المستشعرات الحيوية لبروتين G المستندة إلى BRET لقياس نشاط مستقبلات بروتين G المقترنة في الخلايا الحية

تمثل المستقبلات المقترنة بالبروتين G (GPCRs) أكبر عائلة فائقة من المستقبلات عبر الغشاء ، وهي مسؤولة عن تحويل المحفزات خارج الخلية إلى شلالات إشارات داخل الخلايا مما يؤدي إلى استجابات بيولوجية محددة. إنها أهداف دوائية محورية ، حيث يعمل ما يقرب من 30٪ من الأدوية المسوقة على GPCRs¹. يحفز ارتباط الترابط GPCR تغييرات توافقية في المستقبل ، مما يسهل التفاعلات مع بروتينات G غير المتجانسة و / أو كينازات GPCR (GRKs) و β-arrestins ، وبالتالي بدء الإشارات النهائية أو استيعاب المستقبلات².

تعمل بروتينات G غير المتجانسة كمحولات الطاقة الأساسية داخل الخلايا لإشارات GPCR وتتكون من ثلاث وحدات فرعية: G_α و_{G β} و G_γ. يتم تصنيف هذه القطع غير المتجانسة إلى أربع عائلات - G_{i / o} و G_s و G_q و_{G 12/13} - بناء على النوع الفرعي G_α ، كل منها ينشط مسارات إشارات مميزة: النوع الفرعي_{G i / o} يثبط adenylate cyclase بينما يحفزه G_s ، ينشط G_q فوسفوليباز C-β ، و G_12/13 ينظم عائلة Rho GTPases.

يؤدي تنشيط GPCR إلى إعادة ترتيبها التوافقي ، مما يتيح مشاركة بروتين G بسرعة داخل الحركية دون الثانية. تحفز هذه العملية تغييرات توافقية في بروتين G ، مما يعزز تبادل الناتج المحلي الإجمالي - GTP في الوحدة الفرعية_{G α} . يعمل ربط GTP على تغيير تشكل الوحدة الفرعية_{G α} ، مما يؤدي إلى تفككها عن ثنائي_{G βγ} ، مما يسمح بانتشار الإشارة. وبالتالي ، فإن بروتينات G ضرورية في تعديل الخصوصية والديناميكيات الزمنية للاستجابات الخلوية عن طريق تنظيم البروتينات المستجيبة المتنوعة مثل adenylate cyclase أو القنوات الأيونية^3،4،5.

يحدد هذا البروتوكول قياس تنشيط بروتين G أو تعطيله باستخدام المستشعرات الحيوية القائمة على نقل طاقة الرنين الحيوي (BRET) عند تحفيز GPCR ligand في الخلايا الحية. مستوحى من العمل الرائد على أجهزة الاستشعار الحيوية للبروتين G^6،7،8،9 ، يعتمد نظام G-CASE (مستشعرات النشاط ثلاثي البروتين G) ، الذي قدمه Schihada et ^al.10 ، على BRET بين الوحدات الفرعية G_α و G_βγ ويقدم نهجا مبسطا يتطلب تعداء بلازميد واحد فقط. تعزز هذه الميزة الحساسية وتخفف من التحديات المرتبطة بالتعديد المشترك لترميز البلازميدات المتعددة للوحدات الفرعية الثلاث (G_α و G_β و_{G γ}) من بروتين G غير المتجانس. تم توفير هذه المستشعرات لمجموعات البحث الأكاديمي تجاريا (انظر جدول المواد).

تقدم BRET مزايا كبيرة مقارنة بنقل طاقة الرنين Förster (FRET). في BRET ، يحدث نقل الطاقة بين متبرع مضيء بيولوجي ومتقبل الفلورسنت دون الحاجة إلى مصادر ضوء خارجية. يقلل هذا التلألؤ البيولوجي الجوهري من المشكلات المرتبطة ب FRET ، مثل التألق الذاتي وتشتت الضوء ، مما يؤدي إلى انخفاض إشارة الخلفية وتحسين حساسية الفحص^6،7،11.

