تصوير مقطعي تسلسلي عالي الإنتاجية باستخدام روبوت آلي لتغيير العينات

Summary

يتم عرض ومناقشة تفاصيل التنفيذ وإجراءات جمع البيانات لتصوير الأشعة السينية المعتمد على السينكروترون باستخدام الروبوت الآلي لتغيير العينات في Diamond Light Source (DLS) I13-2 Imaging Beamline هنا. هذا يحسن بشكل كبير من معدل النقل وكفاءة جمع البيانات لخط الشعاع.

Abstract

تصف هذه المخطوطة سير عمل لجمع البيانات الآلي يستخدم ذراعا روبوتية لتبادل العينات، مما يحسن بشكل كبير كفاءة جمع البيانات. تم تنفيذ هذا الإعداد، لتصوير الأشعة السينية بنظام السينكروترون في جهاز Diamond Light Source (DLS) I13-2، خط الشعاع التصويري، باستخدام روبوت لتحقيق تصوير مقطعي تسلسلي عالي الإنتاجية (ثلاثي الأبعاد) أو التصوير (ثنائي الأبعاد). حاليا، في العديد من التجارب، الوقت المطلوب لتبادل العينات يدويا ومحاذاتها مماثل، أو حتى يتجاوز مدة المسح المقطعي نفسه. لتعظيم الاستخدام الفعال لوقت الشعاع المتاح وزيادة معدل الإنتاجية التجريبي، يعد من الضروري أتمتة تبادل العينات ومحاذاتها. استخدام الروبوت كمغير عينات يمكن أن يزيد من سرعة النقل بنسبة لا تقل عن 4-10 أضعاف مقارنة بالإجراءات اليدوية، حسب حجم البكسل المختار. مع جهاز Diamond II وترقيات خطوط الشعاع Operando Coherent TO وPtychographic I maging (OCTOPI) من خطوط الشعاع I13L، سيقلل تدفق الأشعة السينية المتزايد من أوقات المسح التجريبي، مما يجعل النظام أكثر كفاءة. علاوة على ذلك، تتيح الأتمتة جمع البيانات عن بعد، بما في ذلك خدمة البريد الاختيارية للمستخدمين. يتيح مركز العينات الآلي المسح الكامل بدون مراقبة، ويمكن إجراؤه عن بعد. وهذا يمثل ميزة فريدة ومبتكرة للنظام. تصف هذه المخطوطة العملية الكاملة، بما في ذلك تحضير العينات، والتركيب على حوامل متخصصة، ونقلها إلى خط الشعاع، ووضعها على الصواني المخصصة لتبادل العينات الروبوتية. يتم عرض إجراء مركز العينات الآلي وخط أنابيب إعادة البناء بالتصوير المقطعي اللاحق.

Introduction

تم استخدام الأتمتة على نطاق واسع في الصناعات اليدوية الثقيلة لعقود ^1,2,3. ومع ذلك، فقد نضج تطوير الأجهزة والبرمجيات الروبوتية بما يكفي ليتمكن من التعامل مع مهام دقيقة جدا مثل تسلسل الجينوم، إجراء العمليات الطبية في المستشفيات، أو المساعدة في إجراء تجارب الكيمياء^4،5،6،7. الأتمتة لا تقضي فقط على الأخطاء البشرية، بل تحسن أيضا معدل النقل والكفاءة⁴.

مصدر الأشعة السينية المتزامن يولد إشعاعا كهرومغناطيسيا شديد السطوع ومتماسكا للغاية في النطاق الطيفي الواسع من الأشعة تحت الحمراء إلى الأشعة السينية الصلبة. تمكن هذه المصادر من إجراء تجارب تصوير عالية الإنتاجية والدقة العالية مع أوقات مسح قصيرة جدا وإحصائيات عالية. يمكن استخدام التماسك الجزئي لتحقيق تباين أفضل للمواد اللينة ضعيفة الامتصاص مثل البوليمرات أو عينات الأنسجة ^8,9,10 مقارنة بمصادر الأشعة السينية المختبرية. تتطلب مجموعة بيانات كاملة للتصوير المقطعي بالأشعة السينية – التي تسمح بتصور جسم ثلاثي الأبعاد الحقيقي – الحصول على إسقاطات للعينة بزوايا مختلفة. تسمح التطورات في سطوع المصدر، والأجهزة التجريبية، وأنظمة التحكم بأوقات جمع البيانات في حدود عشرات الثواني إلى⁸ دقائق. نتيجة لذلك، أصبح تحميل ومحاذاة العينات أكثر استهلاكا للوقت من فحص التصوير المقطعي نفسه^11,12. من المهم ملاحظة أن تغيير العينات يدويا في تجربة التصوير المقطعي بنظام السينكروترون قد يستغرق وقتا كبيرا (مقارنة بوقت المسح)، حيث يجب اتباع إجراء سلامة الإشعاع عند الدخول والإغلاق إلى القفص التجريبي. عادة ما تستغرق هذه العملية عدة دقائق. بالإضافة إلى ذلك، قد يستغرق محاذاة العينات بضع دقائق.

إذا تم أتمتة عملية تغيير العينات ومحاذاة العينة، فسيتم توفير وقت كبير. لذلك، تم تنفيذ روبوت مغير عينات في خط شعاع I13-2 Imaging لمنشأة DLS سينكروترون. تصف هذه المخطوطة البروتوكول الكامل لإجراء تجربة تصوير مقطعي دقيق بالأشعة السينية بنظام السينكروترون مع عدة عينات باستخدام روبوت مغير عينات عند خط شعاع I13-2 Imaging^11,12. هذا التنفيذ لا يحسن فقط كفاءة وقت التجربة، بل يسمح أيضا بإجراء التجارب عن بعد. البديل هو التشغيل اليدوي أو شبه الآلي، وكلاهما أبطأ بكثير. هنا، شبه الآلي يعني استخدام الروبوت لتبادل العينات فقط دون محاذاة العينة.

