يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

تحليل التعبير والمجمعات لبروتينات سلسلة الجهاز التنفسي للميتوكوندريا في الخميرة الانشطارية Schizosaccharomyces pombe

1.2K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/68336

⸱

مايو 2, 2025

 ,  , 
1Jiangsu Key Laboratory for Pathogens and Ecosystems, College of Life Sciences, Nanjing Normal University

في هذه المقالة

ملخص

تظهر الخميرة الانشطارية Schizosaccharomyces pombe كنموذج جذاب لدراسة الميتوكوندريا. هنا ، نصف بروتوكولا لتحليل وفرة وتجميع مجمعات الجهاز التنفسي للميتوكوندريا في S. pombe. يتيح ذلك توصيف الوظائف الجديدة للجينات المحفوظة في سلسلة الجهاز التنفسي للميتوكوندريا.

الملخص

تعتبر سلسلة الجهاز التنفسي للميتوكوندريا ضرورية لعملية التمثيل الغذائي للطاقة الخلوية ، حيث تعمل كجوهر للفسفرة المؤكسدة. تتكون سلسلة الجهاز التنفسي للميتوكوندريا من خمسة مجمعات إنزيمية ومجمعاتها الفائقة المتفاعلة. يعد تحليل التعبير والمجمعات لهذه البروتينات أمرا حيويا لفهم وظيفة الميتوكوندريا. يمكن دراسة ذلك من خلال الجمع بين الأساليب الكيميائية الحيوية والوراثية في كائن حي نموذجي ممتاز خميرة انشطار Schizosaccharomyces pombe (S. pombe) ، والذي يوفر نظاما تعويضيا للخميرة الناشئة لدراسات بيولوجيا الميتوكوندريا. هنا ، نقدم بروتوكولا مفصلا لعزل الميتوكوندريا S. pombe وتحليل مستويات التعبير والمجمعات لتجميع بروتينات الجهاز التنفسي للميتوكوندريا بواسطة الرحلان الكهربائي لجل SDS-polyacrylamide (SDS-PAGE) والصفحة الأصلية الزرقاء (BN-PAGE). باختصار ، يتم تنقية الميتوكوندريا من الطفرات البرية والجينية ، ثم يتم إذابة مجمعاتها وإخضاعها ل SDS-PAGE / BN-PAGE والنشاف المناعي. تتيح هذه الطريقة توصيف الوظيفة الجديدة للجين في سلسلة الجهاز التنفسي للميتوكوندريا.

المقدمة

تلعب الميتوكوندريا أدوارا مهمة في العمليات البيولوجية المتنوعة ، مثل التنفس الخلوي للطاقة ، والتمثيل الغذائي الغذائي ، وموت الخلايا1. يرتبط خلل الميتوكوندريا بأمراض الدماغ والعضلات والنمو2،3. لذلك ، تعتبر الدراسات التي أجريت على الميتوكوندريا أمرا حيويا لتحسين شيخوخة الإنسان وصحته.

الخميرة الناشئة خميرة خميرة (S. cerevisiae) لطالما استخدمت لدراسة وظائف الجينات في الميتوكوندريا4 لأن طفرات الخميرة المعيبة في التنفس لا يزال بإمكانها إنتاج الطاقة للبقاء على قيد الحياة عن طريق التخمير. ومع ذلك ، فهي إيجابية صغيرة ويمكن أن تتكاثر بدون الحمض النووي للميتوكوندريا (mtDNA). وبالتالي ، فإن الطفرات الجينية المعيبة في التعبير الجيني للميتوكوندريا غالبا ما تفقد mtDNA الخاص بها ، مما يعقد المزيد من الدراسة. في المقابل ، فإن الخميرة الانشطارية Schizosaccharomyces pombe (S. pombe) ، البعيدة تطوريا عن S. cerevisiae ، هي خميرة سلبية صغيرة تتطلب mtDNA للبقاء على قيد الحياة. علاوة على ذلك ، فإن تنظيم mtDNA و mRNA للميتوكوندريا ل S. pombe مشابه لتلك الموجودة في حقيقيات النوىالأعلى 5. العديد من (96) الجينات الأساسية في S. pombe ، مقارنة بستة جينات أساسية فقط في S. cerevisiae ، مطلوبة للتعبير الجيني للميتوكوندريا6. وهكذا ، فإن S. pombe يظهر كنموذج جذاب لدراسة الوظائف الجديدة للجينات في الميتوكوندريا. ومع ذلك ، فإن عدد المنشورات التي تدرس الميتوكوندريا في S. cerevisiae يزيد بحوالي 100 مرة عن تلك الموجودة في S. pombe ، كما أن الأساليب والبروتوكولات المبلغ عنها التي تدرس الميتوكوندريا في S. pombe نادرةأيضا 7.