يقلل هذا الغياب للإثارة الخارجية في BRET من التبييض الضوئي والتأثيرات السامة للضوء ، مما يؤدي إلى انخفاض إشارات الخلفية مقارنة ب FRET. وبالتالي ، غالبا ما تظهر فحوصات BRET حساسية محسنة ، مما يسمح بقياس تنشيط بروتين G ل GPCRs النشطة تأسيسيا. تسهل الحساسية المعززة لمقايسات BRET اكتشاف التفاعلات البيولوجية الدقيقة ، والتي تعتبر ذات قيمة خاصة في الدراسات الدوائية حيث يكون القياس الدقيق لنشاط المستقبلات أمرا بالغ الأهمية.

يمكن ترجمة هذه المستشعرات الحيوية إلى فحص عالي الإنتاجية في 96 بئرا أو 384 بئرا ، كما أوضح مؤخرا سكوت دينيس وآخرون ، حيث تم تطوير طريقة باستخدام هذه المستشعرات الحيوية في مقايسة 384 بئرا قائمة على الغشاء لتحليل نشاط مستقبلات القنب CB1R و CB2R¹². تصف هذه المقالة استخدام هذه المستشعرات الحيوية في 96 بئرا في الخلايا الحية عن طريق قياس نشاط β2-AR كنموذج أولي من الفئة A GPCR ، والذي يربط بروتين G_s و CB1R الذي ينتمي إلى GPCRs من الفئة A وينشط بروتين عائلة_{G i / o} . تم التحقق من صحة استخدام اثنين من أجهزة الاستشعار الحيوية G-CASE: G_s و G_i3 في خلايا HEK 293T مع GPCR إما بشكل عابر (مع β2-AR) أو يتم التعبير عنها بثبات (مع CB1R).

من المهم ملاحظة أنه يمكن إجراء هذه التجربة في خطوط خلايا مختلفة ، مما يدل على تعدد استخدامات ومتانة هذه التقنية عبر سياقات خلوية مختلفة. يضمن ذلك إمكانية تطبيق الطريقة على نماذج تجريبية متنوعة ، مما يجعلها أداة قيمة لدراسة إشارات GPCR في بيئات فسيولوجية ودوائية مختلفة. يوضح الشكل 1 مبدأ مستشعرات نشاط بروتين G القائمة على BRET.

الشكل 1: مبدأ مستشعرات نشاط بروتين G القائمة على BRET. تتكون مستشعرات بروتين G من ثلاث وحدات فرعية: G_α و G_β الأصلي و G_γ. يتم دمج الوحدة الفرعية_{G α} مع NanoLuciferase الصغير والمشرق (Nluc) ، في حين أن الوحدة الفرعية_{G γ} مصنفة بشكل نهائي N مع كوكب الزهرة الدائري (cpVenus¹⁷³). يتم دمج الجينات التي تشفر هذه الوحدات الفرعية لبروتين G المصممة هندسيا في بلازميد واحد. يؤدي ارتباط الترابط ب GPCRs إلى تغييرات توافقية GPCR ، مما يعزز تجنيد بروتين G والتفكك اللاحق متبوعا بالتحلل المائي GTP. يؤدي هذا التفكك إلى تعطيل نقل الطاقة بين الشركاء ، مما يؤدي إلى انخفاض إشارة BRET. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

يتم سرد الكواشف والمعدات المستخدمة في هذه الدراسة في جدول المواد.

1. بذر الألواح الجيدة (اليوم 1)

ملاحظة: اتبع جميع بروتوكولات زراعة الخلايا في غطاء التدفق الصفحي المعقم للحفاظ على ظروف التعقيم. تستخدم ألواح الآبار البيضاء ذات القيعان المسطحة الشفافة لمتابعة نمو الخلايا وقابليتها للحياة. استخدم لوحة البئر البيضاء الكاملة لتجنب استخدام ملصق في الخطوة 3.2.1.

