مقالة منهجية

التصنيع القابل للتكرار ل SPOT كمنصة ثقافية عالية الإنتاجية قائمة على السقالات

DOI:

10.3791/68405

⸱

يوليو 29, 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Biomedical Engineering, University of Toronto, 2Department of Chemical Engineering and Applied Chemistry, University of Toronto, 3Division of Engineering Science, University of Toronto

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوثق هذا البروتوكول تصنيع وتجميع SPOT ، وهي منصة ثقافة عالية الإنتاجية قائمة على السقالات ، بتنسيقات 96 و 384 بئرا. كما أنه يفصل عملية البذر ل SPOT ، سواء كان يدويا أو باستخدام معالج السوائل المتاح تجاريا.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أصبحت العضيات المشتقة من المريض (PDOs) تستخدم بشكل متزايد في مجال أبحاث السرطان لنمذجة الأورام. فهي تجمع بين فوائد النماذج في الجسم الحي والتقليدية في المختبر ، وتلخص تعقيد الأنسجة وعدم التجانس بينما لا تزال تتكون من خلايا بشرية. أدى ظهور نماذج PDO التمثيلية من الناحية الفسيولوجية إلى الحاجة إلى أجهزة تتيح التحليل المباشر للسلوك العضوي. يشرح هذا البروتوكول كيفية تجميع واستخدام النظام الأساسي للأنسجة العضوية (SPOT) المدعوم من السقالات ، وهو جهاز ثقافة عضوي عالي الإنتاجية وثلاثي الأبعاد (3D). تقضي هذه المنصة على الغضروف المفصلي الذي يتكون عادة من الهلاميات المائية المصنفة للسماح بتصوير دقيق وسريع ، على غرار عملية التصوير للثقافات ثنائية الأبعاد (2D). نتيجة لذلك ، يمكن بسهولة تصوير العضيات والثقافات المشتركة المصنفة في SPOT باستخدام الفحص المجهري عالي الإنتاجية. تم تصميم SPOT للاستخدام الجاهز ، وهو متاح للباحثين الذين لديهم خبرة أساسية في زراعة الأنسجة ومتوافق مع كل من سير عمل البذر اليدوي والآلي. يوضح هذا البروتوكول بالتفصيل تصنيع SPOT بتنسيقات 96 و 384 بئرا ، بما في ذلك الإرشادات خطوة بخطوة للتجميع والبذر ومراقبة الجودة واستكشاف الأخطاء وإصلاحها. بينما يتطلب التصنيع 3-4 ساعات ، باستثناء وقت الخمول ، يمكن إنتاج لوحات متعددة في وقت واحد ، مما يحسن قابلية التوسع. من خلال تبسيط ثقافة PDO وتحليلها ، يوفر SPOT أداة قوية لفحص الأدوية عالي الإنتاجية وأبحاث السرطان الانتقالية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

على الرغم من التقدم في البحوث الطبية الحيوية ، لا يزال تطوير فحوصات ذات صلة من الناحية الفسيولوجية في المختبر أمرا صعبا. يجب أن يستوعب الاختبار المثالي مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا ، وتركيبات العلاج ، والجداول الزمنية ، والأجهزة التجارية ، والقراءات التحليلية لتلبية احتياجات الباحثين عبر مختلف التخصصات. ومع ذلك ، نظرا لنقص الأدوات المناسبة ، غالبا ما يعتمد الباحثون على نماذج مبسطة ، مثل الطبقات الأحادية ثنائية الأبعاد لخطوط الخلايا الخالدة ، والتي تفشل في تلخيص التعقيد والأهمية السريرية ، لا سيما في أبحاثالسرطان 1،2. لمعالجة هذا الأمر ، أدى التعاون الحيوي للورم على نطاق واسع والتعاون السريري إلى تطوير نماذج عالية الدقة في المختبر مثل عضيات الورم المشتقة من المريض (PDOs) ، والتي تحتفظ بملامح وراثية وعلاجية خاصة بالمريض مقارنة بخطوط الخلايا3،4،5. وفي الوقت نفسه ، تتطلب التطورات في أتمتة المختبرات واكتشاف الأدوية منصات تتكامل بسلاسة في تدفقات العمل عالية الإنتاجية. في حين أن المنصات الحالية تعالج إما الدقة البيولوجية أو قابلية التوسع ، إلا أن القليل منها تمكن من حل كلا التحديين في وقت واحد6،7،8. يعد تطوير نماذج مؤتمتة عالية الإنتاجية تكرر ميزات المرض الرئيسية أمرا بالغ الأهمية لتطوير البحوث الطبية الحيوية وتسريع توليد البيانات للتطبيقات الانتقالية.

تهدف العديد من النماذج الناشئة إلى معالجة التحديات المرتبطة بزراعة أنواع الخلايا المتخصصة ، مثل PDOs ، ذات الإنتاجية العالية (الشكل 1). المنصات القياسية ، حيث يتم خلط العضيات مع الهيدروجيل في ألواح 96 أو 384 بئرا ، تقدم العديد من القيود: (أنا) يؤدي الحجم المرتفع لهلام الخلية إلى وصول غير متسق إلى المغذيات ، (ثانيا) ينشئ انحناء الغضروف المفصلي جيدا قطع أثرية تصويرية وتدرجات خلوية ، (ثالثا) يفتقر بذر الهيدروجيل إلى التوحيد عبر الدفعات والأفراد ، (رابعا) عدم التوافق مع التصنيع الآلي والفحص المجهري الآلي ، و (ت) استخدام المصفوفة خارج الخلية (ECM) التي عادة ما تكون عينة مخاطر ناعمة وهشة التدمير في كثافة الأنسجة الفسيولوجية أو دمج أنواع الخلايا المقلصة1،9. حاليا ، يتم إجراء غالبية دراسات PDO القائمة على الألواح إما عن طريق بذر هلام الخلية يدويا في اللوحة10،11 ، أو طريقة تراكب الهلام ، حيث يتم تخفيف الهيدروجيل بوسط أقل لزوجة ، ويتم طرد الخلايا إلى قاع البئر لوضعها في المستوى البصريالمناسب 12،13. فشل كلا النهجين في توفير الدعم الميكانيكي للثقافة طويلة الأجل. بناء على ملاحظاتنا السابقة (بيانات غير منشورة) ، ينقبض الهيدروجيل التجاري الممزوج بالخلايا في ألواح الآبار القياسية من أسطح البئر لمدة 9 من أصل 12 بئرا على مدار 12 يوما ، بينما تفتقر طريقة تراكب الهلام إلى التفاعلات الفسيولوجية بين مصفوفة الخلية. بالإضافة إلى ذلك ، لا يمكن الحفاظ على الثقافات الناتجة على مدى فترات طويلة بسبب ضيق المساحة داخل البئر وهي غير متوافقة مع المقايسات التي تتطلب نسبة عالية من الكاشف إلى الخلية المتوسطة14،15،16. تعيق هذه الحواجز العملية اعتماد النماذج ثلاثية الأبعاد وتحد من قابلية التكرار التجريبي في جميع أنحاء المجال.

figure-introduction-1
الشكل 1: تقييم نماذج الاستزراع بناء على قابلية التوسع والملاءمة البيولوجية. الوضع النسبي لمختلف أنظمة الثقافة في المختبر وفي الجسم الحي على طول قابلية التوسع (المحور y) ، المحددة من خلال إنتاجية اللوحة ، والأهمية البيولوجية (المحور السيني) ، مما يسلط الضوء على المقايضات بين إمكانات الإنتاجية والدقة الفسيولوجية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

