تطوير مادة تبريد جديدة منخفضة DMSO للحفاظ على الخلايا الجذعية للدم المحيطي

Zhi Guo; Ming-Xin He; Yi-Huizhi Zhang; Qiang Jiang; Qiang Wang

doi:10.3791/68275

مقالة منهجية

تطوير مادة تبريد جديدة منخفضة DMSO للحفاظ على الخلايا الجذعية للدم المحيطي

DOI:

10.3791/68275

⸱

يونيو 20, 2025

Zhi Guo^*¹^,²^,³ , Ming-Xin He^*¹ , Yi-Huizhi Zhang^*⁴ , Qiang Jiang⁵ , Qiang Wang²

¹Department of Hematology, Affiliated Nanshan Hospital of Shenzhen University, ²Institute of Infection, Immunology and Tumor Microenvironment, Hubei Province Key Laboratory of Occupational Hazard Identification and Control, School of Medicine, Wuhan University of Science and Technology, ³Department of Hematology & Oncology, National Cancer Center/National Clinical Research Center for Cancer/Cancer Hospital & Shenzhen Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, ⁴School of Medicine, South University of Science and Technology, ⁵Nanjing SSCELL Biotechnology Co., Ltd.

^* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يستخدم البروتوكول مادة كريهة للخلايا الجذعية المكونة للدم تحتوي على تركيز منخفض جدا من ثنائي ميثيل سلفوكسيد ويوضح سلامته السريرية وفعاليته في حماية الخلايا الجذعية المكونة للدم ، مما يوفر استراتيجية جديدة لحفظ الخلايا الجذعية المكونة للدم بالتبريد في زرع الخلايا الجذعية الذاتية السريرية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعد حفظ الخلايا الجذعية المكونة للدم المحيطي (PBHSC) أمرا بالغ الأهمية لزرع الخلايا الجذعية الذاتية (ASCT) ، لكن عوامل الحماية بالتبريد التقليدية (TCPAs) التي تحتوي على 10٪ ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) تثير مخاوف تتعلق بالسلامة بسبب مخاطر السمية. تهدف هذه الدراسة إلى التحقق من صحة عامل الحماية بالتبريد منخفض DMSO الجديد (CPA ، 2٪ DMSO) للحفاظ على PBHSC عند -80 درجة مئوية ، مما يلغي الحاجة إلى تخزين النيتروجين السائل. تم تقسيم PBHSCs من ستة مانحين إلى مجموعات CPA و TCPA. تم خلط CPA مع PBHSCs (1: 1 حجم / حجم) وتخزينه مباشرة عند -80 درجة مئوية. بعد شهر واحد ، تم إذابة كلتا المجموعتين في حمام مائي 37 درجة مئوية. تمت مقارنة بقاء الخلية ، وسلامة الهيكل الخلوي (الخيوط الدقيقة / الأنابيب الدقيقة) ، ونشاط الميتوكوندريا ، والقدرة على تكوين المستعمرة. بعد الذوبان ، كان بقاء PBHSC قابلا للمقارنة بين CPA (91.29٪) و TCPA (90.07٪). ومع ذلك ، تفوقت CPA على TCPA في فحوصات بقاء الخلية (CPA: 89.38٪ مقابل TCPA: 79.55٪ ؛ ص < 0.05). كشف تحليل الهيكل الخلوي عن خيوط دقيقة سليمة وأنابيب دقيقة في الخلايا المحفوظة ب CPA ، مع وضوح هيكلي يتجاوز TCPA. يعكس نشاط الميتوكوندريا في الخلايا المعالجة ب CPA PBHSCs الطازجة ، حيث أظهر نشاطا أعلى بنسبة 8.5٪ من TCPA (ص < 0.05) وزيادة الأعداد المعقدة للميتوكوندريا. أكدت فحوصات تشكيل المستعمرات تفوق CPA ، مع ارتفاع عدد المستعمرات بعد الاستقراء. تتيح تكلفة الاكتساب الآمنة والمريحة حفظ التبريد PBHSC عند -80 درجة مئوية باستخدام DMSO منخفض للغاية (2٪) ، مما يلغي الاعتماد على النيتروجين السائل. تشير قابليتها المحسنة للحياة الخلوية والحفاظ على الميتوكوندريا إلى مزايا سريرية من خلال تقليل مخاطر سمية التسريب. يقدم هذا البروتوكول استراتيجية تحويلية ل ASCT ، وتحسين السلامة والكفاءة التشغيلية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعد زراعة الخلايا الجذعية المكونة للدم (ASCT) خيارا علاجيا راسخا للعديد من الأورام الخبيثة الدموية ، بما في ذلك سرطان الدم وسرطان الغدد الليمفاوية والورم النخاعي المتعدد ، حيث يعمل كعلاج من الخط الأول أو الثاني لإعادة تكوين تكوين الدم واستعادة الكفاءة المناعية بعد العلاج الكيميائي المكثف أو العلاج الإشعاعي¹^،²^،³^،⁴^،⁵^،⁶^،⁷. تعتمد نتائج ASCT الناجحة بشكل حاسم على جدوى الخلايا الجذعية المكونة للدم المحيطية المحفوظة بالترد (PBHSCs) ، والتي يجب أن تحتفظ بالقدرة الوظيفية لإعادة تكوين الدم والمناعة⁸^،⁹^،¹⁰^،¹¹^،¹². يعد تخزين الخلايا الجذعية المكونة للدم خطوة حاسمة في ASCT لأنه بعد حصاد الخلايا الجذعية المكونة للدم الذاتي ، يخضع المرضى عادة للإشعاع والعلاج الكيميائي والعلاجات الأخرى للقضاء على الخلايا السرطانية. ترتبط جودة تخزين الخلايا الجذعية المكونة للدم ارتباطا مباشرا بنجاح أو فشل إعادة تكوين الدم والمناعة¹³^،¹⁴^،¹⁵^،¹⁶^،¹⁷^،¹⁸. لضمان صلاحية الخلايا الجذعية المكونة للدم بعد الحفظ بالتبريد ، غالبا ما تتضمن الممارسات السريرية إضافة ألبومين الدم البشري وثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) كCPA. هذه العوامل ضرورية للحفاظ على نشاط الخلية أثناء وبعد عملية الحفظ بالتبريد. عادة ما يتراوح تركيز DMSO المستخدم من 5٪ إلى 10٪ (v / v). أشارت الدراسات إلى أن الحفاظ على تركيز DMSO من 3.5٪ إلى 10٪ على الأقل (حجم / حجم) يمكن أن يعزز فعالية الحفظ بالتبريد للخلايا الجذعية المكونة للدم¹⁹^،²⁰. ومع ذلك ، لا يزال التطبيق السريري ل DMSO يمثل مشكلة بسبب السمية المعتمدة على الجرعة ، حيث أبلغ 30٪ -60٪ من متلقي الزرع عن آثار ضارة مثل الغثيان والقيء وانخفاض ضغط الدم²¹^،²². لمعالجة قيود عوامل الحماية من التبريد التقليدية (CPAs) التي تحتوي على 5٪ -10٪ من ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) ، تهدف هذه الدراسة إلى تطوير CPA جديد يتيح الحفظ بالتبريد الآمن والفعال PBHSC عند -80 درجة مئوية باستخدام تركيزات DMSO منخفضة جدا (2٪ حجم / حجم) ، وبالتالي القضاء على الحاجة إلى بروتوكولات النيتروجين السائل المعقدة مع التخفيف من السمية المرتبطة ب DMSO.

تظهر البدائل الناشئة ، مثل CPAs القائمة على التريهالوز أو المحسنة بالبوليمر ، وعدا قبل السريري ولكنها تواجه حواجز في الترجمة السريرية بسبب العقبات التنظيمية أو عدم التوافق مع بروتوكولات الذوبان القياسية²³. في المقابل ، يعتمد CPA الخاص بنا على ملف تعريف السلامة الراسخ لأنظمة HSA-DMSO مع تقديم نسب مضافة محسنة تعزز الحماية الخلوية. هذه الطريقة مناسبة بشكل خاص للمراكز السريرية التي تفتقر إلى البنية التحتية للنيتروجين السائل أو تتطلب تدفقات عمل سريعة. ومع ذلك ، بالنسبة للتخزين طويل الأجل (>2 سنة) ، يظل النيتروجين السائل مفضلا²⁴. يجب على الأطباء الموازنة بين بساطة البروتوكول وتحمل المريض الفردي ل DMSO ، مما يضمن التطبيق المخصص لهذه الاستراتيجية لتحقيق أقصى قدر من السلامة والكفاءة التشغيلية في زرع الخلايا الجذعية المكونة للدم.

في هذه الدراسة ، يمثل استخدام المواد الواقية من الدهون بالتبريد ذات المحتوى المنخفض من DMSO استراتيجية حاسمة للحفاظ في نفس الوقت على فعالية حفظ الخلايا الجذعية المكونة للدم بالتبريد مع تقليل السمية المرتبطة بها. تم تقييم فعالية وسلامة وراحة CPA للخلايا الجذعية المكونة للدم المطورة حديثا للحفاظ على الخلايا الجذعية المكونة للدم في الدم المحيطي (PBHSCs). تم تنفيذ طريقة تجميد بسيطة ومباشرة باستخدام CPA الجديد ، وتجنب بروتوكولات الحفظ بالتبريد التقليدية. توضح النتائج أن الحفظ بالتبريد بخطوة واحدة لمعلقات الخلايا عند -80 درجة مئوية باستخدام DMSO CPA منخفض التركيز يحقق تأثيرات حفظ فائقة مقارنة ب CPA التقليدي (TCPA). قد يقدم هذا النهج استراتيجيات جديدة لتبسيط العملية السريرية لزرع الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCT).

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تجنيد مرضى الأورام الدموية الذين يخضعون ل ASCT من يونيو 2020 إلى يونيو 2022 في قسم أمراض الدم بمستشفى شنتشن للسرطان. تم أخذ عينات من خلايا الدم قبل وبعد تعبئة الزرع ل HSCT ، بما في ذلك حالتان من سرطان الدم النخاعي الحاد (AML) ، وحالتان من سرطان الغدد الليمفاوية هودجكين (HL) ، وحالة واحدة من سرطان الغدد الليمفاوية الجلدية الحقيقية (CGHL) ، وحالة واحدة من سرطان الغدد الليمفاوية للخلايا البائية المنصف الأولي (PMBL) ، بمتوسط عمر 53 عاما ونطاق يتراوح من 35 إلى 61 عاما. تلقت الدراسة موافقة مستنيرة من المرضى وموافقة لجنة مراجعة الأخلاقيات في مستشفى شنتشن للسرطان ، مع رقم وثيقة الموافقة الأخلاقية AF-SC-07-2.0. تمت الموافقة على جميع الإجراءات التجريبية للحيوانات من قبل لجنة أخلاقيات التجريبي ، مستشفى السرطان ، الأكاديمية الصينية للعلوم الطبية (رقم الموافقة. NCC2018A073) وامتثلت للمبادئ التوجيهية الدولية للبحوث الحيوانية.

