يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

تخليق الحويصلات أحادية الصفيحة العملاقة المركبة: نموذج محاكاة حيوية للخلايا النووية

1.3K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/68274

⸱

يوليو 3, 2025

 ,  , 
1Centre for Research in Nanotechnology & Science, Indian Institute of Technology Bombay, 2Department of Chemistry, Indian Institute of Technology Bombay, 3Department of Chemical Engineering, Indian Institute of Technology Bombay

في هذه المقالة

ملخص

تقدم هذه المقالة طريقة لتحضير الحويصلات العملاقة أحادية الصفيحة المركبة (cGUVs) بهيكل حويصلة في الحويصلة ، مع موصلية كهربائية مخصصة في المناطق الداخلية والحلقية والخارجية. يصنع التكوين الكهربائي GUVs البسيطة ، والتي تتحول إلى خلايا فعمية و cGUVs عبر الصدمة التناضحية ، مما يوفر نموذجا قيما لدراسة الفيزياء الحيوية للخلايا النواة.

الملخص

الحويصلة العملاقة الأحادية البسيطة (sGUV) عبارة عن حويصلة كروية بحجم ميكرون ، تتكون من طبقة ثنائية دهنية تحيط بمحلول مائي بالداخل ويتم تعليقها في وسط مائي آخر. كنماذج محاكاة حيوية للخلايا البيولوجية ، تعد المركبات المضافة الحيوية أنظمة راسخة للدراسات الفيزيائية الحيوية. ومع ذلك ، فإن sGUVs تحاكي الخلايا المنزولة في المقام الأول ، مما يحد من تطبيقها كنماذج للخلايا غير النواة. نقترح الحويصلات العملاقة أحادية الصفيحة المركبة (cGUVs) كنموذج محاكاة حيوي أكثر ملاءمة للخلايا ذات النواة. cGUVs عبارة عن هياكل حويصلة في حويصلة ، حيث يمكن افتراض أن الطبقات الثنائية الحويصلة الخارجية والداخلية تمثل الخلية والغشاء النووي للخلية ، على التوالي.

في هذه الدراسة ، نصف طريقة بسيطة لتخليق cGUVs. باختصار ، تم إنشاء sGUVs باستخدام التركيب الدهني ل DMPC والكوليسترول في حدود 37-43 mol٪ في وسط السكروز عبر طريقة التكوين الكهربائي. ثم تعرضت هذه المركبات الكهروضوئية المتعددة المركبات لصدمة تناضحية عن طريق إدخال محلول جلوكوز مفرط التوتر ، مما أدى إلى انتقال فوري إلى شكل الخلايا الجسدية. أدت هذه العملية إلى تكوين حالة وسيطة حيث ظلت الحويصلات الخارجية والداخلية متصلة من خلال الرقبة ، مما أدى في النهاية إلى تطوير بنية الحويصلة في الحويصلة ، والتي يشار إليها باسم cGUVs.

علاوة على ذلك ، من المعروف أن GUVs المحضرة بمستويات أعلى من الكوليسترول في الطبقة الثنائية تظهر نفاذية أيونية منخفضة. تسمح هذه الخاصية بضبط الموصلية في المحلول الحلقي ل cGUV عن طريق ضبط موصلية وسط الترطيب ، والمحلول الداخلي من خلال الجلوكوز مفرط التوتر ، والمحلول الخارجي عن طريق ضبط التخفيف أو إضافة الوسائط الموصلة ، مما يجعل cGUVs الناتجة ذات موصلية خاضعة للرقابة في المناطق الخارجية والحلقية والداخلية ، ذات صلة بالدراسات الميدانية الكهربائية. نقترح هذا النهج الفعال والمباشر لتصنيع الحويصلات المركبة التي يمكن استخدامها كنموذج محاكاة حيوي للخلايا حقيقية النواة ، مما يعزز تطبيقها في البحوث الفيزيائية الحيوية.