بدافع من هذه التحديات ، تم الاستفادة من المسامية العالية والتعزيز الميكانيكي لسقالة السليلوز الرقيقة لتطوير منصة الأنسجة العضوية المدعومة بالسقالات (SPOT) ، المتوفرة في كل من تنسيقات 96 و 384 بئرا. يشتمل SPOT على سقالة بوليمر منقوشة مسبقا باستخدام طريقة التسلل المطورةمسبقا 17 التي تتطابق مع تخطيط اللوحة ، مما يتيح وضع قطرات هلام الخلية بدقة ويوفر الدعم الهيكلي لمرحلة الهيدروجيل (الشكل 2 أ). يوجه فتل الشعيرات الدموية في السقالة محلول هلام الخلية ، ويشكل شبكة مركبة حيوية مفروضة ميكانيكيا (الشكل 2 ب). بسبب الهيكل المسامي للسقالة ، يتسلل هلام الخلية ويشكل طبقة رقيقة (حوالي 70 ميكرومتر سميكة) ، مما يتطلب كمية أقل بعشرة أضعاف من هلام الخلية لتغطية قاع البئر14. كما تم إثبات توافق SPOT مع بذر السرطان الغدي الأقنية للبنكرياس (PDAC) PDOs من خلال تقييم نموها باستخدام فحوصات التمثيل الغذائي والقياسات القائمة على الصور. منذ تطويرها ، أظهرت SPOT تنوعا كبيرا وقابلية للاستخدام للباحثين المشاركين في الثقافة العضوية. بالإضافة إلى ذلك ، يستوعب تصميم SPOT قابلية التوسع سهلة الاستخدام ، مع تقليل أحجام الكاشف وقدرات التصوير المحسنة من خلال هندسة microgel المسطحة والخالية من الغضروف المفصلي ، مما يضمن تغلغلا موحدا للضوء وتصويرا دقيقا عالي المحتوى14 (الشكل 2C ، D). يدعم SPOT أيضا الزراعة المشتركة مع أنواع الخلايا الأخرى ذات الصلة ، مثل الخلايا الليفية ، لتلخيص البيئة الدقيقة للورمبشكل أفضل 18.

figure-introduction-2
الشكل 2: نظرة عامة على جهاز 96-SPOT وسير عمل تحليل الصور. (أ) التمثيل التخطيطي لتصنيع لوحة SPOT: يتم تجميع الجهاز عن طريق تجميع لوحة بئر تجارية بلا قاع (أعلى) ، وسقالة منقوشة بنقشة PMMA (كما هو موضح باللون الأزرق) ، وفيلم بولي كربونات (أسفل) باستخدام طبقات من لاصق البولي أكريليك على الوجهين (كما هو موضح باللون الأصفر). (ب) بذر الخلايا في بئر السقالة: يتم تعليق الخلايا في هيدروجيل غير مبلمر (كما هو موضح باللون الوردي) ويتم ماصتها في كل بئر حيث تتسلل إلى السقالة. ثم يسمح للهيدروجيل بالهلام لتغليف الخلايا داخل الهيدروجيل المدعوم بالسقالة. (ج) الفحص المجهري: يمكن تصوير الأنسجة الدقيقة الناتجة باستخدام الفحص المجهري الآلي واسع المجال. (د) التحليل المستند إلى الصور: يمكن تحليل الصور المكتسبة للخلايا الفلورية (الخضراء) المعلقة في الهلام باستخدام خطوط أنابيب تحليل الصور القياسية. صورة مجهرية تمثيلية لخلايا KP4 التي تعبر عن GFP في بئر واحد 96 بقعة. شريط المقياس 500 ميكرومتر. تم تعديل هذا الرقم من14. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

ميزة أخرى ل SPOT هي أنه يمكن دمج النظام مع معالج السوائل مفتوح المصدر ، مما يسهل التصنيع الآلي والقابل للتكرار لمزارع PDO. يقلل هذا التقدم من تباين المستخدم ويدعم التصاميم التجريبية المعقدة ، بما في ذلك فحص الأدوية عالي الإنتاجية ومناهج الطب الشخصي18. كما ثبت سابقا أن SPOT متوافق مع التوصيف متعدد الإرسال القائم على الخلية الواحدة للأنماط الظاهرية الخلوية في بيئات الورم غير المتجانسة واسترجاع الخلايا عند الطلب من SPOT عن طريق الهضم18. تضع هذه الميزات SPOT كأداة متعددة الاستخدامات لتطبيقات الفحص ، حيث تكون البيانات الطولية عالية الدقة ضرورية لتقييم فعالية الدواء والسلوك الخلوي في ظل الظروف ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية14،18. من خلال الجمع بين هذه الابتكارات التقنية ، يعالج SPOT القيود الحرجة في أنظمة الثقافة ثلاثية الأبعاد التقليدية.

يوفر هذا البروتوكول دليلا شاملا لتصنيع مكونات SPOT وتجميع الألواح وطرق البذر للثقافات العضوية ثلاثية الأبعاد القوية والقابلة للتكرار. يتضمن إرشادات مفصلة لتلقي الألواح يدويا باستخدام ماصة دقيقة وسير عمل البذر الآلي مع معالج السوائل ، والذي يدعم تنسيقات 96 و 384 بئرا. بالإضافة إلى ذلك ، يحدد هذا البروتوكول تدابير مراقبة الجودة الأساسية ، مثل التحقق من التوزيع الموحد للهلام وسلامة السقالات ، للحفاظ على معايير تجريبية عالية. يتم أيضا توفير استراتيجيات استكشاف الأخطاء وإصلاحها لمعالجة المشكلات الشائعة ، مثل التسلل غير المكتمل للهلام ، والتبخر أثناء البذر ، وانفصال السقالات ، وتزويد الباحثين بحلول عملية لتحسين سير عملهم وتحقيق نتائج موثوقة.

تم تصميم SPOT لسد الفجوات التي تواجهها المقايسات العضوية التقليدية ، بما في ذلك التحديات المتعلقة بإجراء المقايسات وتغيير الوسائط مع الحفاظ على سلامة الجل10،11،12،13. الهدف العام من هذه الطريقة هو تصنيع منصة مدعومة بالسقالات تدعم الاستزراع العضوي على مدار 12 يوما. بالإضافة إلى ذلك ، تغطي هذه الطريقة أيضا توليد مصفوفات الأنسجة في SPOT من خلال البذر اليدوي أو بمساعدة المعالج السائل للسماح للمستخدمين بإجراء أي اضطراب في اتجاه مجرى النهر ، بما في ذلك فحوصات المخدرات IC50 وفحص الجزيئات الصغيرة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذا البروتوكول ، تم استخدام العضيات العضية لسرطان البنكرياس الغدي الأقنوي (PDAC) كمثال. تم إنشاء هذه العضيات من مرضى PDAC ، وتم شراؤها من UHN Biobank في مركز الأميرة مارغريت للسرطان (معرف PMLB PPTO.46 من شبكة الصحة الجامعية ، كندا) بموجب بروتوكول يتوافق مع إرشادات مجلس أخلاقيات البحث بجامعة تورنتو (البروتوكول # 36107). يرجى الاطلاع على جميع المواد والكواشف والمعدات المطلوبة في جدول المواد.

