مقالة منهجية

مقايسة المذنب لقياس تلف الحمض النووي في خلايا 32D التي تعبر عن طفرات FLT3 بعد التعرض لمثبطات FLT3 من النوع الأول والثاني

1.4K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/68469

⸱

أكتوبر 17, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry and Life Sciences, Suzhou University of Science and Technology, 2Jiangsu Province Engineering Research Center of Molecular Target Therapy and Companion Diagnostics in Oncology, Suzhou Vocational Health College, 3Department of Hematology, The Second Affiliated Hospital of Soochow University, 4Taizhou University Affiliated Municipal Hospital, School of Medicine, Taizhou University, 5National Clinical Research Center for Hematologic Diseases, Jiangsu Institute of Hematology, The First Affiliated Hospital of Soochow University, 6Department of Radiation Oncology, The Affiliated Hospital of Soochow University, 7Department of Medical Ultrasound, Suzhou TCM Hospital Affiliated to Nanjing University of Chinese Medicine

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

يصف هذا البروتوكول طريقة فعالة لقياس الفرق في تلف الحمض النووي الناجم عن مثبطات النوع الأول والنوع الثاني في الخلايا الطافرة FLT3 من خلال تطبيق مقايسة المذنب.

الملخص

يظهر التيروزين كيناز 3 (FLT3) الشبيه ب FMS ، وهو مستقبل من الفئة الثالثة التيروزين كيناز ، تكرارا للطفرات بنسبة 30٪ تقريبا في مرضى ابيضاض الدم النخاعي الحاد (AML) ويشكل هدفا علاجيا حاسما. كمثبطات تمثيلية من النوع الأول والنوع الثاني FLT3 ، على التوالي ، يتم استخدام gilteritinib و Quizartinib (AC220) سريريا في إدارة ابيضاض الدم النقوي الحافر FLT3.

يثبط جيلتريتينيب بروتينات FLT3 المنشطة والمعطلة ، مع تثبيط إضافي لأهداف AXL للمساعدة في التغلب على المقاومة. يمنع AC220 FLT3 المنشط. تم استخدام مقايسة المذنب بشكل منهجي لتحديد ومقارنة أنماط تلف الحمض النووي الناجمة عن النوع الأول مقابل مثبطات FLT3 من النوع الثاني في الخلايا الطافرة. كشفت النتائج التجريبية أن تلف الحمض النووي الناجم عن AC220 كان أعلى بكثير من ذلك الناجم عن جيلتريتينيب. لتلف الحمض النووي القوي ، يمكن دمج مثبطات FLT3 مع مثبطات إصلاح تلف الحمض النووي لاستهداف عيوب إصلاح الحمض النووي. توفر النتائج دعما تجريبيا لاستراتيجية الجمع العقلاني للأدوية التي تستهدف تلف الحمض النووي.

المقدمة

يمثل ابيضاض الدم النخاعي الحاد (AML) اضطرابا في الخلايا الجذعية المكونة للدم النسيلية يحدده التوسع المرضي للأسلاف النخاعي غير المتمايزة ، مما يؤدي إلى قمع المكونة للدم وفشل نخاع العظام. يشكل عدم التجانس الجزيئي المتأصل في ابيضاض الدم النقوي الحاد تحديات علاجية كبيرة1. ذات أهمية سريرية خاصة ، تشكل طفرات التيروزين كيناز 3 (FLT3) الشبيهة ب FMS واحدة من أكثر التغيرات الجينية انتشارا في ابيضاض الدم النقوي الحاد ، والتي تحدث في حوالي 30٪ من الحالات ، وتظهر ارتباطا قويا بالنتائج السريرية السلبية2. يخضع مستقبل FLT3 التيروزين كيناز للتنشيط في غشاء البلازما للتوسط في شلالات إشارات PI3K / AKT و RAS / MAPK ، بينما يتم الاحتفاظ بالمتغير المتحور FLT3-ITD داخل الشبكة الإندوبلازمية ، مما يؤدي إلى محول إشارة ثابت ومنشط فسفرة النسخ 5 (STAT5). تؤدي هذه التعديلات الجينية إلى توليد اللوكيميات من خلال آليات متعددة للأورام ، بشكل أساسي من خلال خلل تنظيم نقل الإشارة ، والإشارات التكاثرية غير المنضبطة ، ومقاومة موت الخلايا المبرمج3.