1. طلاء لوحة البئر
   ملاحظة: يمكن استخدام الألواح المطلية مسبقا لتجاوز هذه الخطوة.
   1. تصب في خزان متعدد القنوات حوالي 6 مل من محلول Poly-L-lysine (PLL) المعقم المصفى (0.01٪). باستخدام ماصة متعددة القنوات ، املأ كل بئر من صفيحة دقيقة 96 بئرا بيضاء ب 60 ميكرولتر من PLL.
   2. ضع الصفيحة الصغيرة في مكان مظلم واحتضنها لمدة 20 دقيقة.
   3. أثناء الحضانة ، تابع تحضير الخلايا كما هو موضح في الخطوات 1.2.1-1.2.3.
   4. اسحب محلول PLL باستخدام الماصة متعددة القنوات وقم بتخزينه عند 4 درجات مئوية في أنبوب سعة 15 مل.
   5. اغسل اللوحة ثلاث مرات باستخدام DPBS لإزالة PLL الحر الذي قد يتسبب في تدهور الخلايا.
2. تحضير الخلايا وطلاءها
   1. ثقافة خلايا HEK293 في وسط Eagle المعدل من Dulbecco مكمل بنسبة 10٪ مصل أبقار جنيني (FBS) ، و 100 وحدة / مل من البنسلين ، و 100 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين عند 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂.
      ملاحظة: يضاف FBS إلى وسط الاستزراع لتوفير العناصر الغذائية الضرورية وعوامل النمو المطلوبة لبقاء الخلايا بشكل صحيح.
   2. قم بإزالة الوسط واشطف الخلايا ب 2 مل من DPBS.
   3. أضف 0.5 مل من التربسين واحتضان لمدة 3-5 دقائق عند 37 درجة مئوية لفصل الخلايا.
   4. أضف 4.5 مل من DMEM إلى القارورة لتحييد التربسين ، ثم قم بسحب الماصة لأعلى ولأسفل بشكل متكرر لفصل الخلايا وإعادة تعليقها.
   5. انقل الخلايا المنفصلة إلى أنبوب سعة 15 مل وجهاز طرد مركزي لمدة 5 دقائق عند 1000 × جم (في درجة حرارة الغرفة ، RT).
   6. قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في 2 مل من DMEM.
   7. عد الخلايا بغرفة عد الملاسيز وقم بإعداد 9 مل عند 300,000 خلية / مل. ضعها في خزان متعدد القنوات وقم بزرع الصفيحة الدقيقة ذات 96 بئرا عن طريق صب 100 ميكرولتر لكل بئر باستخدام الماصة متعددة القنوات (الكثافة النهائية 30,000 خلية / بئر).
   8. احتضان الصفيحة الدقيقة à 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ لمدة 24 ساعة تقريبا.
      ملاحظة: يجب أن تصل الخلايا إلى حوالي 70٪ -80٪ من التقاء التعداء الفعال.

2. تعداء البلازميد (اليوم 2)

ملاحظة: يمكن إجراء تعداء الخلية في اليوم الأول على الخلايا العالقة قبل الطلاء ، خلال الخطوة 1.2.7 ، والحصول على البيانات في اليوم 3.

1. قم بتخفيف 10 ميكروغرام من الحمض النووي للبلازميدات المطلوبة (على سبيل المثال ، 5 ميكروغرام من مستقبلات β2-الأدرينالية و 5 ميكروغرام من G_s (قصير) -CASE في خلايا HEK wt أو 10 ميكروغرام فقط من G_i3-CASE في خلايا HEK CB1) و 20 ميكرولتر ليبوفيكتامين في الأنابيب التي تحتوي على 500 ميكرولتر من وسط Opti-MEM. احتضان في RT لمدة 5 دقائق.
   1. للتحكم السلبي ، استبدل مستقبلات β2-الأدرينالية ببلازميد pcDNA 3.1 فارغ بنفس التركيز. امزج المحاليل في أنبوب واحد واخلطها للحصول على خليط تعداء (1 مل).
2. احتضان خليط التعداء على RT لمدة 20 دقيقة.
3. أضف 10 ميكرولتر من خليط تعداء من الخطوة 2.2 باتجاه قطري إلى كل بئر ، وهز اللوحة برفق ذهابا وإيابا لضمان الخلط الكامل.
   ملاحظة: يتم الحصول على تركيز نهائي قدره 100 نانوغرام من الحمض النووي لكل بئر.
4. احتضان الصفيحة الدقيقة في حاضنة مرطبة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ لمدة 24 ساعة.

