مقالة منهجية

مسبار التهجين المنفصل باستخدام أبتامر إضاءة فلورسنت للحمض النووي كمراسل إشارة لتحليل الحمض النووي الخاص بالتسلسل

DOI:

10.3791/68483

⸱

يوليو 8, 2025

 ,  , 
1Chemistry Department, University of Central Florida

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يحدد هذا البروتوكول تصميم مجسات التهجين المنقسمة باستخدام أبتامر الإضاءة الفلورية DAP-10-42 كمراسل إشارة وتطبيقها للكشف عن الحمض النووي والتمايز بين الأهداف ذات بدائل أحادية النيوكليوتيدات.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعتبر أجهزة التسخين الفلورية القائمة على الحمض النووي (FLAPs) واعدة للمقايسات التحليلية الحيوية لأنها توفر قراءة إشارة فلورية منخفضة التكلفة دون الحاجة إلى وضع علامات على مبلغي إشارة الحمض النووي باستخدام الفلوروفورات و / أو التبريد ، على عكس مجسات التهجين التقليدية المستخدمة للكشف الفوري عن الحمض النووي. بدلا من ذلك ، ترتبط FLAPs بشكل غير تساهمي روابط الصبغة ، والتي تظهر مضان منخفض جوهريا في المحاليل المائية ، ولكنها تنبعث منها بشكل كبير عند ربط FLAP. يصف هذا البروتوكول خوارزمية لتصميم مستشعرات أبتامر منقسمة (SLASs) باستخدام DAP-10-42 ، وهو أكثر أجهزة استشعار الحمض النووي كفاءة التي تم الإبلاغ عنها حتى الآن. عندما تكون مجهزة بتسلسلات الحمض النووي المكملة لهدف الحمض النووي ذي الأهمية ، تعد SLAS أداة واعدة لتحليل الحمض النووي تسمح بالكشف الخاص بالتسلسل لأهداف الحمض النووي مع الانتقائية وصولا إلى نيوكليوتيد واحد لتمكين تحليل بدائل النوكليوتيدات المفردة (SNSs). توفر SLASs ميزة قراءة الإشارة المستندة إلى التألق الخالية من الملصقات ، والتي يمكن قياسها باستخدام مقياس الطيف الضوئي الفلوري التقليدي القائم على الكوفيت ، أو مقياس الفلور المحمول ، أو ملاحظتها بصريا عند الإثارة باستخدام مصدر ضوء محمول باليد. يعد نهج SLAS مفيدا لتطبيقات الاستشعار الحيوي في تشخيص الأمراض والمراقبة البيئية والبحوث الجزيئية الحيوية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم إجراء تحليل الحمض النووي باستخدام مجسات التهجين بشكل روتيني لاكتشاف وتحديد تسلسل DNA / RNA المحدد1. أحد أنجح مجسات التهجين هو مسبار المنارة الجزيئية (MB) ، وهو عبارة عن حمض نووي على شكل دبوس شعر
قليل النوكليوتيد المسمى بالفلوروفور والمروي في الطرف المعاكس2،3. يكتشف على الفور (دون الحاجة إلى غسل مركب المسبار المستهدف من فائض المسبار) وجود تسلسل حمض نووي مكمل لجزء حلقة المسبار ويستخدم بشكل شائع في تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR). وتؤدي الحاجة إلى ربط صبغتين تساهميا - الفلوروفور والمروي - بتسلسل قليل النوكليوتيدات للمسبار إلى زيادة التكلفة، خاصة عندما تكون هناك حاجة إلى مسبار جديد من الميغابايت يستهدف تسلسلا جديدا للحمض النووي. بدلا من ذلك ، يمكن استخدام مسبار MB كمراسل إشارة في تنسيق مسبار تهجين متعدد المكونات (مقسم) ، حيث يتفاعل اثنان من قليل النوكليوتيدات غير المسمى مع كل من الهدف ومراسل مسبار MB4. يعزز نهج المسبار متعدد المكونات الانتقائية للتعرف على الحمض النووي ويحسن ارتباط المسبار بالأهداف المنظمة5،6،7 ، ومع ذلك ، لا يلغي هذا النهج الحاجة إلى وضع العلامات التساهمية للمراسل باستخدام الفلوروفور8.