المقدمة

تم استخدام نماذج المحاكاة الحيوية على نطاق واسع لدراسة الظواهر الفيزيائية الحيوية المعقدة لأغشية الخلايا. توفر أبسط نماذج المحاكاة الحيوية هذه رؤى قيمة من خلال تقليل التداخل من المتغيرات التي لا تعد ولا تحصى الموجودة في الخلايا البيولوجية. الحويصلات الأحادية العملاقة (GUVs) هي نظام محاكاة حيوي أساسي يستخدم لدراسة الفيزياء الحيوية الغشائية1،2. تم تأسيس GUVs كنموذج تمثيلي لغشاء الخلية. وهي تتألف من طبقة ثنائية دهنية كروية واحدة بقطر 10-30 ميكرومتر ويتم تغليفها وتعليقها في محلول مائي. في هذه المقالة ، نطلق على هذه sGUVs. يتم إنشاء هذه الأنظمة باستخدام نهج تصاعدي ، حيث يتم تجميع المكونات الخلوية الأساسية - الدهون والبروتينات والمحفزات - لتقليد بنية ووظيفة الأغشية البيولوجية3،4.

على الرغم من أن sGUVs البسيطة ، مع وجود اللب المائي فقط بداخلها ، شائعة الاستخدام ، فقد تم تطوير نماذج أكثر تقدما لتكرار ميزات محددة للخلايا البيولوجية. على سبيل المثال ، تحاكي GUVs ذات الهياكل المدعومة بالأكتين الهيكل الخلوي5،6،7 ، بينما تستخدم البيئات عالية الملح لتقليد الظروف الفسيولوجية. تحاكي بيئات الملح الأعلى الظروف الفسيولوجية ولكن من الصعب الحصول عليها في GUVs لأن الطرق التقليدية ، مثل التكوين الكهربائي8،9 ، غالبا ما تكون غير مناسبة لتصنيع GUVs بحجم ميكرون في ظل هذه الظروف. الطرق الأحدث ، مثل الطريقة بمساعدة الهلام ، والتي تستخدم المواد الهلامية البوليمرية أو النشا للمساعدة في تورم الطبقة الثنائية أثناء الترطيب ، تعالج هذه القيود10،11. وبالمثل ، تمت دراسة التغيرات المورفولوجية ل sGUVs12. تؤثر إضافة الخيوط المغلقة والمفتوحة ، مثل الأكتين المغلف ، والأنابيب الدقيقة ، ومكونات الهيكل الخلوي الأخرى ، ذات الصلابة المتفاوتة ، وحالة الإجهاد التناضحي بداخلها على الانتقال المورفولوجي لهذه الحويصلات المفرغة من الهواء بشكل تناضحي ولكن شبه كروية في البداية. يكشف التحليل النظري عن تحولات مورفولوجية متنوعة ، بما في ذلك الهياكل الأنبوبية والكروية والشبيهة بالمضرب والكرز والقطرات ، بما يتماشى بشكل جيد مع الملاحظات التجريبية12. هذه النتائج لها آثار مهمة على فهم تنظيم الخيوط والأنابيب الدقيقة والحلقات النانوية داخل الخلايا والحويصلات. تستعرض دراسات أخرى طرق تغليف البروتين وتستكشف كيف تنظم الأكتين المغلف والأنابيب الدقيقة ومكونات الهيكل الخلوي شكل الحويصلات ذات المفرغ من الهواء التناضحي12،13.

علاوة على ذلك ، مستوحاة من بنية الخلايا حقيقية النواة ، تم تطوير نماذج معقدة قائمة على GUV نحو تطوير نماذج اصطناعية تشبه الانشطار وانقسام الخلايا ، والتكاثر والميزات متعددة الأجزاء للخلايا حقيقية النواة ، والخلايا ذاتية التكاثر14،15،16،17 ، والخلايا متعددة الأقسام. بالإضافة إلى التطبيق الهيكلي ، فإن GUVs هي أيضا النماذج المختارة لفهم التثقيب الكهربائي للخلية - وهي عملية يؤدي فيها المجال الكهربائي المطبق إلى تكوين المسام في الغشاء الدهني بسبب إجهاد ماكسويل. تظهر GUVs ، ذات الأبعاد المماثلة للخلايا البيولوجية ، تشوه كهربائيا وتثقيبا كهربائيا تحت المجالات الكهربائية. توفر مثل هذه الدراسات على GUVs نظرة ثاقبة للخصائص الكهروميكانيكية مثل سعة الغشاء وصلابة الانحناء18 وآليات التثقيب الكهربائي2،19،20. ومع ذلك ، من الناحية العملية ، فإن هذه الدراسات هي أفضل تمثيل للخلايا المنواة ، مثل خلايا الدم الحمراء (RBCs).

