مقالة منهجية

مسبار التهجين المنفصل باستخدام أبتامر إضاءة فلورسنت للحمض النووي كمراسل إشارة لتحليل الحمض النووي الخاص بالتسلسل

DOI:

10.3791/68483

⸱

يوليو 8, 2025

 ,  , 
1Chemistry Department, University of Central Florida

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يحدد هذا البروتوكول تصميم مجسات التهجين المنقسمة باستخدام أبتامر الإضاءة الفلورية DAP-10-42 كمراسل إشارة وتطبيقها للكشف عن الحمض النووي والتمايز بين الأهداف ذات بدائل أحادية النيوكليوتيدات.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعتبر أجهزة التسخين الفلورية القائمة على الحمض النووي (FLAPs) واعدة للمقايسات التحليلية الحيوية لأنها توفر قراءة إشارة فلورية منخفضة التكلفة دون الحاجة إلى وضع علامات على مبلغي إشارة الحمض النووي باستخدام الفلوروفورات و / أو التبريد ، على عكس مجسات التهجين التقليدية المستخدمة للكشف الفوري عن الحمض النووي. بدلا من ذلك ، ترتبط FLAPs بشكل غير تساهمي روابط الصبغة ، والتي تظهر مضان منخفض جوهريا في المحاليل المائية ، ولكنها تنبعث منها بشكل كبير عند ربط FLAP. يصف هذا البروتوكول خوارزمية لتصميم مستشعرات أبتامر منقسمة (SLASs) باستخدام DAP-10-42 ، وهو أكثر أجهزة استشعار الحمض النووي كفاءة التي تم الإبلاغ عنها حتى الآن. عندما تكون مجهزة بتسلسلات الحمض النووي المكملة لهدف الحمض النووي ذي الأهمية ، تعد SLAS أداة واعدة لتحليل الحمض النووي تسمح بالكشف الخاص بالتسلسل لأهداف الحمض النووي مع الانتقائية وصولا إلى نيوكليوتيد واحد لتمكين تحليل بدائل النوكليوتيدات المفردة (SNSs). توفر SLASs ميزة قراءة الإشارة المستندة إلى التألق الخالية من الملصقات ، والتي يمكن قياسها باستخدام مقياس الطيف الضوئي الفلوري التقليدي القائم على الكوفيت ، أو مقياس الفلور المحمول ، أو ملاحظتها بصريا عند الإثارة باستخدام مصدر ضوء محمول باليد. يعد نهج SLAS مفيدا لتطبيقات الاستشعار الحيوي في تشخيص الأمراض والمراقبة البيئية والبحوث الجزيئية الحيوية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم إجراء تحليل الحمض النووي باستخدام مجسات التهجين بشكل روتيني لاكتشاف وتحديد تسلسل DNA / RNA المحدد1. أحد أنجح مجسات التهجين هو مسبار المنارة الجزيئية (MB) ، وهو عبارة عن حمض نووي على شكل دبوس شعر
قليل النوكليوتيد المسمى بالفلوروفور والمروي في الطرف المعاكس2،3. يكتشف على الفور (دون الحاجة إلى غسل مركب المسبار المستهدف من فائض المسبار) وجود تسلسل حمض نووي مكمل لجزء حلقة المسبار ويستخدم بشكل شائع في تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR). وتؤدي الحاجة إلى ربط صبغتين تساهميا - الفلوروفور والمروي - بتسلسل قليل النوكليوتيدات للمسبار إلى زيادة التكلفة، ....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. تصميم مستشعر Aptamer المنفصل (SLAS) مع DAP-10-42 كمراسل إشارة

  1. تصميم تسلسل اثنين من خيوط قليل النوكليوتيدات غير المعدلة للحمض النووي التي تشكل SLAS. استخدم جزءا يحتوي على النيوكليوتيدات (nts) 4،6-39 من DAP-10-42 (الجدول 1 ، الشكل 1 أ).
  2. قم بتحويل تسلسل الجذع 1 (nts 1-8 و 36-42) إلى الجذع 1 'عن طريق إزالة بقايا الثايمين المنتفخة في الموضع nt 5 ، وتقصير الجذع إلى 4 نقاط أساس (nts 4،6-8 و 36-39) ، وإضافة طرف CG bp (الشكل 1 أ ، الخطوة 1). بالإضافة إلى ذلك ، يحتوي أحد خيوط SLAS على nts 9-29 من التسلسل الأساسي DAP-10-42 ، بينما يحتوي خيط SLAS آخر على nts 30-3....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم إثبات أداء SLAS باستخدام نواة DAP-10-42 كمراسل إشارة باستخدام مسبار مصمم لاستجواب جزء من الجين NANOGP8 المهم لتطور الورم الأرومي الدبقي متعدد الأشكال (GBM) ، وهو شكل عدواني من سرطان الدماغ21. تم الإبلاغ عن احتواء هذا الجزء على SNSs في شحنة الحمض النووي للإكسوسومات المشتقة من الخلاياالسرطانية 22. لذلك ، تم تصميم SLAS لموقع SNS للجين. تم استخدام أهداف الحمض النووي الاصطناعية M أو MM التي تحاكي تسلسل الجين NANOGP8 الذي يحتوي على G أو C في.......