تعتبر سلسلة الجهاز التنفسي للميتوكوندريا ضرورية لإنتاج الطاقة الخلوية وتعمل كنواة للميتوكوندريا8. وهو يتألف من مجمعات سلسلة الجهاز التنفسي I-V ، مثل NADH-ubiquinone oxidoreductase (المركب الأول) ، نازعة هيدروجين السكسينات (المركب II) ، ubiquinone-cytochrome c oxidoreductase أو cytochrome bc1 complex (المركب الثالث) ، السيتوكروم ج أوكسيديز (المركب الرابع) ، و ATP synthase (المركب V) ، جنبا إلى جنب مع ركيزتين وسيطتين تحملان الإلكترون ، يوبيكوينون (CoQ) وسيتوكروم ج (Cyt c)9. كما أنها تتفاعل وتشكل مجمعات فائقة من الترتيب الأعلى ، والتي لا تزال آليات تجميعها غير واضحة إلى حد كبير10،11. ومع ذلك ، فإن S. pombe يفتقر إلى المركب I ، والذي يمكن استبداله بنازعة هيدروجين NADH الخارجية Nde1 و Ndi1 الداخلية12،13،14. جينوم الميتوكوندريا في S. pombe يشفر وحدة فرعية من المركب III (Cob1) ، وثلاث وحدات فرعية من المركب IV (Cox1 ، Cox2 ، Cox3) ، وثلاث وحدات فرعية من المركب V (Atp6 ، Atp8 ، Atp9) 15،16. لقد أبلغنا مؤخرا أن التعبير عن هذه البروتينات وتجميع المجمعات تتأثر بحذف RNA helicase Mss116 (Δmss116) 16 وعامل التجميع Shy1 (Δshy1) 15 في S. pombe ، على التوالي. لتسهيل اكتشاف المزيد من الوظائف الجديدة للجينات في سلسلة الجهاز التنفسي للميتوكوندريا باستخدام هذه الطرق ، نقدم هنا بروتوكولا مفصلا لتحليل الرحلان الكهربائي لجل SDS-polyacrylamide (SDS-PAGE) لمستويات التعبير وتحليل BLUE NATIVE-PAGE (BN-PAGE) لتجميع المجمعات لبروتينات سلسلة الجهاز التنفسي للميتوكوندريا في S. pombe.

يعتمد الأساس المنطقي وراء عزل الميتوكوندريا عن S. pombe على الأساليب المعمول بها في S. cerevisiae17. يتم تحضير البلاستيدات الكروية أولا عن طريق هضم جدران خلايا الخميرة. يتم تجانسها ميكانيكيا ، ويتم تجزئة الميتوكوندريا عن طريق الطرد المركزي التفاضلي18. بعد ذلك ، يتم إذابة بروتينات السلسلة التنفسية للميتوكوندريا ولمستها المناعية بعد SDS-PAGE و BN-PAGE. تم تطوير تقنية BN-PAGE في الأصل لفصل بروتينات غشاء الميتوكوندريا مثل مجمعات سلسلة الجهاز التنفسي19،20،21. يتم إذابة بروتينات الغشاء ذات المجمعات السليمة المحفوظة بواسطة منظفات غير أيونية خفيفة ويتم شحنها بواسطة الصبغة الأنيونية Coomassie G-250. وبالتالي ، يتم فصل مجمعات البروتين وفقا لكتلتها في هلام PAGE الأصليالمتدرج 22. وقد استخدمت هذه الطريقة على نطاق واسع لدراسة مجمعات سلسلة الجهاز التنفسي للميتوكوندريا في S. cerevisiae23 وخلايا الثدييات24،25; ومع ذلك ، لم يتم تطبيقه على نطاق واسع على S. بومبي الميتوكوندريا.

بشكل جماعي ، نقدم هنا طريقة يتم فيها عزل الميتوكوندريا من S. بومبي الخلايا ، وتخضع بروتينات سلسلة الجهاز التنفسي للميتوكوندريا ل SDS-PAGE و BN-PAGE متبوعا بالنشاف المناعي. يتم توضيح المخطط الانسيابي التجريبي في الشكل 1. مع الميتوكوندريا والأجسام المضادة عالية الجودة ، يمكن أيضا تطبيق هذه الطريقة الموضحة في S. pombe على الكائنات الحية الأخرى لتحديد المزيد من الجينات ذات الوظائف في التعبير و / أو تجميع المجمعات لبروتينات السلسلة التنفسية للميتوكوندريا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. تحضير S. pombe spheroplasts