1. صنع محلول PMMA-acetone (التوقيت: 20 دقيقة + ~ 8-16 ساعة في وضع الخمول)

ملاحظة: يستخدم محلول بولي ميثيل ميثاكريلات (PMMA) - الأسيتون في SPOT لتحديد الآبار ومنع التسرب بين الآبار. الإجراء العام هو إذابة PMMA الصلب في الأسيتون. في السابق ، تم استخدام محلول PMMA-acetone لتصميم سقالة ورقية مماثلة لمنع تبادل الوسائط والغازات لتحقيق نقص الأكسجة في نموذج ثقافة ثلاثي الأبعادمختلف 17. هنا ، يتم تكييف صيغة PMMA-acetone لتوليد سقالات متسللة من PMMA لتصنيع SPOT.

  1. في أنبوب طرد مركزي مخروطي سعة 50 مل ، أضف 1.75 جم من مسحوق PMMA. ثم ، في غطاء الدخان ، أضف 7.84 مل من الأسيتون وأغلق الأنبوب بإحكام لتجنب تبخر المذيبات.
  2. إذا كانت هناك حاجة إلى تصور نمط البوليمر ، أضف 5-10 قطرات من طلاء الأظافر إلى المحلول. أغلق أنبوب الطرد المركزي بإحكام. رج الأنبوب يدويا لبدء خلط الملمع بمحلول PMMA-acetone.
    ملاحظة: لكي تكون متسقا عبر دفعات رسم متعددة، قم بتخفيف كمية معروفة من طلاء الأظافر في الأسيتون، ثم قم بسحب هذا المحلول على شكل 7.84 مل من الأسيتون.
  3. ضع محلول PMMA-acetone على الخلاط الدوامي طوال الليل للتأكد من ذوبان المحلول. قم بتخزين محلول PMMA-acetone عند 4 درجات مئوية لمدة أقصاها أسبوعين ، إذا لم يتم فتحه.

2. صنع السقالات المتسللة PMMA

(التوقيت: للزخرفة 96-SPOT: إعداد 15 دقيقة + 6 دقائق لكل سقالة ؛ للزخرفة 384-SPOT: إعداد 15 دقيقة + 10 دقائق لكل سقالة)

ملاحظة: يتم تصنيع السقالات المتسربة PMMA ل 96- / 384-SPOT حصريا على طاولة عمل (بيئة غير معقمة). لصنع سقالات 96/384-SPOT ، يرجى التأكد من تثبيت برنامج راسمة تحرير الرسومات أو مكتبة التحكم في الراسمة المتجهة. يرجى ملاحظة أن بعض الأقسام الفرعية من الإجراء تنطبق على كل من 96-SPOT و 384-SPOT ، في حين أن البعض الآخر خاص بحجم لوحة واحد. وفي الحالة الأخيرة، سيقدم الخياران ألف (للبقعة 96) وباء (للنقطة 384). بالنسبة لنمط (A) 96-SPOT ، هناك ثلاث طبقات ؛ أولا ، تؤسس خطوط التحضير تدفقا ثابتا لمحلول PMMA-acetone ؛ ثانيا ، مجموعة من 96 دائرة ؛ أخيرا ، يرسم نمط مندوب المبيعات المتجول (TSP) المساحات بين الآبار. بالنسبة لنمط (B) 384-SPOT ، تحتوي الوحدة الأولى على خطوط فتيلة ؛ ثانيا ، الحدود المحيطة بلوحة البئر. أخيرا ، يتم رسم شبكة بحيث تبقى 384 منطقة. بالنسبة لكلا النمطين ، يمكن التحكم في أحجام الآبار عن طريق تغيير شفرة المصدر ، كما يتضح من Li et al.14.

  1. إعداد عملية تسلل السقالة
    1. اترك محلول PMMA-acetone (المخزن عند 4 درجات مئوية) يهتز لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. اترك حامل الأنبوب حتى يبدأ التسميم.
    2. قم بتوصيل الراسمة بالطاقة باستخدام كابل الطاقة. يشير الضوء الأخضر الوامض إلى تشغيل الجهاز. قم بتوصيل كابل USB الخاص بالراسمة بالكمبيوتر المخصص للتخطيط.
    3. قم بتغطية حامل المشبك بقطعة من ورق الزبدة. تأكد من تغطية سطح الحامل بالكامل.
      1. لتوجيه رسم أنماط 96 / 384 SPOT ، قم بإعداد قالب 96 / 384 SPOT على ورقة من ورق الطابعة. قم بتنفيذ الخطوات 2.2-2.3 باستخدام قلم بدلا من حقنة ، وورق الطابعة بدلا من ورق البرشمان وفلتر الشاي. بمجرد أن يصبح القالب جاهزا ، ضعه على Clip Easel وقم بتغطيته بورق الزبدة. انتقل إلى الخطوة 2.2 واتبع البروتوكول لعمل سقالات 96 / 384-SPOT.
    4. قم بتثبيت ورق البرشمان على الحامل باستخدام مشابك الموثق (الشكل 3 أ). خذ ورقة من السقالة (أي ورق ترشيح الشاي) واقطعها على طول الجوانب حيث يتم دمج الطبقتين معا (الشكل 3 ب).
    5. ضع مرشح الشاي المقطوع - المسمى سقالة الورق فيما يلي - على حامل المشبك ، مع الجانب الأملس (الجانب الخارجي لمرشح الشاي) لأعلى. قم بتثبيته من ثلاث جوانب. تأكد من أن السقالة الورقية مسطحة بالكامل على حامل المشبك ؛ يجب ألا يكون هناك تجاعيد في منطقة المؤامرة.
  2. رسم نمط 96/384-SPOT
    1. لإعداد برنامج الراسمة وملفه ل 96-SPOT ، اتبع الخيار 2.2.2 ؛ لإعداد البرنامج والملف ل 384-SPOT، اتبع الخيار 2.2.3.
    2. إعداد برنامج الراسمة وملف تخطيط 96-SPOT
      1. في تطبيق البرنامج ، افتح ملف SVG ل 96-SPOT (ملف تكميلي 1 ؛ الشكل 4 أ). في شريط القائمة، انتقل إلى Extensions > Plotter Control (الشكل 4B).
      2. عند ظهور النافذة الجديدة ، اضبط الإعدادات لتتناسب مع الشكل التكميلي 1. ارجع إلى علامة التبويب المؤامرة في نافذة ملحق التحكم في الراسمة اترك هذا مفتوحا لوقت لاحق.
    3. إعداد واجهة برمجة تطبيقات مكتبة التحكم في الراسمة المتجهة وملف الرسم 384-SPOT
      1. افتح نافذة موجه الأوامر (Windows) أو Terminal (Mac). أدخل الأمر لتشغيل دفتر الحوسبة التفاعلية المخصص. تأكد من فتح دفتر الملاحظات في مستعرض.
      2. حدد ملف التعليمات البرمجية 384-SPOT (الملف التكميلي 2) لفتحه. باستخدام طرف 20G (أو طرف 16G لنمط 384-SPOT) ، قم بشفط 1 مل من محلول PMMA-acetone باستخدام حقنة رسم 3 مل (الشكل 3C).
        ملاحظة: يجب أن يكون صمام التحكم في التدفق بين حقنة التحميل سعة 10 مل وأنبوب EVA مفتوحا (موازيا للبرميل). نظرا لأن عملية التسلل مدفوعة بالجاذبية ، تأكد من أن حقنة الرسم سعة 3 مل مملوءة دائما بين علامة 0.5-1.5 مل للحفاظ على حجم توزيع ثابت أثناء الرسم.
    4. بينما لا يزال طرف حقنة الرسم 3 مل داخل محلول PMMA-acetone ، أغلق صمام التحكم في التدفق بين حقنة التحميل سعة 10 مل وأنبوب EVA (قم بإحضاره بشكل عمودي على البرميل).
    5. أغلق أنبوب محلول PMMA-acetone بسرعة. قم بتحميل المحقنة سعة 3 مل على حامل القلم. اضبط ارتفاع المحقنة فيما يتعلق بالحامل لتحقيق المحاذاة التالية (الشكل 3 د).
    6. اضبط موضع Clip Easel بحيث يستقر طرف المحقنة سعة 3 مل عند أصل النمط المرسوم (أي النقطة الداكنة في الجزء العلوي الأيسر من نمط القالب). ارفع حامل قلم الراسمة مع توصيل المحقنة به ، لتحريك حامل المشبك تحته.
    7. افصل بسرعة حقنة 10 مل من الأنبوب للسماح للضغط الجوي بممارسة الضغط على محلول PMMA-acetone المخزن في حقنة التخطيط سعة 3 مل. افتح صمام التحكم في التدفق.
    8. لبدء رسم نمط 96-SPOT ، اتبع الخطوات 2.2.9 ؛ لبدء رسم 384-SPOT ، اتبع الخطوة 2.2.10.
    9. ابدأ رسم 96-SPOT في الراسمة المعينة كما هو موضح أدناه.
      1. في البرنامج ، انقر فوق تطبيق على ملحقات التحكم في الراسمة . سيبدأ الراسمة الآن في الجري ، ورسم نمط PMMA. ليست هناك حاجة إلى مزيد من الإجراءات حتى يتم الانتهاء من التخطيط ، ويعود حامل قلم الراسمة إلى موضعه الرئيسي.
      2. لإيقاف الراسمة مؤقتا أثناء التخطيط ، اضغط على الزر الفضي الصغير على الجانب الأيسر من الراسمة بعد ذلك ، من خلال علامة التبويب "ملحقات التحكم > استئناف الراسمة في برنامج الرسومات ، اختر استئناف التخطيط من حيث توقفت أو إعادة حامل القلم إلى الوضع الرئيسي (الشكل التكميلي 1C (iii)).
    10. بدء رسم 384-SPOT في واجهة الحوسبة المعينة كما هو موضح أدناه.
      1. في الواجهة ، انقر فوق إعادة تشغيل kernel وأعد التشغيل (سهم مزدوج على شريط الأدوات). سيبدأ تشغيل الكود الآن ، مع رسم نمط PMMA. ليست هناك حاجة إلى مزيد من الإجراءات حتى يتم الانتهاء من رسم النمط ويعود حامل القلم إلى موضعه الرئيسي.
      2. لإيقاف الراسمة مؤقتا أثناء التخطيط ، اضغط على الزر الفضي الصغير على الجانب الأيسر من الراسمة حرك رأس الطباعة يدويا إلى الخلف وإلى اليسار حتى يصل إلى موضعه الرئيسي. أعد توصيل الراسمة بالطاقة. على عكس التخطيط 96-SPOT ، لا توجد طريقة لاستئناف التآمر ل 384-SPOT من حيث تم إيقافها مؤقتا. استبدل سقالة الورق وابدأ الكود من البداية.
  3. تفريغ المحقنة والتنظيف
    1. بمجرد الانتهاء من الرسم ، أعد توصيل المحقنة سعة 10 مل بالأنبوب. قم بإزالة المحقنة سعة 3 مل من حامل قلم الراسمة وانقل أي محلول PMMA-acetone متبقي مرة أخرى إلى قارورة المخزون أو تخلص منها في حالة حدوث تبخر كبير أثناء الخطوات السابقة.
    2. اغسل برميل المحقنة سعة 3 مل عن طريق سحب الأسيتون. اترك نظام أنابيب الحقنة ليجف في الهواء قبل إعادته إلى مكان التخزين الخاص به.
    3. قم بفك سقالة SPOT بعناية من حامل المشبك
    4. افحص سقالات SPOT المرسومة للتأكد من إمكانية استخدامها للتجارب (الشكل 3E ، F). راجع الجدول 1 لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها وضمان الجودة والتحكم في الجدول 2 والجدول 3 للحصول على إرشادات.
    5. قم بتخزين جميع السقالات المزخرفة ب PMMA في كيس بسحاب في مكان بارد وجاف.