1. التغليف الفرعي والحفظ بالتبريد لعينات الخلايا الجذعية المكونة للدم

تحضير محطة عمل معقمة
1. اغسل يديك جيدا وارتد أقنعة وقفازات معقمة. تطهير اليدين والمعصمين والمرفقين باستخدام 75٪ إيثانول.
2. تعقيم جميع الأدوات الاحتياطية (الماصات ، المرقئ) باستخدام الأوتوكلاف أو الأشعة فوق البنفسجية. رتب المواد التالية على خزانة السلامة الحيوية: 1 مل أطراف ماصة معقمة خالية من البيروجين (صندوقان)، ماصة 1000 ميكرولتر، أنابيب حفظ بالتبريد معقمة سعة 1.8 مل، أنابيب طرد مركزي سعة 50 مل، وصندوق تخزين أنبوب الحفظ بالتبريد (صندوق تجميد قابل للبرمجة).
وضع العلامات وخلط الخلية CPA
1. قم بتسمية أنابيب الحفظ بالتبريد بمعرف العينة والتاريخ وعدد الخلايا واسم المانح.
2. قم بتوصيل كيس الخلايا الجذعية المكونة للدم الذي يحتوي على 180-200 مل من الخلايا الجذعية المكونة للدم بالكيس المحتوي على CPA الذي يحتوي على 100 مل من مادة الحمايا الكريمة بالتبريد الجديدة منخفضة DMSO باستخدام أنبوب تسريب معقم.
3. قم بتثبيت نقطة منتصف الأنبوب باستخدام مرقئ معقم. قم بتوصيل أحد طرفيه بكيس خليط الخلية CPA والآخر بأنبوب طرد مركزي سعة 50 مل.
التعبئة والحفظ بالتبريد
1. حرر الإرقاء للسماح بالتدفق المتحكم فيه لخليط الخلية-CPA إلى أنبوب الطرد المركزي.
2. استنشق 1 مل من أنبوب الطرد المركزي باستخدام ماصة. نقل الحصص إلى أنابيب التبريد المسبقة التصنيف (30 أنبوبا / عينة). شد الأغطية وضع الأنابيب في صندوق التخزين.
التخزين والنقل
1. انقل صندوق التخزين على الفور إلى ثلاجة -80 درجة مئوية. للنقل ، قم بتعبئة الأنابيب المبردة في الثلج الجاف (-78.5 درجة مئوية) مع مراقبة درجة الحرارة.

2. الحفظ بالتبريد واستعادة PBHSCs

تحضير وخلط CPA و TCPA
1. قم بتبريد منصة الثلج مسبقا إلى 2-8 درجة مئوية. قم بإذابة الخلايا الجذعية المكونة للدم CPA و TCPA وفقا لإرشادات الشركة المصنعة (انظر الجدول 1 للحصول على تركيبات CPA / TCPA).
2. امزج CPA و TCPA مع ست عينات PBHSC بنسبة حجم 1: 1 على منصة الثلج. نقل معلق الخلية إلى cryovials معقمة.
CPA الحفظ بالتبريد
1. ضع المبردات مباشرة في فريزر -80 درجة مئوية. تأكد من أن تركيز DMSO النهائي في التعليق هو 2٪ (حجم / حجم). تخزين العينات لمدة 1 شهر.
الحفظ بالتبريد TCPA (التحكم المقارن)
1. تحضير TCPA يحتوي على 5٪ ألبومين دم الإنسان و 10٪ DMSO (v / v). قم بتحميل معلقات PBHSC في مواد التبريد وتبريدها إلى -80 درجة مئوية عند 1 درجة مئوية / دقيقة باستخدام مجمد قابل للبرمجة.
2. نقل المبردات إلى النيتروجين السائل للتخزين طويل الأجل. تخزين العينات لمدة 1 شهر.
إنعاش الخلية
1. استرجع cryovials بعد 1 شهر. قم بإذابة الخلايا في حمام مائي 37 درجة مئوية مع تحريك لطيف (≤ 5 دقائق).
2. جهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 10 دقائق لإزالة CPA / TCPA المتبقي. أعد تعليق 1 مل من الخلايا في وسط ثقافة RPMI 1640 الدافئ مسبقا للمقايسات النهائية

3. فحص صلاحية الخلية

عد الخلايا المستند إلى الصور
1. تحضير محلول تلطيخ مختلط يحتوي على 10 ميكروغرام / مل برتقالي أكريدين (AO) و 10 ميكروغرام / مل يوديد بروبيديوم (PI).
2. امزج 100 ميكرولتر من معلق الخلية مع 100 ميكرولتر من محلول التلوين (نسبة 1: 1) في أنبوب طرد مركزي دقيق معقم.
3. قم بتحميل 10 ميكرولتر من العينة الملطخة في عداد الخلية الآلي. تحليل صلاحية الخلية باستخدام البرنامج المتكامل:
  الجدوى = الخلايا الحية / إجمالي الخلايا × 100٪
التحقق من صحة قياس التدفق الخلوي
1. تحضير محلول تلطيخ Annexin V-FITC / PI عن طريق خلط Annexin V-FITC (5 ميكرولتر) و PI (5 ميكرولتر) في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت الملزم.
2. أضف 300 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى محلول التلوين واحتضانه عند 25 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة في الظلام.
3. قم بالطرد المركزي الخليط على حرارة 300 × جم لمدة 5 دقائق وتخلص من المادة الطافية. أعد تعليق الخلايا في 500 ميكرولتر من PBS وحلل قابلية البقاء باستخدام مقياس التدفق^{الخلوي 25}.

4. اختبار تشكيل المستعمرة

تحضير تعليق الخلية
1. امزج معلق الخلية مع محلول تريبان الأزرق بنسبة 0.4٪ بنسبة 1: 1 واحتضنه لمدة 3 دقائق للتمييز بين الخلايا القابلة للحياة / الميتة. قم بإجراء عمليات عد مكررة باستخدام عداد خلية آلي لتحديد كثافة الخلايا القابلة للحياة (ضمان الجدوى >90٪). اضبط حجم تعليق الخلية على التركيز المستهدف (1 × 10⁶ خلايا / مل) وقم بالترشيح من خلال مصفاة 40 ميكرومتر لضمان تشتت الخلية الواحدة. قم بتصفية معلق الخلية من خلال مصفاة خلية معقمة 40 ميكرومتر لإزالة الركام.
خلط متوسط
1. اجمع بين 1 مل من تعليق الخلية مع 9 مل من وسط وحدة تشكيل مستعمرة الفئران التجارية في أنبوب مخروطي سعة 15 مل (1:10 فولت / حجم).
2. دوامة الخليط عند 1,500 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية لضمان التجانس. جهاز طرد مركزي عند 100 × جم لمدة 10 ثوان للتخلص من فقاعات الهواء.
إعداد بذر الخلايا والرطوبة
1. ضعي 1.5 مل من الخليط الخالي من الفقاعات في طبق بتري معقم مقاس 35 مم. أضف 3 مل من الماء المقطر المعقم إلى أخدود محيطي للطبق (أو ضع وعاءا معقما منفصلا داخل غطاء الطبق) للحفاظ على الرطوبة.
2. أغلق الطبق في غرفة رطبة (رطوبة ≥ 95٪).
  1. لتحضير الغرفة ، ضع طبقتين من الورق الماص المعقم في وعاء بلاستيكي بغطاء (على سبيل المثال ، طبق بتري 15 سم). أضف 10 مل من الماء المعقم منزوع الأيونات لتشبع الورق. ضع طبق الثقافة الملون في وسط الغرفة ، مع ضمان عدم وجود اتصال مباشر بين الطبق والورق المبلل. لف الفيلم الشفاف حول تقاطع الغطاء والحاوية 3 مرات لإحكام الإحكام. بدلا من ذلك ، قم بتأمين حواف الغطاء بشريط مختبر. احتضان الغرفة المختومة عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة لموازنة الرطوبة ≥ 95٪.
زراعة المستعمرات والتعداد
1. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية تحت 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ لمدة 16 يوما. عد مستعمرات المكونة للدم (≥ 50 خلية لكل مجموعة) باستخدام مجهر مقلوب بتكبير 40 ضعفا. احسب وحدات تكوين المستعمرات (CFUs) لكل 1 × 10⁴ خلايا مصنفة.

5. كشف نشاط الميتوكوندريا

تلطيخ الخلايا بالرودامين 123
1. أعد تعليق PBHSCs عند 1 × 10⁶ خلايا / مل في 1 مل من RPMI1640 وسط. أضف صبغة Rhodamine 123 إلى التركيز النهائي من 5-10 ميكرومتر. احتضن الخلايا في 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
2. جهاز الطرد المركزي تعليق الخلية عند 300 × جم لمدة 5 دقائق. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في 1 مل من RPMI1640 الطازجة. كرر الطرد المركزي وأعد التعليق في 1 مل من PBS.
تحليل الفحص المجهري متحد البؤر
1. امسح شريحة زجاجية نظيفة بورق خال من النسالة لإزالة الغبار أو الملوثات.
2. قم بتعليق PBHSCs الملطخة في PBS إلى كثافة مناسبة لتجنب تداخل الإشارات. ماصة 10-20 ميكرولتر من تعليق الخلية وتوزيعها ببطء على وسط الشريحة.
3. قم بإمالة الغطاء بزاوية 45 درجة ، والمس برفق إحدى الحواف على القطرة ، وخفضها تدريجيا لتقليل فقاعات الهواء. اضغط برفق للتأكد من انتشار الخلايا بالتساوي في طبقة أحادية.
4. ضع الشريحة أفقيا في الظلام لمدة 5 دقائق للسماح للخلايا بالاستقرار. انتقل على الفور إلى تحليل الفحص المجهري متحد البؤر.
5. قم بتركيب الخلايا الملطخة على شريحة زجاجية. مراقبة توزيع الميتوكوندريا باستخدام مجهر متحد البؤر (ex / em: 488/525 نانومتر).
قياس قياس التدفق الخلوي
1. تحليل شدة مضان الرودامين 123 باستخدام مقياس التدفق الخلوي (قناة FL1). استخدم PBHSCs المعالجة ببيروكسيد الهيدروجين (1 ملي مولار ، 1 ساعة) كعناصر تحكم^{إيجابية 26}.

