أضف NH4Cl (50 ملي مولار في 1x PBS) واحتضنه لمدة 15 دقيقة لإخماده.
    7. اغسل ثلاث مرات باستخدام 1x PBS (على غرار الخطوة 5.1.1).
    8. أضف المخزن المؤقت للحجب (5٪ BSA في 1x PBS) واحتضن لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة (RT).
    9. اجمع بين الجسم المضاد الأولي المضاد α-Actinin الأساسي عند 1: 200 في 5٪ BSA (في 1x PBS).
      ملاحظة: امزج الجسم المضاد جيدا.
    10. أضف محلول الجسم المضاد الأساسي إلى العينة.
      ملاحظة: أضف ما يكفي لتغطية العينة بأكملها.
    11. احتضان طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: ضع في اعتبارك وضع العينة على الروك بسرعة بطيئة لمساعدة المحاليل على الاختلاط.
    12. اغسل ثلاث مرات باستخدام 1x PBS (على غرار الخطوة 5.1.1).
    13. تمييع الجسم المضاد الثانوي (555 Alexa Fluor الماعز المضاد للفأر) في 1x PBS (1: 2000).
      ملاحظة: الأجسام المضادة الثانوية حساسة للضوء (الفلوروفور). عندما لا تكون قيد الاستخدام مباشرة ، تأكد من تغطيتها وخارجها عن الضوء.
    14. أضف محلول الجسم المضاد الثانوي إلى العينة.
    15. احتضن في RT لمدة 2 ساعة.
    16. اغسل ثلاث مرات باستخدام 1x PBS (على غرار الخطوة 5.1.1).
    17. أضف DAPI (1 ميكروغرام / مل في ماء معقم منزوع الأيونات) واحتضنه لمدة 5-10 دقائق في الظلام.
    18. صور الخلايا بمجهر عمودي بعدسة غمس 20x.
    19. التقط 50 صورة لكل جهاز.
    20. قم بمعالجة الصور باستخدام مكون إضافي ImageJ يسمى Directionality.
      ملاحظة: خيارات الاتجاه: استخدمت هذه الدراسة n = 45 صندوقا ، تتراوح من 0 درجة إلى 176 درجة لمنع تأثير التغليف. كانت الطريقة المستخدمة هي اتجاه التدرج المحلي ، وتم تحديد جدول العرض. يتوافق خرج الاتجاه مع متوسط زاوية المتجه (يشير إلى زاوية المحاذاة) ، بينما يمثل ناتج الخير متوسط طول المتجه (يشير إلى درجة المحاذاة).
  2. تصوير الخلايا الحية
    ملاحظة: يتيح تصوير الخلايا الحية تتبع العمليات الخلوية الديناميكية في الوقت الفعلي مع الحفاظ على الخلايا في حالتها الطبيعية والحية. تتضمن هذه التقنية استخدام مجهر مضان مزود بغرفة حضانة لالتقاط صور أو مقاطع فيديو عالية الدقة للخلايا أثناء نموها أو انقسامها أو استجابتها للمنبهات. تمكين دراسة السلوك الخلوي والتفاعلات بمرور الوقت وتوفير رؤى قيمة حول الوظيفة الخلوية والديناميكيات.
    1. احتضان الخلايا بنسبة SiR-actin 1: 1000 مع وسائط الثقافة لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية.
    2. استنشق الوسائط واستبدلها ب 1: 2000 (SiR-actin: Media).
      ملاحظة: هذا التخفيف هو تقليل سمية الخلايا للتصوير الحي الممتد.
    3. اجمع صور التألق المناعي كل 15 دقيقة لمدة 5 ساعات على مجهر عمودي مع غرفة حضانة ومرحلة آلية وعدسة غمس 20x.