  1. تنمو 1 لتر من S. بومبي الخلايا في مستخلص الخميرة مع وسائط المكملات الغذائية (نعم) (الجدول 1) لسلالة معينة (WT أو Δshy1) من OD600 = 0.05 إلى OD600 = 1.0.
    ملاحظة: لا تزرع S . خلايا بومبي ب OD600 أكثر من 2.0 ، حيث يصعب هضمها بواسطة الإنزيمات المحللة لتشكيل البلاستيدات الكروية. يمكن زراعة كل من السلالات البرية (WT) والجينات المتحولة بالتوازي للحصول على نتائج قابلة للمقارنة.
  2. حصاد الخلايا عن طريق الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 3,000 × جم عند 4 درجات مئوية. قم بتعليق الخلايا المحببة في 500 مل من ddH2O وخلايا الحبيبات عن طريق الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 3,000 × جم عند 4 درجات مئوية. اغسل الخلايا 1x.
  3. قياس الوزن الرطب لحبيبات الخلية (حوالي 2 غرام ل 1,000 OD600 خلية). قم بتعليق الخلايا في 8 مل من المخزن المؤقت 1x S (الجدول 2 ؛ 4 مل من الخلايا العازلة S / g). أضف ثنائي ثيوثريتول (DTT) إلى 10 ملي مولار وفلوريد فينيل ميثيل سلفونيل (PMSF) إلى 1 ملي مولار طازجا.
  4. أضف الإنزيمات اللايتية إلى تعليق الخلية لهضم جدار الخلية ل S. pombe. قم بالتدوير في شاكر عند 30 درجة مئوية للوقت الذي يعتمد على الإنزيم المحلل المستخدم.
    ملاحظة: يعد الهضم السليم لجدار الخلية خطوة حاسمة لعزل الميتوكوندريا عالية الجودة.
    1. بالنسبة لإنزيم التحلل ، أضف 100 مجم من المسحوق لكل غرام من الوزن الرطب للخلايا واحتضنه لمدة 2 ساعة تقريبا. بالنسبة إلى Lyticase ، أضف 10 مجم من المسحوق لكل غرام من الوزن الرطب واحتضنه لمدة 1 ساعة تقريبا. بالنسبة إلى Zymolyase-20T / 100T ، أضف 5 مجم / 1 مجم من المسحوق لكل غرام من الوزن الرطب واحتضنه لمدة 1 ساعة تقريبا. بالنسبة إلى Lallzyme MMX ، أضف 1 جم من المسحوق لكل غرام من الوزن الرطب واحتضنه لمدة 0.5 ساعة تقريبا. بالنسبة لإنزيم Vinotaste ، أضف 1 جم من المسحوق لكل غرام من الوزن الرطب واحتضنه لمدة ساعتين تقريبا.
  5. لاحظ تكوين البلاستيدات الكروية عن طريق الفحص المجهري (هدف 40x). خذ 20 ميكرولتر من تعليق الخلية في المخزن المؤقت S وأضفه إلى 1 مل من ddH2O ، ولاحظ أن معظم الخلايا مكسورة (الشكل 2 ج).
    ملاحظة: الخلايا العادية S. pombe لها أشكال قضيب (الشكل 2 أ). يجب أن يصبح أكثر من 80٪ من البلاستيدات الكروية في المخزن المؤقت S ، بعد الهضم الفعال ، مستديرة (الشكل 2 ب).
  6. البلاستيدات الكروية الحبيبات بالطرد المركزي لمدة 10 دقائق عند 1,000 × جم عند 4 درجات مئوية. أعد تعليق البلاستيدات الكروية في 8 مل من المحلول المؤقتة 1x S المثلج واغسلها 2x. أعد تعليق البلاستيدات الكروية برفق باستخدام الماصات ذات الأطراف المقطوعة.