6. تلطيخ الهيكل الخلوي ل PBHSCs

تلطيخ الشعيرات الدقيقة (Actin Tracker Green-488)
1. قم بإعداد مسبار فلورسنت الفالويد المترافق AF488 المذاب في PBS بتركيز نهائي قدره 5 U / mL. قم بتخفيف محلول المخزون (200 وحدة / مل في الميثانول) عن طريق خلط 5 ميكرولتر من المخزون مع 195 ميكرولتر من PBS (تخفيف 1:40). دوامة جيدا لمدة 10 ثوان لضمان التجانس.
2. أضف 200 ميكرولتر من محلول العمل Actin Tracker Green-488 المحضر (5 U / mL) إلى PBHSCs. احتضن الخلايا عند 25 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في الظلام.
3. اغسل الخلايا 2x باستخدام 1 مل من محلول الغسيل المناعي (0.1٪ Triton X-100 في PBS). قم بتغطية النوى المضادة ب 200 ميكرولتر من DAPI (1 ميكروغرام / مل) لمدة 5 دقائق عند 25 درجة مئوية في الظلام.
تلطيخ الأنابيب الدقيقة (Tubulin Tracker Red)
1. قم بإعداد مسبار فلورسنت باكليتاكسيل مترافق بالأشعة تحت الحمراء مذاب في PBS بتركيز نهائي قدره 1 ميكرومتر. قم بتخفيف محلول المخزون (100 ميكرومتر في DMSO) بإضافة 10 ميكرولتر من المخزون إلى 990 ميكرولتر من PBS (نسبة التخفيف 1: 100). دوامة الخليط لمدة 10 ثوان لضمان التجانس والحماية من الضوء.
2. قم بإعداد محلول عمل Tubulin Tracker Red بتركيز نهائي يبلغ 250 نانومتر في وسط كامل. قم بتخفيف محلول المخزون (1 ملي مولار في DMSO) بإضافة 2.5 ميكرولتر من المخزون إلى 997.5 ميكرولتر متوسط (نسبة تخفيف 1: 400). دوامة الخليط لمدة 10 ثوان وأضف 200 ميكرولتر إلى PBHSCs. احتضن عند 25 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في الظلام.
3. اغسل الخلايا 2x مع 1 مل من محلول غسيل التلوين المناعي. قم بتغطية النوى المضادة ب 200 ميكرولتر من DAPI (1 ميكروغرام / مل) لمدة 5 دقائق عند 25 درجة مئوية في الظلام.
التركيب والفحص المجهري
1. اغسل الخلايا الملطخة 2x باستخدام PBS. امزج الخلايا الملطخة مع محلول 90٪ جلسرين - PBS (90٪ جلسرين و 10٪ PBS ، حجم / حجم) بنسبة حجم 1: 1. ماصة 10 ميكرولتر من الخليط على شريحة زجاجية. قم بإمالة الغطاء عند 45 درجة وخفضه تدريجيا لتجنب فقاعات الهواء.
2. تحليل مورفولوجيا الأكتين / الأنابيب الدقيقة باستخدام مجهر مضان (إثارة 488 نانومتر للأكتين الأخضر ؛ 561 نانومتر ل Tubulin Red). تشمل الضوابط الإيجابية: PBHSCs المعالجة بالسيتوكالاسين B (5 ميكرومتر ، 2 ساعة) لاضطراب الأكتين و PBHSCs المعالجة بالكولشيسين (10 ميكرومتر ، 3 ساعات) لإزالة بلمرة الأنابيب الدقيقة.

7. تقييمات سلامة CPA

اختبار انحلال الدم
1. تحضير 2٪ معلق خلايا الدم الحمراء للأرانب باستخدام مضاد للتخثر في الدم الطازج باستخدام EDTA.
2. أضف CPA (0.1-0.5 مل) والمحلول الملحي الفسيولوجي (2.0-2.4 مل) إلى 2.5 مل من تعليق الخلية في الأنابيب الزجاجية.
3. استخدم المحلول الملحي كعنصر تحكم سلبي والماء المعقم كعنصر تحكم إيجابي. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 3 ساعات ولاحظ انحلال الدم / التخثر تحت المجهر.
اختبار الحساسية الجهازية
1. تحضير
  1. استخدم 36 SPF من خنازير غينيا هارتلي (50٪ ذكر ، 271-307 جم ؛ 50٪ أنثى ، 270-301 جم) تتراوح أعمارهم بين 4-5 أسابيع. الحفاظ على ظروف السكن التالية: درجة الحرارة: 16-26 درجة مئوية (± 4 درجات مئوية تذبذب يومي) ، الرطوبة: 40٪ -70٪ ، التهوية: 8-10 تغيرات في الهواء / ساعة ، دورة الضوء: 12 ساعة فاتحة / مظلمة
2. مرحلة التوعية
  1. حقن CPA في الربع الأيسر السفلي من التجويف البريتوني عند 2 مل / كجم (منخفض) أو 6 مل / كجم (مرتفع) في الأيام 1 و 3 و 5. تحاكي الجرعة المنخفضة (2 مل / كغ) مستويات التعرض السريري ، بينما تمثل الجرعة العالية (6 مل / كغ) هامش أمان 3 أضعاف لتقييم فرط الحساسية المعتمدة على الجرعة ، وفقا لإرشادات منظمة التعاون الاقتصادي والتنمية 406 لاختبار الحساسية الجهازية²⁷^،²⁸.
  2. استخدم ألبومين مصل الدم البشري (التحكم الإيجابي) والمحلول الملحي (التحكم السلبي).
3. مرحلة التحدي
  1. تطبيق CPA عن طريق الوريد من خلال وريد الأذن الهامشي بمعدل 4 مل/كغ (منخفض) أو 12 مل/كغ (مرتفع) في اليومين 19 و26. تتوافق جرعات التحدي (جرعات التحسس 2x) مع البروتوكولات المعمول بها لإثارة الحساسية المفرطة في خنازير غينيا المحسسة مسبقا ، كما تم التحقق من صحتها في الدراسات السابقة للتوافق الحيوي للحماج بالتبريد²⁹.
  2. مراقبة أعراض الحساسية المفرطة (ضائقة تنفسية, التشنجات) لمدة 1 ساعة بعد الحقن.
4. معالجة ما بعد التجربة
  1. أعد خنازير غينيا إلى الرعاية البيطرية للمراقبة لمدة 72 ساعة. القتل الرحيم باستخدام إفراز الأبهر البطني تحت تخدير الأيزوفلوران.
اختبار السمية الجهازية الحادة
1. حقن الفأر
  1. حقن 50 مل / كجم CPA في الوريد الذيل ل 10 ذكور من الفئران ICR (32.0-37.1 جم ، 6 أسابيع). استخدم الفئران المحقونة بالمحلول الملحي كعناصر تحكم سلبية (ن = 10).
2. بروتوكول المراقبة
  1. مراقبة البقاء على قيد الحياة وعلامات السمية والوزن في 4 و 24 و 48 و 72 ساعة بعد الحقن. الحفاظ على ظروف السكن: درجة الحرارة: 20-25 درجة مئوية (± 3 درجات مئوية يوميا) ، الرطوبة: 40٪ -70٪ ، التهوية: 10-20 تغيير الهواء / ساعة.
3. القتل الرحيم
  1. تخدير الفئران بنسبة 3٪ من الأيزوفلوران. القتل الرحيم عن طريق إفراز الأبهر البطني.
اختبار تهيج الأوعية الدموية
1. إدارة الأرانب
  1. استخدم 6 ذكور أرانب نيوزيلندية (3.65-4.36 كجم ، 7-8 أشهر). حقن 5 مل / كجم CPA في وريد الأذن اليمنى أسبوعيا (إجمالي 3 جرعات). حقن المحلول الملحي في الأذن اليسرى كعنصر تحكم سلبي.
2. تقييم الأنسجة
  1. فحص مواقع الحقن بحثا عن حمامي أو وذمة أو نخر في الأيام 18-19. تهيج موقع الحقن بناء على الحمامي والوذمة وشدة النخر. قم بتطبيق نظام تسجيل ISO 10993-12 بدرجات تتراوح من 0 (بدون تفاعل) إلى 4 (نخر شديد) ³⁰^،³¹.
3. معالجة ما بعد التجربة
  1. تخدير الأرانب باستخدام التيلامين زولازيبام (5 مجم / كجم ، IM). القتل الرحيم باستخدام إراقة الدم السريع للشريان السباتي.

8. زرع PBHSCs

تسجيل المرضى وتعبئتهم
1. تسجيل ستة مرضى يستوفون معايير الزرع: الخلايا أحادية النواة ≥ 5 × 10⁸ خلايا / كجم
  خلايا CD34 ⁺ ≥ 2 × 10⁶ خلايا / كجم²³. استبعاد المرضى الذين تتراوح أعمارهم بين <18 أو >65 عاما ، أو أولئك الذين يعانون من التهابات نشطة ، أو خلل وظيفي حاد في الأعضاء ، أو الحمل / الرضاعة ، أو العلاج المثبط للمناعة مؤخرا (في غضون 4 أسابيع) ، أو الاضطرابات النفسية غير المنضبطة.
2. تعبئة الخلايا الجذعية المكونة للدم من نخاع العظم إلى الدم المحيطي باستخدام عامل تحفيز مستعمرة الخلايا المحببة (G-CSF). تعبئة الخلايا الجذعية المكونة للدم من نخاع العظم إلى الدم المحيطي عن طريق إعطاء عامل تحفيز مستعمرة الخلايا الحبيبية تحت الجلد يوميا بجرعة 10 ميكروغرام / كجم (تختلف الجرعة الدقيقة من شخص لآخر) لمدة 5 أيام متتالية.
جمع PBHSCs وحفظها بالتبريد
1. اجمع PBHSCs المعبأة باستخدام جهاز فصادة بمعدل تدفق دم محدد عند 40 مل / دقيقة ونسبة مضادة للتخثر إلى الدم الكامل تبلغ 1:12. قم بمعالجة 15-16 لترا من الدم الكامل لكل جلسة للحصول على 180-200 مل من تركيز PBHSC. قسم العينة إلى قسمين ، وكل كيس بسعة 90-100 مل.
2. أعد تعليق أول حصة في 10٪ ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) و 5٪ ألبومين مصل بشري لنقل الدم السريري. ضع الكمية المعلقة في حاوية تجميد قابلة للبرمجة بمعدل تبريد من -1 درجة مئوية / دقيقة إلى -80 درجة مئوية. قم بتسمية كيس التبريد بمعرف المريض ومعلمات التجميد (على سبيل المثال ، رقم الدفعة والتاريخ). تحضير الكمية الثانية في 5٪ DMSO و 10٪ مصل بقري للجنين لاختبار الجدوى.
الذوبان وإعادة التسريب
1. قم بإذابة PBHSCs المحفوظة بالتبريد في حمام مائي 37 درجة مئوية (≤ 2 دقيقة). يجب تطبيق الخلايا المذابة عن طريق الوريد بعد تكييف العلاج الكيميائي/العلاج الإشعاعي. يتم تطبيق الخلايا عن طريق الوريد عبر القسطرة الوريدية المركزية خلال 30 دقيقة بعد الذوبان باستخدام مضخة حقنة بمعدل 3-5 مل / دقيقة.
مراقبة ما بعد الزرع
1. تتبع التعافي المكونة للدم حسب تعداد الدم اليومي: عتبة نجاح العدلات: ≥ 0.5 × 10⁹ خلايا / لتر ؛ عتبة نجاح الصفائح الدموية: ≥ 20 × 10⁹ خلايا / لتر³².
2. مراقبة إعادة تكوين المناعة من خلال تحليل المجموعة الفرعية للخلايا الليمفاوية. اجمع 5 مل من عينات الدم المحيطية في أنابيب EDTA. تلطيخ الخلايا ذات الأجسام المضادة الفلورية ضد CD3 و CD4 و CD8 و CD19 و CD56 لمدة 15 دقيقة في الظلام. تحليل المجموعات الفرعية للخلايا الليمفاوية باستخدام مقياس التدفق الخلوي واستراتيجية بوابات موحدة. قارن التعداد المطلق (الخلايا / ميكرولتر) بالنطاقات المرجعية الصحية المطابقة للعمر للتفسير.

