Method Article

أخذ عينات فعالة من مساحة تصميم المستشعرات الحيوية المشفرة وراثيا مع تصميم التجارب وسير عمل الأتمتة

DOI:

10.3791/68448

⸱

October 17th, 2025

 ,  ,  ,  , 
1Manchester Institute of Biotechnology (MIB), Department of Chemistry, University of Manchester

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوفر هذا البروتوكول طريقة للتحسين العالمي المنهجي لأجهزة الاستشعار الحيوية المشفرة وراثيا من خلال إنشاء وتقييم المكتبة الجينية بمساعدة الأتمتة. يقترن ذلك بمنهجيات تصميم التجربة لتبسيط التجريب وتمكين اختيار المكونات الجينية لضبط أجهزة الاستشعار الحيوية على نتائج تصميم محددة.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعد أجهزة الاستشعار الحيوية المشفرة وراثيا أدوات قوية لمعالجة المعلومات عالية الإنتاجية ، مما يتيح نقل إشارات الإدخال البيئية أو الكيميائية إلى مجموعة متنوعة من المخرجات. يسمح ذلك بالاستشعار الديناميكي والتحكم المباشر والتنظيم الدقيق للتعبير الجيني عبر مجموعة واسعة من تطبيقات التكنولوجيا الحيوية ، بما في ذلك تحسين الإنزيم وتطوير السلالة والتحكم في العمليات الميكروبية. لجعلها مناسبة للغرض ، يمكن تحسين أداء المستشعر الحيوي عن طريق تعديل القياس المتكافئ لمكونات دائرة المستشعر الحيوي (على سبيل المثال ، الناقلات ، وحدات الإدخال والإخراج) ، و / أو ضبط التفاعلات بين الجزيئات المرتبطة بالمستشعر الحيوي للمضيف (على سبيل المثال ، بروتين الحمض النووي ، البروتين البروتين). ومع ذلك ، هنا ، فإن العدد الهائل من التباديل المحتملة للمستشعر الحيوي يخلق مساحة تصميم اندماجية معقدة ، مما يستلزم تحسينا دقيقا لاستراتيجيات الفحص لتحديد التكوينات التي تقدم أداء النمط الظاهري المطلوب. يتفاقم هذا التعقيد بسبب سمات أداء المستشعر الحيوي ، مثل قابلية الضبط ، والتي تتطلب تحليل المعايرة بالتحليل الحجمي المستجيب في ظل ظروف الفحص أحادي النسيلة. وبالتالي ، فإن الحاجة إلى استكشاف التسلسلات المتنوعة والفضاء التجريبي تجعل طرق أخذ العينات الجزئية مناسبة بشكل خاص لهذا الغرض. يقوم سير العمل هذا على خوارزميات تصميم التجربة (DoE) ، والتي تم وضعها بشكل جيد للسماح برسم الخرائط المنظمة الفعالة القائمة على الإحصائيات وأخذ العينات الجزئية لمساحة التصميم التجريبي الاندماجية هذه.

تم الإبلاغ عن الداخل عبارة عن أتمتة عالية الإنتاجية ونهج حسابي مشترك لأخذ عينات من مساحة التصميم لأجهزة الاستشعار الحيوية القائمة على عامل النسخ الخيفي بكفاءة لتوفير تكوينات مميزة مع منحنيات استجابة الجرعة الرقمية والتناظرية. يبدأ البروتوكول بإنشاء مكتبات مواقع ربط المروج والريبوسوم والاختيار الآلي لها. يتم تحويل هذه المكتبات وبيانات التعبير المقابلة لها إلى مدخلات منظمة بلا أبعاد ، مما يسمح برسم الخرائط الحسابية لمساحة التصميم التجريبي الكاملة. ثم يتم إجراء أخذ العينات الجزئية باستخدام خوارزمية DoE ومقترنة بتحليل المعايرة بالتحليل الحجمي المستجيب باستخدام منصة أتمتة عالية الإنتاجية. يوفر سير العمل هذا إطارا محايدا لتطوير وتحسين أنظمة الاستشعار الحيوية والدوائر الجينية المستقبلية ، مما يوفر مجموعة أدوات تنظيمية لمجتمع البيولوجيا التركيبية.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعد القدرة على تنظيم التعبير عن الجينات وظيفة أساسية في جميع أشكال الحياة ، مما يسهل الاستجابات الديناميكية في الوقت الفعلي لكل من التأثيرات الداخلية والخارجية ، بدءا من المؤثرات الكيميائية إلى المحفزات الفيزيائية الحيوية1. يتمتع العدد الذي لا يحصى من الأنظمة التنظيمية للنسخ الموجودة في جميع أنحاء الطبيعة بإمكانيات هائلة في زيادة وتسريع هندسة التمثيل الغذائي وأبحاث التكنولوجيا الحيوية التي تمكنها البيولوجيا التركيبية. في بدائيات النوى ، يتم التحكم في الكثير من التنظيم الذي يحدث في الخلية من خلال آليات تنظيمية مكونة من مكون واحد مدفوعة بتفاعلات عوامل النسخ الخيفي (aTFs) مع عدد من المؤثرات الجزيئات الصغيرة2. تتكون عادة من مجال ربط المستجيب (EBD) ومجال ربط الحمض النووي (DBD) ، وتعمل aTFs كمفاتيح جزيئية عند الارتباط بمؤثرات جزيئية صغيرة محددة ، مما يعدل تقارب DBD الخاص بهم لتسلسلات مشغل DNA محددة الموجودة في مناطق محفز الجينوم ، مما يؤدي إلى تنشيط أو قمع النسخ3. أدت هذه الآلية البسيطة المخادعة إلى ظهور عدد من استراتيجيات اللوائح المتنوعة ، بدءا من أنظمة القمع / إزالة القمع إلى المنشطات القادرة على اكتشاف والاستجابة لعدد مذهل من المؤثرات الصغيرة أو المحفزات البيئية4. وبالتالي ، فقد استفادت البيولوجيا التركيبية من هذا التنوع من أجل بناء أجهزة استشعار حيوية مشفرة وراثيا قادرة على اقتران عدد كبير من إشارات الإدخال في مخرجات مخصصة ، أي إنتاج بروتين مراسل الفلورسنت وتنظيم المسارات الاصطناعية. عند تطبيقها في تدفقات عمل التكنولوجيا الحيوية ، تتيح هذه الأنظمة المراقبة في الوقت الفعلي لتركيزات المستقلبات داخل الخلايا ، والتنظيم الديناميكي للمسارات ، والقراءات السهلة التي تساعد في تطوير مسارات وسلالات وعمليات حيوية أكثر كفاءة5،6،7،8.

بشكل أساسي ، تتميز المستشعرات الحيوية وفقا لعدد من المعلمات ، بما في ذلك الخصوصية ، والنطاق التشغيلي ، والنطاق الديناميكي ، والحساسية ، والمنحدر ، مع منحنى استجابة الجرعة لجهاز استشعار حيوي يصف هذه المعلمات من خلال إشارة الخرج كدالة لتركيز الترابط (الشكل 1) 9،10،11،12. يمكن استخدام معادلة هيل لتناسب خصائص أداء المستشعر الحيوي ، مما يوفر دليلا شبه تجريبي لكل معلمة من المعلمات الموضحة أعلاه ، وبالتالي توفير وسيلة لتوصيف نظام المستشعر الحيوي مع تمكين تقييم الجهود المطلوبة لضبط النظام نحو النتائج التي يحركها التطبيق. يمكن تعريف الخصوصية على أنها الاختلافات النسبية في خرج الإشارة التي يسببها مستجيب واحد مقارنة بمجموعة من جزيئات المستجيب المحتملة الأخرى وعادة ما يتم تعديلها على مستوى EBD ل aTF. يتم تعريف النطاق التشغيلي على أنه نطاق تركيزات الترابط التي يستطيع المستشعر الحيوي الشعور بها ، مما يملي نطاق التركيزات التي سيتمكن المستشعر الحيوي من الاستجابة لها. على النقيض من ذلك ، يصف النطاق الديناميكي نسبة أعلى حالة تنشيط قابلة للقياس (ON) إلى حالة التنشيط المعطلة (OFF) وهو معلمة مهمة لضمان أن المستشعر الحيوي يبلغ بشكل موثوق عن تركيزات المستجيب فوق التألق التلقائي للخلفية10. توصف حساسية جزيء المستجيب بأنها التركيز المطلوب لاستنباط إشارة خرج معينة ، تقاس بنصف التركيز الأقصى (EC50) للمستجيب13. وأخيرا، يشار إلى ميل المنحنى بالتعاون (nH) لوحدة التحكم في الوصول (aTF) لموقع المشغل عند المروج وينتج عنه ملف تعريف خرج استجابة رقمية أو تناظرية أكثر. تنشأ التعاون من تفاعلات البروتين والبروتين بين aTFs المرتبطة بالترابط التي تشكل مجمعات متعددة الدرجات تعزز التقارب مع موقع المشغل ، مما يؤدي إلى زيادات حادة في استجابة الدائرة بتركيزات الترابط المشبعة وملف تعريف استجابة رقميةأكثر 14.

يمكن أن تؤثر خصائص استجابة الجرعة للمستشعر الحيوي بشكل كبير على مدى ملاءمة تطبيقاته ، وغالبا ما تكون نقطة "صنع أو كسر" لأي تطبيق مفاهيمي. يمكن أن يختلف أداء المستشعر الحيوي بشكل كبير من نظام إلى آخر ، حيث يختلف النطاق التشغيلي عادة من 0.1 نانومتر إلى 10 ملي موتر13 ، بينما يمكن أن تتراوح النطاقات الديناميكية من 1.4 إلى 2000 أضعاف15. علاوة على ذلك ، في حين أن عدد المركبات المستجيبة التي تم الإبلاغ عنها ل aTFs واسع (المنتجات الأيضية ، والأحماض الأمينية ، والمعادن ، والمضادات الحيوية ، واستشعار النصاب ، وما إلى ذلك)11 ، ليس كل شيء شاملا ، حيث يمثل تحديات للباحثين عندما لا يكون جهاز استشعار حيوي مناسب لمسطيبها موجودا بالفعل في الأدبيات. مكنت البيولوجيا التركيبية هندسة أجهزة الاستشعار الحيوية التي تعالج مثل هذه التحديات ، مما سمح بضبط نطاق المستجيب وخصائص الاستجابة للجرعة لتتماشى بشكل وثيق مع نتائج البحث للتطبيق ، وقد تم استخدامها لمعالجة كلتا المشكلتين المذكورتين أعلاه ، على التوالي16،17. يمكن استهداف مجالين رئيسيين للهندسة عبر البيولوجيا التركيبية ، ومنطقة المحفز للمستشعر الحيوي و aTF نفسه ، والتوسط في آثارهما على مستوى النسخ والبروتين. تشمل الأساليب التي تركز على العناصر الجينية للمستشعر الحيوي من أجل تعديل الأداء على مستوى المروج ، هندسة RBS ، ومواقع المشغل ، و -35 ، -10 (hexboxes) من أجل ضبط الحساسية والنطاقات التشغيلية والديناميكية ، وهي محور المنهجية الموضحة في هذه المخطوطة (الشكل 1). بدلا من ذلك ، يمكن أن يؤدي تعديل انتقائية وحساسية المستشعر الحيوي من خلال تحليل مجال ربط المستجيب وطفرة المخلفات المشاركة في تنسيق المستجيب (باستخدام تماثل التسلسل و / أو البيولوجيا الهيكلية) إلى تعديل استجابته لمستجيب مماثل18،19،20 أو تغييره بالكامل نحو مستجيب غير متشابه ذي الاهتمام16،17،21. يمكن لجهود الضبط هذه بعد ذلك توجيه أجهزة الاستشعار الحيوية نحو تطبيقات محددة ، مع كونها عادة وحدات تحكم في التمثيل الغذائي (حلقات التغذية الراجعة ، دوائر التحكم) ، وأدوات الفحص الأولية (اكتشاف الإنزيم أو السلالة) ، وأدوات الفحص الثانوية (فحص متغير الإنزيم ، وهندسة التمثيل الغذائي) ، والتنقيب البيولوجي للناقل22،23،24. يتضمن أحد الأمثلة على ذلك استخدام aTF المستجيب لحمض المخاط ، CatM ، جنبا إلى جنب مع تسلسل محفز هندسي لتحسين النطاق الديناميكي والتشغيلي. تم دمج هذا النظام مع فرز الخلايا المنشطة بالتألق لعزل سلالات إنتاج حمض المخاط الأكثر فعالية بناء على مضان GFP بعد التطور المختبري التكيفي25.

في حين أن نجاح الاستراتيجيات الهندسية الموضحة أعلاه أمر بديهي ، فإن الترابط بين الرافعات المتاحة لعالم الأحياء الاصطناعية لضبط أجهزة الاستشعار الحيوية يمكن أن يعقد عملية التصميم ويطيل الفترة التي يقضيها في تطوير المستشعرات الحيوية ، مما قد يثني بعض الباحثين عن تنفيذ أجهزة الاستشعار الحيوية في سير العمل الخاص بهم. كما هو موضح في الشكل 1 ، فإن محاولات ضبط المستشعر الحيوي نحو نتيجة معينة من خلال تعديل الصناديق السداسية قد تخفف عن غير قصد من المعلمات الأخرى ، وهذا الاعتماد المتبادل يمثل تحديا معترفا به في هندسة المستشعرات الحيوية12. تتكون الأساليب الشائعة لضبط المستشعرات الحيوية من التصميم العقلاني وهندسة التطور الموجهة ، حيث يعتمد الأول على الفهم المسبق للسمات الهيكلية والميكانيكية للنظام لتركيز التجريب على المكونات ذات الاحتمالية العالية للنجاح. في حين أن هذا الأخير يعتمد على الطفرات العشوائية والتطور الطبيعي إلى جانب شاشة عالية الإنتاجية لاختيار المتغيرات التي تظهر خصائص محسنة26،27،28،29،30. على الرغم من فعاليتها ، إلا أن كلتا التقنيتين تعاني أيضا من بعض العيوب: الهندسة المستهدفة ، على سبيل المثال ، من خلال تركيزها على عناصر هيكلية أو وظيفية محددة ، عرضة للاستكشاف المحدود للفضاء التجريبي الكامل وقد تتجاهل التأثيرات الخيفية أو الثانوية30. على الرغم من أن إنشاء المكتبات وفرزها غير المستهدف ، على الرغم من أنها مثالية لتحسين التصاميم بطريقة غير موجهة ، ولا تتطلب سوى القليل من أعمال التصميم المسبق (أي تصميم المكتبة وتوليدها) ، إلا أنها تتطلب تحيزا نحو طفرة مفيدة. بدون مثل هذا التحيز ، من المتوقع أن تكون نسبة أكبر بكثير من الطفرات ضارة ، مما يتطلب مزيدا من الفحص31. على هذا النحو ، فإن الأساليب الشاملة التي لا تأخذ في الاعتبار فقط التأثير الأساسي للأجزاء المكونة للمستشعر الحيوي (aTF و RBS ومواقع المشغل والعلب السداسية) ولكن أيضا كيفية تفاعل هذه المكونات مع بعضها البعض للتأثير على معلمات المستشعر الحيوي جذابة للغاية.