      ملاحظة: بالنسبة لتجربة تصوير الخلايا الحية، تمت إضافة المغناطيس بمجرد وضع التصوير بالرنين المغناطيسي في نظام التصوير المباشر.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تحتوي اللدائن المغناطيسية فائقة النعومة القائمة على السيليكون (MREs) على وحدات مرنة يمكن ضبطها بدقة عن طريق تطبيق مجال مغناطيسي. يسمح ذلك بإجراء تعديلات سريعة ثنائية الاتجاه ضمن نطاق فسيولوجي ، مع تحكم دقيق في كل من معدل وحجم التغييرات (الشكل 1). تم تقييم ميكانيكا الهلام عن طريق قياس معامل المرونة كما هو موضح سابقا ، ووجد أن متوسط معامل المرونة هو 36.3 ± 5.2 كيلو باسكال مع المغناطيس و 9.3 ± 1.2 كيلو باسكال بدون مغناطيس للنطاق الديناميكي الأكثر نعومة للمخاطر ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم اختبار هذه التقنية بدقة ، ولكن الاهتمام الدقيق بعدة خطوات ضروري لتجربة ناجحة.

في هذا البروتوكول ، نستخدم شبكة حيود تجارية كقالب رئيسي للزخرفة. ومع ذلك ، يمكن أيضا استخدام القوالب البديلة المزخرفة - مثل السيليكون أو القوالب الصغيرة المصنعة SU8 - لإنشاء مجموعة متنوعة من الأنماط بأحجام مختلفة33،35. تأتي بعض مواد PDMS المتاحة تجاريا منقوشةمسبقا 36،37<...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا البحث جزئيا من قبل مركز ديلاوير لأبحاث العضلات والعظام COBRE (P20 GM139760) ، بمنح من المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة من المعاهد الوطنية للصحة وولاية ديلاوير. نود أن نعرب عن خالص امتناننا ل Sagar Doshi من مركز المواد المركبة (CCM) و Ashika Singh من مختبر Dhong في جامعة ديلاوير لدعمهم الذي لا يقدر بثمن في السماح لنا باستخدام مجاهر الليزر متحدة البؤر الخاصة بهم ولتوفير الخبرة اللازمة لتوصيف سطح موادنا. وقد عززت مساهمتهم بشكل كبير جودة عملنا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
555 أليكسا فلور للأجسام المضادة الثانوية المضادة للفئران من أليكسا فلور  ثيرموفيشر ساينتيفيكA-21422https://www.thermofisher.com/antibody/product/Goat-anti-Mouse-IgG-H-L-Cross-Adsorbed-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-21422
عدسة الغمس 20xزايس421452-9800-000https://www.micro-shop.zeiss.com/zh/us/shop/objectives/421452-9800-000/Objective-W-Plan-Apochromat-20x-1.0-DIC-M27-75mm
أطباق 35 ممثيرموفيشر ساينتيفيك130180https://www.thermofisher.com/search/results?query=130180&focusarea=Search%20All
الأجسام المضادة الأولية لمضاد ألفا للأكتينينأبكامEP2528Yhttps://www.abcam.com/en-us/products/primary-antibodies/alpha-actinin-actn1-antibody-ep2528y-ab81265?srsltid=AfmBOoq4HwHixqCheQwwq
VVbjJ3ogKUmZxa4GtG
3SyllFzWvb5XPnwgB
كرات مسحوق الحديد الكربونيليchemicalstore.comCIPMShttps://ironpowders.com/types-of-iron-powder/cipms-carbonyl-iron-powder/
صبغة DAPIثيرموفيشر ساينتيفيكD1306https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/D1306
جهاز إزالة المجفففيشر ساينتيفك08-642-7https://www.fishersci.com/shop/products/nalgene-transparent-polycarbonate-classic-design-desiccator/086427#?keyword=