تؤكد أهمية الأتمتة من خلال مشاريع الأتمتة في خطوط شعاع التصوير المتزامن الأخرى، مع المشاريع الأكثر تشابها في خط شعاع 2BM من APS¹³، وخط شعاع SLS TOMCAT¹⁴، وخط شعاع EMBL P14 على PETRA III¹⁵، وخط شعاع IMAGE في معهد كارلسروه للتكنولوجيا (KIT) مصدر الضوء¹⁶. في نظام 2-BM APS، تركب العينات التي تتطلب مسحا باستخدام روبوت على قاعدة حركية قياسية، توضع في صينية مغير عينات بسعة قصوى تبلغ 60 عينة في كل مرة. ثم يلتقط ذراع الإمساك العينة ويركبها على مرحلة الدوران. ومع ذلك، يتم محاذاة العينات دون اتصال باستخدام جهاز ستيريوسكوب. تم تركيب نظام مشابه في خط شعاع TOMCAT في SLS، لكن هنا العملية مؤتمت بالكامل، حيث يمكنها تنفيذ تحميل العينة، والمحاذاة، ومسح المنطقة الصحيحة ذات الاهتمام، وإعادة البناء. إجمالي عدد العينات التي يمكن مسحها ضوئيا في كل مرة هو 60. مؤخرا، قام خط شعاع P14 على PETRA III¹⁵ بتركيب نظام تغيير عينات يمكنه التعامل مع عينات بيولوجية لينة بحجم حوالي 1 مم. يتم تحديد الموقع والتمركز من خلال إجراء المركز بثلاث نقرات. عند خط شعاع IMAGE في KIT، تتيح محطة نهاية التصوير/التصوير المقطعي عالية الإنتاجية قياس ما يصل إلى 1,500 عينة خلال يومين^و16. وعلى عكس أنظمة الروبوتات المذكورة أعلاه، يمكن لنظام خط الشعاع I13-2 Imaging حاليا التعامل مع عينات يصل قطرها إلى 8 مم وقياس ما يصل إلى 112 عينة خلال نوبة مدتها ثماني ساعات، دون تدخل بشري، بما في ذلك مركز العينات تلقائيا.

تم الإبلاغ عن إعداد التصوير المقطعي الحالي عند I13-2، خط شعاع دايموند-مانشستر إيميجينج، في المنشور المذكور¹⁷. للاكتمال، يتم تلخيص الجوانب الرئيسية لتجارب التصوير المقطعي هنا؛ يرجى أيضا الرجوع إلى الشكل 1. يتكون مكدس مرحلة التصوير المقطعي من سداسي أرجل (PI miCos) لمعالجة العينات وكذلك محاذاة إمالة محور الدوران. يتم تركيب مرحلة دوران تحمل الهواء فوق السداسي الأرجل. تتميز مرحلة الدوران بحركات ممتازة من التذبذب (<2.4 ميكروراد) وخطأ محوري (<100 نانومتر). نظام كاشف التصوير المقطعي مزود بأربعة تكبير (أو مجال رؤية) مختلف. في الدراسة الحالية، تم استخدام أهداف 1.25× (حجم بكسل فعال 2.6 ميكرومتر مع مجال رؤية 6.7 مم × 5.6 مم) و4× (حجم بكسل فعال 0.81 ميكرومتر مع مجال رؤية 2.1 مم × 1.8 مم). كان الهدف 1.25× يحتوي على وميض LuAg:Ce بقدرة 500 ميكرومتر، بينما كان الهدف 4x يحتوي على وميض LuAg:Ce بقوة 100 ميكرومتر (Crytur). يسجل كاشف sCMOS (pco.edge 5.5) صورة شاشة الوميض المكبرة عبر عدسة فوتوغرافية إضافية بقيمة 2x (جميع عدسات المجهر من أوليمبوس). تتراوح أبعاد البكسلات الفعالة من 2.6 ميكرومتر إلى 0.33 ميكرومتر، مع دقة حوالي 1 ميكرومتر عند أعلى تكبير مستخدم. تتكون شريحة الكاشف من 2560 × 2160 بحجم بكسل 6.5 ميكرومتر، وأقصى معدل قراءة لمصفوفة البكسل هو 100 هرتز.

Protocol

ملاحظة: تستخدم هذه الدراسة عينات حشرات من متحف التاريخ الطبيعي (NHM) في لندن، لإجراء تحليل ظاهري مقارن. تم اقتناء العينات من قبل متحف التاريخ الطبيعي، وفقا لإجراءات اقتناء قياسية لضمان جمع العينات والتبرع بها بشكل قانوني.

1. تخطيط التجربة

1. تحقق من جدوى إجراء التصوير المقطعي أو تجارب التصوير مع العينة المعنية عند خط شعاع I13-2 من خلال التواصل مع طاقم خط الشعاع باستخدام الرابط التالي: https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Imaging-and-Microscopy/I13-2/Staff.html .
2. قدم اقتراحا للحصول على فترة زمنية لإجراء التجربة المخططة باستخدام الرابط التالي: https://www.diamond.ac.uk/Users.html.
3. ناقش تحضير العينة وعملية قياس العينة مع فريق خط الشعاع بمجرد قبول الاقتراح وجدولة التجربة. التجارب التي تجرى باستخدام الروبوت لها متطلبات معينة، موضحة في القسم التالي (القسم 2).
4. ناقش أبعاد العينة وتركيبها مع فريق خط الشعاع للتحقق من إمكانية تنفيذ التجربة بنجاح عند خط الشعاع.
5. ابدأ التحضير للزيارة التجريبية مسبقا باتباع التعليمات على الموقع الإلكتروني (https://www.diamond.ac.uk/Users.html).
6. أكمل تدريب السلامة قبل الجلسة التجريبية.