تم اعتماد منهجيات التجريب والنمذجة الإحصائية متعددة المتغيرات المنظمة على نطاق واسع في سير عمل هندسة العمليات من أجل استجواب الفضاء التجريبي متعدد الأبعاد باستخدام أقل عدد ممكن من التجارب. يسمح هذا النهج ، الذي يجمع بين التجريب والنمذجة ، والذي يطلق عليه تصميم التجارب (DoE) ، للباحثين بشكل حاسم بتحسين العمليات المعقدة متعددة المتغيرات نحو نتائج محددة بينما لا يتطلب معرفة مسبقة واسعةالنطاق 23،30. في حين يتم تطبيقه عادة على تحسين المتغيرات المستمرة التي يكون الاستكشاف التجريبي المنظم أكثر سهولة ، فقد تم استخدام DoE أيضا في تحسين مسارات التمثيل الغذائي على المستوى الجيني31،32،33. يتضمن ذلك خطوة فحص أولية يتم فيها اختيار العوامل التي يعتقد أنها الأكثر أهمية للنتيجة المرجوة ، تليها خطوة تحسين حيث يتم تعديل العوامل المحددة للحصول على المخرجات المطلوبة ، في هذه الحالة لتحسين معلمات محددة من أجهزة الاستشعار الحيوية من أجل زيادة نطاق تطبيقها. بشكل حاسم ، يمكن اقتران هذه التقنية بمنصات معالجة السوائل الآلية لزيادة إنتاجية الغربلة حتى مكتبات متوسطة الحجم من 103 - 104 لتحسين أداء المستشعر الحيوي عالميا على أساس قائم على البيانات23. أدناه ، نصف بروتوكولا لتنفيذ نهج مدفوع بوزارة الطاقة لتحسين المستشعر الحيوي ، بمساعدة روبوتات معالجة السوائل لتبسيط توليد المكتبة وفحصها وجمع البيانات من أجل التحسين العالمي لحساسية المستشعر الحيوي.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. تصميم جزء RBS / الترويج

  1. تحديد العناصر التنظيمية الخاصة بأجهزة الاستشعار الحيوية التي يمكن ضبطها بشكل منهجي كمتغيرات مستمرة في عملية DoE. قم بتجميع هذه العناصر التنظيمية في وحدات متميزة. يمكن أن يشمل ذلك الوحدات النمطية التي تنظم نقل المستجيب ، وتعبير عامل النسخ ، و / أو التعبير الجيني الناتج تأكد من أن كل وحدة قابلة للتعديل على مستوى النسخ و / أو الترجمة بواسطة المروج أو RBS (على سبيل المثال ،RBS trans و Preg و RBSout و P out ، و Pout ، على التوالي).
  2. تحديد المواقع الوظيفية الرئيسية داخل مناطق المروج و RBS المختارة، مثل الصناديق السداسية ومواقع المشغل وتسلسلات RBS.
    ملاحظة: يوجد العديد من المروجين المميزين و RBSs في الأدبيات لإنشاء مكتبات من34،35،36. ومع ذلك ، بالنسبة لتسلسلات المروج غير المميزة (عادة مروج Preg ) ، انظر أدناه للحصول على مزيد من الخطوات لتحديد عناصر التسلسل الجيني القابلة للضبط إذا لم يكن أي منها متاحا في الأدبيات.
    1. حدد موقع المشغلات الأخرى التي تحتوي على تسلسلات المستشعرات الحيوية ذات الأهمية عبر عمليات البحث BlastP في aTF مع مدخلات الاستشعار المطلوبة. استخراج المنطقة بين الجينات من aTF وجيناته المنظمة للحصول على تسلسل المروج.
      ملاحظة: سيختلف موقع وعدد تسلسلات المروج وفقا لفئة aTF المستخدمة.
  3. استخدم أدوات محاذاة التسلسل المتعددة وبرامج الزخارف الأخرى للبحث في المروجين المفترضين عن الزخارف المحفوظة مثل hexboxes ومواقع المشغلين. بناء على تحليل تسلسل المروج ، حدد تسلسل النيوكليوتيدات للتوزيع العشوائي مع قواعد متدهورة ، على سبيل المثال ، N = أي شيء ، R = أي بيورين ، Y = أي بيريميدين ، إلخ.
    ملاحظة: يتم توجيه القراء إلى المنشور المصدر للحصول على مزيد من التفاصيل حول تحليل المروج والتوزيع العشوائي الأساسي23.

2. تجميع المكتبة الجزئية والتحقق من صحتها

  1. تصميم وترتيب البادئات التي ستعمل على وجه التحديد على تضخيم متجه التعبير المطلوب للسماح بإدخال متغيرات تسلسل المروج / RBS في اتجاه المنبع لعلامة الفلورسنت (على سبيل المثال ، GFP). قم بتخفيف البادئات المجففة بالتجميد عند الوصول إلى تركيز نهائي يبلغ 100 ميكرومتر في H2O معقم منزوع الأيونات.
    1. قم بتجميع خليط تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل على الثلج في أنابيب PCR وفقا لمعلمات البوليميراز المحدد. تأكد من استخدام بوليميراز عالي الدقة لمنع ترحيل الطفرات إلى العمود الفقري لناقل التعبير. اضبط درجة حرارة التلدين ووقت التمديد وفقا لاحتياجات البادئات وطول منتج PCR المطلوب.
    2. قم بتحليل منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل عن طريق الرحلان الكهربائي للهلام وتنقية الناقل الخطي باستخدام إما تنقية تفاعل البوليميراز المتسلسل أو مجموعة استخراج الهلام. قم بقياس تركيز الحمض النووي المتجه الخطي وتخزينه عند -20 درجة مئوية.
  2. اطلب المكتبات المتغيرة المصممة (RBS أو المروجين) لإدخالها في المتجه الخطي كقليل النوكليوتيدات المتدهورة أحادية الشريطة مع أذرع تماثل البلازميد 30 نقطة أساس في كل من الطرفين 5 و 3 لإعادة التركيب المتماثل المستهدف في متجه التعبير.
    1. عند الوصول ، أعد تعليق قليل النوكليوتيدات المجففة بالتجميد إلى تركيز نهائي يبلغ 100 نانوغرام / ميكرولتر في H2O معقم منزوع الأيونات.
  3. حدد أحجام الكميات متساوية الضورات لمكتبة المتجهات والمتغيرات الخطية باستخدام الآلات الحاسبة عبر الإنترنت. تأكد من أن الحجم النهائي للتفاعل سيصل إلى 20 ميكرولتر وأنه يتم استخدام نسبة مولار 2: 1 من الإدخال إلى المتجه.
    1. قم بإذابة جزء من مزيج التجميع الرئيسي التجاري Gibson (X2) على الجليد وقم بتجميع التفاعل في أنبوب PCR وفقا للأحجام التي توفرها الآلة الحاسبة المختارة.
      ملاحظة: يمكن أيضا صنع مزيج جيبسون الرئيسي في المختبر37،38.
    2. أضف 10 ميكرولتر من مزيج جيبسون الرئيسي 2x إلى شظايا الحمض النووي واحتضن لمدة ساعة واحدة عند 50 درجة مئوية في جهاز تدوير حراري أو ما شابه.
    3. ضع كل 20 ميكرولتر من منتج الربط على 200 ميكرولتر من الإشريكية القولونية المختصة في أنبوب طرد مركزي دقيق. احتضن على الثلج لمدة 30 دقيقة تليها صدمة حرارية لمدة 45 ثانية عند 42 درجة مئوية.
    4. أعد الخلايا إلى الجليد لمدة دقيقتين ، وأضف 800 ميكرولتر من المرق الأمثل للغاية مع وسائط قمع الكبابوليت (SOC) إلى الأنبوب ، واسمح للخلايا بالتعافي لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية في حاضنة اهتزاز.
    5. انشر 50 ميكرولتر من الخلايا المحولة على عدة ألواح أجار أجار 60 مم مع اختيار المضادات الحيوية ذات الصلة. احتضان الألواح عند 37 درجة مئوية لمدة 18 ساعة.
  4. تحقق من اللوحات بحثا عن المحولات ، واحسب عدد المستعمرات التي تمثل 3 أضعاف تنوع المكتبة النظرية لالتقاط تمثيل كاف لكل متغير. قم بتحسين التجميع متساوي الحرارة إذا كان عدد المستعمرات منخفضا / صفرا.
    ملاحظة: يلزم أخذ العينات الزائدة عند التفكير في مكتبة مثالية تم إنشاؤها من كواشف أو توليف عالي الدقة. عادة ما يكون هذا أكبر بمقدار 3 أضعاف الحجم الإجمالي للمكتبة. على سبيل المثال ، 4 أوضاع من الانحطاط (NNNN) = 44 = 256 تسلسلا فريدا. لذلك ، كشط ~ 768 مستعمرة.
    1. اكشط العدد المطلوب من المستعمرات في قارورة واحدة معقمة سعة 125 مل تحتوي على 25 مل من وسائط LB المكملة بالمضادات الحيوية المناسبة. احتضان القارورة عند 37 درجة مئوية لمدة 18 ساعة في حاضنة اهتزاز (180 دورة في الدقيقة) ، مما يضمن أن تكون المزرعة كثيفة بشكل واضح بعد انقضاء هذا الوقت.
    2. استخدم مجموعة تنقية البلازميد متوسطة التحضير لتنقية المكتبة المتغيرة من ثقافة المحولات المعدة. تحديد تركيز الحمض النووي لمكتبة البلازميد; مطلوب 1-10 ميكروغرام للخطوات النهائية. تأكد من أن الحمض النووي للمكتبة مملوء باستخدام H2O معقم منزوع الأيونات.
      ملاحظة: ستركز الخطوات التي تتجاوز هذه النقطة على استنساخ والتحقق من صحة المكتبات المتغيرة في مضيف تعبير Pseudomonas putida (P. putida). قد يتطلب تكييف البروتوكول مع المضيفين الآخرين تعديل أوقات الحضانة ودرجات حرارة الحضانة وطرق التحول.
  5. قم بإعداد لوحة أجار LB من مضيف التعبير المطلوب P. putida عن طريق الخطوط من مخزون الجلسرين واحتضان اللوحة عند 30 درجة مئوية لمدة 18 ساعة.
    1. اختر مستعمرة واحدة من P. putida من لوحة أجار LB ، وقم بتلقيح 10 مل من وسائط LB ، وتنمو عند 30 درجة مئوية لمدة 18 ساعة ، عند اهتزاز 180 دورة في الدقيقة.
    2. جهز الخلايا للكفاءة الكهربائية عن طريق طرد المزرعة المزروعة عند 4000 × جم عند 18 درجة مئوية لمدة دقيقتين. اسكب المادة الطافية ، وأعد تعليقه في 1 مل من H2O المعقم منزوع الأيونات ، وانقل الخلايا المعلقة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق معقم.
      ملاحظة: P. putida يجب أن تظهر الخلايا وردية عند تكويرها.
    3. قم بالطرد المركزي للخلايا لمدة دقيقة واحدة عند 4 × جم في جهاز طرد مركزي دقيق ، واسكب المادة الطافية ، وأعد تعليقها في 1 مل من H2O المعقم منزوع الأيونات. كرر خطوات الطرد المركزي وإعادة التعليق 4 مرات أخرى.
      ملاحظة: قد يحدث فقدان الخلايا عند سكب المادة الطافية أثناء الغسيل. هذا أمر طبيعي ولا ينبغي أن يؤثر على الغلة.
    4. انقل 100 ميكرولتر من الخلايا المغسولة إلى كوفيت التثقيب الكهربائي 0.2 سم ، وأضف 1-10 ميكروغرام من الحمض النووي لمكتبة البلازميد إلى الكوفيت ، واخلطها.
    5. قم بتشغيل المثقب الكهربائي ، وتأكد من ضبط الجهد على 2.5 كيلو فولت للكوفيت 0.2 سم ، وأدخل الكوفيت في غرفة التثقيب الكهربائي ، ونبض.
    6. أضف 900 ميكرولتر من وسائط SOC إلى الكوفيت ، واخلطها وانقل الخلايا إلى أنبوب طرد مركزي دقيق معقم. اسمح للخلايا بالتعافي لمدة ساعتين عند 30 درجة مئوية في حاضنة اهتزاز.
  6. انشر 50 ميكرولتر من الخلايا المحولة على ألواح بتري مربعة كبيرة (230 مم) من أجار LB مكمل بالمضاد الحيوي ذي الصلة واحتضان عند 30 درجة مئوية لمدة 18 ساعة.
    ملاحظة: تأكد من كثافة المستعمرة المعتدلة على ألواح المكتبة (2-3 CFU / سم2). سيعتمد هذا على الكفاءة البكتيرية وحجم الطلاء. إذا كان منخفضا جدا ، فيمكن استخدام تحسين التحول ، أو جولات متتالية من التحول ، لزيادة أعداد المستعمرات.
  7. حدد ما بين 25-50 مستعمرة من جميع لوحات المحولات للتحقق من صحة التسلسل. استخدم البادئات التي تضخم عبر التسلسل المتدهور ، وتضخيم المنطقة بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل ، وإرسالها إلى تسلسل سانجر لتقييم تنوع التسلسل ، بالإضافة إلى تعدد النسيلة.
    ملاحظة: إذا أصبحت الندورة متعددة النسيلة مشكلة ، فإن نشر التحولات عبر دفعات متعددة من الكوفيت مع 1 ميكروغرام من الحمض النووي يمكن أن يساعد في تقليل هذا التأثير.