شبكة الحيودمختبرات ثورGR2550-45031https://www.thorlabs.com/thorproduct.cfm?partnumber=GR2550-45031
جل إيكوفليكس الجزء أ و Bسموث أونإيكوفليكس  جيلhttps://www.smooth-on.com/products/ecoflex-gel/
منظف بلازما الطاولة الموسعسيغما ألدريتشZ561657-1EAhttps://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/z561657
الفيبرونكتين من بلازما البقرسيغما ألدريتشF1141https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/f1141
فلاكتيك DAC150 سبيد ميكسرز  فلاكتيكDAC150https://flacktek.com/products/small-flacktek/
برنامج إيمج جيالمعاهد الوطنية للصحةhttps://imagej.net/ij/download.html
كحول الأيزوبروبيلأمازونhttps://www.amazon.com/Isopropyl-Alcohol-Grade-Anhydrous-gallon/dp/B01M6YK5I4/ref=sr_1_1_sspa?dib=eyJ2IjoiMSJ9.xiBzaAiE5lSJqXz
ZhS_JhDh8zEHgkMzrbsyosvyBpS
Jjufk90Gt79vk1jOZxq_mG3GKeN8
KT1ulag3ZuMShbWoEOCQUy6txx
uGz4709PyUY5YWyeR2GS0PBNx
dbmEdWvgmCYiDBLf8E2prhImZW
l98MoWlVDU4lg1BtcHTTSOwdg87
5l6Ia3YLPs_0alILBXFsizwwnJodR
8D60ZggK5AHBfCfPadXgfJ-9hUE7
uIto.. V3Vf62Lnprtq2u5PRO
SbUFHnPOj1FvD7np7uBge6NuU&
dib_tag=se& hvadid=598724400239
& hvdev=c& hvlocphy=9007460& HVN
ETw=G& HVQMT=E& hvrand=1609157
209668794739& hvtargid=KWD-3203
62094308& hydadcr=5273_13
227703& الكلمات المفتاحية = الأيزوبروبيل+الكحول+
أمازون & MCID=9f9d3252906531
3EA89ab7766d9c244C& QID=1740
675756& sr=8-1-spons& sp_csd=d2l
kZ2V0TmFtZT1zcF9hdGY& PSC=1
مغناطيسCMS مغناطيسيةND05578-45Nhttps://www.magnet4sale.com/n45-neodymium-disc-magnet-1-1-2x1-4-35-lb-pull-strong-magnet/
مجهر نيكون إكليبس 80i القائمنيكونإكليبس 80i
الفرنفيشر ساينتيفك15-103-0503https://www.fishersci.com/shop/products/fisher-scientific-isotemp-general-purpose-heating-drying-ovens/p-4935382
مخفف السيليكونسموث أونمخفف السيليكونhttps://www.smooth-on.com/products/silicone-thinner/
صبغة SiR Actinالهيكل الخلويCY-SC001https://www.cytoskeleton.com/sir-actin
سيلغارد 184 PDMS (مادة الأساس + عامل التجفيف)إلسورث لاصقات2065622https://www.ellsworth.com/products/by-market/consumer-products/encapsulants/silicone/dow-sylgard-184-silicone-encapsulant-clear-3.9-kg-kit/
سيلغارد 527 PDMS الجزء أ و Bإلسورث لاصقات1696742https://www.ellsworth.com/products/by-market/consumer-products/encapsulants/silicone/dow-sylgard-527-silicone-dielectric-gel-clear-0.9-kg-kit/
منابس النقلفيشر ساينتيفك13-711-5AMMDhttps://www.fishersci.com/shop/products/transfer-pipette-32/137115AMMD?searchHijack=true&searchTerm=13
-711-5AMMD& searchType=
RAPID& مطابقة CatNo=13
-711-5AMMD
تريكلور -(1H, 1H, 2H, 2H-بيرفلوروأوكتيل) سيلان  سيغما ألدريتش448931https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/448931

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jacot, J. G., McCulloch, A. D., Omens, J. H. Substrate stiffness affects the functional maturation of neonatal rat ventricular myocytes. Biophys J. 95 (7), 3479-3487 (2008).