2. تحضير العينات (لتجارب الروبوتات)

1. جهز قواعد عينات متوافقة مع SPINE^{رقم 18} لتركيب العينات. قم بتركيب كل عينة على قاعدة عينات قياسية على نمط SPINE مزودة برمز باركود لمصفوفة البيانات لتمكين تتبع العينات تلقائيا.
2. قم بتوصيل العينة بالقاعدة باستخدام أحد تكوينين. تركيب الدبابيس: ثبت العينة على دبوس عينة على نمط SPINE (انظر الشكل 1C، الإدخال الداخلي). الحاوية أو التركيب المباشر: ضع العينة داخل حاوية متوافقة، مثل أنبوب الطرد المركزي الدقيق أو أنبوب البولي إيميد، أو مباشرة على قاعدة العينة.
3. تحقق من التوافق البعدي مع ممسك الروبوت من خلال التحقق من أن العينة المركبة تقع ضمن الأظرف المسموح بها لضمان التعامل الآمن مع الروبوت (انظر الشكل 2):
   الخيار أ: يناسب داخل أسطوانة بقطر 8 مم × ارتفاع 20 مم.
   الخيار ب: يناسب داخل أسطوانة بقطر 3.5 مم × ارتفاع 33 مم.
4. تأكد من أن كلا التكوينين مركزان على قاعدة العينة. تأكد من أن الارتفاع الكلي (العينة + التركيب + القاعدة) لا يتجاوز 27 مم أو 40 مم، حسب التكوين المختار.
5. عند تركيب العينات على دبابيس عينات SPINE، تأكد من وضع العينة فوق الدبوس، دون أن يحجب جزء منها بواسطة عمود الدبوس. يجب تركيب العينة عموديا ومركزيا على قاعدة الدبوس لمنع ملامسة الروبوت. وهذا مهم بشكل خاص لتركيب الخيار B الموصوف في قسم البروتوكول 2.3، وكذلك للعينات الممدودة المثبتة فوق دبابيس العينة.
6. عند التركيب داخل الحاويات أو الأنابيب، ثبت العينة بإحكام داخل الحاوية حتى لا تتحرك أثناء النقل أو التعامل الآلي. تأكد من أن الحاوية نفسها تبقى مصطفة عموديا على قاعدة العينة.
7. ثبت عنصر التثبيت المختار (الدبوس أو الحاوية) بشكل آمن وعموديا على قاعدة العينة لضمان ثبات الموقع طوال فترة التجربة.
8. استخدم طريقة لاصقة أو تثبيت موثوقة لمنع الانفصال أثناء الشحن والتلاعب الآلي، حيث قد تسبب كلتا العمليتين إجهادات ميكانيكية.
   ملاحظة: المواد اللاصقة الشائعة تشمل السيانو أكريلات (الغراء الفائق)، شمع البارافين، وغراء الذوبان الساخن. استشر فريق خط الشعاع إذا لم يكن متأكدا من توافق المواد.
9. تأكد من أن جميع العينات موضوعة على ارتفاع ثابت من الحافة العلوية للحاوية أو على دبوس العينة. بالنسبة للعينات المثبتة داخل الحاويات، تأكد من أن المسافة الجانبية من جدار الحاوية متساوية عبر جميع العينات.
   ملاحظة: التموضع المتسق ضروري لضبط المحاذاة التلقائي الموثوق. العينات الأصغر بالنسبة لمجال الرؤية تسمح بتسامح أكبر.
10. وثق رمز مصفوفة البيانات المرتبط بكل عينة لضمان التعرف الصحيح على العينة أثناء تحليل البيانات.
11. إنشاء ملف samples.csv لربط اسم كل عينة بكود مصفوفة بيانات قاعدة العينة وتمرير المعلمات ذات الصلة بإجراء المسح المقطعي.

3. تغليف وتسليم العينة

1. لا يتجاوز 15 يوم عمل قبل الجلسة التجريبية، قدم تقييم المخاطر التجريبية (ERA) وأعلن عن جميع العينات هناك. يجب أن يتم الموافقة على هذا التقييم من قبل مجموعة الصحة والسلامة في DLS (HSE) قبل السماح بشحن أو جلب العينات إلى الموقع.
2. استخدم قاعدة العينة العالمية مع التخزين و/أو حاوية الشحن المثبتة على دبابيس العينة، وتسمى أيضا Uni-puck. هذا مهم جدا عند الإرسال بالبريد.
3. إذا لم تتناسب العينات داخل فتحات العينات في حاوية التخزين المذكورة في الخطوة 3.2، يرجى إجراء ترتيبات تركيب بديلة، مثل استخدام أغطية واقية مغناطيسية تناسب قاعدة العينة وجلب العينات مباشرة للقياسات.

4. الإعداد التجريبي

1. قم بضبط معلمات مصدر الأشعة السينية لتعظيم التباين في العينة. لتحقيق ذلك، قم بتحريك الطيف الكامل و/أو تصفية طيف الأشعة السينية.
2. تحسين الكاميرا لتكون مسافة عينة بناء على طيف الأشعة السينية ودرجة تباين الطور المطلوبة لعينة معينة.
3. اختر تكبير المجهر بناء على حجم العينة ومجال الرؤية المطلوب، واختر هدف المجهر المناسب.
4. قم بمحاذاة الكاميرا في وضع الكاميرا الأفقي (المحور السيني في المختبر) بالنسبة لشعاع الأشعة السينية.