3. الفحص النسيلي للمكتبة الجزئية - الأتمتة

  1. إعداد معالج السوائل
    1. قم بإنشاء 7 برامج على منصة معالج السوائل لضمان التقليل من حدة الخطوات كثيفة السحب بسحب السوائل.
    2. قم بإنشاء برنامج "نقل السوائل MTP"، وتأكد من إعداد معالج السوائل لماصة حجم قابل للتعديل من خزان مجهز إلى ألواح ميكروتيتر فارغة (MTP) في تخطيطه.
    3. قم بإنشاء برنامج "إضافة الجلسرين إلى MTP"، وتأكد من برمجة معالج السوائل على ماصة حجم 100 ميكرولتر من الجلسرين بنسبة 50٪ في الألواح ، وتأكد من أن سرعة الاستغناء والشفط هي 5-20 ميكرولتر / ثانية.
      ملاحظة: يتم إنشاء برنامج منفصل لحساب اللزوجة العالية بنسبة 50٪ من الجلسرين ، مما قد يؤدي إلى تكوين فقاعات أو شفط غير مكتمل أو تلوث متبادل للآبار المجاورة بسبب الرش إذا لم يتم التحكم فيه.
    4. قم بإنشاء برنامج "DWB Liquid Transfer"، وقم بإعداد معالج السوائل ليتم توجيه الماصة إلى كتل الآبار العميقة (DWB) مع إعداد حجم قابل للتعديل، وتأكد من أن ماصات معالج السوائل تخرج من خزان مملوء مسبقا.
    5. قم بإنشاء برنامج "التلقيح من MTP المذابة" ، وتأكد من برمجة معالج السوائل لشفط 5 ميكرولتر من MTP المذاب الذي يحتوي على المستعمرات المحددة ونقلها إلى لوحات DWB المقابلة في التخطيط.
      ملاحظة: انتبه جيدا لترتيب MTP و DWB في التخطيط ، مما يضمن ترتيبا منطقيا للأحداث لتجنب التلقيح المزدوج العرضي أو الألواح المفقودة.
    6. قم بإنشاء برنامج "نقل إلى فحص DWB" ، وتأكد من ضبط معالج السائل على نقل 5 ميكرولتر من الخلايا من موضع لوحة DWB إلى موضع لوحة DWB آخر. يجب أن يكرر البرنامج هذا الإجراء 4 مرات مع كل نقل لتلقيح موضع لوحة مختلف ، على سبيل المثال ، P1 -> P2 و P1 -> و P3 ، إلخ.
      ملاحظة: يضمن هذا البرنامج الزراعة الفرعية السلسة ل 96 متغيرا في تركيزات مختلفة للمقايسة.
    7. قم بإنشاء برنامج "إعداد الفحص - إعادة تعليق PBS (DWB)" ، وتأكد من أن معالج السوائل يقوم بماصة كل DWB في التخطيط مع 500 ميكرولتر من PBS ، يجب أن يتضمن البرنامج أيضا خطوة خلط لضمان إعادة تعليق كريات الخلايا بشكل صحيح.
    8. قم بإنشاء برنامج "إعداد الفحص - إضافة الخلايا وبرنامج PBS (MTP)" ، وتأكد من أن هذا البرنامج يتضمن خطوة لنقل 200 ميكرولتر من الخلايا المعلقة من موضع لوحة DWB واحد إلى موضع MTP فارغ.
      ملاحظة: بالنسبة لجميع خطوات 3.1 ، ستختلف تخطيطات البرمجة ومعالج السوائل ؛ يجب على الباحثين الرجوع إلى كتيبات معالجات السوائل التجارية المحددة لتعديل البرامج المذكورة أعلاه لتناسب سعة واحتياجات التجربة.
  2. ثقافة المكتبة المتغيرة والترميز الشريطي
    1. حدد حجم المكتبة النظرية واحسب عدد المتغيرات الفردية لضمان تغطية المكتبة بنسبة 95٪ > (يوصى بحجم مكتبة 3x) (راجع الملاحظة الخاصة بالخطوة 2.5).
    2. احسب الحجم المطلوب من وسائط LB المكملة بالمضادات الحيوية وفقا لعدد المستعمرات التي سيتم فحصها (200 ميكرولتر لكل مستعمرة + 10٪ أكثر).
    3. افتح برنامج معالج السوائل وانقر فوق تشغيل بجوار برنامج نقل السوائل MTP (انظر الملف التكميلي 1). ضع الوسائط المحضرة في موضع الخزان المقابل واملأ السطح ب MTPs الفارغة وفقا للتخطيط. اضبط البرنامج على توزيع 200 ميكرولتر من الوسائط. انقر فوق موافق لتأكيد بدء البرنامج.
      ملاحظة: تأكد دائما من توفير الخزانات والنصائح بشكل كاف لمنصة معالج السوائل قبل تأكيد بدء البرنامج لمنع الانقطاع.
    4. كرر البرنامج عدة مرات حسب الحاجة ، وأغلق MTPs المملوءة بغشاء مسامي للحفاظ على العقم.
    5. انقل لوحات MTP المملوءة إلى منصة منتقي المستعمرات وافتحها ، وانقل أيضا الألواح المربعة ل P. putida المحولة باستخدام الحمض النووي لمكتبة البلازميد المتغيرة إلى منصة منتقي المستعمرة. استخدم منتقي المستعمرة لتلقيح كل من آبار لوحة الميكروتيتر المعبأة مسبقا بمستعمرة واحدة من ألواح المكتبة المحولة.
      ملاحظة: تأكد من أن الحد الأدنى لعمق الأجار هو 25 مل لتجنب إتلاف رأس منتقي المستعمرة.
    6. أعد إغلاق الألواح الملقحة ونقلها إلى حاضنة اهتزاز دون اتصال بالإنترنت عند 30 درجة مئوية (800 دورة في الدقيقة)، مما يضمن تمكين التحكم في الرطوبة بنسبة 75٪ لتجنب تبخر المزرعة. اتركها لتنمو لمدة 16 ساعة.
      ملاحظة: بعد الحضانة ، ستظهر الثقافات كثيفة بشكل واضح للعين ، إذا لم يكن الأمر كذلك ، فأعد فحص متطلبات الوسائط والمضادات الحيوية.
    7. بعد 16 ساعة من النمو ، أعد الألواح المزروعة إلى منصة معالج السوائل وفكها. انقر فوق تشغيل بجوار بروتوكول إضافة الجلسرين إلى بروتوكول MTP (انظر الملف التكميلي 1) ، وتأكد من أن تخطيط اللوحة على الشاشة يطابق تخطيط رصيف معالج السوائل. انقر فوق موافق واسمح بتشغيل البروتوكول.
    8. بمجرد الانتهاء ، أغلق الألواح مرة أخرى واخلطها لفترة وجيزة في حاضنة اهتزاز غير متصلة بالإنترنت (800 دورة في الدقيقة) لمدة 5 دقائق قبل الترميز الشريطي والتخزين عند -80 درجة مئوية.
    9. كرر الخطوات 3.2.7. و 3.2.8. حتى يتم إضافة الجلسرين إلى جميع MTPs ، ويتم خلطها وترميزها وتخزينها عند -80 درجة مئوية.
      ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا في هذه المرحلة للتحضير لخطوات التوصيف أدناه. علاوة على ذلك ، يمكن التخطيط لحجب الألواح في عمليات تجريبية مختلفة لتناسب سعة منصة معالج السوائل المستخدمة أو لتقليل عبء العمل في جلسة واحدة.
  3. فحص المكتبة المتغيرة
    1. احسب الحجم المطلوب من الوسائط المكملة بالمضادات الحيوية لعدد DWB المراد ملؤها (~ 495 ميكرولتر لكل بئر + 10٪ أكثر).
    2. انقر فوق تشغيل بجوار برنامج DWB Liquid Transfer (انظر الملف التكميلي 1) ، وتأكد من إضافة الوسائط إلى الخزان الصحيح في تخطيط البرنامج. تأكد من إضافة DWB فارغة إلى مواضع التخطيط المقابلة وتوفر إمدادات كافية من الإكراميات. اضبط البرنامج على توزيع 495 ميكرولتر من الوسائط. عندما تكون جاهزا ، انقر فوق موافق لبدء البرنامج.
    3. أغلق DWBs المملوءة بغشاء قابل للتنفس وانقله إلى التخزين المؤقت عند 4 درجات مئوية ، كرر الخطوة 3.3.2. حتى يتم ملء العدد المطلوب من DWBs بالوسائط.
    4. انقر فوق تشغيل بجوار برنامج Incoculate from Thawed MTP (انظر الملف التكميلي 1) ، وتأكد من نقل أدوات التبريد MTP و DWBs المملوءة إلى منصة معالج السوائل وفقا للتخطيط. تأكد من توفير إمدادات كافية من الإكراميات. انقر فوق موافق لتهيئة البرنامج.
      ملاحظة: قم بإذابة ألواح المخزون على الجليد لمدة 30 دقيقة ، فقط عند إعداد البرامج والألواح المطلوبة لضمان البقاء الأمثل للخلايا.
    5. عند انتهاء البرنامج ، قم بختم DWBs الملقحة طوال الليل بغشاء قابل للتنفس ، ونقلها إلى حاضنة شاكر اللوحة غير المتصلة بالإنترنت مع التحكم في الرطوبة بنسبة 75٪ واتركها تنمو طوال الليل لمدة 16 ساعة عند 30 درجة مئوية (180 دورة في الدقيقة).
    6. أعد إغلاق وخلط وإعادة MTPs بالتبريد إلى -80 درجة مئوية للفريزر وفقا للخطوة 3.2.8.
    7. كرر الخطوات 3.3.4. إلى 3.3.6. مطلوب عدة مرات حتى يتم تلقيح العدد المطلوب من DWBs بين عشية وضحاها ونقلها إلى الحاضنة.
      ملاحظة: يوصى بتسجيل وقت إضافة كل دفعة من اللوحات إلى الحاضنة لحساب الفجوة الزمنية بين عمليات التشغيل أثناء التلقيح واستخدام نفس الترتيب لخطوات المصب.
    8. احسب الحجم المطلوب من الوسائط المكملة بتركيزات مختلفة من المستجيب والمضاد الحيوي وفقا لعدد DWB الليلي المراد فحصها (495 ميكرولتر لكل بئر + 10٪ أكثر). يتطلب كل تركيز مستجيب خزانا منفصلا خاصا به في معالج السائل.
      ملاحظة: للتوصيف الأولي ، مثل فحص التشغيل / الإيقاف ، يكفي تركيزان من المستجيب (على سبيل المثال ، 0 و 1000 ميكرومتر تركيز نهائي). من أجل توليد بيانات استجابة الجرعة لتوصيف أكثر قوة ، يتم زيادة هذا النطاق إلى أربعة تركيزات على الأقل (على سبيل المثال ، 0 و 1 و 25 و 1000 ميكرومتر تركيز نهائي). لا تتطلب أنظمة المثبط إضافة مستجيب للتأكد من الوظيفة ، بينما بالنسبة للمنشطات ، مثل النظام الموضح ، يلزم وجود مستجيب.
    9. انقر فوق تشغيل بجوار برنامج DWB Liquid Transfer (انظر الملف التكميلي 1). تأكد من أن الخزانات التي تحتوي على وسائط مكملة بالمستجيب في المواضع الصحيحة ، وفقا للتخطيط. أضف DWBs فارغة إلى منصة معالج السوائل. تأكد من توفر نصائح كافية للمنصة. عندما تكون جاهزا ، انقر فوق موافق لبدء البروتوكول لإنشاء اختبار DWBs.
    10. بعد التعبئة ، أغلق DWBs المقايسة بغشاء قابل للتنفس وانقله إلى التخزين المؤقت عند 4 درجات مئوية ، وأعد ملء منصة معالج السوائل بمزيد من الألواح الفارغة.
    11. كرر الخطوتين 9.3.3 و10.3.3 عدة مرات حسب الضرورة حتى يتم ملء العدد المطلوب من DWBs.
    12. انقر فوق تشغيل بجوار برنامج نقل إلى فحص DWB (انظر الملف التكميلي 1). تأكد من إضافة DWBs غير المختومة التي تحتوي على وسائط مكملة بالمستجيب إلى المواقع الصحيحة في تخطيط معالج السوائل.
    13. انقل وافتح DWBs طوال الليل التي تحتوي على P. putida المزروعة الملقحة في الخطوة 3.3.4. إلى منصة معالج السوائل ، مما يضمن مرة أخرى الالتزام الصارم بالتخطيط. تأكد من توفر نصائح كافية للمنصة. عندما تكون جاهزا ، انقر فوق موافق لبدء البروتوكول.
      ملاحظة: عادة ما يجب أن يتم نقل وترتيب الثقافات الفرعية في ألواح الفحص على دفعات اعتمادا على حجم منصة معالج السوائل.
    14. بعد انتهاء البرنامج ، قم بتطبيق الأختام ونقل لوحات الفحص إلى حاضنة غير متصلة بالإنترنت عند 30 درجة مئوية ، مع رطوبة 75٪ لمدة 16 ساعة (180 دورة في الدقيقة) ، سيكون حجم الفحص النهائي 500 ميكرولتر في هذه المرحلة.
    15. تخلص من DWBs طوال الليل بعد التلقيح وكرر الخطوات من 3.3.12 إلى 3.3.14 كما هو مطلوب حتى يتم تلقيح جميع المقايسات المطلوبة DWB وتنمو في حاضنات غير متصلة بالإنترنت.
    16. قم بإزالة DWBs من الحاضنة ، وانقلها إلى جهاز طرد مركزي وخلايا بيليه عند 4000 × جم ، 18 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. اسكب المادة الطافية وضع DWBs التي يتم طردها بالطرد المركزي على منصة معالج السوائل.
      ملاحظة: قد تختلف أحجام حبيبات الخلايا اعتمادا على تركيز المستجيب أو المتغير, بالإضافة إلى ذلك قد تظهر بعض الكريات أكثر وضوحا للعين من غيرها.
    17. احسب حجم 1x PBS المطلوب بناء على عدد DWB المراد فحصه (500 ميكرولتر لكل بئر + 10٪ أكثر).
    18. انقر فوق تشغيل بجوار برنامج Assay Setup - PBS Resuspension (DWB) (انظر الملف التكميلي 1) ، واضبط حجم الاستغناء على 500 ميكرولتر ، وتأكد من إضافة 1x PBS إلى الخزان الصحيح ، ثم قم بترتيب الألواح التي يتم طردها بالطرد المركزي وفقا لتخطيط معالج السائل. تأكد من توفر نصائح كافية . انقر فوق موافق لبدء البرنامج.
      ملاحظة: يتم إجراء غسل الخلايا لإزالة وسائط النمو المتبقية ، والتي قد تنتج بعض التألق الذاتي.
    19. أعد إغلاق الألواح المعلقة وإزالتها من معالج السائل. تأكد من إعادة تعليق الكريات تماما عن طريق فحص الجانب السفلي من اللوحة. استمر في نقل DWBs المحببة إلى معالج السوائل وكرر الخطوة 3.3.18. حتى يتم تعليق جميع اللوحات.
    20. انقر فوق تشغيل بجوار برنامج إعداد الفحص - إضافة الخلايا و PBS (MTP) (انظر الملف التكميلي 1). انقل DWBs المعلقة من الخطوة 3.3.18. في معالج السوائل وفقا للتخطيط المقترح. انقل MTPs الفارغة إلى معالج السوائل وفقا للتخطيط. تأكد من ضبط حجم التوزيع على 200 ميكرولتر وتوفر أطراف كافية. انقر فوق موافق لبدء البرنامج.
    21. نقل MTPs المملوءة (حجم الفحص النهائي 200 ميكرولتر) إلى قارئ لوحة متعدد الأوضاع غير متصل بالإنترنت ، وقياس التألق النسبي عند الطول الموجي المناسب لانبعاث الإثارة (على سبيل المثال ، sfGFP lEx / lEm = 488/520) و OD600 لكل بئر في اللوحة.
      ملاحظة: تعتمد إعدادات الطول الموجي لإصدار الإثارة على اختيار الجين الفلوري المشفر في ناقل التعبير. تأكد من اتساق إعدادات الكسب على قارئ اللوحة طوال الوقت وتمكين التمييز بين المتغيرات المنخفضة والعالية دون تشبع الكاشف.
    22. كرر الخطوات 3.3.20. و 3.3.21. حتى يتم نقل جميع عمليات الفحص DWPs إلى MTPs وقياسها.