لسد هذه الفجوة ، نقترح مركب الحويصلات الأحادية الصفيحية العملاقة (cGUVs) كنموذج محاكاة حيوي جديد للخلايا حقيقية النواة21،22. تمتلك هذه الحويصلات بنية حويصلة في الحويصلة ، حيث تحاكي الطبقة الثنائية الداخلية الغشاء النووي ، وتمثل الطبقة الثنائية الخارجية غشاء البلازما. علاوة على ذلك ، نوضح كيف يمكن تعديل التوصيل الكهربائي للمناطق الداخلية والحلقية والخارجية دون الحاجة إلى أجهزة متقدمة ، مثل المعالجات الدقيقة أو المحاقن الدقيقة. يوفر هذا النهج المبسط لتصنيع cGUVs منصة واعدة لتطوير البحوث الفيزيائية الحيوية على الخلايا النواة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. تحضير محاليل خليط الدهون

  1. تحضير محلول 1 مل من DMPC والكوليسترول بنسبة مولارية 63:37 بتركيز نهائي 5 مجم / مل. لهذا الغرض ، أضف 149 ميكرولتر من DMPC (25 مجم / مل من المخزون كما تم استلامه مذاب في الكلوروفورم) ، و 252 ميكرولتر من الكوليسترول (5 مجم / مل من الكوليسترول المذاب في الكلوروفورم) ، و 599 ميكرولتر من الكلوروفورم.
  2. تحضير محلول آخر 1 مل من DMPC: الكوليسترول بنسبة 57:43 مولارية عند 5 مجم / مل ، واخلط 139.8 ميكرولتر من DMPC (25 مجم / مل من المخزون كما تم استلامه مذاب في الكلوروفورم) ، و 301 ميكرولتر من الكوليسترول (5 مجم / مل ، محضر من مسحوق مذاب في الكلوروفورم) ، و 559.2 ميكرولتر من الكلوروفورم.
  3. لتلطيخ الطبقة الدهنية الثنائية ، أضف 100 ميكرولتر من النيل الأحمر (من محلول مخزون 5 ملم) إلى 1 مل من خليط الدهون الذي يحتوي على DMPC والكوليسترول بنسبة 63:37 مولارية (موصوفة في الخطوتين 1.1 و 1.2). بدلا من ذلك ، أضف 30 ميكرولتر من Liss Rhod-PE (1 مجم / مل من مخزون Liss Rhod-PE) إلى 1 مل من خليط الدهون المحضر (الموصوف في الخطوتين 1.1 و 1.2).
    ملاحظة: نظرا لأن المذيب (الكلوروفورم) شديد التقلب ، فبعد الفتح المتكرر للقارورة لاستخدام محلول المخزون (25 مجم / مل من DMPC) ، فقد يتركز ، مما قد يغير التركيبة.

2. بروتوكول التكوين الكهربائي لتصنيع الحويصلات الأحادية العملاقة البسيطة (sGUVs)