3. الحصول على البيانات (اليوم 3)

1. إعداد الترابط
   ملاحظة: محلول الملح المتوازن من هانك (HBSS) العازلة: كلوريد الصوديوم 140 ملي ، كلوريد البوتاسيوم 5 ملي ، كلوريد الكالسيوم 1 ملي ، كبريتات المغنيسيوم هيبتاهيدرات 0.4 ملي ، سداسي هيدرات كلوريد المغنيسيوم 0.5 ملي ، فوسفات الصوديوم ثنائي هيدرات ثنائي القاعدة 0.3 ملي ، فوسفات البوتاسيوم أحادي القاعدة 0.4 ملي ، د جلوكوز (سكر العنب) 6 ملي ، بيكربونات الصوديوم 4 ملي ، درجة الحموضة 7.4 ، مفلتر 0.22 ميكرومتر.
   1. قم بإعداد محلول مخزون بأعلى تركيز ممكن في مذيب الذوبان المناسب للروابط المختلفة (في هذا البروتوكول ، يتم تحضير الأيزوبروتيرينول في H₂0 mQ و WIN-55.212-2 في DMSO).
      ملاحظة: يجب تعديل تركيز محلول مخزون الترابط اعتمادا على قابلية الذوبان وثابت التأين المعروف (K_d) للرابط.
   2. من هذا المخزون ، قم بإعداد تخفيف تسلسلي ليجند يتراوح حول K_d لليجند ، من 10 ميكرولتر في مذيب الذوبان المناسب. قم بتخزين هذا التخفيف التسلسلي عند -20 درجة مئوية.
      ملاحظة: اعتمادا على الترابط ، يمكن تجميد نطاق التخفيف التسلسلي وإذابته حتى عشر مرات قبل حدوث التدهور. قم بإعداد محلول يحتوي فقط على المذيب المستخدم في إذابة الترابط لتضمين حالة السيارة (في هذا البروتوكول ، H₂0 أو DMSO).
   3. لكل تركيز ومركبة من الترابط ، قم بإجراء تخفيف 1/100 في HBSS بإضافة 1.3 ميكرولتر من كل تركيز إلى حجم إجمالي قدره 130 ميكرولتر. ينتج عن هذا تركيز نهائي بنسبة 1٪ في HBSS.
      ملاحظة: نطاق التخفيف النهائي هذا هو النطاق المستخدم في التجارب عن طريق إضافة 10 ميكرولتر للحصول على حجم إجمالي قدره 100 ميكرولتر لكل بئر. ينتج عن هذا تركيز نهائي بنسبة 0.1٪ مركبة في جميع الآبار. يتوافق حجم 130 ميكرولتر مع الكمية اللازمة لملء صف واحد من صفيحة 96 بئرا: (10 × 12) ± 10٪. يتوافق كل صف مع تركيز مختلف من الترابط ، حيث يعمل الصف الأخير كعنصر تحكم في السيارة.
   4. قم بإعداد 980 ميكرولتر من تخفيف Furimazine 1/100 من محلول المخزون (9.8 ميكرولتر في 970.2 ميكرولتر من HBSS للحصول على حجم إجمالي قدره 980 ميكرولتر).
      ملاحظة: قم بإعداد محلول جديد من الفوريمازين واتركه يحتضن لمدة 3 دقائق على الأقل. ثم أضفه مباشرة قبل الاستحواذ. لا ينبغي تحضيره مبكرا جدا ، حيث يبلغ عمر النصف للإشارة حوالي 120 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. للتغلب على هذا القيد ، يمكن استخدام مشتقات الفوريمازين طويلة المفعول ، مثل فيفازين وإندورازين. تحافظ هذه الركائز على إشارة BRET مستقرة لمدة تصل إلى 48 ساعة.
2. قراءات اللوحة
   ملاحظة: استخدم قارئ لوحة متعدد الأوضاع. اضبط القياس وفقا للظروف التي تمت دراستها وعدد التكرارات. هنا ، يتم تقسيم الحصول على البيانات إلى ثلاث قراءات من 4 أعمدة ، وهو ما يعادل 32 بئرا. تتم جميع القراءات باستخدام بصريات علوية بغطاء شفاف لمنع التبخر العازل. قبل جميع القراءات، اضبط كسب القياس. في هذه الدراسة ، تم تثبيت الكسب عند 3600. من الممكن تجنب إضافة الترابط اليدوي باستخدام حاقن آلي أو نظام حقنة ، وهو متوفر في العديد من قارئات الألواح.