4. معالجة البيانات / التحويل والترتيب التفاضلي

  1. قم بإجراء تطبيع للبيانات التي تم جمعها عن طريق قسمة مضان GFP المسجل (RFU) على قياس OD600 المسجل لكل متغير لكل تركيز من تركيزات المستجيب المقدرة (0 و 1000 ميكرومتر).
    ملاحظة: يمكن برمجة معظم قارئات الألواح لتطبيع التألق تلقائيا بواسطة OD600 أثناء جمع البيانات.
  2. احسب ON / OFF للحصول على النطاق الديناميكي لكل متغير بقسمة RFU / OD600 عند 1000 ميكرومتر (ON) على RFU / OD600 عند 0 ميكرومتر (إيقاف التشغيل). ارسم جميع قيم التشغيل / الإيقاف المتغيرة كمخطط مبعثر باستخدام التشغيل / الإيقاف لبنية المستشعر الحيوي الأساسي لتحديد المتغيرات التي تظهر نشاطا أعلى من المستوى الأساسي.
    ملاحظة: تم تحديد تشغيل / إيقاف تشغيل بنية المستشعر الحيوي الأولي المستخدم في البروتوكول ليكون 3.6 أضعاف بناء على التوصيف الأولي للتسلسل البريمن النوع 23.
  3. للتوصيف المتعمق ، قم بملاءمة بيانات الاستجابة للجرعة باستخدام وظيفة Hill مع ميل متغير لاستخراج قيم EC50 و / أو منحدر التل باستخدام برنامج تحليلي.
    ملاحظة: لتقدير الحساسية و EC50 ، اجمع أربع نقاط بيانات على الأقل تمتد عبر النطاق حيث تنتقل الاستجابة من تنشيط منخفض إلى تنشيط مرتفع ، وعادة ما يكون الجزء الأكثر حدة من المنحنى. في حين أن المزيد من نقاط البيانات تعمل على تحسين الدقة والدقة ، فإن أربع نقاط كافية لتقدير ترتيب الحساسية.
  4. من المجموعة الكاملة من المتغيرات ، حدد مجموعة فرعية من المتغيرات (على سبيل المثال ، N = 100) لضمان تغطية متوازنة للتصنيفات المطلوبة ، في هذه الحالة EC50. للقيام بذلك ، حدد المتغيرات التي تمتد على نطاق واسع في EC50 ، مما يضمن تمثيل المتغيرات ذات التصنيف العالي والمنخفضة التصنيف بشكل متناسب. إزالة المتغيرات الزائدة عن الحاجة (على سبيل المثال، تلك ذات التصنيفات المتشابهة والتأثير الضئيل على تغطية التوزيع).
  5. بعد اختيار مكتبة عينة المتغير النهائية (على سبيل المثال ، N = 100) ، قم بتحويل البيانات باستخدام معادلة التحويل الخطية اللوغاريتمية التالية (line-log) (Eq.1).
    مكافئ 1:
    figure-protocol-1
    أين
    figure-protocol-2
    figure-protocol-3
    figure-protocol-4
  6. بالنسبة لقيم EC50، قم بتعيين +1 للأعلى (الأقل حساسية) و-1 للأدنى (الأكثر حساسية). المتوسط الهندسي 0 يتوافق مع مستويات التعبير المتوسطة.

5. جيل تصميم الفحص النهائي / وزارة الطاقة

  1. لاستكشاف مساحة تصميم المستشعر الحيوي بشكل منهجي ، استخدم تصميم الفحص النهائي (DSD). يفضل هذا التصميم نظرا لقدرته على استكشاف مساحة التصميم بكفاءة مع تكييف الدراسة وفقا لاحتياجات النظام المحددة.
  2. انقر فوق فئة وزارة الطاقة ثم حدد زر تصميم الفحص النهائي في البرنامج الإحصائي (انظر الملف التكميلي 2).
  3. حدد العوامل التجريبية (على سبيل المثال ، RBStrans و Preg و RBSout و Pout) كمتغيرات مستمرة بالنقر فوق الزر "مستمر" وتسميتها ، مع التأكد من تعيين القيم على +1 و -1 (انظر الملف التكميلي 3).
  4. حدد الاستجابات المطلوبة (على سبيل المثال ، تشغيل ، إيقاف ، تشغيل / إيقاف ، EC50 ، منحدر) بالنقر فوق الزر إضافة استجابة وتخصيص الاسم (انظر الملف التكميلي 4).
    ملاحظة: حدد هدف الاستجابة من خلال النقر على القائمة المنسدلة للهدف، واختر لا شيء أو تكبير البيانات بناء على هدف التصميم (على سبيل المثال، الاستكشاف مقابل التحسين).
  5. بمجرد تحديد العوامل والاستجابات ، انقر فوق متابعة لفتح علامة تبويب خيارات التصميم. حدد لا توجد كتل مطلوبة ، ثم انقر فوق الزر Make design (انظر الملف التكميلي 5).
    ملاحظة: يمكن إضافة كتل لعزل التصميم عن عوامل الإزعاج (عوامل ليست ذات أهمية أساسية). هذا يمكن أن يضيف تعقيدا للتجارب. ومع ذلك ، يتم استخدامه وفقا لتقدير الباحث.
  6. سيقوم البرنامج بإنشاء جدول تصميم تجريبي يحدد مجموعات محددة من العوامل التي سيتم اختبارها. سيتم استخدام الأجزاء الجينية من المكتبات المحولة المقابلة لتوليد 17 بنية مقابلة. احفظ جدول التصميم وقم بتصديره بالنقر فوق إنشاء جدول (انظر الملف التكميلي 6).

6. كرر الخطوة 2 - تصميم وتجميع التصاميم الجينية المستنيرة بوزارة الطاقة

  1. ابدأ في بناء البلازميدات متعددة المتغيرات وفقا لخطة تصميم الفحص النهائي (DSD).
    1. حدد متغيرا أوليا (على سبيل المثال ، المروج ، RBS ، إلخ). تصميم وترتيب البادئات لخطية متجه التعبير ، والتأكد من أن البادئات تحيط بمنطقة المتغير المستهدفة ، مما يضمن إزالة أي عناصر تسلسل موجودة مسبقا.
    2. تصميم وترتيب البادئات التي ستعمل على وجه التحديد على تضخيم التسلسلات المتغيرة المقابلة لمستويات المكتبة المحددة مسبقا (على سبيل المثال ، -1 ، 0 ، +1) لكل عقدة تنظيمية (Pout P reg RBSخارج RBStrans). تأكد من أن كل برايمر يتضمن أذرع تماثل 30 نقطة أساس مكملة لموقع إدخال متجه التعبير.
    3. قم بتنقية الحمض النووي البلازميد من ثقافة مخزون التبريد ذات الصلة المقابلة لمستويات مكتبة +1 و 0 و -1 للمتغير المحدد عبر miniprep.
  2. قم بإعداد تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل لمتجه التعبير الخطي وشظايا المكتبة على الجليد وحدد تركيز المنتج كما هو موضح في الخطوتين 2.1.1 و 2.1.2.
    1. كرر الخطوات من 2.3 إلى 2.4 من البروتوكول لإجراء تجميع جيبسون لمتجه التعبير الخطي وأجزاء المكتبة. تأكد من استخدام أطباق بتري ذات الحجم القياسي في هذه المرحلة.
    2. غربلة المستعمرات باستخدام تسلسل سانجر لتأكيد تجميع البناء الصحيح لكل تصميم من تصميمات DSD المقترحة ، ثم انتقل إلى تحويل P. putida (الخطوات 2.5 - 2.6).
    3. باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل ، تأكد من وجود البلازميد الصحيح في المستعمرات المحولة. اختر المحولات المؤكدة وقم بتلقيحها في 10 مل من LB مع المضادات الحيوية للنمو بين عشية وضحاها عند 30 درجة مئوية لمدة 18 ساعة (180 دورة في الدقيقة). اصنع أدوات التبريد (25٪ الجلسرين النهائي) وخزنها في درجة حرارة -80 درجة مئوية.

7. الفحص وترشيد البيانات

  1. من مخزون التبريد ، خط P. putida تحولت مع تركيبات تصميم DSD ذات الصلة على LB agar المكملة بالمضادات الحيوية ، واحتضان عند 30 درجة مئوية لمدة 18 ساعة بين عشية وضحاها لزراعة المستعمرات.
    1. اختر ثلاث مستعمرات مفردة من كل لوحة تتوافق مع تصميمات DSD المقترحة والثقافة بين عشية وضحاها في 10 مل من وسائط LB المكملة بالمضادات الحيوية عند 30 درجة مئوية لمدة 18 ساعة.
    2. في اليوم التالي ، قم بتحميل DWB بتدرج تركيز من المستجيب يتراوح من 0 ملي مولار إلى 1 ملي مولار (التركيز النهائي) لكل صف إلى حجم إجمالي يبلغ 50 ميكرولتر لكل بئر. قم بتخفيف الثقافات الليلية 1/100 إلى رطل طازج وأضف 450 ميكرولتر من المزرعة إلى DWB عبر تدرج التركيز.
    3. كرر الخطوتين 3.3.14 و 3.3.16 يدويا للحصول على DWBs المزروعة ، ثم انتقل إلى الخطوات 3.3.18 و 3.3.20 وتنفيذها يدويا. و 3.3.21. للحصول على بيانات RFU/OD لكل متغير مقترح.
  2. قم باحتواء بيانات استجابة الجرعة (RFU / OD) باستخدام وظيفة Hill (مع منحدر متغير) ، واستخراج المعلمات (العوامل) المناسبة للتحسين ، مثل EC50 أو منحدر التل أو النطاق الديناميكي أو النطاق التشغيلي. قم بتحويل البيانات الناتجة إلى log10 وأدخل المعلمات المستخرجة في جدول DSD لكل تصميم من التصميمات المختبرة.
    1. قم بإجراء تحليل فحص من مستويين لتحديد العوامل المهمة التي تؤثر على أداء المستشعر الحيوي. استخدم تحليل نسبة Lenth t ونصف المخططالطبيعي 23 ، 30 لتحديد العامل الذي ينحرف عن التوزيع المتوقع والاحتفاظ به في النموذج. الحفاظ على تأثير الوراثة ، والتأكد من تضمين أي عامل مهم فقط في التفاعل بشكل فردي.
    2. قم بإجراء نمذجة الانحدار القياسي للمربعات الصغرى (SLSR)30 لكل متغير استجابة بشكل مستقل ، مع دمج العوامل المهمة المحددة فقط. تقييم تشخيصات نموذج الانحدار، بما في ذلك المخططات المتبقية، واختبارات عدم الملاءمة، وقيم R²، لضمان تركيب البيانات بشكل صحيح.
    3. استخدم ملف تعريف الاستجابة لتحديد إعدادات العامل المثلى بناء على خصائص المستشعر الحيوي المطلوبة. تحديد وظائف الهدف لكل استجابة (على سبيل المثال، تعظيم النطاق الديناميكي مع تقليل EC50) لإنشاء إعدادات العامل التي تحقق أفضل توازن عبر جميع الاستجابات مع مراعاة قيود النظام والمقايضات.
  3. ارجع إلى مكتبات المتغيرات وقم ببناء المستشعر الحيوي المحسن وفقا للوحدات التي اقترحها محلل ملفات تعريف الاستجابة ، باتباع الخطوات من 6.1 إلى 6.2 من البروتوكول. التحقق من صحة أداء البناء المحسن عبر توصيف الجرعة والاستجابة.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في البداية ، يجب اختيار الوحدات التي يعتقد أنها تؤثر على وظيفة المستشعر الحيوي للاختلاف. يمكن أن يشمل ذلك تنظيم بروتينات النقل ، والتي يمكن أن تؤثر على التركيز داخل الخلايا للروابط وبالتالي إخراج المستشعر الحيوي ، ولكنها تشمل أيضا مستويات النسخ والترجمة النسبية ل aTF نفسه ، بالإضافة إلى مراسل الفلورسنت أو جين الإخراج (الشكل 1). يوضح الشكل 2 سير عمل نموذجي يستخدم في تطوير تجربة قائمة على DoE لتحسين أجهزة الاستشعار الحيوية. بدءا من تنظيم العناصر التنظيمية في وحدات متميزة قابلة للتلاعب عبر البيولوجيا التركيبية من خلال التغييرات على مستوى التسلسل ، وتحديدا في مواقع المشغل أو الصناديق السداسية أو RBS (الشكل 2 أ). على هذا النحو ، فإن الخطوة التالية في سير عمل DoE هي التوزيع العشوائي لمواقع التسلسل من أجل إنشاء مكتبات من المتغيرات (الشكل 2 ب). يجب النظر بعناية في درجة التوزيع العشوائي ، حيث يجب أن يتدرج عدد المستعمرات التي تم فحصها بدرجة التوزيع العشوائي 4N ، حيث N يساوي عدد مواضع القاعدة العشوائية. إن التعامل مع كل محفز فريد أو تسلسل RBS كمتغير فئوي فريد في DoE من شأنه أن يزيد من عدد التركيبات المطلوبة إلى مستويات غير مجدية تجريبيا ، حيث أن هذا التحويل إلى متغيرات مستمرة من خلال توصيف المكتبات هو خطوة فرز ضرورية لقياس نطاق الوظيفة المكتسبة من خلال التوزيع العشوائي وتحديد الجزء العلوي والمتوسط ، والحدود الدنيا للوظائف. يتم تحقيق ذلك أولا من خلال تحليل مخرجات المكتبات كمقياس لقوة RBS أو متغير المحفز من خلال جين المراسل (الشكل 2 ج). يتم إجراء تحويل lin-log ، كما هو موضح ، لتمييز المتغيرات المستمرة إلى مستويات يمكن أن تستخدمها وزارة الطاقة لاستكشاف مجموعات مختلفة وتطوير نموذج يصف تأثيرات هذه المتغيرات. ثم يتم تنفيذ تصميم الفحص باستخدام 3 مستويات تصف نطاق النشاط لكل عامل بطريقة اندماجية (الشكل 2 د). من خلال تجميع واختبار التصاميم المقترحة ، يتم استكشاف المساحة التجريبية بكفاءة والكشف عن التفاعلات بين العوامل. يتم استخدام التحليل الإحصائي للبيانات الناتجة لتحديد مجموعة العوامل التي لها التأثير الأكثر أهمية على إخراج المستشعر الحيوي ، ويستخدم SLSR للتنبؤ بسلوك النظام وفقا لمعايير مختلفة ، مما يسهل تحسين المستشعر الحيوي نحو نتائج محددة مثل زيادة النطاق الديناميكي أو الحساسية (الشكل 2 د).