  1. نظف الشرائح المطلية بأكسيد القصدير الإنديوم (ITO) جيدا بمحلول صابون الأطباق واشطفها بالماء منزوع الأيونات (0.055 ميكرو ثانية / سم). نظف الشرائح بمحلول الإيثانول بنسبة 100٪ ، واشطفها بالماء منزوع الأيونات ، وجففها في فرن على حرارة 85 درجة مئوية.
  2. حدد الجانب الموصل للشرائح المطلية ب ITO باستخدام مقياس المثابك. قم بتأمين الشريحة المطلية ب ITO النظيفة على مرحلة المغطي الدوار باستخدام مكنسة كهربائية بحيث يكون الجانب الموصل متجها لأعلى.
  3. ضع 25 ميكرولتر من المحاليل الدهنية (المحضرة في الخطوة 1.1) عن طريق صب أربع قطرات من المحلول على الجانب الموصل من شريحة ITO. بعد ذلك ، خذ شريحة ITO أخرى وقم بتطبيق 25 ميكرولتر من المحاليل الدهنية (المحضرة في الخطوة 1.2) عن طريق صب أربع قطرات من المحلول على الجانب الموصل من شريحة ITO.
  4. جفف كل من الشرائح المطلية بالدهون بالمكنسة الكهربائية في مجفف يتم الاحتفاظ به في الظلام لمدة ساعتين على الأقل.
    ملاحظة: الحماية من الضوء تحمي الدهون من التغيرات الكيميائية المحتملة.
  5. رتب شريحة ITO مطلية بالدهون (مطلية بالدهون المحضرة في الخطوة 1.1) بالتوازي مع شرائح ITO النظيفة الأخرى ، بحيث يكون الجانب الموصل مواجها لبعضها البعض ، مع وجود فاصل مطاط سيليكون بسمك 3 مم بينهما. أغلق المجموعة بمشبك لإنشاء غرفة تشكيل كهربائي آمنة.
  6. اتبع نفس الإجراء الموضح في الخطوة 2.5 للشريحة المطلية ب ITO مع محلول دهني معد في الخطوة 1.2 لتشكيل غرفة التكوين الكهربائي.
  7. ضع كلتا الحجرتين في حاضنة محفوظة عند 38-40 درجة مئوية واملأ الغرفة ب 100 ملي مولار من محلول السكروز بمساعدة حقنة سعة 2 مل. قم بتطبيق مجال كهربائي للتيار المتردد بمقدار 5 Vpp بتردد 10 هرتز باستخدام مولد دالة ثنائي القناة لمدة 4 ساعات.
    ملاحظة: تأكد من تثبيت الجانب الموصل لشريحة ITO بشكل صحيح على مشابك التمساح التي تتصل بمولد الوظائف.
  8. افصل غرفة التكوين الكهربائي عن مولد الوظيفة. أخرج الحجرة من الحاضنة واتركها لتبرد حتى تصل إلى درجة حرارة الغرفة. احصد المركبات المضافة المركبة من كلتا الغرفتين باستخدام حقنة وانقلها إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 2 مل واحتضانها في درجة حرارة الغرفة (25-27 درجة مئوية) لمدة ساعة واحدة قبل تعريضها لصدمة تناضحية.

3. انتقال الشكل في الصدمة التناضحية (sGUV إلى الخلايا الصبغية إلى cGUV)

  1. نقل 200 ميكرولتر من المركبات الشهيرة المضادة للمركبات المعلقة في وسائط مرطبة تحتوي على محلول سكروز 100 ملي مولار إلى غرفة المراقبة.
  2. أدخل 125 ميكرولتر من محلول الجلوكوز (300 مللي مولار) إلى معلق sGUV هذا الذي يحتوي على 200 ميكرولتر من 100 ملي مولار من السكروز داخل غرفة المراقبة للحث على صدمة تناضحية تبدأ في انتقال شكل sGUVs.
    ملاحظة: اتبع نفس الإجراء (الوارد في الخطوة 3) لتخليق sGUV من تركيبة الدهون الواردة في الخطوتين 1.1 و 1.2 لانتقال الشكل المدفوع بالصدمات التناضحية.
  3. اسمح للمركبات المضافة الطويلة بالصدمات التناضحية بالراحة لمدة ساعة واحدة في غرفة المراقبة الموضوعة في مرحلة الفحص المجهري.
  4. لإجراء ومراقبة انتقال شكل sGUVS ، ضع غرفة المراقبة (غرفة الصهر الكهربائي ، أو طبق بتري ، أو شريحة تقعر ، أو أي غرفة أخرى يمكن استخدامها لمراقبة الفحص المجهري) على مسرح المجهر المقلوب والسماح للحويصلات بالاستقرار.
  5. راقب تحولات الشكل التي تحدث داخل الغرفة. استخدم التباين التفاضلي (DIC) والفحص المجهري الفلوري مع الفلور الخطي ، ELWD 20x / 0.45 ، وخطة الفلور ، عدسة أهداف ELWD 40x / 0.60 لمراقبة انتقالات الشكل لمركبات الأشعة فوق البنفساطية.
  6. لاحظ تكوين حويصلات الفطرة أثناء الانتقال. راقب الغرفة بمرور الوقت حيث تستقر الحويصلات الأكبر في القاع ، متبوعة بعدد متزايد من الحويصلات الأصغر.