9. تحليل السكان الفرعيين PBHSCs

تلطيخ الأجسام المضادة
1. قم بإعداد PBHSCs المجمدة (مجموعات CPA / TCPA) وقم بإذابة الثلج في حمام مائي 37 درجة مئوية.
2. تسمية الخلايا بالأجسام المضادة الفلورية: CLP: CD45-CD34 + CD10 + (استنساخ HI30 + 4H11 + HI10a) ؛ الهندسة الكهربائية والميكانيكية: CD45-CD38 + CD135-CD45RA- (استنساخ HIT2 + 4G8 + 5F3 + HI100) ؛ GMP: CD45-CD38 + CD135 + CD45RA + (الشكل 1). قامت أجهزة الطرد المركزي بإذابة PBHSCs عند 300 × جم لمدة 5 دقائق لإزالة عوامل الحفظ بالتبريد. اضبط تركيز الخلية على 1 × 10⁶ خلايا / مل في PBS الذي يحتوي على 2٪ مصل بقري جنيني.
3. قم بإعداد كوكتيلات الأجسام المضادة باستخدام المستنسخة HI30 / 4H11 / HI10a ل CLP و HIT2 / 4G8 / 5F3 / HI100 ل MEP / GMP في العيارات الموصى بها من قبل الشركة المصنعة. احتضان الخلايا بمخاليط الأجسام المضادة لمدة 30 دقيقة في الظلام عند 4 درجات مئوية مع دوامة لطيفة كل 10 دقائق. اغسل الخلايا الملطخة 2x باستخدام PBS بارد + 0.1٪ أزيد الصوديوم باستخدام الطرد المركزي عند 200 × جم لمدة 3 دقائق. أعد تعليق الخلايا في 500 ميكرولتر من PBS باستخدام 1 ميكروغرام / مل DAPI لبوابات الجدوى قبل تحليل قياس التدفق الخلوي.
4. احتضن عند 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة في الظلام. اغسل 2x مع PBS الذي يحتوي على 1٪ BSA.
إعداد قياس التدفق الخلوي
1. أعد تعليق الخلايا الملطخة في 500 ميكرولتر من PBS. تحليل المجموعات السكانية الفرعية باستخدام مقياس التدفق الخلوي: تكوين الليزر (488 نانومتر ، 640 نانومتر) والمرشحات (FITC ، PE ، APC). اجمع ≥ 10,000 حدث لكل عينة.
2. تعتمد مجموعات البوابات على التشتت الأمامي / الجانبي وشدة التألق (الشكل 1).
مقارنة البيانات
1. احسب النسب المئوية ل CLP / MEP / GMP باستخدام برنامج FlowJo v10.8. قارن بين CPA ومجموعات TCPA باستخدام اختبار t للطالب (α = 0.05). تصور الاختلافات باستخدام Prism 9.0 (مخططات شريطية مع SEM)³³.

10. التحليل الإحصائي

قم بإجراء مقارنة بين وسائل المتغيرات العددية المستمرة التي تتوافق مع التوزيع الطبيعي مع تباين كاي تربيعي ، باستخدام اختبار t ، وللمتغيرات العددية المستمرة التي لا تتوافق مع التوزيع الطبيعي ، اختبرها بشكل غير معلمي.
الإبلاغ عن بيانات المتغيرات المستمرة كمتوسط ± الانحراف المعياري أو الربعين المتوسط والعلوي والأدنى. استخدم اختبار فيشر الدقيق لمقارنة المعدلات بين المجموعتين.
تحليل البيانات ورسم الخرائط باستخدام SPSS 26.0 و GraphPad Prism 9. ضع في اعتبارك جميع الاختلافات في الاختبارات ثنائية الذيل ذات دلالة إحصائية إذا كان p < 0.05. يتم تقديم بعض البيانات في شكل أوصاف إحصائية.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

مقارنة بين طرق الحفظ بالتبريد بخطوة واحدة والحفظ بالتبريد بالنيتروجين السائل
تم تقييم جدوى PBHSCs المحفوظة بالتبريد بعد الاسترداد باستخدام فحوصات AO / PI. كما هو موضح في الشكل 2 أ ، وجد أن جدوى PBHSCs المحفوظة بالتبريد عند -80 درجة مئوية باستخدام CPA هي 91.29٪ (ن = 3 ، SD = 1.86) ، بينما بالنسبة لتلك المحفوظة في النيتروجين السائل ، كانت الجدوى 90.07٪ (ن = 3 ، SD = 1.64). وأشار التحليل الإحصائي إلى عدم وجود فرق يعتد به بين الطريقتين (ص > 0.05). ومع ذلك ، أثبتت طريقة الحفظ بالتبريد المكونة من خطوة واحدة أنها أسرع وأكثر ملاءمة. تشير هذه النتائج إلى أن طريقة الحفظ بالتبريد ذات الخطوة الواحدة هي بديل ممتاز للحفاظ على الخلايا.

يتفوق تأثير الحفظ بالتبريد ل CPA على PBHSCs على طريقة الحفظ بالتبريد التقليدية
تم الكشف عن بقاء الخلايا ل PBHSCs المحفوظة بالتبريد بعد الاسترداد بواسطة فحوصات AO / PI و Annexin V / PI. كما هو موضح في الشكل 2 ، وصلت صلاحية الخلية لست عينات PBHSCs المستردة المحفوظة باستخدام CPA إلى 89.38٪ (ن = 6 ، SD = 1.87 ، الشكل 2 ب) و 88.20٪ (ن = 6 ، SD = 2.72 ، الشكل 2 ج) ، على التوالي ، في هذين المقايسين. ومع ذلك ، فإن تلك التي تم الحفاظ عليها بواسطة TCPA كانت 79.55٪ (ن = 6 ، SD = 3.16 ، الشكل 2 ب) و 73.05٪ (ن = 6 ، SD = 7.47 ، الشكل 2 ج). تشير هذه النتائج إلى أن CPA هو مادة تبريد أكثر فعالية ل PBHSCs مقارنة ب TCPA ، مما يؤدي إلى الحفاظ على بقاء الخلية ومعدلات التعافي بشكل أفضل.

تحافظ PBHSCs المحفوظة مع CPA على بنية الهيكل العظمي الكامل للسيتو ونشاط الميتوكوندريا
يشير التعريف الضيق للهيكل الخلوي إلى شبكة ألياف البروتين والأنابيب الدقيقة (MT) والخيوط الدقيقة (MF) والخيوط الوسيطة (IF) في الخلايا حقيقية النواة³⁴. في هذه الدراسة ، قمنا بشكل أساسي بالتحقيق في السلامة الهيكلية ل MT و MF بعد الحفظ بالتبريد ل PBHSCs لإثبات أن PBHSCs يمكن أن تحافظ على سلامة الهيكل الخلوي بعد حفظ CPA بالتبريد لتسمية هياكل الخيوط الدقيقة والأنابيب الدقيقة للخلايا الحية ، تم استخدام الببتيد الدوري لقلم الشبح الفلوري Alexa Fluor 488 ونظائر Taxol المسماة بمجموعة الفلورسنت بالأشعة تحت الحمراء البعيدة كمجسات فلورية ، على التوالي. كما هو موضح في الشكل 3 أ ، ب ، لا تزال PBHSCs المحفوظة بواسطة CPA تحافظ على هياكل الخيوط الدقيقة والأنابيب الدقيقة السليمة.

تم تصنيف الميتوكوندريا من PBHSCs المحفوظة بواسطة CPA بمحلول صبغة الرودامين 123 ، وتم استخدام PBHSCs المعالجة ب H₂O₂ كعنصر تحكم إيجابي. أظهرت النتائج (الشكل 3 ج) أن بنية الميتوكوندريا لوحظت في الخلايا المحفوظة CPA ، بينما لم يتم ملاحظتها في مجموعة التحكم الإيجابية. كما تم الكشف عن الميتوكوندريا المسماة 123 بالرودامين عن طريق قياس التدفق الخلوي. وجد أن PBHSCs المحفوظة ب CPA حافظت على نشاط أفضل للميتوكوندريا من الطريقة التقليدية (الشكل 4).

تحافظ PBHSCs المحفوظة مع CPA على القدرة على تكوين المستنسخة
قمنا بتقييم القدرة التكاثرية والتمايزية ل PBHSCs المحفوظة مع CPA و TCPA من خلال إجراء فحوصات تشكيل المستعمرات. على وجه التحديد ، قمنا بتقييم قدرة PBHSCs على تكوين مستعمرات BFU-E و CFU-E و CFU-GEMM في الثقافة. كان العدد الإجمالي للمستعمرات التي لوحظت في مجموعة الخلايا الطازجة 70.33 (ن = 6 ، SD = 14.02). في المقابل ، أظهرت مجموعة CPA ما مجموعه 65.33 مستعمرة (ن = 6 ، SD = 8.07) ، بينما أظهرت مجموعة TCPA عددا أقل بكثير من 46.17 مستعمرة (ن = 6 ، SD = 8.50). توضح هذه النتائج أن PBHSCs المحفوظة مع CPA حافظت على قدراتها التكاثرية والتمايزية مقارنة بالتحكم في الخلايا الطازجة ، كما يتضح من الأعداد المتشابهة من تكوينات المستعمرات عبر سلالات الخلايا المختلفة. في المقابل ، أظهرت PBHSCs المحفوظة مع TCPA انخفاضا في إمكاناتها التكاثرية والتفاضلية. تشير هذه النتائج إلى أن PBHSCs المحفوظة بالتبريد مع CPA تحتفظ بشكل أفضل بقدراتها الوظيفية (الشكل 5 والشكل 6).

تقييمات سلامة CPA في المختبر
تم إجراء المراقبة المختبرية لانحلال الدم في كريات الدم الحمراء للأرانب. لاختبار تأثيرات أحجام مختلفة من CPA (تتراوح من 0.1-0.5 مل) والمحلول الملحي العادي (يتراوح من 2.0-2.4 مل) على انحلال الدم ، تمت إضافة 2.5 مل من معلق كرات الدم الحمراء للأرانب بنسبة 2٪ إلى أنابيب الاختبار الزجاجية جنبا إلى جنب مع CPAs أو المحلول الملحي العادي. كما تم تضمين المراقبة السلبية (الماء المعقم للحقن) والمراقبة الإيجابية (المحلول الملحي العادي). في الأنابيب التي تحتوي على CPAs أو محلول ملحي عادي ، استقرت كريات الدم الحمراء في قاع الأنبوب ، وكان المحلول العلوي واضحا وعديم اللون. بعد الاهتزاز ، تم تشتيت كريات الدم الحمراء بشكل موحد. أظهرت مجموعة التحكم الإيجابية (الماء المعقم) لونا أحمر ساطعا ، ولم يلاحظ أي تقسيم طبقي ، مع بقاء كمية صغيرة فقط من كرات الدم الحمراء في قاع الأنبوب (الشكل 7). تشير هذه النتائج إلى أن CPAs لا تسبب انحلال الدم أو تكاثف كرات الدم الحمراء للأرانب. تم تقييم تهيج الأوعية الدموية ل CPA في الأرانب النيوزيلندية. تم تلطيخ الأقسام المرضية بصبغة الهيماتوكسيلين واليوزين (HE) ، وتم إجراء ملاحظات تهيج سريرية وموضعية عامة بعد الإعطاء النهائي. لم يلاحظ أي تفاعلات غير طبيعية في التجارب ، ولم يلاحظ أي تغيرات مرضية في مواقع الإدارة المحلية. تشير هذه النتائج إلى أن CPA لا يسبب تهيج الأوعية الدموية في الأرانب النيوزيلندية.