الشكل 3 يوضح تجميع وفحص مكتبة مروج خاضعة لتنظيم aTF. تم إجراء التجميع متساوي الحرارة باستخدام قليل النوكليوتيدات المتدهور لإنشاء مكتبة مشفرة بالبلازميد ، حيث يتم عشوائية كل بلازميد بشكل فريد في مواضع محددة. ستحدد درجة تنوع المكتبات في النهاية عدد المستعمرات التي سيتم فحصها ، مع استفادة أحجام المكتبات النظرية الأكبر بشكل كبير من الأتمتة. قدم تحليل تسلسل المروج للعاملات المتماثلة ل TphR خريطة لحفظ القاعدة التي تم استخدامها لإبلاغ مواقع التوزيع العشوائي ، وتحديدا القواعد التي أظهرت درجة معينة من التباين وبالتالي قد تعدل النشاط دون أن تكون ضرورية للغاية23. تم استهداف ثلاث قواعد في كل من المربعات السداسية -35 و -10 للتوزيع العشوائي الكامل بالإضافة إلى ست قواعد في موقع المشغل (الشكل 3 أ)، مما أدى إلى مكتبة مروج نظرية ~ 500,000. تم استخدام مكتبة البلازميد لاحقا لتحويل سلالة المضيف. في هذه المرحلة، تعد كفاءة التحويل الجيدة أمرا بالغ الأهمية من أجل الحصول على تغطية مكتبية كافية مع مناهج استكشاف الأخطاء وإصلاحها الشائعة الموضحة في الشكل 3 ب. يمكن أن يؤدي تحسين تركيزات الحمض النووي وطريقة التحويل وتصميم الاستنساخ إلى تحسين إنتاجية المحولات بشكل كبير. الشكل 3 ج يوضح سير عمل نموذجي عند الحصول على المحولات ، يجب أولا زراعة المستعمرات الفردية المقابلة للمتغيرات الفريدة في الوسائط قبل بدء أي عمل توصيف. من أجل تغطية حجم المكتبة النظرية ، يجب اختيار عدد كبير من المتغيرات وتصنيفها في لوحات. يمكن أن تؤدي الاستفادة من الأنظمة الآلية مثل معالجات السوائل وجامعي المستعمرات إلى التقليل من شأن هذه الخطوة كثيفة العمالة. الخطوة 1 من الشكل 3 ج يوضح نقل وسائط النمو إلى MTPs التي تم تحميلها يدويا في رصيف معالج السوائل ، متبوعا بالتلقيح الآلي بواسطة منتقي المستعمرات. بعض المراحل ، مثل إغلاق الألواح ونقلها إلى حاضنات غير متصلة بالإنترنت ، يدوية ولكن يمكن أيضا أتمتتها إذا رغبت في ذلك. بعد نمو الثقافات ، يمكن أيضا استخدام معالجات السوائل لتوليد مخزونات التبريد من خلال إضافة الجلسرين ، كما هو موضح في الشكل 3 ج. في هذه المرحلة ، سيضمن الترميز الشريطي للألواح ربط كل متغير تم اختياره بلوحة معينة وموقع بئر ، مما يتيح سهولة الرجوع لمزيد من التوصيف النهائي. تتمثل إحدى المزايا الرئيسية للأساليب الآلية ، بصرف النظر عن تقليل العمالة ، في تقليل الخطأ البشري ، مع تقليل احتمال المضي قدما في الأخطاء في مرحلة إعداد المكتبة. الخطوة 2 من الشكل 3 ج يوضح مرحلة التوصيف الآلي لإعداد المكتبة. يبدأ هذا via ملء DWBs بالوسائط باستخدام منصة معالج السوائل ، متبوعا بالتلقيح باستخدام مخزون التبريد المشفر. تضمن الأتمتة في هذه المرحلة مرة أخرى تقليل أخطاء سحب العينات والعمالة. ثم يتم إغلاق الألواح ونقلها يدويا إلى حاضنات غير متصلة بالإنترنت للنمو ، وعند هذه النقطة يمكن البدء في تصفيف المركبات المستجيبة في ألواح بئر عميقة جديدة. لأغراض الشاشة الأولية لمكتبات الأجزاء ، يمكن أن يكون من المرغوب فيه وجود شاشة تشغيل / إيقاف بسيطة حيث يمكن استخدام ذلك للفحص المسبق للمتغيرات غير الوظيفية التي تظهر نشاطا مساويا أو أسوأ من البناء الأساسي وإثراء مجموعة المتغيرات لتلك التي تظهر نشاطا محسنا. هذا له فائدة إضافية تتمثل في تقليل تكاليف المواد للنصائح واللوحات التي يمكن أن تصبح باهظة في بروتوكولات فحص المكتبات الكبيرة. ومع ذلك ، حيث يكون تحسين مقاييس أداء المستشعر الحيوي الأكثر تعقيدا مطلوبا (على سبيل المثال ، EC50) ، ستكون هناك حاجة إلى تركيزات إضافية من المستجيب. بعد نمو الثقافات ، يتم إرجاع الألواح إلى منصة معالج السوائل ، والتي تبدأ في تلقيح الألواح التي تحتوي على مركبات مستجيبة قبل إعادتها يدويا إلى الحاضنة مرة أخرى طوال مدة الفحص. الشكل 3D يوضح خطوة الأتمتة النهائية قبل جمع البيانات. بعد الفترة المنقضية للنمو وتنشيط المستشعر الحيوي ، تتم إزالة الألواح من الحاضنة غير المتصلة بالإنترنت وإعادتها إلى منصة معالج السوائل. لإزالة وسائط النمو المتبقية ، والتي يمكن أن تتداخل مع جمع بيانات التألق ، يلزم إجراء الطرد المركزي ، وإزالة الطافية ، وغسل الخلايا باستخدام 1x PBS. يمكن أن يؤدي استخدام معالجات السوائل إلى التقليل من شأن هذه العملية مرة أخرى ، مع إعادة التعليق الآلي للثقافات مما يتيح المعالجة السريعة للألواح ، بما في ذلك نقل الخلايا المغسولة إلى MTPs بتنسيق 96 بئرا للفحص. يمكن إجراء جمع البيانات بطريقة يدوية أو آلية ، حيث تتميز بعض القراء بأكوام الألواح التي يمكن أن تتفاعل مع معالجات السوائل لأتمتة عملية جمع البيانات بشكل أكبر. من خلال مقارنة نسبة تنشيط المستشعر الحيوي في وجود المستجيب (ON) إلى غيابه (OFF) ، تم تقييم 5,000 متغير باستخدام درجة تنشيط المستشعر الحيوي (تغيير الطية) لتحديد وظيفة المستشعر الحيوي. تم المضي قدما فقط في المتغيرات ذات النشاط فوق نشاط البناء الأساسي (3.6 أضعاف) لمزيد من التوصيف كما هو موضح في المنطقة المظللة باللون الأحمر والوردي لمخطط التشتت (الشكل 3D). بناء على اللوحة ومواضع الآبار لتجمع المتغير المخصب ، يمكن بعد ذلك إجراء توصيف قوي باستخدام النسخ المتماثلة البيولوجية أو تركيزات المستجيب المختلفة من خلال الرجوع إلى ألواح المخزون المبرد الأصلية المشفرة شريطية التي تم إنشاؤها في الخطوة 1 من سير العمل.

يوضح الشكل 4 فحص المتغيرات التي تم فرزها من فحص المكتبة الأولي بهدف تطوير مكتبة مروج لتحسين الحساسية. باستخدام البيانات من 5,000 متغير تم فحصها في سير العمل السابق ، تم بعد ذلك تمييز مجموعة من 226 متغيرا من شاشة التشغيل / الإيقاف الأولية ، والتي تم تحديدها على أنها أكثر نشاطا من التسلسل الأبوي ، وتصنيفها وفقا لحساسيتها ، من أجل العمل كمستويات يمكن تصميم DSD حولها. كخطوة أولى ، يجب تحويل المتغيرات الفئوية ، في هذه الحالة المتغيرات العليا P، إلى متغيرات مستمرة تمتد على نطاق حساسية واسع. لفحص الحساسية ، يلزم وجود منحنيات استجابة الجرعة للحصول على بيانات EC50 من وظيفة Hill المرسومة. هذا يزيد من عمل الطلاء بشكل كبير وهو مناسب تماما للأتمتة باستخدام معالجات السوائل لتبسيط عملية إعداد الفحص والفحص كما هو موضح في الشكل 4 أ. بعد سير العمل الذي تم إنشاؤه في الخطوة 2 من الشكل 3 ج ، تم استخدام الرموز الشريطية للوحة ومواضع الآبار المقابلة لمجموعة المتغيرات المخصبة لتلقيح DWBs المملوءة بوسائط النمو والمضادات الحيوية. لتعزيز المتانة التجريبية ، تم فحص المتغيرات في ثلاث نسخ بيولوجية. بعد نقل الألواح إلى الحاضنة غير المتصلة بالإنترنت للنمو ، تم ملء DWBs الطازجة بوسائط نمو مكملة بالمستجيب 0 و 1 و 25 و 1000 ميكرومتر باستخدام معالجات السوائل لتقليل المخاض. لتقليل عدد اللوحات المطلوبة للمقايسة ، تم اختيار نطاق تركيز يشمل الجزء السفلي الأوسط والعلوي من المنحنى ، مع تركيزات نقطة المنتصف التي تكشف عن الحساسيات النسبية لكل متغير كما هو موضح في الشكل 4 أ. بعد تلقيح المجمعات المتغيرة عند كل تركيز مستجيب وتحليل التألق و OD600 ، تم رسم منحنيات استجابة الجرعة ، مع تحليل الانحدار غير الخطي المستخدم لتحديد EC50. في هذه المرحلة ، تم إنشاء مكتبة أولية لكل متغير بقيمة EC50 فريدة ، مع تقديم أقوى 100 متغير كما هو موضح في الشكل 4 ب من أجل تقليل حجم المكتبة بشكل أكبر. قبل استخدام هذه المكتبة في دائرة الطاقة ، يجب إنشاء تحويل المتغيرات الفريدة إلى مكتبة مصنفة ، تمثل نطاق الحساسية الموجودة بداخلها. تم تحقيق ذلك من خلال إجراء تحويل lin-log للبيانات ، والذي يقوم بترتيب البيانات وإعادة قياسها بحيث يتم تصنيف كل متغير من الأكثر حساسية (-1) إلى الأقل حساسية (+1) ، بالإضافة إلى تحديد قيمة نقطة المنتصف (0) ، والتي تمثل المتوسط الهندسي لمجموعة البيانات الشكل 4C. أنتج تحويل البيانات الأولية المخطط الأزرق الموضح في الشكل 4D ، والذي تم من خلاله أخذ تسلسلات Pالمنفصلة المقابلة ل +1 و 0 و -1 إلى تصميم الفحص النهائي كمستويات عاملP out.

الشكل 5 يوضح سير العمل الكامل بعد إنشاء المكتبة من إنشاء DSD إلى النمذجة والتحسين العالمي لجهاز استشعار حيوي بناء على التعلم المدعوم من DoE. الشكل 5 أ يتميز بتقسيم جهاز استشعار حيوي نموذجي إلى 3 وحدات إما مع عقد تنظيم 1 (وحدات النقل والمنظم) أو 2 (وحدة الإخراج). على غرار الشكل 4، سيتم تطوير مكتبات RBS أو مكتبات المروج ، وسيتم اختيار مستويات تتراوح من +1 و 0 و -1 لتشمل أكبر تباين لكل عامل. عادة ما يحدد حجم المكتبات التي تم فحصها عدد التجارب المطلوبة لاستكشاف مساحة التصميم بالكامل ، على سبيل المثال ، إذا كانت كل مكتبة بحجم 22 ، فإن هذا يعادل 224 (234،256) مجموعة. تهدف دائرة الطاقة إلى تبسيط عبء العمل التجريبي عن طريق تقليل عدد المجموعات من خلال تصميمات الفحص المنظمة. في حين أن العديد من المنهجيات ممكنة ، فإن DSD مثالي لتطوير المستشعرات الحيوية لأنه يسمح بتحديد العوامل الرئيسية والتفاعلات الثنائية مع تجنب التأثيرات المربكة من الدرجة الثانية. بالإضافة إلى ذلك ، نظرا لأن تصميمات DSD تستخدم 3 مستويات ، فمن الممكن تقدير الانحناء (غير الخطي). الشكل 5 أ يوضح إخراج DSD نموذجي حيث يتم تعيين كل وحدة من 4 وحدات على مستويات مختلفة ؛ نظرا لأن كل مستوى يتوافق مع محفز معين أو متغير RBS ، يتم استخدام التجميع متساوي الحرارة لتوليد التركيبات الجينية المقابلة للتصميمات الموصى بها ل DSD. بعد تجميع وتحويل سلالة المضيف مع التركيبات الموصى بها ، يتم بعد ذلك الحصول على منحنيات استجابة الجرعة باستخدام مجموعة كاملة من تركيزات المستجيب لتوفير المزيد من الثقة في أداء كل من التركيبات الشكل 5 ب. نظرا لأن DSD يقلل بشكل كبير من عدد التركيبات ، يمكن تنفيذ هذه الخطوة يدويا أو باستخدام معالجات السوائل الآلية إذا كنت تفضل ذلك. الشكل 5 ج يعرض ناتج ملف تعريف التنبؤ الذي تم الحصول عليه بعد بناء واختبار التركيبات المقترحة من شاشة DSD وبناء نماذج تنبؤية بناء على معامل هيل (nH) و EC50 إخراج كل مجموعة تم اختبارها. كان الهدف من التجربة هو تطوير بنية مستشعر حيوي تم تحسينها عالميا نحو كل من nH و EC50 من خلال تعديل التعبير عن العقد التنظيمية الأربعة لتعظيم كلتا المعلمتين. يظهر كل عامل تنظيمي في عموده الخاص مع درجة التعبير المشار إليها على طول المحور x المقابل للمروج المحول lin-log ومكتبات أجزاء RBS (-1 إلى +1). تأثير تغيير التعبير عن العقد على كل من EC50 و nH يشار إليه بالمنحنيات في الحبكات الفرعية. تسلط مخططات الملف الشخصي الضوء على الطبيعة غير البديهية في كثير من الأحيان لتحسين المستشعر الحيوي ، حيث يمكن أن يكون لضبط عقدة تنظيمية واحدة تأثيرات متعارضة على معلمات الإخراج. على سبيل المثال ، RBSعبر يظهر أنه ليس له علاقة قوية مع nH,ومع ذلك ، فإنه يرتبط ارتباطا إيجابيا ب EC50 بطريقة غير خطية. التفاعلات ذات الترتيب الأعلى (غير الخطية) ضمنية أيضا ، في حالة RBSخارج ستؤدي الزيادة في القوة إلى زيادة المنحدر (أعلى NH) مع زيادة مصاحبة في الحساسية (انخفاض EC50) ، مما ينتج عنه منحنى بمنحدر رقمي أكثر واستجابة أكثر حدة لزيادة تركيز المستجيب. من هذه النماذج ، يمكن تقديم الجوانب غير البديهية لضبط المستشعر الحيوي بشكل أكثر وضوحا مما يتيح تحسين عقد التنظيم نحو المستوى الأمثل العالمي. تم استخدام النماذج للتنبؤ بالمثل العالمي لكل من EC50 و nH ، مع الخطوط الحمراء في الرسم البياني التي تشير إلى المستويات المثلى لكل عقدة تنظيمية (الشكل 5 ج). الشكل 5D يوضح ملف تعريف الاستجابة للجرعة لبناء المستشعر الحيوي الأبوي الأولي (الأزرق) مقارنة بتصميم DSD الأفضل أداء (أخضر) والبناء المحسن عالميا (Lilac). استخدام النموذج للتنبؤ بنقاط قوة الوحدة المثالية لتعظيم EC50 و nH، المتغير المقابل ل RBSعبر (-1) ، صريج (-0.7) ، ص & lt 0.001خارج (-0.3) ، و RBSخارج (+1) تم تجميع نقاط القوة وتمييزها بالبناء الأمثل الذي يظهر تحسينات في EC50 و nH (الشكل 5D). في حين أن كلا من DSD والمستشعرات الحيوية المحسنة عالميا تعرض EC مماثلة50 (0.8 مقابل 0.7 ميكرومتر) ، nH تم تحسينه بشكل كبير دون المساس بالمفوضية الأوروبية50 المكاسب التي تم تحقيقها بالفعل. توضح النتائج بوضوح مزايا التصميم المستند إلى البيانات على الأساليب القائمة على الحدس وتعمل على التحقق من صحة DoE كوسيلة لتبسيط وتبسيط عملية ضبط المستشعر الحيوي.