2. التجانس الميكانيكي ل S. pombe spheroplasts

  1. أعد تعليق البلاستيدات الكروية في 8 مل من محلول التجانس المثلج البارد 1x (الجدول 3 ؛ 4 مل من المخزن المؤقت للتجانس / خلايا g) مع مثبطات البروتياز 1x. انقل الخلايا إلى الخالط الزجاجي المبرد مسبقا (مطحنة المناديل Dounce بمدقة وأنبوب اختبار).
  2. قم بتجانس الخلايا ميكانيكيا عن طريق عمل ما يقرب من 15 ضربة لأعلى ولأسفل باستخدام المدقة الضيقة. لمنع بروتينات الميتوكوندريا من التدهور ، تجنب الفقاعات أثناء السكتات الدماغية واحتضان دائما مخزن التجانس والمجانس على الجليد.
    ملاحظة: هناك نوعان من المدقات ذات التركيبات الضيقة والفضفاضة في أنبوب الاختبار. إذا تم استخدام مدقة فضفاضة ، فقد تكون هناك حاجة إلى ما يصل إلى 25 ضربة. يجب تحسين عدد السكتات الدماغية لأن الكثير من السكتات الدماغية يمكن أن تلحق الضرر بأغشية الميتوكوندريا ، كما أن عددا قليلا جدا من السكتات الدماغية يقلل من إنتاجية الميتوكوندريا.
  3. افحص غشاء الخلية المكسور في البلاستيدات الكروية بالمجهر (هدف 40x).
    ملاحظة: تفقد معظم البلاستيدات الكروية شكلها الانكساري وتصبح خلايا شبحية في مخزن مؤقت للتجانس. الميتوكوندريا لا تزال سليمة.

3. عزل الميتوكوندريا S. pombe عن طريق الطرد المركزي

  1. نقل المعلق المتجانس إلى أنابيب الطرد المركزي والخلايا الحبيبات غير المنقطعة والحطام عن طريق الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 1,000 × جم عند 4 درجات مئوية.
  2. جهاز الطرد المركزي المادة الطافية الناتجة لمدة 5 دقائق عند 3,000 × جم عند 4 درجات مئوية ونواة الحبيبات. كرر هذه الخطوة 1x حتى لا يكون هناك تكوين بيليه.
  3. نقل المادة الطافية إلى أنابيب طرد مركزي جديدة وميتوكوندريا بيليه وعضيات أخرى ملوثة عن طريق الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة عند 12,000 × جم عند 4 درجات مئوية.
  4. صب الطاف وإعادة تعليق الحبيبات في 1 مل من المثلج البارد 1x Sorbitol-EDTA-MOPS (SEM) (الجدول 4). جهاز طرد مركزي لمدة 15 دقيقة عند 12,000 × جم عند 4 درجات مئوية لغسل الميتوكوندريا.
  5. أعد تعليق الحبيبات في 1 مل من المخزن المؤقت المثلج البارد 1x SEM وقم بنقل الميتوكوندريا للتجارب المستقبلية.
    ملاحظة: تحتوي هذه الحبيبات على الميتوكوندريا الخام. يمكن تخزينه عند -80 درجة مئوية لتجارب SDS-PAGE و BN-PAGE لاحقا. يمكن أيضا تنقية الميتوكوندريا الخام عن طريق التدرج الشديد لكثافة السكروز ، والطرد المركزي الفائق لأغراض تجريبية أخرى.

4. SDS-PAGE والنشاف المناعي لبروتينات سلسلة الجهاز التنفسي للميتوكوندريا

  1. قم بقياس التركيز الكلي للبروتين لكمية الميتوكوندريا باستخدام مجموعة قياس بروتين BCA عن طريق تخفيف معلق الميتوكوندريا حوالي 25 ضعفا.
  2. أضف المخزن المؤقت لتحميل SDS-PAGE إلى 40 ميكرولتر من بروتينات الميتوكوندريا الإجمالية. قم بتشويه البروتينات عن طريق احتضانها للوقت المحدد في درجة الحرارة المناسبة.
    1. للكشف عن S. pombe Cox1 و Cox3 و Cob1 و Atp6 ، قم بتغيير طبيعة بروتينات الميتوكوندريا عند 45 درجة مئوية لمدة 3 دقائق. للكشف عن S. pombe Cox2 و Hsp60 ، قم بتغيير طبيعة بروتينات الميتوكوندريا عند 90 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
  3. قم بتحميل حوالي 20 ميكروغرام (حوالي 4 ميكرولتر) من بروتينات الميتوكوندريا في هلام SDS-PAGE بنسبة 12٪. إجراء النشاف المناعي لبروتينات السلسلة التنفسية للميتوكوندريا مع الأجسام المضادة المناسبة كما هو موضح في الخطوة 615.
    ملاحظة: S. pombe يتم ترميز بروتينات Cob1 و Cox1 و Cox2 و Cox3 و Atp6 بواسطة mtDNA ، والذي يصعب تعديله مثل وضع العلامات باستخدام حاتمة مشتركة حتى في S. pombe. وبالتالي ، هناك حاجة إلى أجسام مضادة محددة للكشف عن هذه البروتينات. للتحقق من نقاء وسلامة الميتوكوندريا المعزولة ، يمكن اختبار بروتينات السلسلة التنفسية هذه في وقت واحد في المادة الطافية ، والتي يجب أن تحتوي على بروتينات سيتوبلازمية ونووية. على العكس من ذلك ، يمكن اختبار البروتينات السيتوبلازمية والنووية التمثيلية مثل الأكتين والهيستون H3 في عينة الميتوكوندريا.