AC220 و gilteritinib ، كمثبطات نموذجية ل FLT3 ، تمنع تكاثر الخلايا وتحفز موت الخلايا المبرمج عن طريق قمع تعبير FLT3 ، ولكن بآليات عمل مختلفة. لا يغطي Gilteritinib (مثبط من النوع الأول) مجموعة واسعة من الطفرات المنشطة ل FLT3 فحسب ، بل يمنع أيضا AXL tyrosine kinase ، والذي يرتبط ارتباطا وثيقا ب FLT3. من خلال التثبيط المزدوج ، يمكن أن يمنع gilteritinib نمو الخلايا السرطانية بشكل أكثر شمولا4. يمارس AC220 (مثبط من النوع الثاني) تأثيره المثبط من خلال الارتباط التنافسي بتشكل كيناز المنشط ، ويستهدف على وجه التحديد جيب ربط ATP بخصوصية عالية5. قد يؤدي هذا التثبيط إلى اعتقال دورة الخلية وزيادة إجهاد تكرار الحمض النووي.

يرتبط جيلتريتينيب بانخفاض خطر المقاومة ويشار إليه للعلاج الأحادي في ابيضاض الدم النقوي الحافر FLT3 الانتكاسي / المقاوم للحرارة. يعتبر AC220 فعالا وانتقائيا لطفرات FLT3-ITD ، مع معدلات استجابة سريرية جيدة ، ولكنه غير فعال لطفرات FLT3-TKD ، وقد يكون مقاوما لطفرات FLT3-TKD بسبب طفرات FLT3-TKD الثانوية (على سبيل المثال ، D835 أو F691L) لتطوير المقاومة. اكتسبت هذه المثبطات مكانة بارزة في علاجات ابيضاض الدم النقوي الحاد بناء على الفعالية السريرية المثبتة والمؤشرات العلاجية المحسنة6. ومع ذلك ، فإن الاستخدام السريري لهذه الأدوية يواجه تحديا من خلال المقاومة المكتسبة والآثار غير المستهدفة. يؤدي الاستخدام طويل الأمد ل AC220 في العيادة إلى المقاومة بسبب طفرات FLT3-TKD ، في حين أن الاستخدام طويل الأمد ل gilteritinib قد يكون له قيود على الطفرات المركبة (على سبيل المثال ، FLT3-ITD جنبا إلى جنب مع TKD) حتى لو لم ينتج عنه مقاومة بسبب طفرات FLT3-TKD7،8.

تمارس هاتان الفئتان من مثبطات FLT3 تأثيرا علاجيا مزدوجا عن طريق إحداث إجهاد تكاثري بشكل غير مباشر من خلال تثبيط FLT3 وحصار مسار الإشارات التكاثرية - إشارات RAS-MAPK و PI3K-AKT-MTOR و STAT5. عادة ما يؤدي حصار تكاثر الخلايا إلى توقف دورة الخلية ، واضطرابات التمثيل الغذائي (خلل تنظيم توازن الأكسدة والاختزال )، وفي النهاية إلى موت الخلايا المبرمج9،10. تولد هذه الآلية في النهاية آفات الحمض النووي التي تنشط تكيفات إصلاح الحمض النووي التعويضية في مجموعات الخلايا المقاومة. يتيح فحص المذنب المقارنة الكمية لملامح تلف الحمض النووي الخاصة بالمثبط في الخلايا الطافرة FLT3. يوفر هذا النهج التجريبي رؤى مهمة لتطوير علاجات مركبة عقلانية تستغل نقاط الضعف في تلف الحمض النووي ، وبالتالي التغلب على المقاومة العلاجية المكتسبة.

تشمل المنهجيات المعاصرة للكشف عن تلف الحمض النووي التحليل الكيميائي المناعي ، والرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز لشظايا الحمض النووي ، وتفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) ، وتسلسل الجيل التالي (NGS) ، كل منها يظهر حساسية تحليلية عالية وخصوصية11. ومع ذلك ، فإن هذه الأساليب مقيدة بمتطلبات مالية كبيرة ، ومدد معالجة طويلة ، وشروط تجريبية صارمة. وهذا يؤكد على ضرورة اعتماد استراتيجيات الكشف التي توازن بين الدقة التحليلية والبساطة التشغيلية.

تم استخدام مقايسة المذنب على نطاق واسع في علم السموم البيئية وتقييم السمية الجينية نظرا لحساسيته الفائقة ، وإمكانية الوصول التقني ، والقياس الكمي لتلف الحمض النووي المرئي ، وقابليته للتطبيق الواسع عبر الأنظمة البيولوجية12،13. تم إنشاء ثلاثة متغيرات منهجية رئيسية: مقايسة المذنب القلوي للكشف عن كسر الخيط الفردي / المزدوج ، ومقايسة المذنب المحايد لتحليل كسر الخيط المزدوج ، ومقايسة المذنب المعدل بالإنزيم لتحديد آفة الحمض النووي المحددة. 14