figure-results-1
الشكل 1: ضبط معلمات المستشعر الحيوي المشفرة وراثيا. تخطيط الوحدات الجينية لجهاز استشعار حيوي مشفر وراثيا ، بما في ذلك aTF ومواقع المشغل (OS) والعلب السداسية (-35 ، -10) ومكونات RBS. تتوافق المربعات الملونة مع التفاعلات التي تؤثر عادة على معلمات المستشعر الحيوي مثل: تقارب Ligand-aTF (رمادي) ، مشغل aTF (وردي) ، RNAP-Hexbox (أخضر) و RBS (برتقالي). يشار إلى تأثيرات كل معلمة على خصائص استجابة الجرعة في الرسوم البيانية التمثيلية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: نظرة عامة على سير عمل تحسين المستشعر الحيوي النموذجي لوزارة الطاقة. (أ) نظرة عامة على الوحدات النمطية لمكونات المستشعر الحيوي التي تظهر وحدة نقل تشفر بروتين نقل لاستيراد المستجيب المستهدف ، ووحدة تنظيمية تتعلق ب aTF ، ووحدة إخراج تشفر لبروتين مراسل مثل sfGFP. كما تظهر عقد التنظيم ، مثلRBS trans و Preg و Pout و RBSout ، والتي تتوافق مع العقد الجينية التي ستخضع للتوزيع العشوائي من أجل استكشاف معلمات المستشعر الحيوي. (ب) مجموعة مختارة من عناصر التسلسل القابلة للتوزيع العشوائي الأساسي ، بما في ذلك المروجين و RBS. يظهر التسلسل الأبوي للمحفز على السطر العلوي ، مع التسلسل المتحور النهائي الموضح أدناه ، تشير النجوم إلى قواعد غير متغيرة ، بينما تشير K و M و N إلى Guanine / Thymine أو Adenine / Cytosine أو أي نيوكليوتيدات ، على التوالي. يوفر المروجون إمكانات توزيع عشوائي أكبر من خلال استهداف الصناديق السداسية أو مواقع المشغلين ويمكن أن تتضمن أيضا تكرار أو تعديل تباعد التسلسلات. تقدم مكتبات RBS خيارات عشوائية محدودة ، ومع ذلك ، فهي أسهل بكثير في الفحص نظرا لتنوعها الأقصى الأصغر. (ج) يتم تمييز مستويات التعبير عن المتغيرات ثم تحويلها إلى مكتبة lin-log مصنفة لتحويل العوامل المتغيرة الفئوية إلى 3 مستويات منفصلة أكثر قابلية للتحليل عبر DoE. (د) يتم إجراء رسم خرائط للمساحة التجريبية باستخدام مجموعات متعددة الإرسال من المستويات الثلاثة لكل وحدة لتوليد نموذج يمكن استخدامه لإبلاغ خيارات التصميم لضبط أداء المستشعر الحيوي نحو النتائج المرجوة ، ويمكن أن يكون هذا نحو النطاق الديناميكي ، أو نحو الحساسية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3: نمطية المستشعر الحيوي ، وبناء مكتبة المروج ، وسير العمل الآلي. (أ) مثال على التوزيع العشوائي لتسلسلات معينة في محفز aTF وإدخاله في بنية المستشعر الحيوي عبر التجميع متساوي الحرارة. تشير الأحرف العريضة إلى المواضع التي تم تخصيصها عشوائيا في موقع المشغل أو الصناديق السداسية وفقا للمفتاح المقدم أثناء تخليق قليل النوكليوتيدات المتدهورة. (ب) لوحة تصف تحويل مكتبة متغير المستشعر الحيوي الناتجة إلى مضيف استنساخ مثل الإشريكية القولونية ، والخطوات التالية اعتمادا على إنتاجية المحول. يمكن أن تؤدي كفاءة التحويل المنخفضة إلى ضعف تغطية المكتبة النظرية وعدم كفاية الاستكشاف لمساحة التصميم. يعد استكشاف الأخطاء وإصلاحها في هذه المرحلة أمرا ضروريا لضمان توفر جزء كبير من المتغيرات للتوصيف ، مع تحديد تدابير استكشاف الأخطاء وإصلاحها الشائعة. (ج) سير عمل الخطوتين 1 و 2 على النحو المبين في البروتوكول، مع الإشارة إلى الرمز الأحمر للخطوات اليدوية والإشارة إلى الخطوات الآلية. يسلط سير عمل الخطوة 1 الضوء على الخطوات الرئيسية في البروتوكول من اختيار المستعمرة إلى توليد مخزون التبريد. يوضح سير عمل الخطوة 2 إحياء وإعادة ترتيب مخزونات التبريد للقياس حسب منحنى استجابة الجرعة. (د) اللوحة التي توضح الإجراء النهائي قبل الفحص ، بما في ذلك غسل الخلايا ونقلها إلى ألواح الفحص قبل قياس التألق والتطوير التنظيمي. يتم عرض مجموعة متغيرات تم فحصها من 5000 في اللوحة ، مع إظهار المتغيرات تشغيل / إيقاف التشغيل بما يزيد عن تسلسل المروج الأبوي (3.6 أضعاف) المميز في المربع البرتقالي. يمكن رؤية العديد من المتغيرات على أنها تتجمع حول 1 ، مما يشير إلى ضعف الأداء والتباين المنخفض ، ويرجع ذلك على الأرجح إلى التوزيع العشوائي على مستوى التسلسل الذي يتسبب في فقدان الوظيفة. تم تقديم 226 متغيرا موضحا في المؤامرة لتوصيف قوي. تم اقتباس البيانات من المنشور الأصلي بواسطة ألفاريز غونزاليس وآخرون23. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4
الشكل 4: فحص المتغيرات العليا لمكتبة المروج والتمييز عبر تحويل lin-log. (أ) موجز الإجراء القياسي لتوليد بيانات التعبير لمكتبة RBS أو المروج. باستخدام المتغيرات الفرز التي تمثل نطاقا جيدا من مستويات التعبير ، يتم استخدام معالجات السوائل لتوليد لوحات فحص مملوءة مسبقا بتركيز محدد مسبقا من المستجيب الذي يمكن من خلاله اشتقاق منحنيات استجابة الجرعة لمتغيرات فرز 226. (ب) بعد تحديد EC50 وتقليل المكتبة المميزة إلى 100 متغير ، يتم رسم البيانات كمخطط شريطي يوضح مزيج الحساسيات المختلفة الناتجة عن التوزيع العشوائي للمروج. (ج)يتم تحويل بيانات EC50 باستخدام معادلة معدل lin-log لتحويل مجموعة البيانات المستمرة إلى مجموعة فئوية أكثر ملاءمة للتحليل في DSD. (د) تظهر بيانات متغير EC50 المحولة الآن مخفضة إلى مقياس مبسط ويتم ترتيبها من نشاط EC50 مرتفع إلى منخفض. من هذا ، يتم تحديد 3 مستويات تتوافق مع المتغيرات العلوية (+1) المتوسطة الهندسية (0) والسفلي (-1) وسيتم نقلها إلى DSD لاستكشاف الفضاء التجريبي. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-5
الشكل 5: التصميم التجريبي للDSD والاختبار ونتائج التعلم المستندة إلى النموذج. (أ) سير عمل تخطيطي يوضح إنشاء جدول تصميم DSD بناء على المكتبات المصنفة المحولة lin-log لوحداتRBS trans و P reg و Pout و RBSout. يقترح جدول تصميم DSD أصغر عدد من المجموعات لرسم خريطة للمساحة التجريبية بكفاءة. يتم إعطاء مثال على الإخراج حيث تشير +1 و 0 و -1 إلى متغيرات الأداء العلوي والأوسط والسفلي لكل عقدة تنظيمية كما هو موضح في تحويلات lin-log. يتم إنشاؤها عن طريق التجميع متساوي الحرارة وتأكيدها عن طريق التسلسل قبل تحويلها إلى مضيف التعبير للتوصيف. (ب) بعد التحول ، تنمو الخلايا ويتم فحصها مقابل مجموعة واسعة من تركيزات المستجيب ، ويتم قياس ناتج الفلورسنت لتوليد منحنيات استجابة الجرعة. يتم استخراج معلمات مختلفة ، مثل nH و EC50 ، من منحنيات استجابة الجرعة وإدخالها في DSD لإنشاء نماذج تنبؤية لكل عامل. (ج) باستخدام النماذج ، يمكن إجراء تنبؤات حول تأثير تعديل معلمة واحدة للجهاز الاستشعار الحيوي من خلال تغيير مستوى التعبير لأي وحدة تنظيمية. الأهم من ذلك ، يصبح الضبط العالمي للعقد التنظيمية ممكنا ، مما يتيح تعظيم واحد أو أكثر من معلمات المستشعر الحيوي في وقت واحد ، ويشار إليها بالخطوط الحمراء المتقطعة في كل مخطط فرعي. (د) يؤدي تحسين النموذج نحو أقصى قدر من الحساسية إلى البناء المحسن عالميا (أرجواني) ، حيث يتم رسم منحنى استجابة الجرعة مقابل بنية DSD الأفضل أداء (أخضر) وبناء المستشعر الحيوي الأبوي (الأزرق). يتم عرض معلمات nH و EC50 المستخرجة أسفل المخطط ، مما يوضح تحسن كلتا المعلمتين فوق بنية DSD الأفضل أداء ، مما يتحقق من فعالية النماذج التنبؤية التي تم إنشاؤها من DSD. تم اقتباس البيانات من المنشور الأصلي بواسطة ألفاريز غونزاليس وآخرون23. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل التكميلي 1: خطوات بروتوكول معالجة السوائل الآلية المستخدمة لإعداد مكتبة المستشعرات الحيوية وإعداد الفحص. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 2 للشكل التكميلي 6: التوليد التدريجي لتصميم الفحص النهائي (DSD). الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعد مكتبات العناصر الجينية التي تشمل التباين الجيني الواسع أمرا بالغ الأهمية لنجاح المنهجية القائمة على DoE. كما هو موضح في الشكل 2 أ ، يزداد عدد المتغيرات النظرية مع عدد المواضع التي سيتم استهدافها للطفرات بالإضافة إلى درجة التوزيع العشوائي ، مع حجم المكتبة المتزايد باستمرار الذي يخلق اختناقات كبيرة في الفحص. يمكن أن يؤدي تقليل عدد المواضع المستهدفة أو درجة التوزيع العشوائي إلى تقليل عدد المتغيرات التي تحتاج إلى الفرز وهو نهج جذاب إذا كانت هناك حاجة إلى نهج أكثر استهدافا للضبط أو إذا كانت هناك معرفة مسبقة كبيرة بالنظام كدليل. ومع ذلك ، في حالة أنظمة مثل أجهزة الاستشعار الحيوية ، والتي تتميز بالعديد من الميزات المتداخلة أو قد لا تحتوي على عناصر وراثية مميزة جيدا ، فمن الصعب التحايل على متطلبات حجم المكتبة. يمكن أن يؤدي استخدام معالجات السوائل الآلية إلى التقليل من شأن عمل انتقاء المستعمرات وزراعة المتغيرات ، خاصة عندما تكون هناك حاجة إلى زيادة جمع نقاط البيانات لرسم وظائف أكثر تقدما مثل منحنيات استجابة الجرعة مقابل مقارنتين لنقاط البيانات ، مثل التشغيل / الإيقاف. في حين أنه من الصعب تحديد الوقت الموفر على وجه التحديد من تضمين مهام سير العمل الآلية ، الفائدة الرئيسية لتنفيذه هي في الوقت الذي يمكن تخصيصه للتجارب الموازية الأخرى38.

على الرغم من ذلك ، في كثير من الحالات التي تتجاوز فيها أحجام المكتبات 104 ، تصبح المنهجيات بمساعدة معالج السوائل غير عملية39. في مثل هذه الحالات ، يعد الفحص الأولي للمتغيرات باستخدام مقاييس التدفق الخلوي نهجا جذابا للغاية ، مع قدرة فرز أكبر بكثير تصل إلى 107 خلايا في الساعة40. تم استخدام فرز الخلايا المنشط بالتألق (FACS) مع جولتين من الانتقاء الإيجابي وجولة واحدة على الأقل من الاختيار السلبي بشكل روتيني في فرز المتغيرات الأفضل أداء من أجهزة الاستشعار الحيوية قبل توصيف أكثر شمولا16،26،42. وقد استعرضت بالتفصيل وضع وتنفيذ هذه البروتوكولات باستخدام نظام مراقبة الأصول الميراثية (FACS) في مكان آخر31. يمكن إجراء شاشات الفرز الأولية باستخدام فحوصات معالج السوائل القائمة على اللوحة ، كما هو موضح في البروتوكول أعلاه ؛ من خلال مقارنة بيانات التشغيل / الإيقاف باستخدام تركيز مستجيب واحد كما هو موضح في الشكل 3D ، يمكن اختيار المستشعرات الحيوية المتغيرة فقط ذات الكسب الملحوظ للوظيفة (3.6 ضعف كما هو منصوص عليه في الطرق) لمزيد من التوصيف التفصيلي وتبسيط تطوير المكتبة ووقت التشغيل التجريبي. ومع ذلك ، تأتي كل من منصات FACS ومعالج السوائل باستثمارات رأسمالية كبيرة للمختبر وغالبا ما تتطلب مستوى من الخبرة الفنية للتشغيل والصيانة. توفر الشاشات القائمة على لوحة أجار حاجزا تقنيا وماليا أقل للدخول ، وقد تم استخدامها مع فحص المستعمرة gfp أو المستعمرة الزرقاء والبيضاء لاختيار متغيرات مكتبة RBS بالإضافة إلى طفرات الإنزيم بناء على شدة التألق43،44. ومع ذلك ، فإن هذه أيضا محدودة في عدد المتغيرات التي يمكن فحصها بشكل فعال ، ولكنها تتطلب أيضا فرقا كبيرا في التألق لتكون قابلة للاكتشاف44. كحل وسط بين الطفرة المتزامنة الاندماجية بالكامل لعناصر متعددة في وقت واحد ، تهدف منهجية "فرق تسد" بدلا من ذلك إلى تقسيم مكتبات المتغيرات الكبيرة إلى كتل فحص أكثر قابلية للإدارة41. في حين أن النهج المعياري قد يكون عمليا ، إلا أنه لا يستكشف بشكل فعال مساحة التصميم الاندماجي ، حيث من المعروف أن أداء المكونات البيولوجية يعتمد بشكل كبير على السياق ، خاصة في البكتيريا ، حيث ينتشر الاقتران النسخي والانتقالي. هذا لديه القدرة على أن يؤدي إلى خيارات تصميم تستهدف الحد الأقصى المحلي بدلا من التحسين العالمي.