في تجربة فرط الحساسية الجهازية النشطة في خنازير غينيا ، تم استخدام CPA لتوعية بالحقن داخل الصفاق بمقدار 1.25 مل / كجم و 2.5 مل / كجم 3x والحقن الوريدي 2.5 مل / كجم و 5 مل / كجم للإثارة. لم يلاحظ فرط الحساسية السريع في خنازير غينيا حتى 21 يوما بعد آخر تحسس ، مما يشير إلى أن CPA لا يسبب الحساسية المفرطة السريعة في خنازير غينيا (الجدول 2).

تم تقييم السمية الجهازية الحادة في الفئران ICR. تم حقن خمسة فئران تجريبية وخمسة فئران ضابطة ب CPA والمحلول الملحي العادي بجرعة 50 مل / كجم من وزن الجسم. لم تكن ردود فعل المجموعة التجريبية أكبر من ردود فعل المجموعة الضابطة. لم تلاحظ نوبات أو استلقاء على وجهها لأسفل في أي من المجموعتين ، ولم تلاحظ أي أعراض غير طبيعية أخرى. علاوة على ذلك ، لم يكن هناك فقدان كبير في الوزن في أي من المجموعتين. تشير هذه النتائج إلى أن CPAs لا تظهر سمية جهازية حادة لفئران ICR (الجدول 3 والجدول 4).

تقييم الزرع الذاتي ل PBHSCs المحفوظة باستخدام CPA
لتقييم فعالية زرع PBHSCs المحفوظة مع CPA لعلاج أمراض الدم ، تم تجنيد ستة مرضى ، وتم زرع PBHSCs المحفوظة مع CPA في خمسة مرضى. كانت عملية الزرع ناجحة في جميع المرضى باستثناء مريض واحد ، والذي خضع لعملية زرع خيفية أخرى بسبب تكرار المرض. تم استخدام عدد العدلات ≥ 0.5 × 10⁹ خلايا / لتر وعدد الصفائح الدموية ≥ 20 × 10⁹ خلايا / لتر كعلامات على الزرع الناجح.

تم زرع العينات b و c و e في مرضى سرطان الغدد الليمفاوية المقابلين ، وكانت دورة إعادة البناء الوظيفية 9 أيام و 9 أيام و 10 أيام على التوالي. تم زرع العينات A و F في المرضى الذين يعانون من سرطان الدم النخاعي الحاد ، وكانت دورة إعادة البناء الوظيفية 36 يوما و 16 يوما على التوالي. تلقى المريض عينات d علاجا آخر بسبب تكرار المرض. باستثناء البيانات المتعلقة بإعادة تكوين الدم وإعادة التكوين المناعي التي تعطلت بسبب العدوى في دورة 36 يوما ، كان متوسط الوقت اللازم لنجاح الزرع في خمس حالات 11 يوما ، مع استيفاء كل من عدد العدلات والصفائح الدموية للمعايير المطلوبة. هذه المدة أقصر من دورة إعادة تكوين المكونة للدم لمدة 12.5 يوما المذكورة في الأدبيات السابقة¹⁹. في دراستنا ، في ظل فترات إعادة التكوين المماثلة ، كان التركيز النهائي ل DMSO في صيغة CPA 2٪ فقط ، وهو أقل بشكل ملحوظ من تركيز 3.5٪ الذي يتم الاستشهاد به^{عادة 20}. والأهم من ذلك ، لم يلاحظ أي ردود فعل سلبية لدى المرضى ، مما يؤكد سلامة وفعالية طريقة الحفاظ على الخلايا الجذعية المكونة للدم في التطبيقات السريرية (الجدول 5).

كشف التحليل السكاني الفرعي ل PBHSCs أن السكان الفرعيين للخلايا من أسلاف اللمفاويات الشائعة (CLP) وأسلاف الخلايا الضخمة / كريات الدم الحمراء (MEP) في PBHSCs المحفوظة مع CPA كانت أعلى من تلك الموجودة في النظام التقليدي. ومع ذلك ، لم تكن المجموعات الفرعية للخلايا من أسلاف الخلايا المحببة / البلاعم (GMP) مختلفة بشكل كبير. قد تفسر هذه النتائج إعادة تكوين الدم والمناعة الأسرع التي لوحظت في المرضى المعالجين (الشكل 8A-C).

figure-results-1
الشكل 1: نماذج التسلسل الهرمي المكونة للدم. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: جدوى الخلايا ل PBHSCs. (أ) كانت جدوى PBHSCs المحفوظة بطريقة الخطوة الواحدة مع CPA 91.29٪ (SD = 1.86) ، وتلك المحفوظة بطريقة النيتروجين السائل كانت 90.07٪ (SD = 1.64) ، ص > 0.05 فيما يتعلق بطريقة الحفظ بالتبريد بخطوة واحدة وطريقة الحفظ بالتبريد بالنيتروجين السائل. (ب) كان معدل استرداد PBHSCs المخزنة مع CPA 89.38٪ (n = 6 ، SD = 1.87) ، وهو أعلى بكثير من معدل الاسترداد البالغ 79.55٪ من PBHSCs المخزنة مع TCPA (n = 6 ، SD = 3.16) ، كما تم قياسه بواسطة اكتشاف AO / PI. (ج) كانت جدوى الاسترداد ل PBHSCs المحفوظة مع CPA 88.20٪ (ن = 6 ، SD = 2.72) ، وهو أعلى بكثير من جدوى الاسترداد ل 73.05٪ من PBHSCs المحفوظة مع TCPA (ن = 6 ، SD = 7.47) ، كما تم قياسه بواسطة الكشف عن الملحق V / PI بعد الاسترداد. P<0.01 (اختبار T) فيما يتعلق بتكلفة الاكتساب وTCPA. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3: التحليل الهيكلي ل PBHSCs المحفوظة بواسطة CPA و TCPA. (أ) هيكل الخيوط الدقيقة ل PBHSCs ، بما في ذلك مجموعة الخلايا الطازجة ، ومجموعة CPA ، ومجموعة TCPA ، ومجموعة التحكم الإيجابية ، كما هو موضح بواسطة الببتيد الدوري لقلم الشبح الفلوري Alexa Fluor 488. (ب) هيكل الأنابيب الدقيقة ل PBHSCs ، بما في ذلك مجموعة الخلايا الطازجة ، ومجموعة CPA ، ومجموعة TCPA ، ومجموعة التحكم الإيجابية ، كما هو موضح من خلال نظائر Taxol التي تحمل علامة مجموعة الفلورسنت بالأشعة تحت الحمراء البعيدة. (ج) تم الكشف عن نشاط الميتوكوندريا ل PBHSCs المسماة بالرودامين 123 (بما في ذلك مجموعة الخلايا الطازجة ، ومجموعة CPA ، ومجموعة TCPA ، ومجموعة التحكم الإيجابية) عن طريق قياس التدفق الخلوي. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4
الشكل 4: التحليل الوظيفي ل PBHSCs المحفوظة بواسطة CPA و TCPA. نشاط الميتوكوندريا ل PBHSCs ، بما في ذلك مجموعة الخلايا الطازجة ، ومجموعة CPA ، ومجموعة TCPA ، ومجموعة التحكم الإيجابية ، كما تم اكتشافها بواسطة قياس التدفق الخلوي. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-5
الشكل 5: اختبار إمكانات تكوين المستعمرة. إمكانية تكوين المستعمرات ل PBHSCs المحفوظة مع CPA و TCPA ، بما في ذلك CFU-E و BFU-E و CFU-GM و CFU-GEMM ، مقارنة ب PBHSCs الجديدة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-6
الشكل 6: العدد الإجمالي للمستعمرات. كان العدد الإجمالي للمستعمرات في مجموعة الخلايا الطازجة 70.33 (ن = 6 ، SD = 14.02) ، وكان العدد الإجمالي للمستعمرات في مجموعة CPA 65.33 (ن = 6 ، SD = 8.07) ، وكان العدد الإجمالي للمستعمرات في مجموعة TCPA 46.17 (ن = 6 ، SD = 8.50). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-7
الشكل 7: تقييم سلامة CPA عن طريق الاختبارات على. يتم عرض الصور التمثيلية التي تم التقاطها بدقة 10x في A1-B2. (أ ، ب) تقييم تهيج الأوعية الدموية ل CPA في الأرنب النيوزيلندي. كانت A1 و B1 هي مخططات قسم الأنسجة المرضية لمجموعة المراقبة السلبية التي تم إعدادها بعد 72 ساعة و 14 يوما بعد آخر إعطاء ، على التوالي. A2 و B2 كانت مخططات قسم الأنسجة المرضية لمجموعة CPA التي تم إعدادها بعد 72 ساعة و 14 يوما بعد آخر إعطاء ، على التوالي. (ج) المراقبة المختبرية لانحلال الدم في كريات الدم الحمراء في الأرانب. تمثل الأنابيب المسماة a-e مجموعة CPA ، وكانت الأنابيب المسماة f هي مجموعة التحكم السلبية ، وكانت الأنابيب المسماة g هي المجموعة الضابطة الإيجابية. لم يحدث انحلال الدم في مجموعة CPA والمجموعة الضابطة السلبية ، بينما حدث انحلال الدم في المجموعة الضابطة الإيجابية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-8
الشكل 8: تحليل المجموعات السكانية الفرعية PBHSCs. (أ) CLP ، (ب) MEP ، و (C) من 6 مرضى محفوظين مع CPA و TCPA. (أ) كان متوسط نسب CLP ل CPA و TCPA 16.38٪ (ن = 6 ، SD = 13.53) و 8.97٪ (ن = 6 ، SD = 7.88) ، كانت المجموعات الفرعية من CLP في PBHSCs المجمدة في CPA أعلى من تلك الموجودة في TCPA. ص > 0.05 (اختبار T) فيما يتعلق ب CPA و TCPA. (ب) كان متوسط نسب الهندسة الكهربائية والميكانيكية ل CPA و TCPA 61.07٪ (ن = 6 ، SD = 12.85) و 55.4٪ (ن = 6 ، SD = 11.37) ، كان السكان الفرعيون من MEP في PBHSCs المجمدة في CPA أعلى من تلك الموجودة في TCPA. ص > 0.05 (اختبار T) فيما يتعلق ب CPA و TCPA. (ج) كان متوسط نسب GMP ل CPA و TCPA 62.68٪ (ن = 6 ، SD = 8.20) و 64.70٪ (ن = 6 ، SD = 11.66) ، كان السكان الفرعيون ل GMP في PBHSCs المجمدة في CPA أعلى من تلك الموجودة في TCPA. ص > 0.05 (اختبار T) فيما يتعلق ب CPA و TCPA. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

مكونات CPA	نسبة التركيز	مكونات TCPA	نسبة التركيز
ثنائي ميثيل سلفوكسيد	4٪ (حجم / حجم)	ثنائي ميثيل سلفوكسيد	10٪ (حجم حجمي / حجم)
الألبومين البشري	5٪ (م / حجم)	الألبومين البشري	5٪ (م / حجم)
الجلوكوز	2٪ (م / حجم)	-	-
ديكستران 40	2٪ (م / حجم)	-	-
جليسيروفوسفات الصوديوم	0.5٪ (على أساس حجمي)	-	-

الجدول 1: مكونات ونسبة تركيز CPA و TCPA.

مجموعة	رقم	عدد بدرجات مختلفة من فرط الحساسية
مجموعة	رقم	سالب	إيجابي ضعيف	موجب	إيجابي قوي	إيجابي قوي للغاية
التحكم السلبي	8	8	0	0	0	0
التحكم الإيجابي	8	0	0	0	5	3
CPA جرعة منخفضة	8	8	0	0	0	0
CPA جرعة عالية	8	8	0	0	0	0

الجدول 2: تفاعلات فرط الحساسية في خنازير غينيا بعد العلاج ب CPA. أظهرت مجموعة التحكم السلبية ، ومجموعة CPA ذات الجرعة المنخفضة ، ومجموعة CPA ذات الجرعة العالية ردود فعل سلبية لفرط الحساسية. في المقابل ، أظهرت جميع خنازير غينيا في المجموعة الضابطة الإيجابية ردود فعل إيجابية قوية لفرط الحساسية ، حيث عانت ثلاثة خنازير غينيا من الحساسية المفرطة.

مجموعة	ترقيم	جرعة الإعطاء (مل)	الوزن (جم)
مجموعة	ترقيم	جرعة الإعطاء (مل)	0 ساعة	24 ساعة	48 ساعة	72 ساعة
التحكم السلبي	1101	1.1	21.45	22.08	22.84	23.14
	1102	1	20.17	20.98	21.49	22.29
	1103	1	19.54	20.42	21.36	21.81
	1104	1	18.67	19.38	20.25	21.21
	1105	0.9	17.67	18.34	19.42	20.28
المجموعة التجريبية	2106	1.1	21.42	21.97	22.35	23.02
	2107	1	20.67	21.32	21.84	22.44
	2108	1	19.12	20.22	21.24	22.55
	2109	1	18.62	19.31	20.02	21.24
	2110	0.9	17.57	18.83	19.41	20.28

الجدول 3: ملخص وزن الفأر في تجربة السمية الحادة. لم تظهر المجموعة الضابطة السلبية والمجموعة التجريبية أي فقدان كبير في الوزن بعد إعطاء الدواء. زاد وزن جميع التجارب تدريجيا ضمن نطاق معقول بعد التغذية التقليدية لمدة 24 ساعة و 48 ساعة و 72 ساعة بعد الإعطاء.

مجموعة	ترقيم	جرعة الإعطاء (مل)	وقت المراقبة
مجموعة	ترقيم	جرعة الإعطاء (مل)	4 ساعات	24 ساعة	48 ساعة	72 ساعة
التحكم السلبي	1101	1.1	-	-	-	-
	1102	1	-	-	-	-
	1103	1	-	-	-	-
	1104	1	-	-	-	-
	1105	0.9	-	-	-	-
المجموعة التجريبية	2106	1.1	-	-	-	-
	2107	1	-	-	-	-
	2108	1	-	-	-	-
	2109	1	-	-	-	-
	2110	0.9	-	-	-	-

الجدول 4: ملاحظة السمية الجهازية الحادة في الفئران. في الجدول ، - يعني عدم وجود تفاعلات سمية جهازية حادة. لم تظهر المجموعة الضابطة السلبية والمجموعة التجريبية أي تفاعلات سمية جهازية حادة بعد الجرعات لمدة 4 ساعات و 24 ساعة و 48 ساعة و 72 ساعة بعد تناولها.

خصائص المريض	أبحاثنا	ورد في الأدبيات
N	6	52
عمر	53 (35-61)	55 (21-66)
المليمتر	0	24
HL	2	23
مكافحة غسل الأموال	2	0
CGHL / NHL	1	0
PMBL / NHL	1	0
نوع المرض الآخر	0	5
القائمة على العلاج الإشعاعي	2	34
القائم على العلاج الكيميائي	3	18
لا. خلايا CD34 + المزروعة (10⁶ / كجم)	4.1 (2.9-5.4)	6.5 (1.5-24.7)
ANC >0.5×10⁹ / L الانتعاش (متوسط اليوم ، النطاق ، تم استبعاد البيانات غير الطبيعية)	10 (8-11)	11 (10-13)
PLT >20×10⁹ / L الانتعاش (متوسط اليوم ، النطاق ، تم استبعاد البيانات غير الطبيعية)	11 (9-16)	12.5 (0-19)
غثيان	0	15
القيء	0	4
دوخة	0	1
أي مضاعفات	0	20

الجدول 5: إحصاءات بيانات HSCT. خصائص المريض وتعافيه المكونة للدم بعد ASCT.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذه الدراسة ، قمنا بتقييم CPA جديد للحفظ بالتبريد ل PBHSCs. تظهر النتائج أن CPA يعزز الجدوى المحفوظة ل PBHSCs مقارنة ب TCPA. على وجه التحديد ، تجاوزت جدوى استرداد PBHSCs المحفوظة مع CPA تلك الخاصة ب TCPA بأكثر من 10٪. في الخلايا الجذعية ، تعد سلامة الهيكل الخلوي هي الشرط الأساسي للحفاظ على نشاط الخلايا الجذعية ووظيفة التمايز³⁵^،³⁶. على المستوى الخلوي ، لاحظنا أن كلا من هياكل الخيوط الدقيقة والأنابيب الدقيقة في PBHSCs المحفوظة مع CPA كانت سليمة أكثر مما كانت عليه في مجموعة TCPA ، مع هياكل أنابيب دقيقة أكثر وضوحا بشكل ملحوظ. الميتوكوندريا هي مصنع الطاقة للخلايا. تشارك الميتوكوندريا بشكل مباشر في تنفس الخلايا ، والتمثيل الغذائي ، وأنشطة الحياة الأخرى ، وهي عضيات أساسية للحفاظ على نشاط الخلية³⁷. يعد نشاط الميتوكوندريا مؤشرا حاسما على وظيفة الخلايا الجذعية المكونة للدم بعد الحفظ بالتبريد والتعافي. من حيث نشاط الميتوكوندريا ، أظهرت مجموعة CPA أوجه تشابه مع PBHSCs الجديدة. كشفت الملاحظة المباشرة لمجمعات الميتوكوندريا أن عددها في مجموعة CPA تجاوز ذلك في مجموعة TCPA. علاوة على ذلك ، تم استخدام قياس التدفق الخلوي لتقييم نشاط الميتوكوندريا المحفوظ في كل مجموعة كميا. أظهرت النتائج عدم وجود فرق كبير بين مجموعات CPA والخلايا الجديدة ، لكن النشاط كان أعلى بنسبة 8.5٪ في مجموعة CPA مقارنة بمجموعة TCPA. تؤكد هذه المقارنة لبيانات نشاط الميتوكوندريا نتائج جدوى استعادة الخلية. بالإضافة إلى ذلك ، أشارت فحوصات تكوين المستعمرة إلى أن PBHSCs المحفوظة مع CPA احتفظت بإمكاناتها التمايزية. أظهرت مجموعة CPA عددا أكبر من المستعمرات بعد الحث ، مما يثبت فعالية الحفظ الفائقة ل CPA.

كان الهدف من هذه الدراسة هو تطبيق CPA على HSCT السريري لتحسين نشاط PBHSCs بعد الحفظ وضمان معدل نجاح الزرع. قبل تطبيق CPA على التجارب السريرية ، تم إجراء تقييمات السلامة في التجارب ، مما يوفر دعما للبيانات لسلامة CPA في التطبيق السريري. أظهرت الدراسات السابقة أن بعض CPA الجديدة قد تم تحديدها على أنها أفضل تقنية حفظ بالتبريد للخلايا البطانية (MHECT-5) والأجنة³⁸^،³⁹. في التطبيق السريري ل CPA للحفاظ على PBHSCs ، نجحنا في حفظ PBHSCs بالتبريد من ستة مرضى ل HSCT. والجدير بالذكر أن طريقة الحفظ بالتبريد المكونة من خطوة واحدة باستخدام CPA ساهمت بشكل كبير في تبسيط عملية حفظ العينات. استخدمت هذه الطريقة ، مقارنة بتقنيات الحفظ بالتبريد ذات الخطوة الواحدة التي تم الإبلاغ عنها سابقا للخلايا الجذعية المكونة للدم ، تركيزا أقل من DMSO ، وهو تقدم كبير للتطبيقات السريرية. من بين المرضى الستة ، خضع خمسة بنجاح لعملية الزرع. تلقى المريض المتبقي علاجا بديلا بسبب تكرار المرض. أجرينا تقييما إحصائيا لدورة إعادة البناء الوظيفي للمرضى الخمسة الذين أكملوا عملية الزرع. بصرف النظر عن حالة واحدة تم فيها تمديد دورة إعادة البناء بسبب العدوى ، كان متوسط الوقت لإعادة تكوين وظائف المكونة للدم والمناعة 11 يوما ، وهو أسرع من 12.5 يوما المذكورة في الأدبيات السابقة. بشكل حاسم ، لم يلاحظ أي سمية أثناء عملية الزرع. هذه النتيجة جديرة بالملاحظة بشكل خاص عند النظر في أن التركيز النهائي ل DMSO في طريقة CPA كان 2٪ فقط ، مقارنة بتركيز 10٪ (v / v) المستخدم في طريقة TCPA. هذا الاستخدام الناجح لتركيز DMSO المنخفض في CPA لتقليل الآثار الجانبية يتحقق من صحة استراتيجيتنا وهو أمر حيوي للفعالية السريرية.

في ضوء إعادة التكوين الوظيفي المعجل التي لوحظت في دراستنا ، قمنا بالتحقيق في الاختلافات المحتملة في أعداد خلايا CD34 + المنقولة. كشف التحليل الإحصائي أن عدد خلايا CD34 + المنقولة كان ، في المتوسط ، 2.4 × 10⁶ خلايا / كجم ، وهو أقل من الأرقام الواردة في الأدبيات السابقة⁴⁰. قادنا هذا إلى افتراض أن CPA قد يوفر حماية فائقة لمجموعات سكانية فرعية محددة داخل PBHSCs التي تعتبر ضرورية لإعادة تكوين الدم والمناعة. لاستكشاف هذه الفرضية ، أجرينا تحليلا مفصلا للمجموعات السكانية الفرعية ل CLP و GMP و MEP في PBHSCs المحفوظة مع كل من CPA و TCPA. أظهرت النتيجة أن المجموعات السكانية الفرعية ل CLP و MEP في PBHSCs المحفوظة مع CPA زادت مقارنة بتلك المحفوظة مع TCPA ، بينما لم يكن هناك فرق كبير في المجموعات السكانية الفرعية ل GMP. يمكن أن يتمايز CLP إلى خلايا تائية وخلايا بائية وخلايا NK في جسم الإنسان. قد تؤدي الجرعة المتزايدة من CLP إلى تسريع إعادة تكوين المناعة³³. يمكن أن يتمايز الميكانيكي وميكانيكي إلى كريات الدم الحمراء والصفائح^{الدموية 41}. يعزز جليسروفوسفات الصوديوم في CPA تخليق ATP للميتوكوندريا من خلال مكوك الجلسرفوسفات ، مما يعالج عجز الطاقة الناجم عن الحفظ بالتبريد. هذا أمر بالغ الأهمية لخلايا CLP ، التي تعتمد على تحلل السكر لتمايز اللمفاوية⁴². بالإضافة إلى ذلك ، كان الانحراف المعياري العالي لجدوى TCPA أعلى من الانحراف المعياري لتكلفة الاكتساب (7.47 مقابل 2.72 ، الشكل 3) ، مما يشير إلى تباين نتائج TCPA ، والذي قد يكون بسبب ظروف التجميد غير المستقرة. لذلك ، نقترح أن الحفاظ المعزز على CLP و MEP قد يكون عاملا حاسما في تقصير وقت الشفاء لوظيفة المكونة للدم والمناعة. يبدو أن التأثيرات الوقائية الفائقة ل CPA على المجموعات الفرعية CLP و MEP تسهل إعادة البناء الوظيفي بشكل أسرع أثناء علاجات نقل الدم السريرية. هذا لا يحسن النتائج العلاجية فحسب ، بل يقلل أيضا من مدة وتكلفة العلاج للمرضى الذين يخضعون لعملية الزرع. في جوهرها ، تقدم طريقتنا نهجا أكثر اقتصادا ل HSCT ، مما يؤدي إلى تحسين الجوانب السريرية والاقتصادية لرعاية المرضى.

على الرغم من الجهود البحثية المستمرة لتحديد المواد التي يمكن أن تحل محل DMSO ، لا يزال البحث عن بدائل يمثل تحديا. في حين كانت هناك تقارير عن ظهور تقنيات ومواد جديدة في هذا المجال^{، لا تزال} هناك عروض صارمة للسلامة في المختبر لهذه المركبات الجديدة غير موجودة. وبالمثل ، لا توجد أدلة كافية لتأكيد سلامتها وفعاليتها للاستخدام السريري ، لا سيما فيما يتعلق بدراسة الشوائب. لذلك ، تتطلب هذه المواد الناشئة التحقق من الصحة المكثفة قبل تطبيقها في الإعدادات السريرية. في هذا السياق ، نعتقد أن الاستخدام الأمثل ل DMSO ، مع ضمان الحفاظ الفعال على الخلايا ، لا يزال هو الإستراتيجية الأكثر قابلية للتطبيق السريري. سلطت الدراسات السابقة الضوء على دور نقل الجليسروفوسفات في إنتاج ATP وتنظيم نشاط الميتوكوندريا داخل^{الخلايا 45}^،⁴⁶. بناء على هذا الفهم ، نقترح أن دمج جليسروفوسفات الصوديوم في CPA يمكن أن يكون بمثابة استراتيجية فعالة لاستبدال جزء كبير من DMSO المستخدم تقليديا في TCPA كعامل وقائي تناضحي. لا يوجد ذكر للأبحاث الحديثة حول بدائل ثنائي ميثيل سلفوكسيد منخفضة ، مما يشير إلى بعض الحداثة في هذه الطريقة.

بشكل عام ، تشمل الخطوات المحورية في بروتوكول الحفظ بالتبريد الخاص بنا ما يلي: (1) التحكم الدقيق في تركيز DMSO عند 2٪ (حجم / حجم) ، (2) معدل تبريد متحكم فيه يبلغ -1 درجة مئوية / دقيقة ، و (3) الذوبان السريع في حمام مائي 37 درجة مئوية. تضمن هذه الخطوات الحد الأدنى من الإجهاد التناضحي وتكوين بلورات الجليد. والجدير بالذكر أن انخفاض تركيز DMSO يعالج بشكل مباشر مخاوف السمية الخلوية المرتبطة بحلول DMSO التقليدية بنسبة^{10٪ 47}. يمنع التبريد المتحكم فيه تلف الجليد داخل الخلايا ، كما تم التحقق من صحته في الحفظ بالتبريد للخلايا الجذعية الوسيطة⁴⁸ ، بينما يحافظ الذوبان السريع على وظيفة الميتوكوندريا ، وهو عامل حاسم للبقاء بعد الذوبان⁴⁹. قمنا بتحسين ثلاثة جوانب: (ط) طريقة الخلط: كشفت التجارب الأولية عن تراكم الخلايا أثناء إضافة CPA. التبديل إلى الخلط المتساقط مع الدوامة عند 500 دورة في الدقيقة القضاء على التكتل. (ثانيا) بروتوكول التلوين: أدى الغسيل المسبق للخلايا باستخدام PBS الذي يحتوي على 0.05٪ Tween-20 إلى تحسين كفاءة اختراق الأجسام المضادة بنسبة 18٪. (ثالثا) اتساق الذوبان: أدى تنفيذ نافذة ذوبان موحدة مدتها 120 ثانية إلى منع التباين في معدلات الاسترداد (± 2٪ مقابل ± 7٪ في الدراسات التجريبية). بالنسبة للمشكلات الشائعة مثل انخفاض عدد المستعمرات ، أدت زيادة الحجم المتوسط ل MethoCult إلى 2 مل / طبق والتحكم في الرطوبة (>95٪) إلى حل هذه المشكلة ، بما يتماشى مع معايير ثقافة السلف المكونة للدم⁵⁰. هناك قيودان يستحقان الاهتمام: (ط) التحيز السكاني الفرعي: بينما يحافظ CPA بشكل فعال على مجموعات فرعية CLP و MEP ، فإن مجموعات سكانية نادرة مثل CD34 + CD38-CD90 + HSCs طويلة الأجل تظهر تعافيا أقل بنسبة 12٪ مقارنة بالضوابط الجديدة (ص = 0.03). (ثانيا) لتقييم سلامة الهيكل الخلوي ، الذي يعتمد على الصور النوعية ، يجب دمج بعض المقاييس الكمية (على سبيل المثال ، شدة التألق ، والدرجات الهيكلية) في تحليلات أكثر موثوقية. تعمل طريقة CPA الخاصة بنا على تطوير الممارسات الحالية من خلال: (ط) تعزيز السلامة: انخفضت معدلات انحلال الدم من 8.2٪ (TCPA) إلى 1.5٪ (CPA) في 24 ساعة بعد الذوبان (ص < 0.001). (ثانيا) التفوق الوظيفي: أظهرت الخلايا المحفوظة ب CPA تكوين مستعمرة CFU-GEMM أعلى بنسبة 23٪ مقابل TCPA ، وهو أمر بالغ الأهمية للنقش متعدد^{السلالات 51}. (ثالثا) الكفاءة السريرية: يشير نجاح الزرع مع 2.4 × 10⁶ خلايا CD34 + / كجم (مقابل معيار الأدبيات ≥ 4 × 10⁶) إلى تعزيز الفاعلية. هذه التقنية تبشر بما يلي: (ط) تخزين HSC المعدل جينيا: قد تعمل حماية الميتوكوندريا الخاصة ب CPA على استقرار الخلايا المعدلة بواسطة CRISPR أثناء الحفظ بالتبريد⁵². (ثانيا) البنوك العضوية: تظهر البيانات الأولية جدوى بنسبة 89٪ في العضيات المعوية المحفوظة ب CPA مقابل 54٪ في TCPA (ن = 3). (3) شبكات التوزيع العالمية: يتيح المحتوى المنخفض ل DMSO تجارب نقل درجة الحرارة المحيطة باستخدام مواد متغيرة^{الطور 53}.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويعلن جميع المؤلفين أن البحث أجري في غياب أي علاقات تجارية أو مالية يمكن تفسيرها على أنها تضارب محتمل في المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذه الدراسة من قبل مشروع الدعم المالي لبناء التخصص الطبي الرئيسي لمنطقة نانشان ، ومشروع العلوم والتكنولوجيا الرئيسي للنظام الصحي في منطقة شنتشن نانشان (رقم. NSZD2023018) ، ومختبر NHC الرئيسي للتحول الطبي للتكنولوجيا النووية (مستشفى ميانيانغ المركزي. رقم المنحة 2023HYX033).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسم	الشركة	رقم فهرسي
طبق زراعة الخلايا 35 مم	LABSELECT	12111
Acridine Orange / PROPIDIUM IODIDE	Countstar	GMS10139.10
Actin-Tracker Green-488	Beyotime	C1033
Alexa Fluor 488 (AF 488)	Beyotime	A0423
Annexin V-FITC	BD	556420
خلوي للصورة الأوتوماتيكي	على الطاولة Countstar	Rigel-S2
حل الحفاظ على الخلايا XBBC-02	نانجينغ SSCELL التكنولوجيا الحيوية المحدودة	YB020050 YB020100
Colchicine	Beijing Biolab Technology Co.، Ltd.	BP0857
مجهر المسح الضوئي بالليزر متحد البؤر	Zeiss	LSM880
Cytochalasin B	Shanghai Jimi Biotechnology Co.، Ltd.	K0006
DAPI تلطيخ كيت	بكين Biolab التكنولوجيا المحدودة	HR0453
DMSO	Panreacapplichem	A3672
FBS	Gibco	10099-141
مقياس التدفق الخلوي	BD	FACSLSRFortessa
Glycerol	AMRESCO	854
الألبومين البشري	SenBeiJia التكنولوجيا البيولوجية المحدودة	SBJ-DB2044
بيروكسيد الهيدروجين	سيجما-ألدريتش	H1009
Immunostaining Wash Buffer	Biolab Technology Co.، Ltd.	GL1124
المجهر المقلوب	شركة نيكون	ECLIPSE Ti
Invitrogen Tubulin Tracker أحمر عميق	ثيرمو فيشر العلمي	T34077
MethoCult تقنيات	STEMCELL	المتوسطة 4531
PBS	Gibco	10010023
Phalloidin-iFluor 488	Xian Biolite Biotech Co.، Ltd.	23115
محلول ملحي فسيولوجي	بكين Biolab التكنولوجيا المحدودة	GL1735
بروبيديوم يوديد	BD	BDB556463
الرودامين 123	سيجما ألدريتش	R8004
RPMI1640	جيبكو	11875093
الحرارية العلمية فورما Steri-Cycle CO2 حاضنة	حراري فيشر العلمي	371
خلاط دوامة	نانجينغ هوتشوان الالكترونية المحدودة	دي إم تي - 201 زي تي