5. تحضير عينة الميتوكوندريا ل BN-PAGE

  1. ميتوكوندريا الحبيبات من الحصص السابقة في الخطوة 3.5 عن طريق الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة عند 12,000 × جم عند 4 درجات مئوية. استخدم 2 مجم من بروتينات الميتوكوندريا (حوالي 400 ميكرولتر من الحصص الميتوكوندريا) لتحليل BN-PAGE.
  2. أعد تعليق الميتوكوندريا في 200 ميكرولتر من 3x BN-PAGE جل عازل (1.5 م 6-حمض أمينوكابرويس ؛ 150 ملي مبل بيس تريس ، درجة الحموضة 7.0 ، معدلة باستخدام حمض الهيدروكلوريك). أضف 2 ميكرولتر من 100x PMSF و 1 ميكرولتر من 1 M MgCl2. جهاز الطرد المركزي التعليق لمدة 15 دقيقة عند 12,000 × جم عند 4 درجات مئوية.
  3. أعد تعليق حبيبات الميتوكوندريا في 160 ميكرولتر من 5٪ (وزن / حجم) ديجيتونين (DG) أو 64 ميكرولتر من 5٪ (وزن / حجم) n-Dodecyl-β-D-maltopyranoside (DDM). احتضن على الثلج لمدة 30 دقيقة مع الخلط اللطيف كل 10 دقائق.
    1. بالنسبة للتجارب الأولى في S. pombe ، أضف 4 مجم منظف DG لكل مجم من بروتينات الميتوكوندريا لإذابة أغشية الميتوكوندريا للحفاظ على مجمعات سلسلة الجهاز التنفسي الفائقة. أضف 1.6 مجم من منظف DDM لكل مجم من بروتينات الميتوكوندريا لفصل مجمعات سلسلة الجهاز التنفسي للميتوكوندريا الفردية. اضبط تركيز علاج DG و DDM عن طريق زيادة أو تقليل 2 أضعاف وفقا للنتائج الأولية لمجمعات البروتين المختلفة في BN-PAGE.
  4. جهاز الطرد المركزي التعليق لمدة 5 دقائق عند 20,000 × جم عند 4 درجات مئوية. انقل المادة الطافية وقم بقياس تركيز البروتين المذاب باستخدام مجموعة القياس الكمي BCA.
  5. أضف 80 ميكرولتر (1/2 حجم منظف) من 3x BN-PAGE عازل عينة (الجدول 5) إلى حوالي 160 ميكرولتر من المادة الطافية المعالجة ب DG أو أضف 32 ميكرولتر (1/2 حجم منظف) من 3x BN-PAGE عازل عينة إلى حوالي 64 ميكرولتر من المادة الطافية المعالجة ب DDM.
    ملاحظة: على عكس SDS-PAGE ، لا يمكن تغيير طبيعة عينات البروتين الخاصة ب BN-PAGE عن طريق الغليان.

6. BN-PAGE والنشاف المناعي لمجمعات سلسلة الجهاز التنفسي للميتوكوندريا

  1. قم بتجميع جل Bis-Tris الأصلي مسبقة الصب (3٪ -12٪ تدرج). بدلا من ذلك ، قم بإعداد جل Bis-Tris الأصلي المصنوع يدويا (3٪ -12٪ تدرج) عن طريق خلط 3٪ و 12٪ BN-PAGE (الجدول 6) في خلاط متدرج.
  2. قم بتحميل عينات البروتين المعالجة ب DG أو DDM وعلامة البروتين ذات الوزن الجزيئي العالي ل PAGE الأصلي.
    1. مطلوب ما مجموعه 100 ميكروغرام من بروتينات الميتوكوندريا القابلة للذوبان لتحليل BN-PAGE لمجمعات سلسلة الجهاز التنفسي للميتوكوندريا. قم بتحميل ما يقرب من 12 ميكرولتر من عينة البروتين المعالجة ب DG أو 5 ميكرولتر من عينة البروتين المعالجة ب DDM في جل BN-PAGE. اضبط حجم التحميل للتأكد من أن شدة التحكم في التحميل ، مثل بروتين مصفوفة الميتوكوندريا Mcp60 (Hsp60) ، متساوية بين جميع العينات بعد التعرض النهائي15.
  3. قم بتشغيل الجل بجهد / تيار ثابت يبلغ 80 فولت / 6 مللي أمبير لمدة 30 دقيقة تقريبا باستخدام عازلة الكاثود مع 0.02٪ (وزن / حجم) Coomassie G-250. بعد ذلك ، استبدل المخزن المؤقت للكاثود الأزرق بمخزن مؤقت للكاثود بدون Coomassie G-250 واستمر في العمل بتيار ثابت يبلغ 10 مللي أمبير لمدة 3 ساعات تقريبا حتى تصل واجهة الصبغة الزرقاء Coomassie G-250 إلى قاع الجل.
    1. لمنع مجمعات سلسلة الجهاز التنفسي للميتوكوندريا من التدهور أو التفكيك ، قم بتشغيل الجل بمخازن مبردة مسبقا عند 4 درجات مئوية. بالنسبة للهلام مسبقة الصب ، استخدم المخزن المؤقت للتشغيل مسبقة الصب. بالنسبة للجل المصنوع يدويا ، استخدم المخزن المؤقت لتشغيل الأنود 1x BN-PAGE (50 ملي مولار Bis-Tris ، درجة الحموضة 7.0 ، معدلة باستخدام HCl) و 1x BN-PAGE كاثود تشغيل المخزن المؤقت (15 ملي مولار Bis-Tris ، درجة الحموضة 7.0 ، معدلة باستخدام حمض الهيدروكلوريك ؛ 50 ملي مولار تريسين).
  4. قطع حارة الجل المحملة بعلامة البروتين. قم بتلطيخ العلامة باستخدام عازلة Coomassie R-250 لمدة 15 دقيقة. قم بتثبيته حتى تظهر العلامة.
    ملاحظة: علامة البروتين ذات الوزن الجزيئي العالي ل PAGE الأصلية ليست ملطخة مسبقا. سيكون مرئيا بعد تلطيخه باستخدام Coomassie R-250.
  5. اغمر الجزء الآخر من الجل في المخزن المؤقت لنقل 1x BN-PAGE (الجدول 7) لموازنة 30 دقيقة. اشطف غشاء لطخة PVDF من نفس الحجم 0.45 ميكرومتر بميثانول 100٪ واغمره في المخزن المؤقت لنقل BN-PAGE لموازنة لمدة 10 دقائق. انقل البروتينات في الجل إلى غشاء لطخة PVDF 0.45 ميكرومتر تحت تيار ثابت يبلغ 300 مللي أمبير لمدة ساعتين.
    ملاحظة: لا ينصح باستخدام غشاء النيتروسليلوز (NC) لأن غشاء NC يربط صبغة Coomassie G-250 بإحكام شديد.
  6. اشطف غشاء PVDF بميثانول 100٪ لغسل صبغة Coomassie G-250 الزرقاء. احتضان غشاء PVDF في 1x TBS (50 ملي مولار تريس ، درجة الحموضة 8.0 ، معدلة باستخدام حمض الهيدروكلوريك ؛ 150 ملي كلوريد الصوديوم) المخزن المؤقت القائم على الحجب الذي يحتوي على 5٪ (وزن / حجم) حليب خالي الدسم لمدة ساعة واحدة عند 25 درجة مئوية.
  7. احتضان غشاء PVDF بالأجسام المضادة الأولية المشار إليها ضد مجمعات سلسلة الجهاز التنفسي للميتوكوندريا S. pombe بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: تركيز الجسم المضاد Cob1 للكشف عن المركب III هو 1: 1,000. تركيز الجسم المضاد Cox1 للكشف عن المركب الوريدي هو 1: 2,000. تركيز الجسم المضاد Atp6 للكشف عن المركب V هو 1: 200.
  8. اغسل غشاء PVDF بمخزن مؤقت 1x TBST (الجدول 8). احتضان غشاء PVDF بالجسم المضاد الثانوي بتركيز 1: 10,000 لمدة ساعة عند 25 درجة مئوية.
  9. اغسل غشاء PVDF بمخزن مؤقت 1x TBST. كشف ومسح غشاء PVDF. قم بمحاذاة الصورة المكشوفة لجل BN-PAGE مع صورة علامة البروتين الأصلية لتقدير الأوزان الجزيئية لمجمعات السلسلة التنفسية للميتوكوندريا والمجمعات الفائقة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

استخدمنا هذا البروتوكول سابقا للتحقيق في آثار حذف shy1 ، S . pombe متماثل ل SURF1 البشري ، على التعبير عن بروتينات سلسلة الجهاز التنفسي المشفرة mtDNA وتجميع مجمعات سلسلة الجهاز التنفسي للميتوكوندريا. وجدنا أن مستويات الحالة المستقرة ل Cob1 و Cox1 و Cox2 و Cox3 و Atp6 قد انخفضت بشكل كبير في سلالة Δshy1 (الشكل 3) ، مما يشير إلى أن Shy1 مطلوب للتعبير عن بروتينات السلسلة التنفسية المشفرة بواسطة mtDNA. علاوة على ذلك ، أظهر تحليل BN-PAGE أن وفرة المجمعات الفائقة...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

في هذه الدراسة ، نقدم بروتوكولا مفصلا لعزل الميتوكوندريا S. pombe وإجراء SDS-PAGE و BN-PAGE لتحليل التعبير والمجمعات لبروتينات سلسلة الجهاز التنفسي للميتوكوندريا.

يستخدم الترسيب المناعي المشترك (co-IP) بشكل شائع للكشف عن تجميع مجمعات البروتين. ومع ذلك ، من الصعب على Co-IP اكتشاف تجميع بروتينات غشاء الميتوكوندريا. بدلا من ذلك ، تتمتع BN-PAGE بالعديد من المزايا: (أنا) لا تستطيع بعض الأجسام المضادة التعرف على الحلقات المدفونة في مجمعات البروتين الأصلية أ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدينا تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

نشكر الدكتور يينغ هوانغ والدكتور يينغ لوه على دعمهما. تم دعم هذا العمل بمنح (32270048 إلى JS و 31900403 إلى G.F.) من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
6-حمض أمينوكابرويسسانجونA430196
أكريلاميد / مكرر (37.5: 1) 40٪   ؛BiolabGS1374
بيرسولفات الأمونيومسانجونA100486
الأجسام المضادة المضادة ل ATP6BioworldالداخليةIB: 1: 200
الجسم المضاد المضاد ل Cob1BioworldIBداخلي: 1: 1000
الجسم المضاد المضاد ل Cox1BioworldداخليIB: 1: 2000
الأجسام المضادة ل Cox2Bioworldالداخلية: 1: 1000
الأجسام المضادة ل Cox3BioworldالداخليةIB: 1: 200
الأجسام المضادة المضادة ل Hsp60BioworldالداخليةIB: 1: 3000
مجموعة قياس البروتين BCALEAGENEPT0001
Bis-TrisYEASEN60105ES25
Coomassie Brilliant Blue G-250SERVA17524.01
Coomassie أزرق لامع R-250سانجونA100472
ديجيتونينسيجماD141
D-SorbitolSangonA100691
EDTASolarbioE8030
خلاط متدرجالدخن العلميMGM-50
HEPESSolarbioH8090
بروتين عالية الوزن الجزيئي ل الصفحة الأصليةفي الوقت الحقيقيRTD6142
IgG-Alexa Fluor Plus 800 (الجسم المضاد الثانوي المضاد للأرانب)Thermo FisherA32735IB: 1: 10000
Immobilon-FL 0.45 & mu ؛ م PVDF غشاءMilliporeIPFL00005
Kimble Kontes Dounce طاحونة الأنسجةThermo FisherK8853000015
KOHSangonA610441
Lallzyme MMXLallemandNA.
إنزيم التحللSigmaL3768
LyticaseSigmaL4025
MgCl2SangonA601336
MOPSSangonA421333
Native Bis-Tris Gels (مسبقة الصب)SolarbioPG41510-N
PMSFSangonA610425
مسبقة الصب قيد التشغيل مخزن مؤقت ل Native-PAGESolarbioPG00020-N
Protease مثبط كوكتيل لمستخلصات الخميرةBeyotimeP1020
السكروزسانجونA610498 
تيميدسيجماT9281
تريسينسيجماT0377
توين -20سولاربيوT8220
فينوتيستنوفوزيميسإن إيه
ZymolyaseMP Biomedicals320921
IB علامة جل

المراجع

  1. Schatz, G. Getting mitochondria to center stage. Biochem Biophys Res Comm. 434 (3), 407-410 (2013).
  2. Schapira, A. H. Mitochondrial disease. Lancet. 368 (9529), 70-82 (2006).
  3. Lin, M. T., Beal, M. F. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in neurodegenerative diseases. Nature. 443 (7113), 787-795 (2006).
  4. Malina, C., Larsson, C., Nielsen, J. Yeast mitochondria: an overview of mitochondrial biology and the potential of mitochondrial systems biology. FEMS Yeast Res. 18 (5), (2018).
  5. Kühl, I., Dujeancourt, L., Gaisne, M., Herbert, C. J., Bonnefoy, N. A genome wide study in fission yeast reveals nine PPR proteins that regulate mitochondrial gene expression. Nucl Acid Res. 39 (18), 8029-8041 (2011).
  6. Uehara, L., et al. Multiple nutritional phenotypes of fission yeast mutants defective in genes encoding essential mitochondrial proteins. Open Biol. 11 (4), 200369(2021).
  7. Mori, A., et al. In fission yeast, 65 non-essential mitochondrial proteins related to respiration and stress become essential in low-glucose conditions. Rl Soc Open Sci. 10 (10), 230404(2023).
  8. Vercellino, I., Sazanov, L. A. The assembly, regulation and function of the mitochondrial respiratory chain. Nat Rev Mol Cell Biol. 23 (2), 141-161 (2022).
  9. Rich, P. R., Maréchal, A. The mitochondrial respiratory chain. Essays Biochem. 47, 1-23 (2010).
  10. Lobo-Jarne, T., Ugalde, C. Respiratory chain supercomplexes: Structures, function and biogenesis. Semin Cell Dev Biol. 76, 179-190 (2018).
  11. Guan, S., Zhao, L., Peng, R. Mitochondrial Respiratory Chain Supercomplexes: From Structure to Function. Int J Mol Sci. 23 (22), 13880(2022).
  12. Luttik, M. A. H., et al. The Saccharomyces cerevisiae NDE1 and NDE2 Genes Encode Separate Mitochondrial NADH Dehydrogenases Catalyzing the Oxidation of Cytosolic NADH. J Biol Chem. 273 (38), 24529-24534 (1998).
  13. Li, W., et al. Yeast AMID Homologue Ndi1p Displays Respiration-restricted Apoptotic Activity and Is Involved in Chronological Aging. Mol Biol Cell. 17 (4), 1802-1811 (2006).
  14. Malecki, M., Bähler, J. Identifying genes required for respiratory growth of fission yeast. Wellcome Open Rese. 1, 12(2016).
  15. Luo, Y., Xu, Y., Ahmad, F., Feng, G., Huang, Y. Characterization of Shy1, the Schizosaccharomyces pombe homolog of human SURF1. Sci Rep. 14 (1), 21678(2024).
  16. Wang, Y., Feng, G., Huang, Y. The Schizosaccharomyces pombe DEAD-box protein Mss116 is required for mitoribosome assembly and mitochondrial translation. Mitochondrion. 76, 101881(2024).
  17. Izawa, T., Unger, A. K. Isolation of Mitochondria from Saccharomyces cerevisiae. Meth Mol Biol. 1567, 33-42 (2017).
  18. Gregg, C., Kyryakov, P., Titorenko, V. I. Purification of Mitochondria from Yeast Cells. J Vis Exp. (30), e1417(2009).
  19. Schägger, H., von Jagow, G. Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form. Anal Biochem. 199 (2), 223-231 (1991).
  20. Schägger, H. Native electrophoresis for isolation of mitochondrial oxidative phosphorylation protein complexes. Meth Enzymol. 260 (C), 190-202 (1995).
  21. Schägger, H. Blue-native gels to isolate protein complexes from mitochondria. Meth Cell Biol. (65), 231-244 (2001).
  22. Wittig, I., Braun, H. P., Schägger, H. Blue native PAGE. Nat Protoc. 1 (1), 418-428 (2006).
  23. Lemaire, C., Dujardin, G. Preparation of respiratory chain complexes from Saccharomyces cerevisiae wild-type and mutant mitochondria activity measurement and subunit composition analysis. Meth Mol Biol. 432, 65-81 (2008).
  24. Konovalova, S. Analysis of Mitochondrial Respiratory Chain Complexes in Cultured Human Cells using Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis and Immunoblotting. J Vis Exp. (144), e59269(2019).
  25. Fiala, G. J., Schamel, W. W. A., Blumenthal, B. Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis (BN-PAGE) for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates. J Vis Exp. (48), e2164(2011).
  26. Flor-Parra, I., Zhurinsky, J., Bernal, M., Gallardo, P., Daga, R. R. A Lallzyme MMX-based rapid method for fission yeast protoplast preparation. Yeast. 31 (2), 61-66 (2014).
  27. Sellem, C. H., Lemaire, C., Lorin, S., Dujardin, G., Sainsard-Chanet, A. Interaction Between the oxa1 and rmp1 Genes Modulates Respiratory Complex Assembly and Life Span in Podospora anserina. Genetics. 169 (3), 1379-1389 (2005).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

تعبير البروتين الميتوكوندريالفصل الكهربائي للهلام بـ "النيتيف الأزرق"الفصل الكهربائي للهلام بـ "دوديسلفات الصوديوم"عزل الميتوكوندرياالمعقدات الفائقة للسلسلة التنفسيةالتحليل المناعي البروتينيميتوكوندريا خميرة الانشطار
تحليل التعبير والمجمعات لبروتينات سلسلة الجهاز التنفسي للميتوكوندريا في الخميرة الانشطارية Schizosaccharomyces pombe
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.