يمثل النقل والتعرف على محفزات معينة ميزة مهمة أخرى لتطوير أجهزة الاستشعار الحيوية تستحق الذكر ، على الرغم من عدم كونها التركيز الرئيسي للبروتوكول الموضح. يمثل عدم وجود aTF مناسب للجزيء المستهدف تحديا كبيرا للباحثين. يمكن أن يوفر الاختيار العقلاني ل aTF الموجود الذي يربط نظيرا هيكليا للمستجيب المستهدف نموذجا مثاليا لتطبيق التوزيع العشوائي للكودون من أجل ضبط خصوصية aTF على المستجيب المطلوب17. يمكن أن تتيح محاذاة التسلسل المستهدف مع الهياكل المحلولة أو تنبؤات Alphafold تحديد مواقع ربط المستجيب مع بقايا الأحماض الأمينية المشتبه بها والتي تخضع للتوزيع العشوائي والترتيب شبه العقلاني ، وقابلة للتكيف مع البروتوكول17. وبالمثل ، فإن اختيار وتعديل الناقلات المسؤولة عن استيراد / تصدير المؤثرات يمكن أن يغير بشكل كبير خصائص استجابة جرعة المستشعر الحيوي. تم العثور على التعبير الجيني للناقل ليكون لاعبا مهما في استجابة المستشعر الحيوي ، مع مكتبة متنوعة من محفزات Ptac و RBS التي تتحكم في التعبير عن ناقل MucK المستخدم لتحقيق الاستقرار في تعبيره عبر جولات متعددة من FACS ، مما يعزز متانة استجابة المستشعر الحيوي17. وبالمثل ، يمكن لفحص بروتينات الناقل المختلفة نفسها تعديل خصوصية المستشعرات الحيوية ، مع فحص مجموعة مفترضة من ناقلات PcaK باستخدام مستشعر حيوي مستجيب ل PCA يؤدي إلى تحديد ناقلين قادرين بشكل فريد على امتصاص ركائز 3،5 هيدروكسيل ، مما يوسع مجموعة المركبات التي يمكن اكتشافها بواسطة هذا النظام24.

يمكن أن تصبح الأنظمة الأساسية الآلية أدوات أكثر قوة للتوصيف والاستكشاف عند إقران مبادئ وزارة الطاقة بنماذج التعلم العميق46،47. بعد استكشاف مساحة تصميم جهاز استشعار حيوي مع منصة عالية الإنتاجية لأول مرة ، تم الاستفادة من خوارزميات التعلم الآلي للتنبؤ بوظيفة التسلسلات غير المميزة بدقة جيدة 47. يمكن بسهولة تطبيق الأساليب الموضحة في هذا البروتوكول في اختبار نماذج تعلم اللغة الجديدة لتصميم المروج ، على غرار النماذج التي تم تطويرها بناء على التنبؤ بالتسلسل عبر RBS48. علاوة على ذلك ، يمكن أن يستفيد تكامل هذه النماذج من بيانات وظيفة التسلسل الموجودة في تصميمات المحفز غير الوظيفي ويوفر نظرة ثاقبة نقدية للوظائف الأوسع للمستشعر الحيوي ككل. وبالتحديد ، سيكون لهذا القدرة على معالجة قيود حاسمة في سير عمل DoE ، حيث أن الإيجابيات الخاطئة ، على سبيل المثال ، محفز غير وظيفي ، لا تساوي بالضرورة ناتجا محسوبا من الصفر ، مع ظواهر مثل النسخ الزائف أو إدخال عنصر من الضوضاء في بيانات DoE ، والتي يصعب تحديدها والتحكم فيها. بشكل حاسم ، من أجل تضمين إجمالي مساحة التصميم التجريبي ، يجب أن تعرض أي مكتبات تم إنشاؤها مجموعة واسعة من الأنشطة ، حيث سيؤدي نطاق النشاط غير الكافي إلى انحراف مخرجات التصميم وخلق عدم الموثوقية في أي نماذج إحصائية تم إنشاؤها من مجموعة البيانات30. إذا أصبح التباين المنخفض للمكتبة مشكلة ، فيمكن تنفيذ استكشاف عناصر التسلسل الأخرى أو زيادة درجة التوزيع العشوائي ، ويمكن مقارنة التباين بين المكتبات حتى يتم تحقيق مجموعة متغيرات مناسبة.

يتضمن أحد الجوانب الحاسمة لعملية دائرة الطاقة التقدير والاختيار الصحيحين للتأثيرات الأولية والثانوية التي تم الحصول عليها من DSD والتي سيتم دمجها بعد ذلك في التحليل الإحصائي. وزارة الطاقة ، كونها نهجا قائما على النمذجة ، معرضة بشدة للإفراط في التجهيز والتحيز ، مما قد يعقد عملية التحسين بسرعة من خلال توجيه جهود الهندسة التكرارية إلى أقسام دون المستوى الأمثل من مساحة التصميم49. على هذا النحو ، من الأهمية بمكان التأكد من أن أي تصميمات معزولة بقوة عن مثل هذه التأثيرات ، سواء في مرحلة الحمل أو تحليل البيانات. في مرحلة تصميم الفحص الأولية ، يمكن أن تساعد عمليات التشغيل المركزية حيث يتم تعيين جميع العوامل على المتوسط الهندسي (أي 0،0،0،0) في تقليل تحيز النموذج من خلال حساب أفضل للتفاعلات غير الخطية ، مع عدم إضافة عبء تجريبي كبير (1-3 أشواط إضافية)49. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن يساعد تضمين التصميمات العشوائية في حساب المتغيرات الدخيلة التي لم يتم تضمينها في التصميم التجريبي ولكن لا يزال بإمكانها التأثير على متغيرات الاستجابة التي يتم قياسها. في السياق البيولوجي ، يعالج التوزيع العشوائي مشكلات مثل التأثيرات الزمانية المكانية ، مثل موضع اللوحة ، أو التباين من دفعة إلى دفعة ، مما يمنع هذه التأثيرات من التأثير بشكل كبير على تفسير البيانات. يمكن أن يؤدي الاهتمام بهذه التفاصيل في هذه المرحلة المبكرة إلى تحسين متانة النماذج ويؤدي إلى استنتاجات أكثر موثوقية. بعد إجراء التجارب المقترحة من DSD ، يلزم التحليل الإحصائي للبيانات لتوضيح تلك العوامل التي كان لها تأثير كبير على معلمات المخرجات. تقدم المخططات نصف العادية تمثيلا مرئيا بديهيا لمقادير التأثير ، مع تأثيرات بدون أهمية تقع عادة على طول خط مستقيم ، في حين أن التأثيرات ذات التأثير الكبير ستنحرف عن هذا الخط ، مما يتيح الاختيار البسيط لأهم العوامل في تحسين المستشعر الحيوي. مع وضع ذلك في الاعتبار ، يجب اتباع نهج متحفظ لاختيار التأثير ، كما هو الحال مع جميع النمذجة ، لتقليل مخاطر الإفراط في تركيب النموذج.

ستؤدي القدرة على تصميم وتحسين أجهزة الاستشعار الحيوية والدوائر الجينية الأخرى بسرعة إلى تسريع وتيرة البحث في مجال التكنولوجيا الحيوية بشكل كبير ، مثل تطوير السلالات والإنزيم ، ولكن أيضا في التشخيص في الوقت الفعلي. إن ظهور منهجيات الفحص القائمة على DoE في هذا المجال واعد بشكل خاص ، حيث يسهل الاستخدام الفعال للوقت والموارد مع استكشاف أقصى مساحة ممكنة للتصميم ، وقد تم استخدامه بالفعل لتأثير كبير في تحسين الدوائر الجينية لمسارات التمثيل الغذائي وأجهزة الاستشعار الحيوية31،33،34،51. تعد وزارة الطاقة مناسبة بشكل خاص لمشاكل التحسين متعددة العوامل التي تعمل فيها العديد من تفاعلات الدرجة الأولى أو الثانية أو حتى الثالثة والتي سيكون من الصعب استجوابها باستخدام نهج التصميم التجريبي النموذجي لعامل واحد في كل مرة. علاوة على ذلك ، غالبا ما تؤدي الجهود المبذولة لهندسة جانب واحد من المستشعر الحيوي عن غير قصد إلى التضحية بمعلمة أخرى ، مثل تحسين الحساسية على حساب النطاق الديناميكي51. من خلال قدرة وزارة الطاقة على رسم خريطة لمثل هذه التفاعلات المخفية بالإضافة إلى إنشاء نماذج تتنبأ بسلوك المستشعر الحيوي ، يتم تسريع دورة تعلم اختبار البناء بشكل كبير.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون عدم وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وحظي فريق الخبراء الاستشاري بدعم من منحة BBSRC DTP (BB/M011208/1). تم دعم MC بمنحة وضع الاستجابة BBSRC (BB / P01738X / 1). نود أيضا أن نشكر معهد هنري رويس للمواد المتقدمة (الممول من خلال منح EPSRC رقم. EP/R00661X/1 و EP/S019367/1 و EP/P025021/1 و EP/P025498/1) للوصول إلى مرافقها.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1000 & نصائح L CO-RE ، معقمة غير مرشحهاميلتون   ؛235939
2.2 مل 96 لوحة Deepwell ، آبار مربعة مع قيعان على شكل حرف Vالحراريه11594754
300 & نصائح L CO-RE ، NTRs مكدسة ، معقمةهاميلتون   ؛235985
96 قاع واضح جيدا ، لوحة microtitre سوداءغرينر  655097
الاغاروز   ؛إنفيتروجين16500100
الحمض النووي البلازميد المجمعالمستخدم المزود  NA
قارئ ClarioStar Plus Microplate  بي إم جيNA
مزيج محلول Dexynucloetide (dNTP)  نيبN0447L
ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)   ؛فيشر BioReaggents BP231-100
سلم الحمض النووي 100bpنيبN3231L
سلم الحمض النووي 1 كيلو بايتنيبN3232L
تسلسل الحمض النووي   ؛المصدر: العلوم البيولوجيةNA
تخليق الحمض النووي  IDTNA
الإشريكية القولونية DH5α الخلايا الميكانةنيبطراز C2987H
صبغة تحميل الجل ، أرجواني X6 بدون SDSنيبب 7025 إس
نبض الجينات / Micropulser Electroporation Cuvettes ، فجوة 0.2 سمBiorad 1652082
الرسم البياني لوحة المنشور 10 GraphPadNA
هاميلتون ستار السوائل المعالجة هاميلتون   ؛NA
HT multitron لوحة شاكر حاضنة  إنفورس HTNA
مجموعة التحليل الإحصائي JMP جي إم بيNA
مرق LB (ميلر)ميلر   ؛L3522
مرق LB (ميلر) مع أجار   ؛سيغماL3147
MicroPulser Electroporator Biorad 1652100
NEBuilder HiFi DNA الجمعية ماستر ميكسنيبطراز E2621S
Q5 بوليميراز الحمض النووي عالي الدقةنيبطراز M0491S
QIAprep Spin Midiprep كيتكياجين  12143
QIAprep Spin Miniprep Kitكياجين27104
طقم استخراج جل QIAquick   ؛كياجين28706 × 4
طقم تنقية QIAquick PCR   ؛كياجين28104
Qpix 420 منتقي المستعمراتالأجهزة الجزيئية في المملكة المتحدةNA
نمو نمو SOC المتوسط نيبطراز B9020S
SYBR آمن الحمض النووي جل وصمة عارإنفيتروجينط33102
مخزن مؤقت TAE (ثلاثي أسيتات EDTA ، 50X)   ؛ثيرمو فيشر   ؛ب49
UltraPureTM ماء مقطر خال من Dnase/Rnase إنفيتروجين10977015