4. تعديل الموصلية في المناطق الداخلية والحلقية والخارجية من cGUVs

  1. اضبط موصلية المحاليل في مناطق مختلفة من cGUVs (الداخلية والحلقية والخارجية) عن طريق إضافة كميات مناسبة (ميكرولتر) من محلول ملح مخزون 7.5 ملي مولار قبل إعطاء صدمة تناضحية للمركبات الكهروضوئية.
    1. على سبيل المثال ، لإنشاء موصلية أعلى في المناطق الخارجية والداخلية مقارنة بالمنطقة الحلقية ، انقل 200 ميكرولتر من محلول السكروز إلى غرفة الصهر الكهربائي. أضف 20 ميكرولتر من محلول ملح 7.5 ملي مولار إلى الغرفة. إحداث صدمة تناضحية عن طريق إضافة 125 ميكرولتر من محلول الجلوكوز 300 ملليمتر.
    2. اسمح لمركبات sGUV المصابة بالصدمة التناضحية بالراحة لمدة 3-4 ساعات. في هذه الحالة ، يتم الحصول على cGUVs بموصلية أعلى في المناطق الخارجية والداخلية مقارنة بالمنطقة الحلقية في النهاية.
  2. قم بإجراء التشوه الكهربائي ل cGUVs عن طريق تطبيق جهد كهربائي للتيار المتردد يبلغ 7.5 Vpp عند 100 كيلو هرتز باستخدام مولد وظيفي في غرفة الصهر الكهربائي التي تحتوي على أقطاب كهربائية سلكية متباعدة 500 ميكرومتر.
  3. بعد تطبيق مجال كهربائي للتيار المتردد ، التقط الفيديو بمعدل 10 إطارات / ثانية ولاحظ تشوه الشكل المفلطح للحويصلات الخارجية وتشوه الشكل البرولاتي للحويصلات الداخلية ، مما يؤكد الموصلية العالية في المناطق الخارجية والداخلية مقارنة بالمنطقة الحلقية في مجالات cGUV.

5. التحليل المجهري ل cGUVs

  1. التصوير المجهر المقلوب: قم بإجراء تباين التداخل التفاضلي (DIC) والفحص المجهري الفائفلوري باستخدام مجهر مقلوب ومقترن بكاميرا أحادية اللون. استخدم DIC والفحص المجهري الفلوري مع الفلور Plan و ELWD 20x / 0.45 و Plan fluor ، العدسات الموضوعية ELWD 40x / 0.60 لمراقبة انتقالات الشكل ل sGUVs. استخدم مرشحا أخضر (EX 510-560 ، DM 575 ، BA 590) لطبقة ثنائية البقع الحمراء النيلية لدراسة التألق.
    ملاحظة: توفر صور DIC رؤى قيمة حول حالة الرقبة المتصلة ، مما يؤكد ما إذا كانت تظل سليمة أو تخضع للاندماج لتشكيل cGUVs.
  2. استخدم برنامج ImageJ لإدراج شريط مقياس واقتصاص صور الفحص المجهري. لإضافة شريط قياس، انتقل إلى تحليل | اضبط المقياس لمعايرة الصورة، ثم انتقل إلى تحليل | أدوات | شريط المقياس لإدخال شريط المقياس.
  3. الفحص المجهري متحد البؤر للمورفولوجيا: للحصول على فهم أوضح لتشكل cGUV ، يتم استخدام مجهر متحد البؤر للمسح الضوئي بالليزر لمسح المحور z بحجم خطوة 1 ميكرومتر. التصوير باستخدام المجهر متحد البؤر: استخدم مجهر متحد البؤر للمسح بالليزر مع عدسة موضوعية Plan-Apochromat 40x / 1.3 زيت DIC لتصوير cGUVs. صورة cGUVs ملطخة باللون الأحمر النيلي أو الرودامين PE باستخدام وضع أحادي القناة الأحمر ، بطول موجي للإثارة يبلغ 561 نانومتر ونطاق انبعاث يتراوح بين 561 و 695 نانومتر.
  4. لتعديل واستخراج ملف .czi للصورة في البرنامج المرتبط بالمجهر ، قم بإدراج رسومات مثل شريط المقياس وتمكين عرض 2D و 3D ، ثم انتقل إلى المعالجة | طريقة | المعلمات وانقر فوق تطبيق للحصول على صورة بتنسيق JPG.
  5. التحضير للفحص المجهري متحد البؤر: املأ محلولا مائيا يحتوي على cGUVs في غرفة مخصصة معدلة (تم استبدال الزجاج السفلي بزجاج Coverslip) للتصوير متحد البؤر. اترك العينة دون إزعاج لمدة 10-15 دقيقة للسماح ل cGUVs بالاستقرار في التصوير متحد البؤر ؛ قم بتحميل خليط cGUVs في شريحة التجويف وأغلقها بغطاء لإيقاف حركات cGUVs. بعد ذلك ، قم بتحليل cGUVs من خلال الفحص المجهري متحد البؤر والمسح الضوئي z بفواصل زمنية 1 ميكرومتر.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