   1. قم بإزالة الوسط من أول 4 أعمدة من اللوحة المكونة من 96 بئرا. اشطف كل بئر ب 100 ميكرولتر من HBSS وأضف 80 ميكرولتر من HBSS. ألصق ملصقا أبيض على الجانب السفلي من اللوحة. هذا يحسن قياسات التألق و / أو التلألؤ البيولوجي.
   2. تسجيل أطياف تلألؤ بروتين G: أدخل لوحة 96 بئرا في قارئ اللوحة. سجل انبعاث cpVenus¹⁷³ باستخدام أحادي اللون 535/30 نانومتر وقم بقياس انبعاث اللمعان بين 500 و 600 نانومتر بدقة 2 نانومتر.
      ملاحظة: هذا التسجيل هو عنصر تحكم لضمان انبعاث التألق عند إثارة cpVenus¹⁷³ .
   3. تسجيل أطياف تلألؤ بروتين G: سجل شدة انبعاث Nluc باستخدام أحادي اللون 450/40 نانومتر وقياس انبعاث التلألؤ بين 400 نانومتر و 600 نانومتر بدقة 5 نانومتر.
      ملاحظة: هذا التسجيل هو عنصر تحكم لضمان عدم انبعاث تلألؤ بيولوجي قبل إضافة ركيزة Nluc ، furimazine.
   4. قم بإزالة اللوحة من قارئ اللوحة وأضف 10 ميكرولتر من محلول الفوريمازين المعد مسبقا (الخطوة 3.1.4.) في كل بئر بمساعدة ماصة متعددة القنوات.
   5. كرر الخطوة 3.2.3.
      ملاحظة: هذا التسجيل هو عنصر تحكم لضمان انبعاث التلألؤ البيولوجي عند إضافة الفوريمازين. تابع مباشرة الخطوة 6.2.3 بعد هذا القياس لمنع تغير الإشارة بسبب استهلاك الفوريمازين و/أو تدهوره. يمكن أن يحدث تباين إشارة BRET بسبب استهلاك الفوريمازين و / أو التدهور والعمليات التنظيمية التي تحدث لإنهاء الاستجابة الناجمة عن تحفيز الناهض. للتغلب على هذا القيد ، يمكن استخدام مثبطات GRK (CMPD101) ومثبطات الاستيعاب (dynasore) أو الخلايا المعدلة جينيا الخالية من GRKs أو الاعتقالات.
   6. تسجيل بروتين G الأساسي BRET: قبل إضافة رابطة GPCRs ، سجل Nluc و cpVenus¹⁷³ شدة انبعاث باستخدام 450/40 نانومتر و 535/30 نانومتر أحادي اللون ، على التوالي. قم بقياس 3 دورات من 60 ثانية مع وقت قياس 0.30 ثانية (إجمالي وقت القراءة 3 دقائق).
      ملاحظة: عادة ما تؤدي زيادة فترة القياس إلى 0.90 ثانية إلى تحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء بشكل كبير ولكنها تؤدي إلى وقت قراءة أطول بكثير. يجب على المجرب أن يقرر ما إذا كانت الدقة الزمنية الأعلى أو نسبة الإشارة إلى الضوضاء المحسنة أكثر أهمية لتطبيقها.
   7. قم بإزالة اللوحة من قارئ اللوحة وأضف 10 ميكرولتر من نطاق التخفيف المعد مسبقا لرابط GPCR (الخطوة 3.1) على التوالي في كل بئر من عمود واحد بمساعدة ماصة متعددة القنوات. اتبع نفس الإجراء ل 3 أعمدة أخرى.
   8. تسجيل BRET الناجم عن الترابط البروتين G: سجل شدة انبعاث Nluc و cpVenus¹⁷³ باستخدام 450/40 نانومتر و أحادي اللون 535/30 نانومتر ، على التوالي. قم بقياس 16 دورة من 60 ثانية بفاصل زمني للقياس يبلغ 0.30 ثانية (إجمالي وقت القراءة 16 دقيقة).
      ملاحظة: قم بإعداد معلمات القياس لقياس الآبار في أعمدة. تتم قراءة التكرارات بفارق زمني قدره 2.4 ثانية.
   9. كرر الخطوة 3.2. للأعمدة الأربعة التالية 2 مرات.