يتضمن المبدأ المنهجي: (1) تحريض خيط الحمض النووي يخترق العلاج التجريبي. (2) التحلل المخزن المؤقت للذوبان الأغشية الخلوية والنووية ، مما يسمح بانتشار البروتين السيتوبلازمي / النووي والحمض النووي الريبي في المخزن المؤقت للرحلان الكهربائي ، بينما يظل الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي مجمدا في مصفوفة الاغاروز ؛ (3) التمسخ القلوي (الرقم الهيدروجيني > 13) مما يؤدي إلى فك الحمض النووي وتحرير شظايا الحمض النووي التالفة ؛ (4) الهجرة الأنودية المدفوعة بالمجال الكهربائي للحمض النووي المجزأ مما يخلق مورفولوجيا مميزة للمذنب ، مع احتفاظ الحمض النووي السليم ببنية نووية كروية15،16. يتم تحقيق القياس الكمي لتلف الحمض النووي من خلال التحليل المحوسب لنسبة الحمض النووي للذيل (TDP) ، مما يوفر قياسا دقيقا للتأثير السام للجينات بدقة الخلية الواحدة17.

استخدم هذا التحقيق إطارا تجريبيا منهجيا لمقارنة التأثيرات السامة الجينية التفاضلية ل gilteritinib و AC220 في خلايا FLT3 المتحولة 32D التي تم التحقق من صحتها. يتألف التصميم التجريبي من مكونين رئيسيين: (أنا) إنشاء نموذج تلف الحمض النووي الخاص بطفرة FLT3 ، و (ثانيا) التقييم الكمي لتلف الحمض النووي الناجم عن المخدرات من خلال منهجية فحص المذنب القلوي. تم الحفاظ على خط الخلايا 32D المتحولة FLT3 في ظل ظروف قياسية في المختبر قبل التعرض لمثبطات FLT3 المخففة بشكل متسلسل. تم تقييم الجدوى الخلوية باستخدام فحوصات CCK-8 ، مع الحساب اللاحق لقيم التركيز المثبط النصف الأقصى (IC50) من خلال تحليل الانحدار غير الخطي. تم اختيار قيمة IC50 بخمسة أضعاف كعتبة تحريض تلف الحمض النووي. تم حصاد الخلايا المعالجة بالعقاقير ودمجها في أغاروز منخفض نقطة الانصهار على الشرائح لتحليلها لاحقا. تم إجراء الفصل الكهربائي عند 24 فولت (~ 0.74 فولت / سم) و 300 مللي أمبير لمدة 30 دقيقة في المخزن المؤقت القلوي ، حيث هاجر الحمض النووي المجزأ بشكل أنودي لتشكيل مورفولوجيا المذنب المميزة ، بينما احتفظ الحمض النووي السليم بتكوين النواة الكروية. تم تحقيق القياس الكمي لتلف الحمض النووي من خلال مشروع برمجيات فحص المذنب المحوسب لتحليل الصور (CASP) لقياس لحظة الذيل ، مع زيادة قيم عزم ذيل الزيتون المرتبطة ارتباطا مباشرا بمدى تجزئة الحمض النووي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. بناء نموذج تلف الحمض النووي في خلايا 32D مع طفرات FLT3-ITD 18