3. 96/384 بئر قطع الشريط

(التوقيت: للزخرفة 96-SPOT: 15 دقيقة لكل 5 قطع من الشريط ؛ للزخرفة 384-SPOT: 30 دقيقة لكل 5 قطع من الشريط)

ملاحظة: هذه واحدة من أكثر الطرق فعالية لقص الأشرطة بدقة وكفاءة ، خاصة بالنسبة لأنماط الشريط ذات 384 بئرا. توفر هذه الطريقة أيضا إمكانية النقش بالليزر لطبقة واحدة من الشريط (بلاستيك الغطاء العلوي) لتحسين قابلية الاستخدام أثناء عملية التجميع. بدلا من ذلك ، يمكن أيضا قص الأشرطة باستخدام قواطع الورق بمعدل أبطأ دون عملية النقش.

  1. افتح ملف القطع بالليزر بنمط الشريط 96 / 384 بئرا (الملف التكميلي 3 ، الملف التكميلي 4) وقم بتحميل نمط الطباعة المشفر بثلاثة ألوان مختلفة في برنامج القطع بالليزر بالنقر فوق مؤامرة بالإعدادات التالية في الشكل التكميلي 2 أ.
  2. قم بتحميل قطعة من الشريط على سطح القاطع بالليزر وتأكد من تسطيح الشريط بسلاسة على السطح. استخدم إما أشرطة ورقية أو أوزان ثقيلة لتثبيت الأشرطة أثناء القطع.
    ملاحظة: تأكد من أن الشريط مسطح على سطح القاطع بالليزر. قد يؤثر أي نتوء على جودة الأشرطة المقطوعة ، وخاصة الأشرطة ذات 384 بئرا.
  3. اضبط موقع نمط الطباعة ليتماشى مع موقع الشريط بناء على دليل القاطع بالليزر.
  4. قم بقص كل من الأشرطة 96 / 384 بئر باستخدام نفس إعداد قاطع الليزر كما هو موضح في الشكل التكميلي 2 ب. ترتيب الخطوط بألوان محددة مهم. قطع الخط الأحمر أولا قبل الخط الأخضر. قطع اللون الأزرق في النهاية.
    الخط الأحمر: وضع Rast / Vest مع طاقة ليزر 45٪ ، وسرعة 80٪ ، و 1000 بكسل لكل بوصة ، و 0.50 مم المحور Z.
    الخط الأخضر: وضع Rast / Vest مع طاقة ليزر 7٪ ، وسرعة 100٪ ، و 1000 بكسل لكل بوصة ، و 0.50 مم المحور Z.
    الخط الأزرق: وضع Rast / Vest مع طاقة ليزر 50٪ ، وسرعة 80٪ ، و 1000 بكسل لكل بوصة ، و 0.50 مم من المحور Z.
  5. قم بتخزين الأشرطة المزخرفة بشكل صحيح حتى تجميع SPOT.

4. 96/384-SPOT الجمعية (التوقيت: 1 ساعة)

ملاحظة: يوضح هذا القسم بالتفصيل إجراءات تجميع أجهزة 96 / 384-SPOT في بيئة معقمة مثل خزانة السلامة البيولوجية (BSC). بدلا من ذلك ، يمكن تجميع أجهزة 96 / 384-SPOT مسبقا في بيئة غير معقمة ثم تعقيمها عن طريق عملية تعقيم غاز الإيثيلين.