5. تحميل العينات ومحاذاة

1. افحص العينات وتركيب العينات بدقة في بداية كل جلسة تجريبية بحثا عن أي عينات تبدو تالفة أو مثبتة بشكل فضفاض. أبلغ المستخدمين عن أي عينات من هذا النوع.
   ملاحظة: حاليا، خط الشعاع مزود بحوامل تصل إلى 7 قرص، ويمكن لكل قرص أن يحمل حتى 16 عينات. يمكن قياس ما مجموعه 112 عينة خلال تشغيل روبوت واحد. يرجى الرجوع إلى الشكل التكميلي 2، الذي يوضح كيفية تحديد مواقع فتحة القرص (الدبوس).
2. قم بتركيب عينات على فتحات القرص والقرص (الدبابيس) المحددة في ملف samples.csv. قم بإجراء تجربة جكلية لإجراء تبادل عينات الروبوت على بعض العينات لاختبار عمل الروبوت، وكذلك للتأكد من أن العينات ضمن المواصفات المطلوبة.
3. استخدم قاعدة عينة مع دبوس عينة (بدون عينة) لمحاذاة محور دوران مرحلة الدوران مع مركز الكاشف في الاتجاه الأفقي.
4. حرك أعلى الدبوس إلى مركز كاميرا الأشعة السينية (الشكل 3A). محاذاة كاميرا التلسكوب (TC)، التي تم إعدادها عند 90° مع الشعاع، كما هو موضح في الصورة (الشكل 3)، لتكون في مركز مجال الرؤية (FOV). حدد إحداثيات هذا الموقع في إحداثيات بكسل TC.
5. قم بتحديث موقع الهدف العينة في السكربت الذي يتعامل مع محاذاة العينة.
6. قم بتركيب عينة تمثيلية. شغل سكريبت محاذاة العينات التلقائي لوضع العينة في مركز الدوران على TC. رابط النص متوفر في الملف التكميلي 1.
7. تحقق مما إذا كانت منطقة العينة المعنية (ROI) مركزة في مجال الرؤية (FOV) لكاميرا الأشعة السينية.
8. إذا لم يكن عائد الرؤية مركزا في مجال الرؤية، كرر الخطوات من 5.5 إلى 5.7 وقم بتحسين محاذاة العينة بتغيير الإحداثيات الخاصة بموقع الهدف.
   ملاحظة: يتم تنفيذ القسمين 4 و5 من قبل جهة الاتصال المحلية باستثناء القسم 4.2.

6. إعداد جمع البيانات

1. تحقق من أن هيكل الملف/المجلدات المطلوبة في نظام ملفات DLS قد تم إنشاؤه لتخزين البيانات الخام، وملفات البيانات الوصفية، ونتائج التحليل.
2. انسخ ملف samples.csv إلى المجلد المذكور في الخطوة 6.1.
3. قم بتحديث وقت تعريض الكاميرا وعدد الإسقاطات التي يجب الحصول عليها في samples.csv، بناء على بنية العينة والتباين المطلوب.
4. حدد مجموعتين من مواقع المحرك تسمى موضع التحميل (LP) وموضع المسح (SP). LP هو المجموعة التي يتم فيها تحسين المراحل لتحميل العينة، وSP لمسح العينة بالتصوير المقطعي.
   ملاحظة: يتم تنفيذ القسم 6 بواسطة جهة الاتصال المحلية أو يتم إنشاؤه تلقائيا بواسطة أنظمة DLS.

7. إجراء جمع البيانات

1. قم بتركيب جميع العينات على المواقع الصحيحة للقرص والدبابيس، كما هو موضح في ملف samples.csv.
2. لجمع البيانات، استخدم وركستنشن البيانات العامة (GDA)، وهو برنامج مفتوح المصدر طورته DLS (https://alfred.diamond.ac.uk/documentation/manuals/GDA_User_Guide/master/introduction.html). هو نظام قائم على جافا يستخدم في DLS للتحكم في التجارب وجمع البيانات. تم توفير لقطة شاشة في الشكل التكميلي 1.
3. استخدم كائنا يسمى توموماتيك في GDA لتغيير العينات تلقائيا، محاذاة العينة، والقياس المقطعي.
4. أصدر الأمر tomomatic.load (/dls/i13/data/year/... samples.csv) في محطة GDA لتحميل الملف. ثم أصدر التوموماتيك. مسح () لتشغيل الأمر.
5. يلتقط الروبوت العينة أولا من صينية التحميل ويأخذها إلى قارئ الباركود الليزري. بمجرد قراءة الباركود، ينقل العينة إلى مرحلة التصوير المقطعي ويركبها. تأكد من أن العملية بأكملها تسير بسلاسة.
   ملاحظة: هنا، يتم استخدام روبوت ياسكاوا مزود بمقبض الانحناء المطور داخليا.
6. بمجرد تنفيذ تحميل العينة، تنتقل المراحل إلى موضع SP. ثم يتم تنفيذ وظيفة autoCentrePin داخل النص التوموماتيكي، الذي يضع العينة في مركز الدوران (COR). أصبح قياس التصوير المقطعي بالأشعة السينية باستخدام مغير عينات روبوتي جاهزا الآن للتنفيذ.
   ملاحظة: يرجى مراجعة الملف التكميلي 1 للكشف عن الرمز الزائف للنص التوموماتيكي.
7. نفذ وظيفة TomoFlyscan لقياس التصوير المقطعي. تجمع هذه الدالة أولا 40 صورة إسقاط بدون شعاع إكس، ويشار إليها بصورة مظلمة (DI)، و40 صورة بشعاع أشعة إكس ولكن بدون عينة في الشعاع، وتعرف بصورة المجال المسطح (FI). ستستخدم هذه الصور لتطبيع الصورة أثناء إعادة بناء البيانات.
8. اجمع صور الإسقاط (PI) مع العينة في الشعاع عند فترات زوايا دوران العينة، كما هو موضح في ملف samples.csv. في الحالة الحالية، يحتوي على 3001 صورة PI.
   ملاحظة: جميع الخطوات، من 7.5 إلى 7.8، تسير واحدة تلو الأخرى دون أي تدخل بشري.

8. الوصول إلى البيانات والتحليل

1. يمكنك الوصول إلى البيانات المحفوظة من خلال تصفح نظام الملفات والمجلد المناسبين. البيانات الممسوحة الضوئية المذكورة في القسم السابق تحفظ في ملفين مختلفين، أحدهما يحتوي على *.nxs وملف *.hdf مع رقم * رقمي، على سبيل المثال: 123456.nxs و 123456.hdf. يحتوي NXS على البيانات الوصفية للمسح، بينما يحتوي HDF على جميع بيانات صورة العرض (البيانات المرتبطة من NXS).
2. استخدم خط أنابيب إعادة البناء من Savu^{رقم 19} لتوليد شرائح ثنائية الأبعاد من صور الإسقاط.
3. الوصول إلى الصور المعاد بناؤها وتصورها باستخدام برامج العرض ثلاثي الأبعاد، مثل AVIZO/ImageJ.
   ملاحظة: يتطلب إكمال القسمين 7 و8 إجراءات منسقة من المستخدمين وجهات الاتصال المحلية، مع تنفيذ خطوات فرعية فردية من قبل كل منهم.