  1. استعادة الخلايا
    1. باستخدام الملقط ، قم بنقل خلايا FLT3-ITD الطافرة 32D المحفوظة بالتبريد بسرعة (مخزنة عند -80 درجة مئوية). استرجع المبردات باستخدام الملقط واغمرها على الفور في حمام مائي منظم لدرجة الحرارة (37 درجة مئوية ± 0.5 درجة مئوية) لمدة 60 ثانية على وجه التحديد لإكمال الذوبان المتحكم فيه.
      ملاحظة: أثناء الذوبان ، قم بهز التبريد بشكل متقطع في الحمام المائي لضمان تسخين موحد.
    2. قم بالطرد المركزي للعينات المحفوظة بالتبريد عند 150 × جم لمدة 5 دقائق عند 25 درجة مئوية ± 1 درجة مئوية. استنشق المادة الطافية بعناية باستخدام ماصات مصلية معقمة مع الاحتفاظ بالحبيبات الخلوية.
    3. أضف 1 مل من وسط النمو الكامل (RPMI 1640 + 10٪ مصل أبقار الجنين + 1٪ بنسلين / ستربتومايسين) إلى أنبوب الحفظ بالتبريد. قم بإجراء عملية سحب لطيفة من خلال 10 دورات سحب متسلسلة (حجم 1 مل) لضمان إعادة التعليق الكامل. انقل معلق الخلية إلى طبق زراعة الخلايا 100 مم وأضف 7 مل من الوسط الكامل لتحقيق حجم نهائي يبلغ 8 مل.
    4. قم بتحريك وعاء الاستزراع برفق بخمس حركات أفقية وخمس حركات دورانية. حافظ على الخلايا في حاضنة مرطبة عند 37.0 درجة مئوية ± 0.2 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 و 95٪ رطوبة. احتضان لمدة 24 ساعة قبل المعالجة التجريبية.
  2. تقييم صلاحية الخلية
    1. حدد خلايا FLT3-ITD 32D الطافرة في مرحلة النمو اللوغاريتمي مع حالة خلوية جيدة للتجربة.
      ملاحظة: عادة ما يكون للخلايا في مرحلة النمو اللوغاريتمي دورة انقسام قصيرة وتكرار عال لانقسام الخلايا.
      1. راقب مورفولوجيا وحالة نمو الخلايا 32D المتحولة ب FLT3-ITD باستخدام مجهر إلكتروني. تأكد من استيفاء معايير عتبات التكاثر الخلوي: ابحث عن خلايا che التي تكون على شكل كريات واحدة ذات حواف ناعمة ، وتشتت موحد ، وعدد قليل من الركام ، وحجم الخلية الموحد ، وسلامة غشاء البلازما السليمة ، والحطام الخلوي < 5٪.
    2. استخدم عداد الخلية لتحديد تركيز تعليق الخلية.
      ملاحظة: امزج معلقات الخلايا (10 دورات سحب متسلسلة باستخدام أطراف معقمة سعة 1 مل بسرعة قصوى للماصة بنسبة 50٪).
    3. قم بتوحيد تعليق الخلية إلى 2.0 × 105 خلايا / مل في وسط النمو الكامل باستخدام التخفيف التكراري. باستخدام ماصة ، قم بتوزيع 50 ميكرولتر من الاقتباس في الآبار المركزية (B2-G7) للوحة ذات قاع مسطح 96 بئرا. املأ الآبار الطرفية (A1-H12) ب 100 ميكرولتر من PBS المعقمة للحفاظ على الرطوبة وتقليل تأثيرات تبخر الحافة.
    4. تحضير الوسط المحتوي على مثبطات FLT3: حدد تسعة آبار في لوحة زراعة خلوية مكونة من 12 بئرا وقم بتسميتها وفقا لسلم تركيز مثبط FLT3 (0 ، 3.90625 ، 7.8125 ، 15.625 ، 31.25 ، 62.5 ، 125 ، 250 ، 500 ، و 1000 نانومتر). أضف 400 ميكرولتر من الوسط الكامل إلى الآبار المسماة 10.0 ميكرومتر و 200 ميكرولتر من الوسط الكامل إلى الآبار المتبقية.
      1. تخفيف جيلتريتينيب: أضف 4 ميكرولتر من كاشف جيلتيريتينيب 100 ميكرومتر (جيلتريتينيب في ثنائي ميثيل سلفوكسيد) إلى كل بئر من الآبار المسماة 1000 نانومتر باستخدام مسدس ماصة واخلط المحلول جيدا. ماصة 200 ميكرولتر من 1000 نانومتر جيلتريتينيب في الآبار المسمى 500 نانومتر واخلطها ؛ ثم ماصة 200 ميكرولتر من 500 نانومتر جيلتريتينيب في الآبار المسماة 250 نانومتر واخلطها. في كل مرة ، خذ 200 ميكرولتر من التخفيف السابق في البئر التالي واخلطه لتحقيق التركيز المطلوب.
      2. تخفيف AC220: أضف 4 ميكرولتر من كاشف AC220 100 ميكرومتر (AC220 في ثنائي ميثيل سلفوكسيد) إلى كل بئر من الآبار المسمى 1000 نانومتر باستخدام مسدس ماصة. اتبع الخطوة 1.2.4.1 للآبار الأخرى.