  1. تحضير سقالة SPOT للتجميع
    1. خذ سقالة منقوشة بنقشة PMMA إما ل 96 أو 384 بقعة. قص الورق الزائد حول المنطقة الزرقاء من السقالة. اترك 5 مم من المساحة البيضاء حول محيط المنطقة الزرقاء. ستكون الورقة الناتجة حوالي 760 مم × 1300 مم.
      ملاحظة: لا تقطع خط التحضير. إنه مفيد في تحديد أي جانب من السقالة خشن / أملس (الشكل 3E ، F).
    2. لتحضير سقالة 96 SPOT للتجميع ، اتبع الخطوة 4.1.3. لتحضير سقالة 384 نقطة ، اتبع الخطوة 4.1.4.
    3. قم بإجراء ثقب المساحات بين الآبار على السقالة 96 SPOT.
      1. ضع قطعة من فيلم البولي إيثيلين (1000 مم × 1500 مم) فوق دعامة أكريليك صلبة (2700 مم × 2700 مم). ضع الدعامة المغطاة بغشاء البولي إيثيلين على سطح العمل وضع السقالة فوق فيلم البولي إيثيلين (الشكل 5 أ).
      2. قم بمحاذاة حافة المسطرة بين الصفين الأولين بحيث لا يتم تتبع التتبع بجانب هذه الحافة في بئر.
      3. ضع عجلة التتبع على المسطرة في الجزء السفلي من السقالة. قم بلف عجلة التتبع لأعلى إلى أعلى السقالة ، باستخدام المسطرة لتوجيه مسار الشفرة. كرر هذا لجميع المساحات بين الصفوف على السقالة (أي 7x).
      4. كرر الخطوتين 4.1.3.2 و 4.1.3.3 لكل مسافة أخرى بين الأعمدة، بدءا من المسافة بين العمودين الأولين.
    4. لا تقم بإجراء ثقب للمساحات بين الآبار على سقالة 384 SPOT باتباع الخطوات أدناه.
      1. لا تثقب المساحات بين الآبار للسقالة 384-SPOT. انتقل مباشرة إلى الخطوة 4.2.
  2. تعقيم مواد SPOT ومعدات التجميع
    1. ضع السقالة المطبوعة ، شريطين من 96 بئرا (أو شريطا 384 بئرا) ، صفيحة 96 بئر بلا قاع (أو 384 بئرا بلا قاع) ، غطاء لوحة 96 بئرا (أو غطاء لوحة 384 بئرا) ، فيلم بولي كربونات ، لوح بولي ثنائي ميثيل سيلوكسان (PDMS) ، كيس بلاستيكي قابل لإعادة الإغلاق ، ملاقط ، وسكين دقيق في BSC ، الأشعة فوق البنفسجية لمدة 20 دقيقة على جانب واحد (الشكل 5 ب).
    2. اقلب جميع المواد ومعدات التجميع على الجانب الآخر والأشعة فوق البنفسجية لمدة 20 دقيقة أخرى.
  3. إرفاق السقالة بأول شريط 96/384 بئر
    1. ضع السقالة على الجانب الخشن لأعلى (الشكل 3F) على لوح PDMS ، بحيث تعمل الصفوف أفقيا. استخدم خط التحضير لتحديد الجانب الخشن (يشير خط التحضير المحاذي لليمين إلى الجانب الخشن لأعلى).
    2. قم بتنعيم السقالة على لوح PDMS بحيث لا توجد تجاعيد أو فقاعات على (أو تحت) السقالة. قم بإزالة الطبقة الواقية من الجانب غير المحفور من الشريط على الوجهين. اربط منتصف الشريط قليلا وقم بمحاذاة العمودين الأوسطين من الشريط مع السقالة.
    3. بمجرد المحاذاة ، اضغط على منتصف الشريط لأسفل. قم بتنعيم الشريط على السقالة ، بدءا من المنتصف وتحرك للخارج.
      ملاحظة: سيكون للسقالة المحاذاة بشكل غير صحيح نمط PMMA واضح متداخل مع منطقة البذر الآبار.
    4. استخدم الملقط لإزالة السقالة بعناية من لوح PDMS وتخزين البلاطة للتلفيقات المستقبلية.
  4. إرفاق السقالة بشريط 96/384 بئر ثاني
    1. ضع السقالة على طاولة العمل. اقلب السقالة بحيث يكون الجانب الأملس (الجانب غير المسجل) متجها لأعلى.
    2. قم بإزالة الطبقة الواقية الوسطى من الجانب المحفور من الشريط الثاني. تأكد من أن العمودين الأوسطين من الشريط مكشوفان. إذا تم استخدام تصميم الشريط غير المحفور ، فقم بإزالة الطبقة الواقية تماما من جانب واحد.
    3. اربط منتصف الشريط قليلا وقم بمحاذاة العمودين الأوسطين من الشريط مع السقالة.
    4. بمجرد محاذاة الشريط مع السقالة ، اضغط على منتصف الشريط لأسفل. إذا تم استخدام تصميم الشريط المحفور ، فقم بإزالة الطبقتين الواقيتين الأخريين المجاورتين للقسم الأوسط المكشوف من الشريط. قم بتنعيم الشريط على السقالة ، بدءا من المنتصف والانتقال إلى الخارج.
  5. إرفاق السقالة بلوحة لا نهاية لها
    1. قم بإزالة الطبقة الواقية من الشريط من الجانب الخشن من السقالة. إذا كنت تستخدم تصميم الشريط المحفور ، فقم بإزالة الطبقة الواقية الوسطى فقط.
    2. قم بمحاذاة السقالة على الجانب السفلي من اللوحة التي لا قاع لها (بغطاء). بمجرد محاذاة ، اضغط على منتصف السقالة على الجانب السفلي من اللوحة. إذا كنت تستخدم التصميم المحفور ، فقم بإزالة الطبقات الواقية المجاورة للوسط المكشوف. قم بتنعيم السقالة على الطبق من المنتصف إلى الخارج.
  6. إرفاق السقالة بفيلم البولي كربونات
    1. باستخدام الملقط ، قم بفك الطبقة الواقية لفيلم البولي كربونات بعناية. بمجرد أن تصبح فضفاضة ، قشر الطبقة الواقية ببطء من الفيلم. لا تقم بإنشاء مسافات بادئة في الفيلم ، لأنها ستؤثر على خصائصه البصرية للتصوير المجهري.
    2. كرر الخطوة 4.6.1 مع الجانب الآخر من فيلم البولي كربونات. بمجرد إزالة كلتا الطبقتين الواقيتين ، ضع الفيلم جانبا على طاولة العمل.
    3. قم بإزالة الطبقة الواقية من الشريط المتصل بقاع اللوحة. اضغط على فيلم البولي كربونات على السقالة ، بدءا من المنتصف إلى الخارج.
    4. اضغط بقوة على فيلم البولي كربونات على قاع اللوحة بحيث تحصل جميع الآبار على حدود واضحة.
    5. باستخدام سكين دقيق ، قم بقطع المواد الزائدة بعناية من قاع اللوحة.
      ملاحظة: انتبه أكثر لعدم قطع اللوحة أو أي من الآبار. إذا لم يتم قطع السكين بسهولة ، فتحقق مما إذا كان يقطع اللوحة.
  7. تخزين 96/384-SPOT بعد التجميع
    1. بعد التجميع الكامل 96-SPOT ، ضعه في كيس بلاستيكي شفاف قابل لإعادة الإغلاق. أحضر الحقيبة خارج BSC.
    2. ضع دعامة أكريليك صلبة على الجانب السفلي من اللوحة. قم بتثبيت دعامة الأكريليك على اللوحة في الزوايا المتقابلة (الشكل 5 ج). احتفظ به لمدة 30 دقيقة على الأقل في كل زاوية قبل الاستخدام.
    3. قم بتخزين الطبق في مكان نظيف وجاف حتى الاستخدام.