Results

يظهر الشكل 1 روبوت مغير العينات Yaskawa GP7 المثبت على خط شعاع Diamond I13-2 Imaging Image. يظهر الشكل 1A الروبوت (1) والممسك الانحنائي المصمم داخليا (2). يمكن لهذا الممسك حمل عينة بقطر ≤ 8 ملم. يوضح الشكل 1B الروبوت (1) ونظام كاميرا البصريات/الأشعة السينية (4) و(6) المستخدمين لجمع بيانات التصوير المقطعي. يأخذ الروبوت القابض العينة من صينية العينات (3)، التي يمكنها حمل 7 أقراص أحادية مع 16 عينة على كل منها، كما هو موضح في الشكل 1C. تركب العينات على عصا الألمنيوم (5)، ويتم جمع بيانات التصوير المقطعي باستخدام نظام الكشف (6). تفاصيل (5) و(6) موفرة في الفقرة الأخيرة من قسم المقدمة. الخط الأحمر المكسور في الشكل 1B يشير إلى اتجاه شعاع الأشعة السينية.

تفاصيل مخطط تثبيت العينة وتصميم مقبض الانحناء موضحة في الشكل 2. يظهر الشكل 2A عينة بلاستيكية أسطوانية، مصنوعة بالطباعة ثلاثية الأبعاد، ملصقة على قاعدة العينة. يمثل حد العينة الغلاف الأقصى لارتفاع العينة والقطر. تشير الأسهم الحمراء إلى الموقع الذي يمسك فيه ممسك الانثناء قاعدة العينة لنقلها من صينية العينة إلى مرحلة التصوير المقطعي والعكس صحيح. يظهر تصميم ثلاثي الأبعاد لمسك الانحناء في الشكل 2B. يتم تشغيل أصابع القابض بواسطة أنبوب دفع متحكم فيه هوائيا (الشكل 1B، البند 2). المساحة المركزية في القابض قطرها 8.9 مم، كما هو موضح في الشكل 2C، مما يسمح بحجم عينة أقصى يبلغ 8 مم مع هامش ~1 مم. يوضح الشكل 2D صورة الجزء العلوي من مرحلة التصوير المقطعي. يتم تركيب عصا من الألمنيوم فوق المرحلتين المتعامدتين وقرص مغناطيسي له قطر دقيق بحيث يتناسب التجويف في أسفل قاعدة العينة. وبما أن هذا القرص مغناطيسي، فإنه يثبت قاعدة العينة المثبتة بإحكام أثناء قياسات التصوير المقطعي.

لهذه التجربة التمثيلية، تم اختيار 64 عينة من الحشرات التي قدمها متحف التاريخ الطبيعي (NHM) في لندن. تم اختيار عينات لتمثيل مجموعة من الأنماط الظاهرية للمفصليات مع ملاءمتها ضمن قيود حجم الممسك. نظرا لأن المفصليات، وخاصة الحشرات، تمثل الغالبية العظمى من تنوع الأنواع المعروفة، حيث يزيد عدد أنواع الأنواع المسماة عن أكثر من مليون نوع، فإن عينة العينات منها صعبة بشكل خاص لإجراء دراسات مقارنة للنمط الظاهري. لذا تظهر العينة الحالية إمكانات هذا النهج من خلال أخذ عينات من ثلاث فروع على مستوى الفئة من المفصليات: العنكب، الإنتوجناثا، وإنسكتا، بالإضافة إلى أخذ عينات أكثر دقة داخل الحشرات لالتقاط التنوع في سبعة رتب، بما في ذلك أربعة من أغنى الأنواع التي لا تزال موجودة اليوم. تم تثبيت العينات على بطاقة لاصقة. ثم تم تركيب البطاقات على دبابيس العينة. يتم تجنب تركيب العينات (الحشرات) مباشرة على دبابيس العينة، لأن البنية عالية الامتصاص في العارضة ذات العينات منخفضة الامتصاص ستخلق تشوهات خطوطية أثناء إعادة البناء، بالإضافة إلى صعوبة تثبيتها بأمان على دبابيس العينة. يوضح الجدول 1 القالب samples.csv الملف الذي سيملأه المستخدم بالمعلمات المطلوبة للتصوير المقطعي (الأعمدة A، B، C، E، F، G، H، K). وصف كل عمود مقدم في الجدول. يتم ملء الأعمدة D وI وJ وL في input_file بعد محاذاة وتحسين معلمات التصوير المقطعي عند خط الشعاع. تم قياس جميع العينات ال 64 أولا بهدف 1.25x (مجال رؤية 6.7 مم × 5.6 مم) عند مسافة انتشار محسنة للأشعة السينية (من عينة إلى كاشف)، ولاحقا تم قياس نفس العينات بهدف 4x باستخدام معلماتها المحسنة. بمجرد تحميل العينات على صينية العينات وتأمين الخزانة التجريبية، يبدأ المسح باستخدام GDA.

تم تنفيذ المحاذاة التلقائية للعينة بواسطة سكريبت مكتوب بلغة بايثون (موقع الملف على GitHub: https://gist.github.com/ndg63276/9b3c5cfe7db26b14930dff3ef889e2bc). في البداية، يتم ضبط محاذاة العينة باستخدام تركيبة قاعدة عينة ودبوس عينة بدون العينة. يظهر الشكل 3 دبوس العينة، كما يراه كاميرا التلسكوب الجانبي (الكاميرا موضوعة بزاوية 90° على شعاع الأشعة السينية - الشكل 1B، البند 4)، والذي يستخدم كعينة محاذاة قياسية. صورة كاميرا التلسكوب ثنائية بحيث يمكن اكتشاف العينة من الخلفية. يتم تحديد حواف العينة وتمييزها كحد أبيض، كما هو موضح في الشكل 3. موقع الإحداثيات المرجعية للعينة هو أعلى الدبوس المميز كدائرة بيضاء في الشكل 3A. عند النظر إلى صورة الأشعة السينية، يتم تحديد عائد الرؤية للعينة على الكاميرا الجانبية، ويتم تحديد موقع الإحداثيات المطلوبة للهدف، المشار إليه كسهم أزرق مزدوج الرأس مع نقطة حمراء (الشكل 3B)، على الكاميرا الجانبية. يتيح هذا الإعداد وضع العينة ليس فقط على ال COR، بل أيضا على ارتفاع أو أقل أو خارج المركز ببضعة مليمترات إذا لزم الأمر. بعد تحميل العينة على مرحلة التصوير المقطعي، يتم تنفيذ وظيفة التمركز التلقائي. ينقل السكربت العينة أولا إلى الموضع المستهدف (الشكل 3B) ويذهب إلى 0°. بعد ذلك، ينقل العينة إلى زاوية 90° (الشكل 3C) ويحدد مقدار العينة التي يجب تحريكها لوضع العينة في مركز الدوران (COR). عادة ما يستغرق هذا حوالي 15-20 ثانية. العينة الآن على جهاز COR (الشكل 2D)، وتم محاذاة COR بالفعل مع مركز الكاميرا. النظام جاهز الآن للحصول على التصوير المقطعي.