        ملاحظة: تأكد من نقل محلول مخزون مثبط FLT3 في الماصة بالكامل إلى الآبار لتجنب المحلول المتبقي. تأكد من خلط المحلول جيدا قبل الشروع في التخفيف.
    5. الحضانة: توزيع الوسائط المحتوية على مثبط FLT3 في آبار معينة (50 ميكرولتر / بئر) باستخدام ماصة. حافظ على اللوحة المكونة من 96 بئرا في ظل ظروف الاستزراع الفسيولوجي (37.0 درجة مئوية ± 0.2 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 ، 95٪ رطوبة) لمدة 72 ساعة ± 15 دقيقة بدقة.
    6. Aliquot 10 ميكرولتر من كاشف CCK-8 لجميع آبار التحكم التجريبية والفارغة باستخدام ماصة. احم اللوحة من الضوء واحتضنها في ظروف طبيعية (37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2) لمدة 2.0 ساعة ± 10 دقائق.
      ملاحظة: قم بتوزيع الكاشف بسرعة ماصة منخفضة بعمق غمر طرف 2 مم لتقليل تكوين الفقاعات. تجنب فقاعات الهواء أثناء إضافة العينة لمنع التداخل مع قراءات OD.
    7. قم بإزالة اللوحة ذات 96 بئرا من الحاضنة وقم بقياس الامتصاص عند 450 نانومتر باستخدام قارئ صفيحة دقيقة. سجل النتائج.
    8. احسب النسبة المئوية للتثبيط وفقا لمعادلة حساب IC50 :
      تثبيط (٪) = figure-protocol-1 × 100٪
      يشير الدواء التجريبي جيدا إلى آبار الخلايا المعالجة بالدواء. يشير التحكم في الخلية جيدا إلى آبار الخلايا التي لم يتم علاجها بالدواء. تشير آبار التحكم الفارغة إلى وسط فقط بدون خلايا.
    9. تحليل بيانات استجابة الجرعة الطبيعية من خلال الانحدار غير الخطي ، باستخدام نموذج لوجستي من أربعة معلمات. انقر فوق الزر Fitting Curve لتركيب المنحنى. اشتقاق التركيز المثبط النصف الأقصى (IC50) من تقارب النموذج (R2 > 0.98 ، المجموع المتبقي للمربعات < 0.15) وحساب فترات الثقة 95٪ من خلال إعادة تشكيل التمهيد 1000 تكرار.
  3. تجربة تلف الحمض النووي لخلايا 32D مع طفرة FLT3-ITD الناجمة عن مثبط FLT3
    1. حدد خلايا FLT3-ITD 32D الطافرة التي تظهر طفرة في النمو (وقت مضاعفة السكان < 24 ساعة) لتقييم تلف الحمض النووي.
    2. عد الخلايا (راجع الخطوة 1.2.2 للحصول على التفاصيل).
    3. بذر الخلايا: اضبط كثافة معلق الخلية إلى 1 × 106 خلايا لكل طبق ، باستخدام طبق قطره 6 سم و 4 مل من معلق الخلية لكل طبق.
    4. قم بإعداد ثلاث نسخ مكررة لكل تركيز مثبط: 55 نانومتر جيلتريتينيب: 4 مل من الوسط + 2.2 ميكرولتر من مخزون 100 ميكرومتر ، 0.15 نانومتر AC220: 4 مل من الوسط + 6 ميكرولتر من مخزون 100 نانومتر. دوامة - امزج المحاليل ووازنها عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة ؛ رج الأنابيب برفق لضمان الخلط الكافي. استنشق الوسط الأصلي واستبدله ب 4 مل / طبق من الوسط المحتوي على مثبطات طازجة باستخدام ماصات مصلية معقمة.
    5. احتضان الخلايا المعالجة في ظل ظروف فسيولوجية (37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 ، 95٪ رطوبة) لفترات محددة (0 ، 2 ، 4 ، 6 ساعات). معالجة ضوابط الوقت صفر على الفور لتقييم تلف الحمض النووي الأساسي.
    6. مقايسة استبعاد التربان الأزرق
      1. جهاز طرد مركزي للخلايا التي تم جمعها عند 150 × جم لمدة 1 دقيقة. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا ب 1 مل من وسط الاستزراع.
      2. قم بإضافة 100 ميكرولتر من الخلايا المعلقة في أنبوب طرد مركزي بلاستيكي ، أضف 100 ميكرولتر من صبغة التربان الزرقاء (2x) ، واخلطها برفق ، وصمة عار لمدة 3 دقائق.
      3. عد الخلايا (راجع الخطوة 1.2.2 للحصول على التفاصيل).
      4. احسب صلاحية الخلية على النحو التالي:
        ٪ بقاء الخلية = figure-protocol-2 × 100٪
        ملاحظة: تمت معالجة العينات ذات الجدوى ≥90٪ فقط لمقايسة المذنب.