4. تحليل البيانات

ملاحظة: اجمع بيانات كل قراءة في ملفات جداول بيانات منفصلة.

1. قراءات التحكم
   1. ارسم شدة الانبعاث مقابل الطول الموجي.
2. قراءات النقاق القاعدية
   1. لكل بئر ، احسب نسبة BRET للقراءات الثلاث. تعرف نسبة BRET على أنها انبعاثات متقبلة / انبعاثات مانحة.
      
   2. لكل بئر ، احسب متوسط نسب BRET الثلاثة قبل إضافة الترابط. تسمى هذه القيمة نسبة BRET القاعدية قبل تحفيز الترابط: نسبة_قاعدية.
   3. لتطبيع نسب BRET السابقة لجميع الآبار ، لكل من القياسات الثلاثة ، يتم طرح قيمة نسبة BRET المحسوبة من آبار التحكم في المركبات من نسبة BRET في وقت القياس المقابل.
      ملاحظة: تتوافق البيانات التي تم تحليلها مع النقاط الزمنية قبل إضافة الترابط. نظرا لأن الآبار التي يضاف إليها الترابط معروفة ، يمكن تحديد آبار التحكم في المركبات وفقا لذلك.
3. قراءات BRET الناجم عن الترابط البروتيني G
   1. لكل بئر ، احسب نسبة BRET لكل قراءة ، كما هو موضح في القسم 4.2.1. تسمى هذه القيم_{Ratio stim}.
   2. لقياس التغيرات التي يسببها الترابط ، احسب ΔBRET لكل_تحفيز نسبة لكل بئر كنسبة مئوية على القاعدية. لذلك ، استخدم النسبة_{القاعدية} المقابلة المحسوبة مسبقا في القسم 4.2.2.
      
   3. احسب ΔBRET (٪) لتطبيع قيم ΔBRET لكل بئر. لذلك ، اطرح قيم ΔBRET الخاصة بالسيارة.
   4. لتصور حركية ΔBRET في جدول بيانات ، أضف قراءات BRET القاعدية الثلاث التي تم تطبيعها في الخطوة 4.2.3. أمام قيم ΔBRET(٪) المقابلة المحسوبة لكل بئر في القسم 3.3.4.
   5. ارسم البيانات السابقة مقابل وقت القراءة للحصول على رسم بياني حركي.
   6. عند الوصول إلى هضبة ، خذ قيم ΔBRET (٪) في وقت محدد وارسمها مقابل تركيز الترابط المستخدم ، حيث يتوافق كل بئر مع تركيز تجند مختلف. يتم الحصول على منحنى استجابة الجرعة.
      ملاحظة: عادة ما يتم الوصول إلى الهضبة بعد حوالي 5 دقائق من تحفيز الترابط. في هذا البروتوكول ، يتم رسم القيم التي تم الحصول عليها بعد تحفيز الترابط لمدة 15 دقيقة. لمقارنة البيانات من التجارب المختلفة ، اضبط الوقت اعتمادا على حركية التنشيط.
   7. ارسم البيانات السابقة في برنامج التحليل وقم بملاءمتها باستخدام ملاءمة ثلاثية المعلمات للجرعة والاستجابة السينية بناء على المعادلة التالية:
      
      حيث X هو تركيز الترابط المستخدم ، و Y هي قيم ΔBRET (٪) ، وأعلى وأسفل يمثلان الهضاب ، و EC₅₀ هو تركيز الترابط المطلوب للوصول إلى 50٪ من التأثير الأقصى. هذا يسمح للمرء بالحصول على E_max و EC₅₀.
   8. قارن البيانات من حالة التحكم باستخدام اختبار مان ويتني غير البارامتري. تعتبر النتائج مهمة عند 0.05 < p .