5. بذر 96/384 نقطة (التوقيت: 2 ساعة و 45 دقيقة)

ملاحظة: يوضح هذا القسم بالتفصيل إجراءات بذر أجهزة 96 / 384-SPOT لإنشاء أنسجة دقيقة ثلاثية الأبعاد موحدة. تتضمن عملية البذر الاستغناء الدقيق عن حجم هلام خلوي محدد (على سبيل المثال ، 5 ميكرولتر ل 96-SPOT أو 2 ميكرولتر ل 384-SPOT) على سقالة SPOT المجمعة مسبقا. لضمان التسلل المنتظم وتوزيع الهلام ، يتم توجيه قطرة هلام الخلية على طول البنية المسامية للسقالة من خلال فتل الشعيرات الدموية. يمكن تنفيذ هذه الخطوة يدويا باستخدام ماصة دقيقة أو آليا مع معالجة السوائل. بعد البذر ، يتم تحضين الألواح عند 37 درجة مئوية لتمكين بلمرة الهلام وتغليف الخلايا.

  1. تحضير لوحة 96/384 SPOT
    1. قم بفك 96- / 384-SPOT وقم بإزالة دعامة الأكريليك من الأسفل.
    2. في BSC ، قم بإزالة SPOT من الكيس البلاستيكي. قم بتشغيل الأشعة فوق البنفسجية لتعقيم الجزء الداخلي من اللوحة وتغطيتها لمدة 20 دقيقة قبل إغلاق الغطاء والتقليب إلى أسفل اللوحة لمدة 20 دقيقة أخرى من المعالجة بالأشعة فوق البنفسجية.
    3. الماصة 70 ميكرولتر من PBS في كل مساحة بين الآبار للوحة 96-SPOT. لا تقم بسحب PBS في اللوحة 384 SPOT. برد الطبق على حرارة 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل البذر.
  2. تحضير الخلايا
    1. افصل الخلايا عن قوارير المزرعة أو العضيات من القباب الهلامية بناء على المناولة الموصى بها واحسب كمية الخلية باستخدام مقياس كثافة الدم وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. لاحظ كثافة الخلية لتعليق الخلية (أي عدد الخلايا لكل مل) لحساب حجم تعليق الخلية المطلوب للخطوات 5.4.1-5.4.2 بناء على كثافة البذر المطلوبة.
  3. تحضير الجل
    1. باتباع تعليمات تحضير الهيدروجيل المحسنة سابقا17،19،20،21 ، قم بإنشاء الهيدروجيل عن طريق توزيع 1 مل من 3 مجم / مل من الكولاجين البقري من النوع 1 في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل.
      ملاحظة: يجب حفظ المكونات والخليط الناتج على الجليد طوال مدة التحضير.
    2. قم بتوزيع 125 ميكرولتر من الحد الأدنى من الوسط الأساسي المركز 10x (MEM) في الكولاجين البقري. مربي الماصة ببطء لأعلى ولأسفل حتى يتحول المزيج من اللون الوردي إلى الأصفر.
    3. قم بتوزيع 8 ميكرولتر من بيكربونات الصوديوم 0.8 M في خليط الكولاجين البقري. مربي الماصة ببطء لأعلى ولأسفل حتى تمتزج حتى يصبح الخليط ورديا باهتا. استخدم المحلول المختلط في غضون 30 دقيقة من التحضير لضمان التبلور المتسق عبر تجارب متعددة.
      ملاحظة: إذا ظل الخليط أصفر ، فقم بمعايرة المحلول إلى درجة الحموضة 7 عن طريق إضافة 0.8 متر في 0.5 ميكرولتر حتى يتحقق اللون الوردي الباهت. اختياري: باتباع نفس الإجراء ، يمكن تحضير الجل للثقافات التي تتطلب تركيزا أعلى من الكولاجين. لزراعة العضيات ، استخدم مزيج الهيدروجيل الذي يتميز به Landon-Brace et al.17.
  4. تعليق الخلايا في الجل
    1. قم بتوزيع حجم تعليق الخلية المطلوب لكثافة هلام الخلية المستهدفة في أنبوب الطرد المركزي الدقيق وجهاز الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق.
    2. شفط المادة الطافية وإعادة تعليق الحبيبات الخلية في هلام (يختلف الحجم حسب التركيز المستهدف)
  5. بذر 96 / 384 لوحة SPOT يدويا
    1. ضع طبق 96 / 384 SPOT على كيس ثلج مجمد. لبذر 96-SPOT ، اتبع الخطوات 5.5.2. لبذر 384-SPOT ، اتبع الخطوات 5.5.3.
    2. البذر يدويا 96-SPOT
      1. قم بتغطية طرف ماصة سعة 10 ميكرولتر مسبقا بخليط خلية هلام. استنشق 5 ميكرولتر من الجل باستخدام ماصة سعة 20 ميكرولتر ثم أخرجها إلى المحطة الأولى حتى تتكون قطرة عند الحافة. المس القطرة في منتصف البئر.
        ملاحظة: قد يؤدي إخراج الجل عن طريق الضغط على الماصة إلى المحطة الثانية إلى ظهور فقاعات هواء. يجب زرع جميع الآبار في غضون 5 دقائق من أجل هلام متسق بين الآبار.
      2. بعد بذر جميع الآبار المرغوبة ، قم بتغطية اللوحة واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة لبلمرة الجل. قم بتوزيع 200 ميكرولتر من الوسائط في كل بئر مصنف واحتضانه لمدة ساعة واحدة على الأقل دون انقطاع قبل أي تصوير أو اضطراب مطلوب.
    3. البذر يدويا 384-SPOT
      1. قم بتغطية طرف ماصة سعة 10 ميكرولتر مسبقا بخليط خلية هلام. قم بشفط 2 ميكرولتر من الجل باستخدام ماصة سعة 10 ميكرولتر ثم أخرجها إلى المحطة الأولى حتى تتشكل قطرة عند الحافة.
        ملاحظة: يوصى بشدة باستخدام ماصة متعددة القنوات سعة 10 ميكرولتر.
      2. المس القطرة في منتصف البئر. بعد بذر جميع الآبار المرغوبة ، قم بتغطية اللوحة واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة لبلمرة الجل.
      3. قم بتوزيع 60 ميكرولتر من الوسائط في كل بئر مصنف واحتضنه لمدة 1 ساعة على الأقل دون انقطاع قبل أي تصوير أو اضطراب مطلوب.
    4. البذر 96/384-SPOT باستخدام معالج سائل
      1. أثناء تحضير خليط الجل الخلوي ، قم بتشغيل معالج السائل ووحدة مرشح HEPA الخاصة به على درجة عالية. رش 70٪ من الإيثانول بحذر داخل معالج السوائل وامسحه بمناشف ورقية مبللة بالإيثانول.
      2. قم بتحميل بروتوكول البذر 96-SPOT أو 384-SPOT (الملف التكميلي 5 أو الملف التكميلي 6) قبل إجراء معايرة رأس الماصة. قم بتركيب وحدات درجة الحرارة في الفتحتين 1 و 4 (الشكل 6 أ).
      3. لأغراض المعايرة، استخدم الصناديق المخصصة لأطراف المرشح P20 وP200. قم بتحميلها في الفتحتين 5 و 6 على التوالي (الشكل 6 ب). قم بمعايرة رأس الماصة بناء على المطالبات المعروضة على البرنامج. بعد المعايرة ، قم بالتبديل إلى صندوق أطراف المرشح المعقم P20 و P200 للبذر في الفتحتين 5 و 6. أعد رش السطح بنسبة 70٪ من الإيثانول وأغلق الباب حتى البذر.
        ملاحظة: من الضروري معايرة الأطراف إلى الجزء العلوي من لوحة 96 / 384 SPOT بدقة. يوصى باستخدام شريط ختم اللوحة للمساعدة في تصور المحور z للأطراف بالنسبة إلى الجزء العلوي من اللوحة. الموضع المثالي هو عندما تلامس الأطراف الموجودة على الرأس متعدد القنوات شريط ختم اللوحة وتخلق انبعاجا صغيرا.
    5. قم بتشغيل كلتا وحدتي درجة الحرارة واضبطهما على 4 درجات مئوية أثناء وجود الخلايا في آخر خطوة دوران أثناء تحضير خليط هلام الخلية. بعد الانتهاء من الخطوة 5.4 ، قم بتحميل الكمية المطلوبة من خليط هلام الخلية على كل أنبوب من أنابيب PCR المكونة من 8 شرائط 0.2 مل داخل BSC.
      ملاحظة: الحد الأدنى لحجم خليط خلية هلام ليتم تحميله في كل أنبوب هو: 96-SPOT: 5 ميكرولتر مضروبا في عدد الأعمدة التي يجب زرعها بالإضافة إلى الحجم الميت. 384-SPOT: 2 في 2 ميكرولتر مضروبا في عدد الأعمدة التي يجب زرعها مرات ثم زائد الحجم الميت. يوصى بأن يكون الحجم الميت حوالي 10-20 ميكرولتر لكل أنبوب لتجنب الفقاعات والأعمدة غير المكتملة في النهاية.