2. تحضير الكاشف وإعداد عينة الخلية

  1. قم بموازنة محلول التحلل (يحتوي على 2.5 M NaCl ، 100 mM EDTA ، 10 ملي تريس ، درجة الحموضة 10 ، 1٪ Triton X-100 ، 10٪ DMSO) عند 4 درجات مئوية ± 0.5 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة باستخدام الثلاجة.
  2. قم بإذابة الاغاروز منخفض الذوبان (LMA) عند 95 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة ، ثم احتفظ به في حمام مائي عند 37 درجة مئوية لمنع التصلب.
  3. قم بإعداد المخزن المؤقت للرحلان الكهربائي القلوي (300 ملي هيدروكسيد الصوديوم ، 1 ملي مولار EDTA ، الرقم الهيدروجيني >13) بوزن 12 جم من هيدروكسيد الصوديوم باستخدام ميزان إلكتروني ، وسحب 2 مل من محلول 500 ملي مولار EDTA ، ثم إضافة ddH2O لتكوين ما يصل إلى 1 لتر من المخزن المؤقت.
  4. حصاد الخلايا
    1. اجمع تعليق الخلية في أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل. قم بالطرد المركزي معلقات الخلية عند 800 × جم لمدة 5 دقائق. استنشاق المواد الطافية باستخدام الترشيح الفراغي.
      1. أعد تعليق الخلايا برفق في 1 مل من الوسط الكامل باستخدام أطراف ماصة عريضة التجويف سعة 1 مل ، متبوعة ب 10 انعكاسات رأسية.
      2. عد الخلايا كما في الخطوة 1.2.
      3. قم بالطرد المركزي لتعليق الخلية في أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل عند 150 × جم لمدة 5 دقائق لإزالة الوسط الكامل. أعد تعليق الخلايا المغسولة في PBS الخالي من الكالسيوم إلى ~ 5.0 × 105 خلايا / مل.

3. إجراء فحص المذنب

  1. قم بإعداد شرائح فحص المذنب وعينات الخلايا مسبقا. قم بإعداد خليط 10: 1 (حجم/حجمي) من LMA agarose ومعلق الخلية (5 × 105 خلايا/مل) في أنابيب سعة 1.5 مل باستخدام ماصة واخلطها برفق. قم بتوزيع 55 ميكرولتر من خليط خلايا الاغاروز على شرائح المذنب باستخدام ماصة مثبتة بزاوية 45 درجة، مع الحفاظ على مسافة 2 مم من سطح الشريحة. ضع الشرائح المغطاة بالخليط على حرارة 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة لتجنب الضوء.
    ملاحظة: أثناء إضافة LMA وخليط الخلية إلى شرائح فحص المذنب ، قم بتوزيع المعلق ببطء وبشكل متساو لمنع تكوين الفقاعات وضمان توزيع الجل المتجانس.
  2. اغمر الشرائح الصلبة في محلول تحلل مبرد مسبقا (يحتوي على 2.5 M NaCl ، 100 ملي EDTA ، 10 ملي مولار تريس ، درجة الحموضة 10 ، 1٪ Triton X-100 ، 10٪ DMSO) وقم بإجراء التحلل لمدة ≥1 ساعة عند 4 درجات مئوية في ظل ظروف محمية من الضوء.
  3. بعد التحلل ، قم بإزالة الشريحة من المحلل واستخدم مسدس الماصة لامتصاص أكبر قدر ممكن من السوائل حول المجداف. ثم ضع الشريحة في مخزن مؤقت للرحلان الكهربائي القلوي (300 ملي هيدروكسيد الصوديوم ، 1 ملي مولار EDTA ، الرقم الهيدروجيني >13) والتوازن المسبق لمدة ساعة واحدة عند 4 درجات مئوية ، مع الحرص على تجنب الضوء.
  4. الرحلان الكهربائي: ضع الشرائح في غرفة الرحلان الكهربائي وأضف محلول الرحلان الكهربائي القلوي الكافي لغمر الشرائح. قم بإجراء الرحلان الكهربائي عند 24 فولت (ما يعادل 0.74 فولت / سم) بتيار ثابت (300 مللي أمبير) لمدة 30 دقيقة باستخدام مخزن مؤقت متوازن مسبقا (4 درجات مئوية) لتقليل تلف الحمض النووي.
  5. التحييد: بعد الرحلان الكهربائي ، استخدم مسدس ماصة لشفط محلول الرحلان الكهربائي القلوي من الشريحة ، واغمر الشرائح لمدة 2 × 5 دقائق في dH2O ، ثم اغمرها في 70٪ إيثانول لمدة 5 دقائق. جفف الشرائح في حاضنة على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
  6. تلطيخ: ضع 100 ميكرولتر من صبغة الحمض النووي 1x YeaRed لكل بئر واحتضنه لمدة 30 دقيقة في درجة الحرارة المحيطة في ظل ظروف محمية من الضوء. قم بإزالة البقع الزائدة عن طريق الشطف المائي اللطيف متبوعا بالتجفيف الحراري عند 37 درجة مئوية.
  7. التصوير: قم بإجراء تصور مضان باستخدام مجهر مضان مزود بهدف 4x ، مع الحصول على الصور الرقمية في ظل ظروف التعرض القياسية.