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Components and mechanisms of regulation of gene expression. Comput Biol Transcription Factor Binding. 23, 23-32 (2010).">Yilmaz, A., Grotewold, E. Components and mechanisms of regulation of gene expression. Comput Biol Transcription Factor Binding. 23, 23-32 (2010).
  2. One-component systems dominate signal transduction in prokaryotes. Trends Microbiol. 13 (2), 52-56 (2005).">Ulrich, L. E., Koonin, E. V., Zhulin, I. B. One-component systems dominate signal transduction in prokaryotes. Trends Microbiol. 13 (2), 52-56 (2005).
  3. Highly multiplexed design of an allosteric transcription factor to sense new ligands. Nat Commun. 15 (1), 10001(2024).">Nishikawa, K. K., et al. Highly multiplexed design of an allosteric transcription factor to sense new ligands. Nat Commun. 15 (1), 10001(2024).
  4. Engineering allosteric transcription factors guided by the LacI topology. Cell Syst. 14 (8), 645-655 (2023).">Hersey, A. N., Kay, V. E., Lee, S., Realff, M. J., Wilson, C. J. Engineering allosteric transcription factors guided by the LacI topology. Cell Syst. 14 (8), 645-655 (2023).
  5. Applications and advances of metabolite biosensors for metabolic engineering. Metab Eng. 31, 35-43 (2015).">Liu, D., Evans, T., Zhang, F. Applications and advances of metabolite biosensors for metabolic engineering. Metab Eng. 31, 35-43 (2015).
  6. Tailor-made transcriptional biosensors for optimizing microbial cell factories. J Ind Microbiol Biotechnol. 44 (4), 623-645 (2017).">De Paepe, B., Peters, G., Coussement, P., Maertens, J., De Mey, M. Tailor-made transcriptional biosensors for optimizing microbial cell factories. J Ind Microbiol Biotechnol. 44 (4), 623-645 (2017).
  7. Applications of genetically-encoded biosensors for the construction and control of biosynthetic pathways. Metab Eng. 14 (3), 212-222 (2012).">Michener, J. K., Thodey, K., Liang, J. C., Smolke, C. D. Applications of genetically-encoded biosensors for the construction and control of biosynthetic pathways. Metab Eng. 14 (3), 212-222 (2012).
  8. Synthetic biosensors for precise gene control and real-time monitoring of metabolites. Nucleic Acids Res. 43 (15), 7648-7660 (2015).">Rogers, J. K., et al. Synthetic biosensors for precise gene control and real-time monitoring of metabolites. Nucleic Acids Res. 43 (15), 7648-7660 (2015).
  9. Principles of genetic circuit design. Nat Methods. 11 (5), 508-520 (2014).">Brophy, J. A. N., Voigt, C. A. Principles of genetic circuit design. Nat Methods. 11 (5), 508-520 (2014).
  10. Biosensor-based engineering of biosynthetic pathways. Curr Opin Biotechnol. 42, 84-91 (2016).">Rogers, J. K., Taylor, N. D., Church, G. M. Biosensor-based engineering of biosynthetic pathways. Curr Opin Biotechnol. 42, 84-91 (2016).
  11. Transcription factor-based biosensors for screening and dynamic regulation. Front Bioeng Biotechnol. 11, 1118702(2023).">Tellechea-Luzardo, J., Stiebritz, M. T., Carbonell, P. Transcription factor-based biosensors for screening and dynamic regulation. Front Bioeng Biotechnol. 11, 1118702(2023).
  12. Fundamental design principles for transcription-factor-based metabolite biosensors. ACS Synth Biol. 6 (10), 1851-1859 (2017).">Mannan, A. A., Liu, D., Zhang, F., Oyarzún, D. A. Fundamental design principles for transcription-factor-based metabolite biosensors. ACS Synth Biol. 6 (10), 1851-1859 (2017).
  13. Escherichia coli "Marionette" strains with 12 highly optimized small-molecule sensors. Nat Chem Biol. 15 (2), 196-204 (2019).">Meyer, A. J., Segall-Shapiro, T. H., Glassey, E., Zhang, J., Voigt, C. A. Escherichia coli "Marionette" strains with 12 highly optimized small-molecule sensors. Nat Chem Biol. 15 (2), 196-204 (2019).
  14. Transcriptional regulation by the numbers: applications. Curr Opin Genet Dev. 15 (2), 125-135 (2005).">Bintu, L., et al. Transcriptional regulation by the numbers: applications. Curr Opin Genet Dev. 15 (2), 125-135 (2005).
  15. Lighting up yeast cell factories by transcription factor-based biosensors. FEMS Yeast Res. 17 (7), fox076(2017).">D'Ambrosio, V., Jensen, M. K. Lighting up yeast cell factories by transcription factor-based biosensors. FEMS Yeast Res. 17 (7), fox076(2017).
  16. Directed evolution of the PcaV allosteric transcription factor to generate a biosensor for aromatic aldehydes. J Biol Eng. 13 (1), 91(2019).">Machado, L. F. M., Currin, A., Dixon, N. Directed evolution of the PcaV allosteric transcription factor to generate a biosensor for aromatic aldehydes. J Biol Eng. 13 (1), 91(2019).
  17. Tackling the Catch-22 situation of optimizing a sensor and a transporter system in a whole-cell microbial biosensor design for an anthropogenic small molecule. ACS Synth Biol. 11 (12), 3996-4008 (2022).">Shin, S. M., Jha, R. K., Dale, T. Tackling the Catch-22 situation of optimizing a sensor and a transporter system in a whole-cell microbial biosensor design for an anthropogenic small molecule. ACS Synth Biol. 11 (12), 3996-4008 (2022).
  18. An orthogonal and pH-tunable sensor-selector for muconic acid biosynthesis in yeast. ACS Synth Biol. 7 (4), 995-1003 (2018).">Snoek, T., et al. An orthogonal and pH-tunable sensor-selector for muconic acid biosynthesis in yeast. ACS Synth Biol. 7 (4), 995-1003 (2018).
  19. Integrating continuous hypermutation with high-throughput screening for optimization of cis,cis-muconic acid production in yeast. Microb Biotechnol. 14 (6), 2617-2626 (2021).">Jensen, E. D., et al. Integrating continuous hypermutation with high-throughput screening for optimization of cis,cis-muconic acid production in yeast. Microb Biotechnol. 14 (6), 2617-2626 (2021).
  20. Evolving small-molecule biosensors with improved performance and reprogrammed ligand preference using OrthoRep. ACS Synth Biol. 10 (10), 2705-2714 (2021).">Javanpour, A. A., Liu, C. C. Evolving small-molecule biosensors with improved performance and reprogrammed ligand preference using OrthoRep. ACS Synth Biol. 10 (10), 2705-2714 (2021).
  21. Manipulating the molecular specificity of transcriptional biosensors for tryptophan metabolites and analogs. Cell Rep Phys Sci. 5 (10), 102211(2024).">Xi, C., Ma, Y., Amrofell, M. B., Moon, T. S. Manipulating the molecular specificity of transcriptional biosensors for tryptophan metabolites and analogs. Cell Rep Phys Sci. 5 (10), 102211(2024).
  22. State-of-the-art in engineering small molecule biosensors and their applications in metabolic engineering. SLAS Technol. 29 (2), 100113(2024).">Chaisupa, P., Wright, R. C. State-of-the-art in engineering small molecule biosensors and their applications in metabolic engineering. SLAS Technol. 29 (2), 100113(2024).
  23. Tuning the performance of a TphR-based terephthalate biosensor with a design of experiments approach. Metab Eng Commun. 19, e00250(2024).">Alvarez Gonzalez, G., Chacón, M., Butterfield, T., Dixon, N. Tuning the performance of a TphR-based terephthalate biosensor with a design of experiments approach. Metab Eng Commun. 19, e00250(2024).
  24. Genetically encoded biosensor enabled mining, characterisation and engineering of aromatic acid MFS transporters. J Biol Eng. , (2025).">Roy, P. L., Chacón, M., Dixon, N. Genetically encoded biosensor enabled mining, characterisation and engineering of aromatic acid MFS transporters. J Biol Eng. , (2025).
  25. Engineering glucose metabolism for enhanced muconic acid production in Pseudomonas putida KT2440. Metab Eng. 59, 64-75 (2020).">Bentley, G. J., et al. Engineering glucose metabolism for enhanced muconic acid production in Pseudomonas putida KT2440. Metab Eng. 59, 64-75 (2020).
  26. Recent advances in computational methods for biosensor design. Biotechnol Bioeng. 118 (2), 555-578 (2021).">Khoshbin, Z., Housaindokht, M. R., Izadyar, M., Bozorgmehr, M. R., Verdian, A. Recent advances in computational methods for biosensor design. Biotechnol Bioeng. 118 (2), 555-578 (2021).
  27. A rationally and computationally designed fluorescent biosensor for d-serine. ACS Sens. 6 (11), 4193-4205 (2021).">Vongsouthi, V., et al. A rationally and computationally designed fluorescent biosensor for d-serine. ACS Sens. 6 (11), 4193-4205 (2021).
  28. Designing with living systems in the synthetic yeast project. Nat Commun. 9 (1), 2950(2018).">Szymanski, E., Calvert, J. Designing with living systems in the synthetic yeast project. Nat Commun. 9 (1), 2950(2018).
  29. Reconfiguring the challenge of biological complexity as a resource for biodesign. mSphere. 7 (6), e00547(2022).">Szymanski, E. A., Henriksen, J. Reconfiguring the challenge of biological complexity as a resource for biodesign. mSphere. 7 (6), e00547(2022).
  30. Development of high-performance whole cell biosensors aided by statistical modeling. ACS Synth Biol. 9 (3), 576-589 (2020).">Berepiki, A., Kent, R., Machado, L. F. M., Dixon, N. Development of high-performance whole cell biosensors aided by statistical modeling. ACS Synth Biol. 9 (3), 576-589 (2020).
  31. Targeted mutagenesis and high-throughput screening of diversified gene and promoter libraries for isolating gain-of-function mutations. Front Bioeng Biotechnol. 11, (2023).">Huttanus, H. M., et al. Targeted mutagenesis and high-throughput screening of diversified gene and promoter libraries for isolating gain-of-function mutations. Front Bioeng Biotechnol. 11, (2023).
  32. Algorithmic co-optimization of genetic constructs and growth conditions: application to 6-ACA, a potential nylon-6 precursor. Nucleic Acids Res. 43 (21), 10560(2015).">Zhou, H., Vonk, B., Roubos, J. A., Bovenberg, R. A., Voigt, C. A. Algorithmic co-optimization of genetic constructs and growth conditions: application to 6-ACA, a potential nylon-6 precursor. Nucleic Acids Res. 43 (21), 10560(2015).
  33. Improving metabolic pathway efficiency by statistical model-based multivariate regulatory metabolic engineering. ACS Synth. Biol. 6 (1), 148-158 (2017).">Xu, P., Rizzoni, E. A., Sul, S. Y., Stephanopoulos, G. Improving metabolic pathway efficiency by statistical model-based multivariate regulatory metabolic engineering. ACS Synth. Biol. 6 (1), 148-158 (2017).
  34. Tn7-based device for calibrated heterologous gene expression in Pseudomonas putida. ACS Synth Biol. 4 (12), 1341-1351 (2015).">Zobel, S., et al. Tn7-based device for calibrated heterologous gene expression in Pseudomonas putida. ACS Synth Biol. 4 (12), 1341-1351 (2015).
  35. Development of a high efficiency integration system and promoter library for rapid modification of Pseudomonas putida KT2440. Metab Eng Commun. 5, 1-8 (2017).">Elmore, J. R., Furches, A., Wolff, G. N., Gorday, K., Guss, A. M. Development of a high efficiency integration system and promoter library for rapid modification of Pseudomonas putida KT2440. Metab Eng Commun. 5, 1-8 (2017).
  36. Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments. Methods Enzymol. 498, 349-361 (2011).">Gibson, D. G. Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments. Methods Enzymol. 498, 349-361 (2011).
  37. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).">Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  38. Human-automation interaction strategies and models for life science applications. Hum Factors Ergon Manuf Serv Ind. 19 (6), 601-621 (2009).">Kaber, D. B., et al. Human-automation interaction strategies and models for life science applications. Hum Factors Ergon Manuf Serv Ind. 19 (6), 601-621 (2009).
  39. High-throughput screens and selections of enzyme-encoding genes. Curr Opin Chem Biol. 9 (2), 210-216 (2005).">Aharoni, A., Griffiths, A. D., Tawfik, D. S. High-throughput screens and selections of enzyme-encoding genes. Curr Opin Chem Biol. 9 (2), 210-216 (2005).
  40. Analysis of large libraries of protein mutants using flow cytometry. Adv Protein Chem. 55, 293-315 (2001).">Georgiou, G. Analysis of large libraries of protein mutants using flow cytometry. Adv Protein Chem. 55, 293-315 (2001).
  41. Gene amplification, laboratory evolution, and biosensor screening reveal MucK as a terephthalic acid transporter in Acinetobacter baylyi ADP1. Metab Eng. 62, 260-274 (2020).">Pardo, I., et al. Gene amplification, laboratory evolution, and biosensor screening reveal MucK as a terephthalic acid transporter in Acinetobacter baylyi ADP1. Metab Eng. 62, 260-274 (2020).
  42. Biosensor-guided improvements in salicylate production by recombinant Escherichia coli. Microb Cell Fact. 18 (1), 18(2019).">Qian, S., Li, Y., Cirino, P. C. Biosensor-guided improvements in salicylate production by recombinant Escherichia coli. Microb Cell Fact. 18 (1), 18(2019).
  43. Screening for enhanced triacetic acid lactone production by recombinant Escherichia coli expressing a designed triacetic acid lactone reporter. J Am Chem Soc. 135 (27), 10099-10103 (2013).">Tang, S. Y., et al. Screening for enhanced triacetic acid lactone production by recombinant Escherichia coli expressing a designed triacetic acid lactone reporter. J Am Chem Soc. 135 (27), 10099-10103 (2013).
  44. Effective use of biosensors for high-throughput library screening for metabolite production. J Ind Microbiol Biotechnol. 48 (9-10), kuab049(2021).">Kaczmarek, J. A., Prather, K. L. J. Effective use of biosensors for high-throughput library screening for metabolite production. J Ind Microbiol Biotechnol. 48 (9-10), kuab049(2021).
  45. The evolution, evolvability, and engineering of gene regulatory DNA. Nature. 603 (7901), 455-463 (2022).">Vaishnav, E. D., et al. The evolution, evolvability, and engineering of gene regulatory DNA. Nature. 603 (7901), 455-463 (2022).
  46. Model-driven generation of artificial yeast promoters. Nat Commun. 11, 2113(2020).">Kotopka, B. J., Smolke, C. D. Model-driven generation of artificial yeast promoters. Nat Commun. 11, 2113(2020).
  47. Encoding genetic circuits with DNA barcodes paves the way for machine learning-assisted metabolite biosensor response curve profiling in yeast. ACS Synth Biol. 11 (2), 977-989 (2022).">Zhou, Y., et al. Encoding genetic circuits with DNA barcodes paves the way for machine learning-assisted metabolite biosensor response curve profiling in yeast. ACS Synth Biol. 11 (2), 977-989 (2022).
  48. Programmable cross-ribosome-binding sites to fine-tune the dynamic range of transcription factor-based biosensor. Nucleic Acids Res. 48 (18), 10602-10613 (2020).">Ding, N., Yuan, Z., Zhang, X., Chen, J., Zhou, S., Deng, Y. Programmable cross-ribosome-binding sites to fine-tune the dynamic range of transcription factor-based biosensor. Nucleic Acids Res. 48 (18), 10602-10613 (2020).
  49. Using design of experiments to guide genetic optimization of engineered metabolic pathways. J Ind Microbiol Biotechnol. 51, kuae010(2024).">Moon, S., Saboe, A., Smanski, M. J. Using design of experiments to guide genetic optimization of engineered metabolic pathways. J Ind Microbiol Biotechnol. 51, kuae010(2024).
  50. An automated design-build-test-learn pipeline for enhanced microbial production of fine chemicals. Commun Biol. 1, 66(2018).">Carbonell, P., et al. An automated design-build-test-learn pipeline for enhanced microbial production of fine chemicals. Commun Biol. 1, 66(2018).
  51. An ultra-sensitive Comamonas thiooxidans biosensor for the rapid detection of enzymatic polyethylene terephthalate (PET) degradation. Appl Environ Microbiol. 89 (1), e0160322(2023).">Dierkes, R. F., et al. An ultra-sensitive Comamonas thiooxidans biosensor for the rapid detection of enzymatic polyethylene terephthalate (PET) degradation. Appl Environ Microbiol. 89 (1), e0160322(2023).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Genetically Encoded BiosensorsBiosensor DesignDesign Of ExperimentsHigh Throughput AutomationPromoter LibraryRibosome Binding SiteEffector TitrationGenetic Circuit OptimizationMicrotiter Plate ScreeningAllosteric Transcription Factor

Related Articles