الشكل 2: الخطوات الرئيسية لإجراء فحص BRET. نظرة عامة على الخطوات التجريبية الرئيسية الثلاث الموضحة في هذا البروتوكول (بذر الخلايا ، وتعداء الخلية ، واكتساب إشارة BRET) ودليل تفصيلي تدريجي للحصول على البيانات. الإعداد التجريبي: في اليوم الأول ، يتم زرع الخلايا في صفيحة بيضاء مطلية مسبقا ب 96 بئرا مع قاع مسطح وشفاف بكثافة 30,000 خلية / بئر. في اليوم 2 ، يتم نقل الخلايا باستخدام مستشعر بروتين G المحدد جنبا إلى جنب مع بلازميدات GPCR أو pcDNA3.1 المدروسة بعد 24 ساعة من الحضانة ، يتم قياس نشاط مستشعر بروتين G من خلال قراءات التلألؤ البيولوجي والفلورة عند إضافة الترابط. الحصول على البيانات: بعد غسل HBSS للخلايا ، يضاف 80 ميكرولتر من HBSS إلى الآبار ، ويتم قياس انبعاث cpVenus¹⁷³ الفلوري بين 500 نانومتر و 600 نانومتر باستخدام أحادي اللون 535/30 نانومتر (1). بعد ذلك ، يتم قياس التلألؤ البيولوجي Nluc بين 400 نانومتر و 600 نانومتر باستخدام أحادي اللون 450/40 نانومتر ، قبل (2) وبعد (3) إضافة الفوريمازين. أخيرا ، يتم قياس إشارة BRET لنشاط بروتين G القاعدي والليجند باستخدام أحاديات اللون 450/40 نانومتر و 535/30 نانومتر ، على التوالي ، على مدى 3 دقائق (3 دورات من 60 ثانية بفاصل قياس 0.30 ثانية) (4) و 16 دقيقة (16 دورة من 60 ثانية بفاصل قياس 0.30 ثانية) (5). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

تم تفصيل مخطط معمم للإعداد التجريبي والتنفيذ في الشكل 2. تم تقييم تنشيط بروتينات عائلة Gs أو Gi / o بعد تنشيط الترابط لاثنين من GPCRs باستخدام المستشعرات الحيوية G-CASE. أولا ، تمت دراسة عائلة نموذجية A GPCR ، حيث تم نقل β2-AR بشكل عابر في خلايا HEK 293T. عندما تم تطبيق ناهض (أي الأيزوبروتيرينول) على خلايا وزن HEK التي تعبر عن β2-AR جنبا إلى جنب مع مستشعر البروتين Gs (قصير) -CASE ، لوحظ انخفاض يعتمد على التركيز في إشارة BRET ، مما يشير إلى تنشيط بروتين Gs (الشكل 3 ب). انخفضت قيم ΔBRET عند تركيز الترابط حتى الوصول إلى التشبع ، مع ملاحظة هضبة بعد حوالي 5 دقائق من تحفيز الترابط. في المقابل ، أظهرت خلايا وزن HEK المنقولة ببلازميد pcDNA3.1 الفارغ ومستشعر بروتين Gs (قصير) -CASE استجابة عكسية ولكنها منخفضة وغير مهمة لتحفيز الأيزوبروتيرينول (الشكل 3 ب). في هذا البروتوكول ، يتم رسم القيم التي تم الحصول عليها بعد 15 دقيقة من تحفيز الترابط. لضمان اتساق النتائج واستقلالها عن اختيار الوقت ، يجب اختبار نقاط زمنية أخرى ، لضمان الوصول إلى التوازن. بالإضافة إلى ذلك ، لمقارنة النتائج عبر التجارب المختلفة ، يجب تعديل اختيار الوقت بناء على حركية التنشيط لكل تجربة.