  2. Körner, A., Mosqueira, M., Hecker, M., Ullrich, N. D. Substrate stiffness influences structural and functional remodeling in induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Front Physiol. 12, 710619(2021).
  3. Dou, W., et al. A microdevice platform for characterizing the effect of mechanical strain magnitudes on the maturation of iPSCcardiomyocytes. Biosens Bioelectron. 175, 112875(2021).
  4. Abadi, P. P. S. S., et al. Engineering of mature human induced pluripotent stem cellderived cardiomyocytes using substrates with multiscale topography. Adv Funct Mater. 28 (19), 1707378(2018).
  5. Ahn, H., et al. Hierarchical topography with tunable micro and nanoarchitectonics for highly enhanced cardiomyocyte maturation via multiscale mechanotransduction. Adv Healthc Mater. 12 (12), 2202371(2023).
  6. Chan, Y. C., et al. Electrical stimulation promotes maturation of cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells. J Cardiovasc Transl Res. 6 (6), 989-999 (2013).
  7. Hirt, M. N., et al. Functional improvement and maturation of rat and human engineered heart tissue by chronic electrical stimulation. J Mol Cell Cardiol. 74, 151-161 (2014).
  8. Levental, I., Georges, P. C., Janmey, P. A. Soft biological materials and their impact on cell function. Soft Matter. 3 (3), 299-306 (2007).
  9. Swift, J., et al. Nuclear laminA scales with tissue stiffness and enhances matrixdirected differentiation. Science. 341 (6149), 1240104(2013).
  10. Isermann, P., Lammerding, J. Nuclear mechanics and mechanotransduction in health and disease. Curr Biol. 23 (24), R1113-R1121 (2013).
  11. Wozniak, M. A., Chen, C. S. Mechanotransduction in development: a growing role for contractility. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (1), 34-43 (2009).
  12. Yang, X., Pabon, L., Murry, C. E. Engineering adolescence. Circ Res. 114 (3), 511-523 (2014).
  13. Hazeltine, L. B., et al. Effects of substrate mechanics on contractility of cardiomyocytes generated from human pluripotent stem cells. Int J Cell Biol. 2012, 508294(2012).
  14. Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate. Science. 310 (5751), 1139-1143 (2005).
  15. Deng, B., Zhao, Z., Kong, W., Han, C., Shen, X., Zhou, C. Biological role of matrix stiffness in tumor growth and treatment. J Transl Med. 20 (1), 540(2022).
  16. Jaalouk, D. E., Lammerding, J. Mechanotransduction gone awry. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (1), 63-73 (2009).
  17. Vite, A., et al. Extracellular stiffness induces contractile dysfunction in adult cardiomyocytes via cellautonomous and microtubuledependent mechanisms. Basic Res Cardiol. 117 (1), 41(2023).
  18. Stowers, R. S., et al. Matrix stiffness induces a tumorigenic phenotype in mammary epithelium through changes in chromatin accessibility. Nat Biomed Eng. 3 (12), 1009-1019 (2019).
  19. Engler, A. J., et al. Embryonic cardiomyocytes beat best on a matrix with heartlike elasticity: scarlike rigidity inhibits beating. J Cell Sci. 121 (22), 3794-3802 (2008).
  20. Rodriguez, A. G., Han, S. J., Regnier, M., Sniadecki, N. J. Substrate stiffness increases twitch power of neonatal cardiomyocytes in correlation with changes in myofibril structure and intracellular calcium. Biophys J. 101 (10), 2455-2464 (2011).
  21. Boothe, S. D., et al. The effect of substrate stiffness on cardiomyocyte action potentials. Cell Biochem Biophys. 74 (4), 527-535 (2016).