4. معالجة البيانات

  1. قم بإجراء تحليل كمي للصور لتحديد معلمات المذنب القياسية ، بما في ذلك الحمض النووي للذيل (٪) ، ولحظة ذيل الزيتون ، وطول الذيل (ميكرومتر).
    1. افتح واجهة البرنامج (الشكل 5).
    2. قم باستيراد صورة إلى البرنامج ، وانقر فوق ملف ، ثم انقر فوق تحديد ملف لاستيراد الصورة التي تريد تحليلها إلى البرنامج. بعد ذلك ، اضغط باستمرار على زر الماوس واسحب حتى يظهر مربع أزرق. اسحب المربع الأزرق للتأكد من أن الخلية التي تريد تحليلها محاطة بالمربع. يمكن استخدام خيار الضبط في الشكل لضبط موضع الإطار ليشمل الخلية بأكملها (الشكل 5).
    3. قبل بدء التحليل، انقر على ابدأ، ثم انقر على تحليل. سيتم عرض نتائج تحليل الخلية المفردة على الجانب الأيمن ضمن "الملفات الشخصية". بعد تحليل كل خلية، انقر فوق حفظ. يتم عرض المعلمات التي يمكن اكتشافها على الجانب الأيمن من "الملفات الشخصية" ، ويتم عرض القيم العددية للمعلمات المختلفة في الأسفل. أخيرا ، انقر فوق ملف | تصدير النتائج. تشمل النتائج التي تم الحصول عليها HeadArea و TailArea و HeadDNA و TailDNA و HeadDNA و TailDNA و HeadRadius و TailLength و CometLength و HeadMeanX و TailMeanX و TailMoment و OliveTailMoment.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

تم استخدام مقايسة المذنب بشكل منهجي لتحديد ملامح تلف الحمض النووي التفاضلية الناجمة عن gilteritinib و AC220 في خطوط الخلايا المتحولة FLT3. أظهرت التحليلات أن الفرق في تلف الحمض النووي بين مجموعات الخلايا غير المعالجة ب gilteritinib و AC220 لم يكن ذا دلالة إحصائية (P > 0.05). حققت الزيادات المعتمدة على الجرعة في قيم الحمض النووي للذيل (٪) وذيل لحظة الزيتون (OMT) دلالة إحصائية (P < 0.05) بعد التعرض لمدة 2-6 ساعات. يمثل OMT ناتج النسبة المئوية للحمض النووي في الذيل و "المسافة بين مركز ثقل مضان الرأس والذيل". تشير الاخ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يمثل مقايسة المذنب تقدما كبيرا في منهجيات تقييم السمية الجينية. توفر هذه التقنية مزايا مميزة مقارنة بالأساليب التقليدية من خلال إمكانية الوصول التقني ، ودقة الخلية الواحدة ، والتصور المباشر لأنماط الضرر عبر ملفات تعريف الهجرة الكهربية. في التطوير العلاجي ل AML ، يتيح فحص المذنب التقييم المنهجي للملامح السامة للوراثة للعوامل المرشحة خلال مراحل التحقق من الصحة المستهدفة ، مما يوفر بيانات دوائية مهمة لتحسين ما قبل السريري19،20.

...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين تضارب في المصالح للإفصاح عنها.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل من قبل فريق البحث المبتكر للعلوم والتكنولوجيا التابع لمؤسسة جيانغسو للتعليم العالي (2021) ، وبرنامج مركز أبحاث تكنولوجيا الهندسة في كلية جيانغسو المهنية (2023) ، وبرنامج العلوم والتكنولوجيا الطبية والصحية في مقاطعة تشجيانغ (2025KY1861) ، ومؤسسة العلوم الطبيعية الرئيسية لمؤسسات التعليم العالي في جيانغسو في الصين (المنحة رقم 24KJA310008) ، وبرامج كلية سوتشو للصحة المهنية (رقم المنحة. SZWZYTD202201 ، szwzy202406) ، ومشروع مختبر الدولة الرئيسي للطب الإشعاعي والحماية ، جامعة سوشو (GZK12023013).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
0.5 متر EDTAبيوتايمالمعيار ST066
1x صبغة الحمض النووي YeaRedياسين10202 إس
خلية 32DكوبيورCBP60995
تيار متردد 220الهدف مولتي 2066
طقم عد الخلايا -8دوجيندوCK04
لوحة عد الخلاياتشيوجينغإكس بي ك 25
حاضنة ثاني أكسيد الكربون 2< / sub>الحراريه51032872
مشروع برمجيات فحص المذنب (CASP)
طقم فحص المذنب   ؛تريفيجن4250-050-ك
سيتيشن 5بيوتيك16280004
FBSعمومالمعيار ST30-3302
جيلتريتينيبالهدف مولتي 4409
GraphPad بريزم 9.0
جهاز طرد مركزي عالي السرعةالحراريه  9سؤال2861
ماصات L-1000XLS +مطرين17014382
ماصات L-20XLS +مطرين17014392
خزان النيتروجين السائلمفيكريوجياردة -175-216
Multiskan FC microplate photometerالحراريه1410101
Na2OHداماو1588
برنامج تلفزيونيسولاربيوص 1020
محلول البنسلين والستربتومايسين، 100xبيوتايمج0222
RPMI 1640 متوسطجيبكوC22400500BT
مجهر الخلايا الحية ثلاثي العينينموتيك1.1001 [إ+12]
فريزر بدرجة حرارة منخفضة للغايةهيرV118574