    6. أغلق أنابيب PCR المكونة من 8 شرائط 0.2 مل باستخدام الأغطية المسطحة المكونة من 8 شرائط قبل نقل خليط هلام الخلية من BSC على الجليد.
    7. قم بتحميل لوحة SPOT المبردة مسبقا على وحدة درجة الحرارة الموجودة في الفتحة 4 باستخدام كتلة تنسيق اللوحة السفلية المسطحة (الشكل 6 ب).
    8. قم بتحميل أنابيب PCR المكونة من 8 شرائط 0.2 مل بخليط خلية هلام على وحدة درجة الحرارة في الفتحة 3 باستخدام كتلة تنسيق 96 بئر.
    9. افتح الأغطية المسطحة وغطاء لوحة SPOT وقم بتخزينها داخل معالج السائل ولكن بعيدا عن الفتحات المستخدمة. افتح غطاء صندوق طرف المرشح P20 وP200.
    10. قم بتشغيل البروتوكول. بعد بذر جميع الآبار المرغوبة ، قم بتغطية اللوحة واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة لبلمرة الجل.
    11. قم بتوزيع 200 ميكرولتر أو 60 ميكرولتر (96- / 384-SPOT) من الوسائط في كل بئر مصنف واحتضانه لمدة ساعة واحدة على الأقل دون انقطاع قبل أي تصوير أو اضطراب مطلوب.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعمل نمط PMMA للسقالة الورقية كحاجز مادي لمنع تبادل المحتوى عبر الآبار. هذا التصميم أمر بالغ الأهمية لضمان بقاء الآبار المجاورة معزولة كيميائيا وبيولوجيا ، مما يمنع الانتشار غير المقصود للوسائط أو الأدوية أو العوامل المفرزة أو حتى الخلايا14. يسمح دمج PMMA بالتقسيم الدقيق ، مما يجعل SPOT منصة موثوقة للفحص عالي الإنتاجية ودراسات الزراعة المشتركة حيث يجب تقليل التلوث المتبادلإلى الحد الأدنى 14،18. يتم وصف تجارب ضمان الجودة ومراقبة الجودة المو...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذا البروتوكول ، يتم توفير دليل مفصل لتصنيع واستخدام 96 و 384 بئر SPOT ، يغطي التجميع ، واليدوي ، وبذر هلام الخلايا بمساعدة السائل. على عكس أنظمة سدادات الهيدروجيل التقليدية ، يزيل SPOT القطع الأثرية المتعلقة بالغضروف المفصلي ، مما يسهل التصوير غير المدمر في الموقع للعضيات كما هو موضح سابقا14،16،22. بالإضافة إلى ذلك ، توفر السقالة دعما هيكليا ، مما يضمن استقرار الثقافة على المدى الطو...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يقر المؤلفون بمساعدة جينيفر لام في الحصول على الصور. تم إنشاء الشكل 1 والشكل 2 والشكل 7 أ باستخدام BioRender.com. تم دعم هذا العمل من قبل منحة اكتشاف مجلس أبحاث العلوم الطبيعية والهندسة الكندي (NSERC) (منحة #RGPIN-2021-03488) إلى A.P.M. ؛ برنامج التميز البحثي الأول في كندا (CFREF) للطب حسب التصميم للأسئلة الكبرى إلى APM ؛ منح NSERC Canada للخريجين - برنامج الدكتوراه إلى RC ؛ جائزة مؤسسة Peterborough KM Hunter الخيرية ل R.C. ؛ منحت زمالة المجلس الوطني للبحوث (NRC) CRAFT إلى N.T.L. NSERC إنشاء TOeP إلى N.T.L. ؛ جائزة أبحاث الطلاب الجامعيين NSERC إلى Z. K. ؛ وجائزة التميز بجامعة تورنتو ل CMT.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
0.2 مل أنابيب PCR (شرائط من 8)   ؛سارستيدت72.985.002
أنبوب الطرد المركزي 1.5 ملFroggaBioLMCT1.7B
1000 - & أطراف الماصة Lكسوف4-1019-260-000
ماصات مصلية سعة 10 ملFroggaBio394010
حقنة سعة 10 ملBD, كندا302995
10x الحد الأدنى من الوسط الأساسي (MEM 10x)جيبكو11430030
طبق 150 ممكورنينج430599
أطراف الاستغناء عن 16 عيار مع وصلة قفل Luerماكماستر كار ، إلينوي ، الولايات المتحدة الأمريكية6699أ2
20 & رفوف أطراف مرشح Lأوبنترون999-00099
200 µ رفوف أطراف مرشح Lأوبنترون999-00081
200 - و مو ؛ أطراف الماصة Lكسوف4-1030-260-000
أطراف الاستغناء عن 20 عيار مع وصلة قفل Luerماكماستر كار ، إلينوي ، الولايات المتحدة الأمريكية6699أ4
384 بئر صفيحة بئر بدون قاع (أسود)غرينر82051-544
حقنة 3 مل   ؛BD, كندا309657
أنبوب طرد مركزي مخروطي من مادة البولي بروبيلين سعة 50 ملVWRCA21008-940
أنبوب طرد مركزي مخروطي من مادة البولي بروبيلين سعة 50 ملVWRCA21008-940
96 بئر صفيحة بئر بدون قاع (أسود)غرينر82050-714
أسيتونفيشر العلميةأ 18-1
الميزان التحليليغير متاحغير متاح
امتداد AxiDraw ل Inkscape (https://wiki.evilmadscientist.com/Axidraw_Software_Installation)غير متاحغير متاح
AxiDraw Python API (https://axidraw.com/doc/py_api/#installation) غير متاحغير متاح
AxiDraw V3 آلة الكتابة والرسم الشخصية عالية الأداءالعلماء المجانين الشر ، الولايات المتحدة الأمريكيةغير متاح
الكولاجين البقري (PureCol 3 مجم / مل)BioMatrix المتقدم5005
خط الخلية المفضلغير متاحغير متاح
مشبك الحامل (مضمن في حزمة AxiDraw V3)العلماء المجانين الشر ، الولايات المتحدة الأمريكيةغير متاح
وسائط الثقافة المفضلةغير متاحغير متاح
شريط حماية من احتجاز الأوساخ3 م6851 PN36851
شريط لاصق من البولي أكريليك على الوجهين (800 مم × 1200 مم)أبحاث المواد اللاصقة ، ARcare90106NB
مصل الأبقار الجنينية (FBS)جيبكو12483-020
مرشحات الشاي Finum XL   ؛رينش & شركة Held GmbH & شركة KG ، هامبورغ ، ألمانيا420.69.00
أغطية مسطحة لأنابيب PCR سعة 0.2 مل (شرائط من 8)سارستيدت65.989.002
مشابك زنبركية بلاستيكية شديدة التحملالمعيار1024-554
وحدة HEPA – نموذج 110-130 فولت 60 هرتزأوبنترون999-00109
كيس ثلج (مجمد ، 1400 مم × 1800 مم)غير متاحغير متاح
برنامج Inkscapeغير متاحغير متاح
قاطع ليزرنظام الليزر العالميVLS3.75
أنابيب مصغرة من أسيتات فينيل إيثيل (EVA) بقطر خارجي 0.07 بوصةماكماستر كار ، إلينوي ، الولايات المتحدة الأمريكية1883T3
ماصة إلكترونية متعددة القنوات P20 (Gen2)أوبنترون999-00005
ماصة إلكترونية متعددة القنوات P300 (Gen2)أوبنترون999-00006
طلاء الأظافرسالي هانسنSBS-006861اختياري ، لتصبغ حبر PMMA
أوبنترونز OT-2أوبنترون999-00111
ماصة P1000جيلسونFA10006M
ماصة P200 ذات 8 قنواتجيلسونF144072
ماصة P200جيلسونFA10005M
مناشف ورقيةغير متاحغير متاح
بارافيلمشركة بيميس ، إنك52859-079
ورق زبدة   غير متاحغير متاح
ماصات باستورVWR14672-380
البنسلين-الستربتومايسين (P/S)سيجما ألدريتشص 4333
بولي (ميثيل ميثاكريلات) (PMMA)سيجما ألدريتش182230
فيلم بولي كربونات (760 مم × 1300 مم)ماكماستر كار85585 ك102
مونومر بولي ديميثيل سيلوكسان ورابط متقاطع (PDMS ، 1500 مم × 2700 مم)Ellsworth المواد اللاصقة4019862
سكين دقيقغير متاحغير متاح
دعامة أكريليك صلبة (حجم مناسب في أسفل لوحة البئر)ماكماستر كار8560 ك239
دعم من الورق المقوى الصلبغير متاحغير متاح
حاكمغير متاحغير متاح
مقص   ؛غير متاحغير متاح
بيكربونات الصوديوم (0.8 مليون في الماء المقطر)سيجما ألدريتشط6014
سطح درجة الحرارة مع كتل الألمنيوم (Gen2)أوبنترون999-00097
عجلة التتبع HEEPDD (أمازون)B07YQWB284
شريط شفاف غير متاحغير متاح
تريبان بلوجيبكو15250-061
التربسينجيبكو25200-056
الملقطغير متاحغير متاح
خلاط دوامة   ؛غير متاحغير متاح