تم تصنيع sGUVs باستخدام طريقة التكوين الكهربائي (كما هو موضح في الشكل 1) وحصادها من الغرفة باستخدام حقنة. تم تصور المركبات الكهربية المضافة المحصودة في البداية تحت المجهر المقلوب وتعرضت لصدمة تناضحية للحث على تحولها إلى شكل خلية فمية. بعد مزيد من إعادة تشكيل الغشاء ، يتم تحويل هذه الخلايا الفعمية إلى بنية حويصلة في حويصلة تسمى مركب الحويصلة العملاقة أحادية الصفيحة (cGUV) (الشكل 1). تم تحليل cGUVs بشكل أكبر باستخدام الفحص المجهري...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

تحدد تركيبة وأنواع الدهون إلى حد كبير الخواص الميكانيكية للطبقة الثنائية التي تشكل GUV. تظهر طبقة ثنائية مكونة من DMPC / Chol تحولات فريدة في الشكل عند تعرضها لصدمة تناضحية. تحت صدمة تناضحية شديدة التوتر ، يتم طرد السائل المائي داخل sGUV ، مما يؤدي إلى تشوه طبقة GUV الثنائية. تتأثر انتقالات الشكل المرصودة بشكل أساسي بالتدفق الخارجي للمياه وصلابة انحناء الطبقة الثنائية. تظهر هذه التشوهات بأشكال مختلفة ، بما في ذلك أشكال نجم البحر والدمبل ، اعتمادا على قوة الصدمة التناضحية والتكوين الدهني ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإعلان عنه.