في هذه الدراسة لحشرات NHM، أجريت 128 فحصا مقطعيا دون تدخل بشري. استغرق القياس ما مجموعه 17 ساعة. كل فحص كان حوالي 8 دقائق. مثل هذا التجربة بدون استخدام الروبوت كانت ستستغرق حوالي 20 إلى 25 دقيقة لكل مسح مقطعي. هذا يعني أن المسح المقطعي باستخدام الروبوتات أسرع بثلاث إلى أربع مرات من المسح اليدوي للحالة الحالية. يعرض الجدول 2 ملف سجل نموذجي يتم إنشاؤه في نهاية مسح دفعة الروبوت، بما في ذلك المعلمات المطلوبة لربط كل رقم مسح بالعينة المقابلة له. تفاصيل إضافية موفرة في أسطورة الجدول 2 .

يظهر الشكل 4 صور إسقاط مطبعة لإحدى العينات، وهي حشرة (فئة – حشرة، رتبة – خنافس)، تم تصويرها خلال تجربة التصوير المقطعي المذكورة أعلاه بتكبير 1.25x و4x. الصف العلوي، الشكل 4A-C، يظهر عينة مصورة ب 1.25x، ثم تم تصوير نفس العينة ب 4x، أي الشكل 4D-F. الشكل 4 A–F يعرض صور الإسقاط الملتقطة عند 0° و90° و180°. المستطيل الأصفر يظهر مجال رؤية الصور المكبرة التي يتم الحصول عليها بهدف 4x. من المهم ملاحظة أنه بمجرد تحميل العينات على الصينية الموضحة في الشكل 1C، سارت جميع العمليات دون تدخل بشري. يرجى ملاحظة أن هذين المسحين تم الحصول عليهما على بعد ~8.5 ساعة من الفصل. هذا يدل على الاستقرار وقابلية تكرار الإعداد.

يظهر الشكل 5 شرائح أفقية أو عرضية من مجموعة شرائح إعادة بناء التصوير المقطعي للعينة المذكورة في الشكل 4. كل من شرائح 1.25x (الشكل 5A) و4x (الشكل 5B) مرسومة دون قص الصور ولهما 2510 × 2510 بكسل. الشرائح مركزة جيدا داخل مجال الرؤية، مما يوضح أن التكبير في منطقة ذات تكبير أعلى ممكن دون الحاجة لأي تدخل جسدي.

تظهر النتائج المعروضة هنا أن تنفيذ نظام روبوتي لتبادل العينات في تجارب التصوير المقطعي المقطعي بنظام السينكروترون يوفر عدة مزايا مهمة. تشمل هذه زيادة معدل الإنتاجية، وتحسين كفاءة العمليات، والقدرة على إجراء المسوحات بتكبير متعدد (التكبير) دون الحاجة إلى تدخل بشري. وبالنظر إلى عدد العينات التي يجب مسحها، كما في دراسة NHM المقدمة هنا، سيكون من المستحيل الحصول على استنتاجات إحصائية قوية ومتسقة من خلال المسح اليدوي.

الشكل 1: صورة للروبوت وإعداد التصوير المقطعي التجريبي المثبت في خط شعاع I13-2. (أ) الروبوت (1) مزود بمقبض انحناء مصمم داخليا (2). (ب) صينية تحميل العينة (3) ومرحلة التصوير المقطعي (5). تستخدم الكاميرا البصرية (كاميرا التلسكوب)، المشار إليها ب (4)، لمحاذاة العينات على جهاز COR. يحتوي نظام الكاشف (6) المستخدم للقياس على عدة أهداف آلية لتغيير مجال الرؤية تلقائيا، بالإضافة إلى كاشف pco.edge 5.5. السهم الأحمر المتقطع يمثل اتجاه شعاع الأشعة السينية. (ج) صورة لصينية تحميل العينات مع 7 قرص، وكل قرص يمكنه حمل ما يصل إلى 16 عينة مثبتة على مزيج من قاعدة العينة ودبابيس العينة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 2: تفاصيل مخطط تثبيت العينة وتصميم مقبض الانحناء. (أ) صورة لعينة بلاستيكية مطبوعة ثلاثية الأبعاد مثبتة على قاعدة عينات، تمثل الحد الأقصى لغلاف العينة الذي يمكن لمسته بواسطة ممسك الانحناء. تشير الأسهم الحمراء إلى الموضع الذي يمسك فيه الممسك قاعدة العينة. (ب) التصميم ثلاثي الأبعاد لمسك الانحناء. يتم تشغيل أصابع الممسك لتثبيت أو تحرير قاعدة العينة. (ج) رسم مقطع عمودي للممسك بأبعاد محددة. أقصى فتحة في الوسط هي 8.9 مم؛ لذلك، الحد الأقصى المسموح به للعينة هو ≤ 8 ملم. (D) صورة لأعلى مرحلة التصوير المقطعي. تم تركيب عصا من الألمنيوم (تشير إليها السهم الأزرق) في أعلى المرحلتين المتعامدتين. يتم تثبيت قرص مغناطيسي في أعلى العصا التي توضع قاعدة العينة (مع العينة) عليها بواسطة الممسك. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 3: لقطات من رسم الفيديو لإجراء محاذاة COR باستخدام كاميرا التلسكوب الجانبي. (أ) صورة لدبوس المحاذاة قبل بدء روتين المحاذاة. التقاطع الأزرق ذو الرأسين مع نقطة حمراء مركزية هو موقع الهدف، والذي يتزامن مع وضع الزاوية المئوية لمرحلة دوران التصوير المقطعي. يظهر الإدخال الصورة المكبرة لأعلى الدبوس الذي يظهر مركز العينة المكتشف من حيث الارتفاع والعرض. (ب) الدبوس محاذي مع موضع الهدف عند 0°. (C) تم تدوير الدبوس إلى 90°، وهو خارج الهدف. (د) الدبوس محاذي مع موضع الهدف عند 90°. الآن الدبوس محاذي في كلا الاتجاهين المتعامدين؛ لذا، ستدور العينة في مركز الكاميرا. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 4: صور إسقاط طبيعية لحشرة جمعت بهدف 1.25x و4x. كانت الحشرة تنتمي إلى فئة الحشرات، من رتبة Coleoptera. يمثل هذا اثنين من أصل 128 فحصا للتصوير المقطعي. تم لصق الحشرة على ورقة ومثبتة على دبوس العينة. صور الإسقاط ذات الهدف 1.25x تكون عند (A) 0°، (B) 90°، (C) 180°، و4x عند (D) 0°، (E) 90°، و(F) 180°. تم جمع مجموعة الفحوصات المقطعية 1.25x و4x في جلسة واحدة دون أي تدخل بشري. توفر مجموعة صور بحجم 1.25x رؤية كاملة للعينة، وتظهر مجموعة صور 4x قدرة التكبير. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 5. مقارنة شريحة مقطعية متطابقة تم الحصول عليها باستخدام مجالين مختلفين للنظر. شريحة واحدة معاد بناؤها من التصوير المقطعي لصور الإسقاط المعروضة في الشكل 4 لتكبيرات (A) 1.25x و (B) 4x. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الجدول 1: ملف samples.csv نموذجي يقدمه المستخدم يحتوي على معلمات التصوير المقطعي. يقرأ هذا الملف بواسطة سكريبت بايثون التوموماتيك المستخدم لجمع البيانات. الأعمدة A (وصف العينة)، B (معرف القرص)، C (فتحة في القرص)، E (خطوة دوران التصوير المقطعي)، F (عدد FI)، G (عدد DI)، H (التكبير المستخدم)، وK (أولوية الفتحة) يتم ملؤها بواسطة المستخدم. يتم ملء الأعمدة D (وقت التعريض)، I (مسافة انتشار الأشعة السينية بين العينة والكاميرا)، J (حركة الكاميرا عبر الشعاع لوضع COR في مركز الكاميرا)، وL (باركود قاعدة العينة) بعد المحاذاة والتحسين الأولي. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

الجدول 2: ملف سجل الإخراج النموذجي محفوظ ك Output_file.txt بعد مسح جميع العينات. يبلغ الملف عن جميع معلمات الإدخال، بالإضافة إلى ذلك، يوفر الباركود للعينة المسحها (العمود M)، والمسار إلى ملفات البيانات الوصفية والصور الممسوحة ضوئيا (العمود N)، وموضع المحرك المستخدم لجمع FI (العمود O). ببساطة، يوفر هذا الملف الناتج المعلومات اللازمة لإعادة بناء البيانات وتحليلها. وبما أنه لم يتم توفير أي إدخال في العمود A من ملف الإدخال، يتم ملء هذا العمود بعدد المسح الحالي، بالإضافة إلى أرقام القرص والدبابيس. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

الملف الإضافي 1: رمز زائف يصف السكربت المستخدم لتشغيل الروبوت كمغير عينات. يوضح الملف روتين التركيب التلقائي للعينات، وقراءة رموز مصفوفة البيانات، ومحاذاة العينات تلقائيا، وتنفيذ المسح المقطعي. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الشكل الإضافي 1: لقطة شاشة لواجهة اكتساب البيانات العامة. تسمح هذه الواجهة بضبط معايير الكاميرا الأساسية، وتصور العينة بشكل حي، وبدء عمليات التقاط الصور المقطعية. يمكن بدء عمليات المسح باستخدام زر الشاشة (المسح اليدوي فقط) أو عبر واجهة سطر الأوامر، التي تشير إليها المستطيل الأصفر في أسفل منتصف لقطة الشاشة. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الشكل الإضافي 2: صورة لمعيار SPINE بوك (يسار) وغطاء القرص (يمين). يتم ترقيم مواقع الدبابيس، الموضحة باللون الأحمر، والتي تركب عليها قواعد العينة، بدءا من الموقع المقابل للشق في عمود التثبيت المركزي. الرقم 7267 (المشار إليه باللون الأبيض) هو رقم تعريف القرص. يمكن تركيب غطاء القرص على القرص لحماية العينات أثناء النقل أو التخزين. يرجى التأكد من توافق أحجام العينات قبل محاولة تركيب الغطاء. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

Discussion

يعد تحضير العينة ومحاذاة العينات خطوتين حاسمتين لعمل روبوت مغير العينات الأوتوماتيكي بشكل صحيح^وفعال. حجم العينة ومتطلبات التركيب مذكورة في القسم 2 (البروتوكول). ببساسة، يجب أن يكون قطر العينة 8 مم أو أقل ويجب أن يكون مركزا جيدا على قاعدة العينة¹². يتم تحديد هذا القيد بواسطة أبعاد الممسك. أيضا، يجب أن تكون جميع العينات في قياس واحد على نفس الارتفاع بحيث يكون وضع العينات في مركز الدوران متسقا عبر جميع العينات. إذا تم محاذاة الروبوت لتجربة ما، فإن إجراء تجربة أخرى مع روبوت مغير العينة يكون مؤتمتيا بالكامل، باستثناء تعيين منطقة الاهتمام للعينة. يتم شرح ذلك في قسم النتائج التمثيلية، الشكل 3. ومن المهم أيضا ملاحظة أن هذا جزء من عملية المحاذاة التي يقوم بها طاقم خط الشعاع (الاتصال المحلي). بمجرد تحديد ذلك، تجرى جميع قياسات العينة دون تدخل بشري. من وجهة نظر المستخدم، القياسات مؤتمتة بالكامل. حتى الآن، تستخدم قواعد العينة ودبابيس العينات من شركة Molecular Dimensions Ltd فقط؛ ومع ذلك، هناك مزودون آخرون، مثل MiTeGen وHampton Research، ينتجون قواعد عينات ودبابيس عينات بنمط SPINE.