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Antoni, D., Burckel, H., Josset, E., Noel, G. Three-Dimensional Cell Culture: A Breakthrough in vivo. Int J Mol Sci. 16 (3), 5517-5527 (2015).
  2. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (10), 839-845 (2007).
  3. Zhao, Z., et al. Organoids. Nat Rev Methods Primers. 2 (1), 1-21 (2022).
  4. Done, A. J., Birkeland, A. C. Organoids as a tool in drug discovery and patient-specific therapy for head and neck cancer. CR Med. 4 (6), 101087(2023).
  5. Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nat Rev Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
  6. Schuster, B., et al. Automated microfluidic platform for dynamic and combinatorial drug screening of tumor organoids. Nat Commun. 11 (1), 5271(2020).
  7. Bozal, S. B., et al. Development of an automated 3D high content cell screening platform for organoid phenotyping. SLAS Disc. 29 (7), 100182(2024).
  8. Seiler, S. T., et al. Modular automated microfluidic cell culture platform reduces glycolytic stress in cerebral cortex organoids. Sci Rep. 12 (1), 20173(2022).
  9. Costa, E. C., et al. 3D tumor spheroids: an overview on the tools and techniques used for their analysis. Biotechnol Adv. 34 (8), 1427-1441 (2016).
  10. Pinho, D., Santos, D., Vila, A., Carvalho, S. Establishment of Colorectal Cancer Organoids in Microfluidic-Based System. Micromachines. 12 (5), 497(2021).
  11. Töpfer, E., et al. Bovine colon organoids: From 3D bioprinting to cryopreserved multi-well screening platforms. Toxicol in Vitro. 61, 104606(2019).
  12. Tong, Z., et al. Towards a defined ECM and small molecule based monolayer culture system for the expansion of mouse and human intestinal stem cells. Biomaterials. 154, 60-73 (2018).
  13. Krebs, J., et al. Carrageenan-Based Crowding and Confinement Combination Approach to Increase Collagen Deposition for In Vitro Tissue Development. Gels. 9 (9), 705(2023).
  14. Li, N. T., et al. An off-the-shelf multi-well scaffold-supported platform for tumour organoid-based tissues. Biomaterials. 291, 121883(2022).
  15. Phan, N., et al. A simple high-throughput approach identifies actionable drug sensitivities in patient-derived tumor organoids. Commun Biol. 2 (1), 78(2019).
  16. Hofer, M., Lutolf, M. P. Engineering organoids. Nat Rev Mater. 6 (5), 402-420 (2021).
  17. Landon-Brace, N., et al. An Engineered Patient-Derived Tumor Organoid Model That Can Be Disassembled to Study Cellular Responses in a Graded 3D Microenvironment. Adv Func Mater. 31 (41), 2105349(2021).
  18. Cao, R., et al. An Automation Workflow for High-Throughput Manufacturing and Analysis of Scaffold-Supported 3D Tissue Arrays. Adv Healthcare Mater. 12 (19), 2202422(2023).
  19. Rodenhizer, D., Dean, T., Xu, B., Cojocari, D., McGuigan, A. P. A three-dimensional engineered heterogeneous tumor model for assessing cellular environment and response. Nat Protoc. 13 (9), 1917-1957 (2018).
  20. Young, M., et al. A TRACER 3D Co-Culture tumour model for head and neck cancer. Biomaterials. 164, 54-69 (2018).
  21. Dean, T., Li, N. T., Cadavid, J. L., Ailles, L., McGuigan, A. P. A TRACER culture invasion assay to probe the impact of cancer associated fibroblasts on head and neck squamous cell carcinoma cell invasiveness. Biomater Sci. 8 (11), 3078-3094 (2020).
  22. Du, Y., et al. Development of a miniaturized 3D organoid culture platform for ultra-high-throughput screening. J Mol Cell Biol. 12 (8), 630-643 (2020).
  23. Shing, C. B. Automating the Generation of a High-Throughput Three- Dimensional Human Adipocyte Model. , University of Toronto. (2009).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة