تقدم هذه المقالة طريقة لتحضير الحويصلات العملاقة أحادية الصفيحة المركبة (cGUVs) بهيكل حويصلة في الحويصلة ، مع موصلية كهربائية مخصصة في المناطق الداخلية والحلقية والخارجية. يصنع التكوين الكهربائي GUVs البسيطة ، والتي تتحول إلى خلايا فعمية و cGUVs عبر الصدمة التناضحية ، مما يوفر نموذجا قيما لدراسة الفيزياء الحيوية للخلايا النواة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تخليق الحويصلات أحادية الصفيحة العملاقة المركبة: نموذج محاكاة حيوية للخلايا النووية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
الحويصلة العملاقة الأحادية البسيطة (sGUV) عبارة عن حويصلة كروية بحجم ميكرون ، تتكون من طبقة ثنائية دهنية تحيط بمحلول مائي بالداخل ويتم تعليقها في وسط مائي آخر. كنماذج محاكاة حيوية للخلايا البيولوجية ، تعد المركبات المضافة الحيوية أنظمة راسخة للدراسات الفيزيائية الحيوية. ومع ذلك ، فإن sGUVs تحاكي الخلايا المنزولة في المقام الأول ، مما يحد من تطبيقها كنماذج للخلايا غير النواة. نقترح الحويصلات العملاقة أحادية الصفيحة المركبة (cGUVs) كنموذج محاكاة حيوي أكثر ملاءمة للخلايا ذات النواة. cGUVs عبارة عن هياكل حويصلة في حويصلة ، حيث يمكن افتراض أن الطبقات الثنائية الحويصلة الخارجية والداخلية تمثل الخلية والغشاء النووي للخلية ، على التوالي.
في هذه الدراسة ، نصف طريقة بسيطة لتخليق cGUVs. باختصار ، تم إنشاء sGUVs باستخدام التركيب الدهني ل DMPC والكوليسترول في حدود 37-43 mol٪ في وسط السكروز عبر طريقة التكوين الكهربائي. ثم تعرضت هذه المركبات الكهروضوئية المتعددة المركبات لصدمة تناضحية عن طريق إدخال محلول جلوكوز مفرط التوتر ، مما أدى إلى انتقال فوري إلى شكل الخلايا الجسدية. أدت هذه العملية إلى تكوين حالة وسيطة حيث ظلت الحويصلات الخارجية والداخلية متصلة من خلال الرقبة ، مما أدى في النهاية إلى تطوير بنية الحويصلة في الحويصلة ، والتي يشار إليها باسم cGUVs.
علاوة على ذلك ، من المعروف أن GUVs المحضرة بمستويات أعلى من الكوليسترول في الطبقة الثنائية تظهر نفاذية أيونية منخفضة. تسمح هذه الخاصية بضبط الموصلية في المحلول الحلقي ل cGUV عن طريق ضبط موصلية وسط الترطيب ، والمحلول الداخلي من خلال الجلوكوز مفرط التوتر ، والمحلول الخارجي عن طريق ضبط التخفيف أو إضافة الوسائط الموصلة ، مما يجعل cGUVs الناتجة ذات موصلية خاضعة للرقابة في المناطق الخارجية والحلقية والداخلية ، ذات صلة بالدراسات الميدانية الكهربائية. نقترح هذا النهج الفعال والمباشر لتصنيع الحويصلات المركبة التي يمكن استخدامها كنموذج محاكاة حيوي للخلايا حقيقية النواة ، مما يعزز تطبيقها في البحوث الفيزيائية الحيوية.
المقدمة
تم استخدام نماذج المحاكاة الحيوية على نطاق واسع لدراسة الظواهر الفيزيائية الحيوية المعقدة لأغشية الخلايا. توفر أبسط نماذج المحاكاة الحيوية هذه رؤى قيمة من خلال تقليل التداخل من المتغيرات التي لا تعد ولا تحصى الموجودة في الخلايا البيولوجية. الحويصلات الأحادية العملاقة (GUVs) هي نظام محاكاة حيوي أساسي يستخدم لدراسة الفيزياء الحيوية الغشائية1،2. تم تأسيس GUVs كنموذج تمثيلي لغشاء الخلية. وهي تتألف من طبقة ثنائية دهنية كروية واحدة بقطر 10-30 ميكرومتر ويتم تغليفها وتعليقها في محلول مائي. في هذه المقالة ، نطلق على هذه sGUVs. يتم إنشاء هذه الأنظمة باستخدام نهج تصاعدي ، حيث يتم تجميع ا....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. تحضير محاليل خليط الدهون
- تحضير محلول 1 مل من DMPC والكوليسترول بنسبة مولارية 63:37 بتركيز نهائي 5 مجم / مل. لهذا الغرض ، أضف 149 ميكرولتر من DMPC (25 مجم / مل من المخزون كما تم استلامه مذاب في الكلوروفورم) ، و 252 ميكرولتر من الكوليسترول (5 مجم / مل من الكوليسترول المذاب في الكلوروفورم) ، و 599 ميكرولتر من الكلوروفورم.
- تحضير محلول آخر 1 مل من DMPC: الكوليسترول بنسبة 57:43 مولارية عند 5 مجم / مل ، واخلط 139.8 ميكرولتر من DMPC (25 مجم / مل من المخزون كما تم استلامه مذاب في الكلوروفورم) ، و 301 ميكرولتر من الكوليسترول (5 مجم / مل ، محضر من مسحوق مذاب في الكلوروفورم) ، و 559.2 ميكرولتر من الكلوروف....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
تم تصنيع sGUVs باستخدام طريقة التكوين الكهربائي (كما هو موضح في الشكل 1) وحصادها من الغرفة باستخدام حقنة. تم تصور المركبات الكهربية المضافة المحصودة في البداية تحت المجهر المقلوب وتعرضت لصدمة تناضحية للحث على تحولها إلى شكل خلية فمية. بعد مزيد من إعادة تشكيل الغشاء ، يتم تحويل هذه الخلايا الفعمية إلى بنية حويصلة في حويصلة تسمى مركب الحويصلة العملاقة أحادية الصفيحة (cGUV) (الشكل 1). تم تحليل cGUVs بشكل أكبر باستخدام الفحص المجهري.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
تحدد تركيبة وأنواع الدهون إلى حد كبير الخواص الميكانيكية للطبقة الثنائية التي تشكل GUV. تظهر طبقة ثنائية مكونة من DMPC / Chol تحولات فريدة في الشكل عند تعرضها لصدمة تناضحية. تحت صدمة تناضحية شديدة التوتر ، يتم طرد السائل المائي داخل sGUV ، مما يؤدي إلى تشوه طبقة GUV الثنائية. تتأثر انتقالات الشكل المرصودة بشكل أساسي بالتدفق الخارجي للمياه وصلابة انحناء الطبقة الثنائية. تظهر هذه التشوهات بأشكال مختلفة ، بما في ذلك أشكال نجم البحر والدمبل ، اعتمادا على قوة الصدمة التناضحية والتكوين الدهني .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإعلان عنه.
شكر وتقدير
يشكر روبيش كومار وزارة تنمية الموارد البشرية (MHRD) ، حكومة الهند ، على زمالة PMRF ومنحة الطوارئ. نحن نقدر بامتنان مجهر المسح الضوئي بالليزر متحد البؤر للمنشأة المركزية ، IRCC ، IIT Bombay.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| Cholesterol (Sigma grade, 99%) | Avanti Polar Lipids, Inc. | C8667 | لتركيب sGUV |
| Choloroform | Merck Life Science Pvt. Ltd. | DA2P711602 | يستخدم كمذيب لتحضير محلول الدهون |
| DMPC | Avanti Polar Lipids, Inc. | 850345C | لتركيب sGUV |
| Ethanol | Hayman | F204325 | لتنظيف شرائح ITO |
| FITC-DEXTRAN (4 Kda-MW) | Sigma-Aldrich | 466994 | للتغليف داخل الحويصلات الداخلية لـ cGUV |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G-7021 | لتحضير محلول الجلوكوز، المستخدم في الصدمة الأسموزية لـ sGUV المعلقة في محلول السكروز |
| Liss Rhod PE | Sigma-Aldrich | 810150C-1MG | لتلطيخ جزيئات الدهون |
| Nile red | Sigma-Aldrich | 72485 | لتلطيخ أغشية cGUV وsGUV |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | 1936060521 | لتحضير محلول ملحي، لتغيير الموصلية لأقسام cGUV |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378 | لتحضير محلول السكروز كوسيلة ترطيب لغرفة التشكيل الكهربائي |
| المعدات | |||
| شرائح Cavitly | Blue star | وضع معلق cGUV لملاحظة المجهر | |
| كاميرا CMOS pco.edge 4.2 | Excelitas | 61009524 | للصور أحادية اللون الفلورية وتصوير DIC |
| غطاء شريحة (22 x 60 ملم) | Blue star | لتغطية شرائح التجويفات | |
| غرفة توحيد الخلايا الكهربائية Eppendrof | Sigma-Aldrich | وضع معلق sGUV في الغرفة للملاحظة الأسموزية والمجهر، ويمكن استخدام أي غرفة بسيطة أخرى | |
| مولد الوظائف (مزدوج القنوات) | Tektronix | AFG3022C | مولد الوظائف المستخدم لتوصيل المجال الكهربائي المتردد إلى غرفة التشكيل الكهربائي |
| حاضنة | مخصص محلي | غرفة التشكيل الكهربائي موضوعة عند 40 درجة | |
| شرائح ITO | Sigma-Aldrich | 576352-10PAK | شرائح ITO المستخدمة في طريقة التشكيل الكهربائي |
| مجهر Nikon Eclipse المقلوب | Nikon | TE2000-U | لرؤية sGUV وcGUV |
| صفيحة سيليكون (3 ملم سمك) | Sigma-Aldrich | GF49463141 | لتوفير المسافة في غرفة التشكيل الكهربائي |
| محقنة (2 مل) | Becton Dickinson India Pvt Ltd. | 300844 | يستخدم في حقن وسيلة الترطيب وحصاد sGUV من غرفة التشكيل الكهربائي |
| إعداد المجهر confocal Zeiss | المنشأة المركزية لمعهد IIT بومباي |
المراجع
- Dimova, R. Chapter one - Giant vesicles: A biomimetic tool for membrane characterization. Advances in planar lipid bilayers and liposomes. Iglic, A. 16, 1-50 (2012).
- Maoyafikuddin, M., Thaokar, R. M. Effect of the waveform of the pulsed electric field on the cylind....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