شكر وتقدير

يشكر روبيش كومار وزارة تنمية الموارد البشرية (MHRD) ، حكومة الهند ، على زمالة PMRF ومنحة الطوارئ. نحن نقدر بامتنان مجهر المسح الضوئي بالليزر متحد البؤر للمنشأة المركزية ، IRCC ، IIT Bombay.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
Cholesterol (Sigma grade, 99%)Avanti Polar Lipids, Inc.C8667لتركيب sGUV
CholoroformMerck Life Science Pvt. Ltd.DA2P711602يستخدم كمذيب لتحضير محلول الدهون
DMPCAvanti Polar Lipids, Inc.850345Cلتركيب sGUV
EthanolHaymanF204325لتنظيف شرائح ITO
FITC-DEXTRAN (4 Kda-MW)Sigma-Aldrich466994للتغليف داخل الحويصلات الداخلية لـ cGUV
GlucoseSigma-AldrichG-7021لتحضير محلول الجلوكوز، المستخدم في الصدمة الأسموزية لـ sGUV المعلقة في محلول السكروز
Liss Rhod PESigma-Aldrich810150C-1MGلتلطيخ جزيئات الدهون
Nile redSigma-Aldrich72485لتلطيخ أغشية cGUV وsGUV
Sodium chloride (NaCl)Sigma-Aldrich1936060521لتحضير محلول ملحي، لتغيير الموصلية  لأقسام cGUV
SucroseSigma-AldrichS9378لتحضير محلول السكروز كوسيلة ترطيب لغرفة التشكيل الكهربائي
المعدات
شرائح CavitlyBlue starوضع معلق cGUV لملاحظة المجهر
كاميرا CMOS pco.edge 4.2Excelitas61009524للصور أحادية اللون الفلورية وتصوير DIC
غطاء شريحة (22 x 60 ملم)Blue starلتغطية شرائح التجويفات
غرفة توحيد الخلايا الكهربائية EppendrofSigma-Aldrichوضع معلق sGUV في الغرفة للملاحظة الأسموزية والمجهر، ويمكن استخدام أي غرفة بسيطة أخرى
مولد الوظائف (مزدوج القنوات)TektronixAFG3022Cمولد الوظائف المستخدم لتوصيل المجال الكهربائي المتردد إلى غرفة التشكيل الكهربائي 
حاضنةمخصص محليغرفة التشكيل الكهربائي موضوعة عند 40 درجة
شرائح ITOSigma-Aldrich576352-10PAKشرائح ITO المستخدمة في طريقة التشكيل الكهربائي
مجهر Nikon Eclipse المقلوبNikonTE2000-Uلرؤية sGUV وcGUV
صفيحة سيليكون (3 ملم  سمك)Sigma-AldrichGF49463141لتوفير المسافة في غرفة التشكيل الكهربائي
محقنة (2 مل)Becton Dickinson India Pvt Ltd.300844يستخدم في حقن وسيلة الترطيب وحصاد sGUV من غرفة التشكيل الكهربائي
إعداد المجهر confocal Zeissالمنشأة المركزية لمعهد IIT بومباي