المراجع

  1. Swaminathan, M., Wang, E. S. Novel therapies for AML: A round-up for clinicians. Expert Rev Clin Pharmacol. 13 (12), 1389-1400 (2020).
  2. Daver, N., Schlenk, R. F., Russell, N. H., Levis, M. J. Targeting flt3 mutations in AML: Review of current knowledge and evidence. Leukemia. 33 (2), 299-312 (2019).
  3. Papaemmanuil, E., et al. Genomic classification and prognosis in acute myeloid leukemia. N Engl J Med. 374 (23), 2209-2221 (2016).
  4. Mori, M., et al. a FLT3/AXL inhibitor, shows antileukemic activity in mouse models of FLT3-mutated acute myeloid leukemia. Invest New Drugs. 35 (5), 556-565 (2017).
  5. Papaemmanuil, E., Döhner, H., Campbell, P. J. Genomic classification in acute myeloid leukemia. N Engl J Med. 375 (9), 900-901 (2016).
  6. Cortes, J. Quizartinib: A potent and selective FLT3 inhibitor for the treatment of patients with FLT3-ITD-positive AML. J Hematol Oncol. 17 (1), 111(2024).
  7. Döhner, H., Wei, A. H., Löwenberg, B. Towards precision medicine for AML. Nat Rev Clin Oncol. 18 (9), 577-590 (2021).
  8. Kantarjian, H., et al. Acute myeloid leukemia: Current progress and future directions. Blood Cancer J. 11 (2), 41(2021).
  9. Miyamoto, K., Minami, Y. Cutting edge molecular therapy for acute myeloid leukemia. Int J Mol Sci. 21 (14), (2020).
  10. Yang, X., Wang, J. Precision therapy for acute myeloid leukemia. J Hematol Oncol. 11 (1), 3(2018).
  11. Jackson, S. P., Bartek, J. The DNA-damage response in human biology and disease. Nature. 461 (7267), 1071-1078 (2009).
  12. Olive, P. L., Banáth, J. P. The comet assay: A method to measure DNA damage in individual cells. Nat Protoc. 1 (1), 23-29 (2006).
  13. Collins, A. R. The comet assay for DNA damage and repair: Principles, applications, and limitations. Mol Biotechnol. 26 (3), 249-261 (2004).
  14. Azqueta, A., et al. Technical recommendations to perform the alkaline standard and enzyme-modified comet assay in human biomonitoring studies. Mutat Res Genet Toxicol Environ Mutagen. 843, 24-32 (2019).
  15. Cotelle, S., Férard, J. F. Comet assay in genetic ecotoxicology: A review. Environ Mol Mutagen. 34 (4), 246-255 (1999).
  16. Tice, R. R., et al. Single cell gel/comet assay: Guidelines for in vitro and in vivo genetic toxicology testing. Environ Mol Mutagen. 35 (3), 206-221 (2000).
  17. Pu, X., Wang, Z., Klaunig, J. E. Alkaline comet assay for assessing DNA damage in individual cells. Curr Protoc Toxicol. 65, 3.12.11-13.12.11 (2015).
  18. Liu, S. B., et al. Impact of flt3-itd length on prognosis of acute myeloid leukemia. Haematologica. 104 (1), e9-e12 (2019).
  19. Wang, Y., Lin, X., Wang, Y., Wang, G. Synergistic effect of adavosertib and fimepinostat on acute myeloid leukemia cells by enhancing the induction of DNA damage. Invest New Drugs. 42 (1), 70-79 (2024).
  20. Kumar, S., Yedjou, C. G., Tchounwou, P. B. Arsenic trioxide induces oxidative stress, DNA damage, and mitochondrial pathway of apoptosis in human leukemia (hl-60) cells. J Exp Clin Cancer Res. 33 (1), 42(2014).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

FLT3

مقالات ذات صلة