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في البروتوكول المبلغ عنه ، تشمل الخطوات الحاسمة (1) تصميم SLAS. (ثانيا) درجة حرارة الفحص ؛ (3) وجود كاتيونات فلزية أحادية وثنائية التكافؤ (K + و Mg2+) ؛ (رابعا) تركيزات خيوط SLAS.

تصميم SLAS
عند تصميم خيوط SLAS ، من المهم مراعاة الاستقرار الديناميكي الحراري للمجمعات التي تشكلها خيوط SLAS-S و SLAS-U في حالة عدم وجود أهداف ، وفي وجود هدف محدد أو غير محدد (إذا كانت هناك حاجة إلى تمايز SNS). يمكن تعديل استقرار مركب SLAS-S .......

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تحظى الأموال من مكتب UCF للأبحاث الجامعية (OUR) ل AK بتقدير كبير. يتم دعم العمل على تحسين ظروف LATE-PCR للجين NANOGP8 من قبل صندوق فلوريدا للابتكار في السرطان (منحة MOABC).

....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
أورامين أوMP Biomedicals 195064صبغة فلوروجينية تستخدم للإبلاغ عن الإشارات
كاري كسوف فلورومترأجيلينت تكنولوجيزجي 9800 ألقياس إشارة الفلورسنت للعينات
ثنائي ميثي سلفوكسيدMP Biomedicals 196055مذيب لإعداد محاليل مخزون Auramine O
قليل النوكليوتيدات DNA (الاشعال ، خيوط SLAS ، قالب اصطناعي ل PCR)IDTغير متاححسب الطلب ومحلى من قبل البائع ، ويستخدم دون مزيد من التنقية
مزيج dNTP ، 10 مليثيرموفيشر العلميةر0191لتفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل المتأخر
كلوريد المغنيسيومإنفيتروجينAM9530Gمكون عازلة مطلوب للارتباط الصحيح لخيوط المسبار بالهدف الذي تم تحليله
أنابيب الطرد المركزي الدقيقة (1.5 مل)فيشربراند02-681-320بلاستيك لتحضير العينة
الماصة الدقيقة (0.1-2.5 µ L)إيبيندورفK56877Gتستخدم لإعداد العينة
الماصة الدقيقة (100-1000 µ L)إيبيندورفK13160Fتستخدم لإعداد العينة
الماصة الدقيقة (20-200 µ L)إيبيندورفJ05253Mتستخدم لإعداد العينة
ماصة دقيقة (2-20 µ L)إيبيندورفG24675Gتستخدم لإعداد العينة
جهاز طرد مركزي صغيركورنينج 6770تستخدم لتدوير العينات   ؛
مياه خالية من النوكلياز (غير معالجة ب DEPC)ثيرموفيشر العلميةطراز AM9932استخدم للعينات في فحص PCR و SLAS
أنابيب PCR (0.5 مل)إنفيتروجينطراز AM9932لقياس التألق باستخدام مقياس فلور Quantus
نصائح ماصة (20-200 & micro; L)VWR76322-150بلاستيك لتحضير العينة
أطراف الماصة (1-10 uL)VWR76322-528بلاستيك لتحضير العينة
كلوريد البوتاسيوم   ؛إنفيتروجينAM9640Gمكون عازلة مطلوب للطي الصحيح لمجال أبتامر الفلورسنت المضيء للمسبار
مقياس الفلورومتر الكميبروميجاE6150مقياس فلورومتر محمول منخفض التكلفة يمكن استخدامه لقياسات التألق
كوفيت الكوارتزستارنا16.50F-Q-10/Z15لاستخدامها لقياس التألق باستخدام مقياس الفلور Cary Eclipse
بوليميراز Taq DNA مع Taq Buffer القياسينيو إنجلاند بيولابسطراز M0273Sلتضخيم جزء الجين المراد تحليله باستخدام مقايسة SLAS   ؛
المخزن المؤقت Tris-HCl (الرقم الهيدروجيني 7.4)بوسطن بيو برودكتسآر -314مكون المخزن المؤقت
مصباح الأشعة فوق البنفسجيةالأشعة فوق البنفسجية95-0016-14لإثارة AO لمراقبة الإشارات المرئية
خلاط دوامةVWR10153-838تستخدم لخلط العينات

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wetmur, J. G. DNA Probes: Applications of the principles of nucleic acid hybridization. Crit Rev Biochem Mol Biol. 26 (3-4), 227-259 (1991).
  2. Tyagi, S., Kramer, F. Molecular Beacons: Probes that Fluoresce upon Hybridization. Nat Biotechnol. 14

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Split Hybridization ProbeDNA Light Up AptamerSequence Specific DetectionNucleic Acid AnalysisLabel Free FluorescenceSingle Nucleotide SubstitutionFluorescent SpectrophotometerPortable FluorometerMelting Temperature AnalysisTarget Binding Duplex

مقالات ذات صلة