مقياس Beijing

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lysak, D., et al. Long-term cryopreservation does not affect quality of peripheral blood stem cell grafts: A comparative study of native, short-term and long-term cryopreserved haematopoietic stem cells. Cell Transplant. 30, 9636897211036004(2021).
Araújo, A. B., et al. Effects of cell concentration, time of fresh storage, and cryopreservation on peripheral blood stem cells: Pbsc fresh storage and cryopreservation. Transfus Apher Sci. 61, 103298(2022).
Epperla, N. Astct clinical practice recommendations for transplantation and cellular therapies in diffuse large b cell lymphoma. Transplant Cell Ther. 29 (9), 548-555 (2023).
Alsuliman, T., et al. Autologous hematopoietic cell transplantation as a part of a sequential multi-phase therapeutic approach (r-copadm/cyve/asct) as first-line treatment of high-grade b-cell lymphoma: Results of a retrospective study with long-term follow-up. Bone Marrow Transplant. 58 (4), 437-439 (2023).
Liu, L., et al. The first case of multiple myeloma treated with asct followed by anti-bcma car-t cells using retrovirus vector: A case report. Heliyon. 10 (17), 36955(2024).
Passweg, J. R., et al. Postremission consolidation by autologous hematopoietic cell transplantation (hct) for acute myeloid leukemia in first complete remission (cr) and negative implications for subsequent allogeneic hct in second cr: A study by the acute leukemia working party of the european society for blood and marrow transplantation (ebmt). Biol Blood Marrow Transplant. 26 (4), 659-664 (2020).
Esteghamat, N. S., et al. Utilization of autologous hematopoietic cell transplantation over time in multiple myeloma: A population-based study. Clin Lymphoma Myeloma Leuk. 24 (4), e119-e129 (2024).
Guo, Z., et al. Analysis of allogeneic hematopoietic stem cell transplantation with high-dose cyclophosphamide-induced immune tolerance for severe aplastic anemia. Int J Hematol. 104 (6), 720-728 (2016).
Yanada, M., et al. Allogeneic hematopoietic cell transplantation for patients with acute myeloid leukemia not in remission. Leukemia. 38 (3), 513-520 (2024).
Wang, Q., et al. Chinese guidelines for integrated diagnosis and treatment of intestinal microecology technologies in tumor application (2024 edition). J Cancer Res Ther. 20 (4), 1130-1140 (2024).
Wang, Q., et al. Expert consensus on the relevance of intestinal microecology and hematopoietic stem cell transplantation. Clin Transplant. 38 (4), e15186(2024).
Drozd-Sokolowska, J., et al. Autologous hematopoietic cell transplantation for t-cell prolymphocytic leukemia: A retrospective study on behalf of the chronic malignancies working party of the ebmt. Haematologica. 109 (5), 1608-1613 (2024).
Jantunen, E., Partanen, A., Turunen, A., Varmavuo, V., Silvennoinen, R. Mobilization strategies in myeloma patients intended for autologous hematopoietic cell transplantation. Transfus Med Hemother. 50 (5), 438-447 (2023).
Bonnin, A., et al. mobilization and conditioning protocols actualization for autologous stem cell transplantation for autoimmune diseases: Guidelines from mathec-sfgm-tc. Bull Cancer. 10, (2023).
Khouri, J., et al. Body mass index does not impact hematopoietic progenitor cell mobilization for autologous hematopoietic cell transplantation. J Clin Apher. 34 (6), 638-645 (2019).
Bigi, F., et al. Impact of anti-cd38 monoclonal antibody therapy on cd34+ hematopoietic stem cell mobilization, collection, and engraftment in multiple myeloma patients-a systematic review. Pharmaceuticals. 17 (7), 944(2024).
Drozd-Sokołowska, J., et al. Stem cell mobilization performed with different doses of cytarabine in plasma cell myeloma patients relapsing after previous autologous hematopoietic cell transplantation-a multicenter report by the polish myeloma study group. Cancers. 16 (14), 2588(2024).
Santinelli-Pestana, D. V., et al. Outcomes of patients after mobilization failure of hematopoietic stem cells for autologous stem cell transplantation. Hematol Transfus Cell Ther. 46 (3), 256-260 (2024).
Mitrus, I., et al. A faster reconstitution of hematopoiesis after autologous transplantation of hematopoietic cells cryopreserved in 7.5% dimethyl sulfoxide if compared to 10% dimethyl sulfoxide containing medium. Cryobiology. 67 (3), 327-331 (2013).
Halle, P., et al. Uncontrolled-rate freezing and storage at -80 degrees c, with only 3.5-percent dmso in cryoprotective solution for 109 autologous peripheral blood progenitor cell transplantations. Transfusion. 41 (5), 667-673 (2001).
Davis, J. M., Rowley, S. D., Braine, H. G., Piantadosi, S., Santos, G. W. Clinical toxicity of cryopreserved bone marrow graft infusion. Blood. 75 (3), 781-786 (1990).
Windrum, P., Morris, T. C., Drake, M. B., Niederwieser, D., Ruutu, T. Variation in dimethyl sulfoxide use in stem cell transplantation: A survey of ebmt centres. Bone Marrow Transplant. 36 (7), 601-603 (2005).
Yao, J., Shen, L., Chen, Z., Zhang, B., Zhao, G. Hydrogel microencapsulation enhances cryopreservation of red blood cells with trehalose. ACS Biomater Sci Eng. 8 (5), 2066-2075 (2022).
Bank, H. L., Brockbank, K. G. Basic principles of cryobiology. J Card Surg. 2 (1 Suppl), 137-143 (1987).
Chan, L. L., Mcculley, K. J., Kessel, S. L. Assessment of cell viability with single-, dual-, and multi-staining methods using image cytometry. Methods Mol Biol. 1601, 27-41 (2017).
Kim, M., Cooper, D. D., Hayes, S. F., Spangrude, G. J. Rhodamine-123 staining in hematopoietic stem cells of young mice indicates mitochondrial activation rather than dye efflux. Blood. 91 (11), 4106-4117 (1998).
Frankild, S., Basketter, D. A., Andersen, K. E. The value and limitations of rechallenge in the guinea pig maximization test. Contact Dermatitis. 35 (3), 135-140 (1996).
OECD Guidelines for the Testing of Chemicals. , Organisation for Economic Co-operation and Development. https://www.oecd.org/content/dam/oecd/en/publications/reports/2022/06/test-no-406-skin-sensitisation_g1gh292d/9789264070660-en.pdf (2025).
Poinsatte, K., et al. Quantification of neurovascular protection following repetitive hypoxic preconditioning and transient middle cerebral artery occlusion in mice. J Vis Exp. (99), e52675(2015).
Houh, Y. K., Kim, K. E., Park, H. J., Cho, D. Roles of erythroid differentiation regulator 1 (erdr1) on inflammatory skin diseases. Int J Mol Sci. 17 (12), 2059(2016).
Chin, L., et al. Diffuse optical spectroscopy for the quantitative assessment of acute ionizing radiation induced skin toxicity using a mouse model. J Vis Exp. (111), e53573(2016).
Bazinet, A., Popradi, G. A general practitioner's guide to hematopoietic stem-cell transplantation. Curr Oncol. 26 (3), 187-191 (2019).
André, I., et al. Correction to: Ex vivo generated human t-lymphoid progenitors as a tool to accelerate immune reconstitution after partially HLA compatible hematopoietic stem cell transplantation or after gene therapy. Bone Marrow Transplant. 57 (5), 851(2022).
Herrmann, H., Aebi, U. Structure, assembly, and dynamics of intermediate filaments. Subcell Biochem. 31, 319-362 (1998).
Li, Y. Y., Choy, T. H., Ho, F. C., Chan, P. B. Scaffold composition affects cytoskeleton organization, cell-matrix interaction and the cellular fate of human mesenchymal stem cells upon chondrogenic differentiation. Biomaterials. 52, 208-220 (2015).
Wang, D., et al. Tissue-specific mechanical and geometrical control of cell viability and actin cytoskeleton alignment. Sci Rep. 4, 6160(2014).
Benard, G., Karbowski, M. Mitochondrial fusion and division: Regulation and role in cell viability. Semin Cell Dev Biol. 20 (3), 365-374 (2009).
Von Bomhard, A., Elsässer, A., Ritschl, L. M., Schwarz, S., Rotter, N. Cryopreservation of endothelial cells in various cryoprotective agents and media - vitrification versus slow freezing methods. PLoS One. 11 (2), e0149660(2016).
Kamoshita, M., et al. Successful vitrification of pronuclear-stage pig embryos with a novel cryoprotective agent, carboxylated ε-poly-l-lysine. PLoS One. 12 (4), e0176711(2017).
Castillo, N., et al. Post-thaw viable CD45+ cells and clonogenic efficiency are associated with better engraftment and outcomes after single cord blood transplantation in adult patients with malignant diseases. Biol Blood Marrow Transplant. 21 (12), 2167-2172 (2015).
Woolthuis, C. M., Park, C. Y. Hematopoietic stem/progenitor cell commitment to the megakaryocyte lineage. Blood. 127 (10), 1242-1248 (2016).
Agathocleous, M., et al. Ascorbate regulates haematopoietic stem cell function and leukaemogenesis. Nature. 549 (7673), 476-481 (2017).
Svalgaard, J. D., et al. Low-molecular-weight carbohydrate pentaisomaltose may replace dimethyl sulfoxide as a safer cryoprotectant for cryopreservation of peripheral blood stem cells. Transfusion. 56 (5), 1088-1095 (2016).
Jahan, S., Kaushal, R., Pasha, R., Pineault, N. Current and future perspectives for the cryopreservation of cord blood stem cells. Transfus Med Rev. 35 (2), 95-102 (2021).
Meglasson, M. D., Smith, K. M., Nelson, D., Erecinska, M. Alpha-glycerophosphate shuttle in a clonal beta-cell line. Am J Physiol. 256 (1 Pt 1), E173-E178 (1989).
Willson, J. A., et al. Neutrophil hif-1α stabilization is augmented by mitochondrial ros produced via the glycerol 3-phosphate shuttle. Blood. 139 (2), 281-286 (2022).
Jarocha, D., Zuba-Surma, E., Majka, M. Dimethyl sulfoxide (DMSo) increases percentage of CXCR4 (+) hematopoietic stem/progenitor cells, their responsiveness to an SDF-1 gradient, homing capacities, and survival. Cell Transplant. 25 (7), 1247-1257 (2016).
Hunt, C. J. Cryopreservation: Vitrification and controlled rate cooling. Methods Mol Biol. 1590, 41-77 (2017).
Gao, D., Critser, J. K. Mechanisms of cryoinjury in living cells. Ilar J. 41 (4), 187-196 (2000).
Tonyalı, G., et al. Simple isolation of human bone marrow adipose tissue-derived mesenchymal stem/stromal cells. Curr Protoc. 5 (1), e70081(2025).
He, Y., et al. Hematological effects of glyphosate in mice revealed by traditional toxicology and transcriptome sequencing. Environ Toxicol Pharmacol. 92, 103866(2022).
Bak, R. O., Dever, D. P., Porteus, M. H. Crispr/cas9 genome editing in human hematopoietic stem cells. Nat Protoc. 13 (2), 358-376 (2018).
Bembnista, E., et al. Should we cryopreserve allogenic hematopoietic stem cell grafts. In Vivo. 39 (2), 870-876 (2025).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

تطوير مادة تبريد جديدة منخفضة DMSO للحفاظ على الخلايا الجذعية للدم المحيطي

في هذه المقالة

ملخص

الملخص

المقدمة

البروتوكول

النتائج

المناقشة

الإفصاحات

شكر وتقدير

المواد

المراجع

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

مقالات ذات صلة