يتم حاليا تطوير واختبار أجهزة التقاط عينات أكبر، مصممة لحمل عينات تصل قطرها إلى 12 مم. سيسمح ذلك للروبوت بالتعامل مع عينات أكبر، مثل تلك الموضوعة داخل أنابيب الطرد المركزي الدقيق والمثبتة على قاعدة عينات. قد يتضمن تصميم الممسك المحسن آلية تقترب من العينة من الجانب، مما يزيل القيود الحالية على حجم العينة. علاوة على ذلك، فإن ترقية خط الشعاع ستزيد من معدل الإنتاجية بمقدار كبير، مما يمكن من مسح أكثر من 3,000 عينة يوميا. وهذا بدوره سيسمح بجمع مجموعات بيانات ذات دلالة إحصائية تضم حوالي 30,000 عينة خلال 10 أيام من وقت الحزمة. في المستقبل القريب، سننفذ خط أنابيب إعادة بناء التصوير المقطعي الجديد يسمى HTTomo.

يجب ملاحظة أن معايير مثل مسافة انتشار الحزمة (مسافة العينة إلى الكاشف)، وقت التعرض، عدد الإسقاطات، إلخ، يجب تحسينها مسبقا، كما هو الحال في كل تجربة تصوير مقطعي بالأشعة السينية بسينكروترون آخر. قيد آخر هو أن المراحل المشاركة في التجربة، مثل معالجة العينات ذات الستة محاور، مراحل التصوير المقطعي، ومراحل معالجة الكاميرا، كان يجب أن تكون في موقع محدد لتحميل وتفريغ العينة. وهذا يعني أن المراحل يجب أن تتحرك ذهابا وإيابا عند تحميل وتفريغ العينات.

في الختام، يمكن إجراء التصوير المقطعي عالي الإنتاجية بمساعدة روبوت تغيير العينة، مما يجعل العملية أسرع ب 4-10 مرات على الأقل ويقلل أو يلغي وقت الموت مقارنة بالتشغيل اليدوي. كما تسمح الأتمتة التجريبية باستخدام الروبوتات بنشر الأفراد بكفاءة أكبر، حيث يتطلب الأمر عددا أقل من الأشخاص لإجراء القياسات. يعد قياس مجموعات البيانات ذات الدلالة الإحصائية أمرا مهما للعديد من المجالات العلمية حيث يتطلب الأمر حجما موثوقا وكافيا من البيانات لمعالجة الحالة العلمية. استخدام الروبوت يمكن أن يساعد كثيرا في مثل هذه المهام.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Air-bearing rotation stage	Aerotech, Inc.	https://www.aerotech.com/wp-content/ uploads/2021/01/abrt-data-sheet.pdf	مرحلة تدوير التجويف الهوائي
AVIZO	ThermoFisher scientific		برنامج تجاري لتصور البيانات وتحليلها
Cryocap -MiTeGen	MiTeGen LLC	https://www.mitegen.com/product/ reusable-goniometer-base-styles/	مورد CryoCap بديل
CryoCap-Hampton research	Hampton research	https://hamptonresearch.com/ product-CrystalCap-SPINE-HT-445.html	مورد CryoCap بديل
Cryocaps( MD7-401) and Cryopins(MD7-410)	Calibre Scientific	https://www.moleculardimensions.com/ products/magnetic-cryovials-and-cryocaps	يستخدم لتركيب العينات
Detector Optics	Olympus/Evident Scientific	https://evidentscientific.com/en/objective-finder? creative=651972731238&keyword =olympus+objectives&matchtype= e&network=g&device=c&campaign id=19865307548&adgroupid=144 087466781&gad_source=1&gad_ campaignid=19865307548&gbraid =0AAAAADMIOOmWDa2WC5VP2 Ngxlqao8dyWe&gclid=Cj0KCQiAhtv MBhDBARIsAL26pjFYUqjLVZ1Miz p2W7eGzD2SEPNTjxiA87Dry6un 1Fx6GplHQjuBR94aAs1xEALw_wcB	العدسات الموضوعية والعينية الضوئية
GDA	Diamond Light Source Ltd.	https://www.diamond.ac.uk/Users/Experiment -at-Diamond/IT-User-Guide/Software/Data-Acq/GDA.html	برنامج الاستحواذ على البيانات العامة
Hexapod	PI miCos GmbH	https://www.physikinstrumente.co.uk/en/pro ducts/6-axis-hexapods-parallel-positioners	مرحلة سداسية المحاور لمحاذاة التصوير المقطعي ومعالجة العينة
ImageJ	Developed at the National Institutes of Health, University of Wisconsin	https://imagej.net/ij/	برنامج معالجة الصور وتصورها مفتوح المصدر
pco.edge 5.5 sCMOS camera	PCO (PCO AG / Excelitas Technologies)	https://www.excelitas.com/product-category/ pcoedge-cooled-scmos-cameras	كاميرا الأشعة السينية المستخدمة في التصوير المقطعي
SAVU	Diamond Light Source Ltd.	https://www.diamond.ac.uk/Home.html ;jsessionid=8977FA8A10694BFA2AA DFD5D0D23B320	خط أنابيب إعادة بناء التصوير المقطعي
Scintillators	CRYTUR, spol. S r.o	https://www.crytur.com/materials/luag-ce/	بصريات الوميض
Universal V1-puck( Uni-puck)	Calibre Scientific	https://www.moleculardimensions. com/products/uni-pucks-and-accessories	يتم تركيب العينات على Uni-puck لالتقاطها بواسطة الروبوت