المراجع

  1. Dimova, R. Chapter one - Giant vesicles: A biomimetic tool for membrane characterization. Advances in planar lipid bilayers and liposomes. Iglic, A. 16, 1-50 (2012).
  2. Maoyafikuddin, M., Thaokar, R. M. Effect of the waveform of the pulsed electric field on the cylindrical deformation of uncharged giant unilamellar vesicles. Langmuir. 39 (28), 9660-9670 (2023).
  3. Nair, K. S., Bajaj, H. Advances in giant unilamellar vesicle preparation techniques and applications. Adv Colloid Interface Sci. 318, 102935(2023).
  4. Göpfrich, K., et al. One-pot assembly of complex giant unilamellar vesicle-based synthetic cells. ACS Synth Biol. 8 (5), 937-947 (2019).
  5. Chen, S., Sun, Z. G., Murrell, M. P. In vitro reconstitution of the actin cytoskeleton inside giant unilamellar vesicles. J Vis Exp. (186), e64026(2022).
  6. Merkle, D., Kahya, N., Schwille, P. Reconstitution and anchoring of cytoskeleton inside giant unilamellar vesicles. ChemBioChem. 9 (16), 2673-2681 (2008).
  7. Fink, A., et al. Extracellular cues govern shape and cytoskeletal organization in giant unilamellar lipid vesicles. ACS Synth Biol. 12 (2), 369-374 (2023).
  8. Angelova, M. I., Dimitrov, D. S. Liposome electroformation. Faraday Discuss Chem Soc. 81, 303-311 (1986).
  9. Angelova, M. I., Soléau, S., Meleard, P., Faucon, F., Bothorel, P. Preparation of giant vesicles by external AC electric fields. Kinetics and applications. Trends in Colloid and Interface Science VI. Progress in Colloid & Polymer Science. Helm, C., Loesche, M., Moehwald, H. 89, 127-131 (1992).
  10. Weinberger, A., et al. Gel-assisted formation of giant unilamellar vesicles. Biophys J. 105 (1), 154-164 (2013).
  11. Maoyafikuddin, M., Pundir, M., Thaokar, R. Starch aided synthesis of giant unilamellar vesicles. Chem Phys Lipids. 226, 104834(2020).
  12. Shi, C., et al. Morphological transformations of vesicles with confined flexible filaments. Proc Natl Acad Sci USA. 120 (18), e2300380120(2023).
  13. Litschel, T., Schwille, P. Protein reconstitution inside giant unilamellar vesicles. Annu Rev Biophys. 50, 525-548 (2021).
  14. Kurihara, K., et al. Self-reproduction of supramolecular giant vesicles combined with the amplification of encapsulated DNA. Nat Chem. 3 (10), 775-781 (2011).
  15. Zong, W., et al. A fissionable artificial eukaryote-like cell model. J Am Chem Soc. 139 (29), 9955-9960 (2017).
  16. Zong, W., Li, Q., Zhang, X., Han, X. Deformation of giant unilamellar vesicles under osmotic stress. Colloids Surf B: Biointerfaces. 172, 459-463 (2018).
  17. Shin, J., Jang, Y. Multicompartment synthetic vesicles for artificial cell applications. ACS Appl Eng Mater. 2 (12), 2758-2770 (2024).
  18. Riske, K. A., Dimova, R. Electro-deformation and poration of giant vesicles viewed with high temporal resolution. Biophys J. 88 (2), 1143-1155 (2005).
  19. Maoyafikuddin, M., Kulkarni, S. V., Thaokar, R. M. Synthesis method and high salt concentration can affect electrodeformation of GUVs under strong pulsed DC fields. ACS Omega. 10 (7), 6427-6436 (2025).
  20. Behera, N., Thaokar, R. M. Numerical modeling of giant pore formation in vesicles under msPEF-induced electroporation: Role of charging time and waveform. Bioelectrochemistry. 164, 108926(2025).
  21. Kumar, R., Chakrabarti, R., Thaokar, R. M. Compound giant unilamellar vesicles as a bio-mimetic model for electrohydrodynamics of a nucleate cell. Soft Matter. 20 (35), 6995-7011 (2024).
  22. Sinha, K. P., Thaokar, R. M. Electrohydrodynamics of a compound vesicle under an AC electric field. Journal of Physics. 29 (27), 275101(2017).
  23. Méléard, P., et al. Bending elasticities of model membranes: Influences of temperature and sterol content. Biophys J. 72 (6), 2616-2629 (1997).
  24. Dimova, R. Recent developments in the field of bending rigidity measurements on membranes. Adv Colloid Interface Sci. 208, 225-234 (2014).
  25. Needham, D., McIntosh, T. J., Evans, E. Thermomechanical and transition properties of dimyristoylphosphatidylcholine/cholesterol bilayers. Biochemistry. 27 (13), 4668-4673 (1988).
  26. Almeida, P. F. F., Vaz, W. L. C., Thompson, T. E. Lateral diffusion in the liquid phases of dimyristoylphosphatidylcholine/cholesterol lipid bilayers: a free volume analysis. Biochemistry. 31 (29), 6739-6747 (1992).
  27. de Meyer, F., Smit, B. Effect of cholesterol on the structure of a phospholipid bilayer. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (10), 3654-3658 (2009).
  28. Kraske, W. V., Mountcastle, D. B. Effects of cholesterol and temperature on the permeability of dimyristoylphosphatidylcholine bilayers near the chain melting phase transition. Biochim Biophys Acta. 1514 (2), 159-164 (2001).
  29. Corvera, E., Mouritsen, O. G., Singer, M. A., Zuckermann, M. J. The permeability and the effect of acyl-chain length for phospholipid bilayers containing cholesterol: theory and experiment. Biochim Biophys Acta. 1107 (2), 261-270 (1992).
  30. Kamiya, K., Osaki, T., Takeuchi, S. Formation of vesicles-in-a-vesicle with asymmetric lipid components using a pulsed-jet flow method. RSC Advances. 9 (52), 30071-30075 (2019).
  31. Doğan Güzel, F., Kaur, J., Zendeh, Z. Cheap portable electroformed giant unilamellar vesicles preparation kit. J Liposome Res. 33 (2), 183-188 (2023).
  32. Kaur, J., et al. On-chip label-free impedance-based detection of antibiotic permeation. IET Nanobiotechnol. 15 (1), 100-106 (2021).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

تخليق الحويصلات أحادية الصفيحة العملاقة المركبة: نموذج محاكاة حيوية للخلايا النووية
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.