لتوليد منحنيات استجابة الجرعة السيني الموضحة في الشكل 3 ج ، تم رسم قيم ΔBRET المقاسة بعد 15 دقيقة من التحفيز (عندما تستقر الهضبة) مقابل تركيزات الترابط المختلفة. EC50 المرصود (9.4 نانومتر ± 2.1 نانومتر) يقع في نطاق قيم Kd المعروف للمستقبل للأيزوبروتيرينول (13 نانومتر ± 6 نانومتر) 13،14 (الشكل 3C ، D). توضح هذه النتائج كفاءة مستشعرات G-CASE في تقييم تنشيط بروتين G مع استجابة ملحوظة مرتبطة على وجه التحديد بوجود β2-AR.

الشكل 3: تقييم مستشعر بروتين Gs في خلايا وزن HEK. قراءات ΔBRET الحركية عند إضافة الأيزوبروتيرينول الناهض إلى خلايا HEK wt المنقولة باستخدام مستشعر بروتين GS و β2-AR (A) أو pcDNA3.1 (B). (ج) منحنيات استجابة الجرعة التي تم الحصول عليها عن طريق تركيب قيم ΔBRET (٪) بعد تحفيز الترابط لمدة 15 دقيقة بتركيزات متفاوتة من الترابط. (د) مقارنة القيم القصوى ΔBRET بين الخلايا المنقولة pcDNA3.1 و β2-AR المحفزة بالأيزوبروتيرينول. تم اختبار الاختلاف الإحصائي مع حالة pcDNA3.1 باستخدام اختبار مان ويتني غير البارامتري (** ص < 0.01). تظهر البيانات متوسط ± SEM لثلاث تجارب مستقلة أجريت في تكرار. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

ثانيا ، تم اختبار المستشعرات الحيوية في خلايا HEK CB1 ، وهو خط خلية HEK 293T يعبر بثبات عن CB1R. تم نقل هذه الخلايا بشكل عابر باستخدام مستشعر بروتين Gi3-CASE. أدى التحفيز باستخدام ناهض CB1R WIN-55،212-2 إلى إحداث إشارة ΔBRET تعتمد على التركيز ، مما يشير إلى تنشيط مسار Gi3 (الشكل 4 أ). في المقابل ، لم تظهر خلايا HEK wt التي تم نقلها باستخدام مستشعر بروتين Gi3-CASE وتحفيزها في نفس الظروف أي استجابة ، مما يؤكد خصوصية تنشيط CB1R (الشكل 4 ب). تم الوصول إلى هضبة في حوالي 5 دقائق بعد تنشيط الترابط. سلط منحنى استجابة الجرعة المقابل الضوء على استجابة ΔBRET المعتمدة على التركيز الناجمة عن تحفيز WIN-55،212-2 في خلايا HEK-CB1 ، بينما لم يلاحظ مثل هذه الاستجابة في خلايا وزن HEK (الشكل 4 ج). EC50 المرصود (112 نانومتر ± 25 نانومتر) يقع في نطاق قيم EC50 المعروفة للمستقبل ل WIN-55،212-2 (354 نانومتر ± 62 نانومتر) 15 (الشكل 4C ، D). أخيرا ، مقارنة بين قيم ΔBRET التي تم الحصول عليها لمدة 15 دقيقة عند تحفيز الناهض مع 10 ميكرومتر من WIN-55،212-2 في HEK CB1 ، وتوضح خلايا HEK wt التنشيط المعتمد على CB1R لمسار إشارات Gi3 (الشكل 4 د).

الشكل 4: تقييم مستشعر بروتين Gi3 في خلايا HEK CB1. قراءات ΔBRET الحركية عند إضافة ناهض WIN-55،212-2 إلى HEK CB1 (A) أو HEK wt خلايا (B). منحنيات استجابة الجرعة التي تم الحصول عليها عن طريق تركيب قيم ΔBRET (٪) بعد 15 دقيقة من تحفيز الترابط مقابل تركيز الترابط (C). مقارنة القيم القصوى ΔBRET بين خلايا HEK wt و HEK CB1 المحفزة باستخدام WIN-55.212-2 (D). تم اختبار الفرق الإحصائي مع حالة وزن HEK باستخدام اختبار مان ويتني غير البارامتري (****p < 0.0001). تظهر البيانات متوسط ± SEM لخمس تجارب مستقلة تم إجراؤها في تكرار. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.