  22. Curtis, A., Wilkinson, C. Topographical control of cells. Biomaterials. 18 (24), 1573-1583 (1997).
  23. Martínez, E., Engel, E., Planell, J. A., Samitier, J. Effects of artificial micro and nanostructured surfaces on cell behaviour. Ann Anat. 191 (1), 126-135 (2009).
  24. Ravichandran, R., Liao, S., Ng, C. C., Chan, C. K., Raghunath, M., Ramakrishna, S. Effects of nanotopography on stem cell phenotypes. World J Stem Cells. 1 (1), 55(2009).
  25. Brunetti, V., et al. Neurons sense nanoscale roughness with nanometer sensitivity. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (14), 6264-6269 (2010).
  26. Clark, P., Connolly, P., Curtis, A. S. G., Dow, J. A., Wilkinson, C. D. Topographical control of cell behaviour: I. Simple step cues. Development. 99 (3), 439-448 (1987).
  27. Nguyen, A. T., Sathe, S. R., Yim, E. K. F. From nano to micro: topographical scale and its impact on cell adhesion, morphology and contact guidance. J Phys Condens Matter. 28 (18), 183001(2016).
  28. DowellMesfin, N. M., et al. Topographically modified surfaces affect orientation and growth of hippocampal neurons. J Neural Eng. 1 (2), 78-90 (2004).
  29. Loesberg, W. A., et al. The threshold at which substrate nanogroove dimensions may influence fibroblast alignment and adhesion. Biomaterials. 28 (27), 3944-3951 (2007).
  30. Corbin, E. A., et al. Tunable and reversible substrate stiffness reveals a dynamic mechanosensitivity of cardiomyocytes. ACS Appl Mater Interfaces. 11 (23), 20603-20614 (2019).
  31. Bouhrira, N., Vite, A., Margulies, K. B. Distinct cytoskeletal regulators of mechanical memory in cardiac fibroblasts and cardiomyocytes. Basic Res Cardiol. 119 (2), 277-289 (2024).
  32. Lee, B. W., et al. Adult human cardiomyocyte mechanics in osteogenesis imperfecta. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 325 (4), H814-H821 (2023).
  33. Cao, Z., Ball, J. K., Lateef, A. H., Virgile, C. P., Corbin, E. A. Biomimetic substrate to probe dynamic interplay of topography and stiffness on cardiac fibroblast activation. ACS Omega. 8 (6), 5406-5414 (2023).
  34. Clark, A. T., et al. Magnetic field tuning of mechanical properties of ultrasoft PDMSbased magnetorheological elastomers for biological applications. Multifunct Mater. 4 (3), 035001(2021).
  35. Kim, Y., Kwon, C., Jeon, H. Genetically engineered phage induced selective H9c2 cardiomyocytes patterning in PDMS microgrooves. Materials. 10 (8), 973(2017).
  36. Fujiwara, Y., Deguchi, K., Miki, K., Nishimoto, T., Yoshida, Y. A method for contraction force measurement of hiPSCderived engineered cardiac tissues. Methods Mol Biol. 2320, 171-180 (2021).
  37. Dirar, Q., et al. Activation and degranulation of CART cells using engineered antigenpresenting cell surfaces. PLoS One. 15 (9), e0238819(2020).
  38. Kim, C., Kim, H., Park, H., Lee, K. Y. Controlling the porous structure of alginate ferrogel for anticancer drug delivery under magnetic stimulation. Carbohydr Polym. 223, 115045(2019).
  39. Fan, D., et al. Recent advances of magnetic nanomaterials in bone tissue repair. Front Chem. 8, 745(2020).
  40. GonzalezRico, J., et al. Tuning the cell and biological tissue environment through magnetoactive materials. Appl Sci. 11 (18), 8746(2021).
  41. AntmanPassig, M., Shefi, O. Remote magnetic orientation of 3D collagen hydrogels for directed neuronal regeneration. Nano Lett. 16 (4), 2567-2573 (2016).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

PDMS

مقالات ذات صلة