الأبتاميرات الفلورية المضيئة (FLAPs)9 هي أبتامرات لها صلة بالأصباغ الحساسة للبيئة منخفضة الفلورسنت (الفلوروجينات) ، حيث يعزز الارتباط بواسطة FLAP مضان مشعب الفلوروجين. على عكس المجسات ومراسلي الإشارات المصنفين بالفلورسنت ، لا تتطلب FLAPs عناصر الاستشعار ليتم تصنيفها تساهميا بصبغة واحدة أو أكثر ، وبالتالي توفر ميزة الكشف عن التألق الخالي منالملصقات 10. هذا مهم بشكل خاص أثناء خطوة التحسين عندما تحتاج العشرات من تركيبات الحمض النووي إلى الاختبار لتحقيق أداء فحص مرض. علاوة على ذلك ، يمكن تحسين فحوصات FLAP عن طريق ضبط تركيز مستشعر الفلوروجين و / أو FLAP بدلا من تغيير تصميم المستشعر. يمكن أن تكون هذه المزايا كبيرة لمختبرات البحث والتدريس منخفضة الميزانية. تعتبر FLAPs للحمض النووي واعدة بشكل خاص كمراسلين للإشارة لمجسات التهجين متعددة المكونات المشار إليها باسم مستشعرات أبتامر الانقسام (SLASs) 11. أكثر أنواع الحمض النووي FLAP التي تم الإبلاغ عنها حتى الآن هي DAP-10-42 ، والتي تم اختيارها في الأصل لتعزيز مضان أصباغ دابوكسيل سلفونيل12 ، مع قدرة مختلطة على ربط وتعزيز مضان مجموعة متنوعة من أصباغ أريل ميثان (على سبيل المثال ، الأورامين O ، AO ؛ البنفسجي البلوري ، السيرة الذاتية) 13. تم تحويل DAP-10-42 إلى SLAS لاستخدامها في تحليل الحمضالنووي 13،14،15.

الهدف من الطريقة الموضحة هنا هو تمكين التحليل الخاص بالتسلسل لأهداف الحمض النووي ذات الأهمية باستخدام خيوط SLAS الخالية من الملصقات والصبغة الفلورية كمكون عازل. يصف هذا البروتوكول خوارزمية لتصميم SLAS بناء على DAP-10-42 ويسلط الضوء على أداء SLAS للكشف الانتقائي للغاية عن تسلسل الحمض النووي الذي يختلف في أقل من نيوكليوتيد واحد.

يتطلب اختبار الكشف عن الحمض النووي SLAS اثنين من قليل النوكليوتيدات غير المعدلة للحمض النووي يتم تصنيعه خصيصا واستخدامهما بتركيز نهائي من 0.5-1 ميكرومتر لتحقيق أقصى أداء. يستخدم البروتوكول الموصوف هنا صبغة Auramine O (AO) المتوفرة تجاريا كفلوروجين. يتراوح تركيز AO النهائي في الفحص من 1-10 ميكرومتر لضمان تعزيز مضان عالي في وجود هدف محدد من الحمض النووي فوق الفراغ (غياب الهدف ؛ الشكل التكميلي 1). المكونات الضرورية للمخزن المؤقت للفحص هي أيونات البوتاسيوم والمغنيسيوم (الشكل التكميلي 2). تعمل أيونات البوتاسيوم (1.25-40 مليمتر) على استقرار مجال G-quadruplex المقترح ل FLAP المستخدم كمراسل إشارة. تقلل أيونات المغنيسيوم (2.5-50 مليمتر) من تنافر مجموعات الفوسفات سالبة الشحنة عند التفاعلات المستهدفة SLAS. وينبغي ألا تتجاوز درجة حرارة مقايسة SLAS باستخدام التتابعات المبلغ عنها لمجال الإبلاغ عن الإشارة 28 درجة مئوية لتجنب فقدان الأداء16.

SLAS متوافق مع أهداف الحمض النووي أحادية الشريطة ، مثل أمبليكونات الحمض النووي ل PCR غير المتماثل أو تفاعل تضخيم الحمض النووي متساوي الحرارة (على سبيل المثال ، تضخيم بوليميراز إعادة الإدماجية ، RPA17) ، منتجات الحمض النووي الريبي من التضخيم بوساطة النسخ (TMA) أو التضخيم القائم على تسلسل الحمض النووي (NASBA) 18 ، وجزيئات الحمض النووي الريبي الأصلية مثل miRNA أو rRNA أو ncRNA). يمكن اكتشاف الاختلافات في تسلسل النيوكليوتيدات للهدف وصولا إلى نيوكليوتيد واحد باستخدام نهج SLAS13،14.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. تصميم مستشعر Aptamer المنفصل (SLAS) مع DAP-10-42 كمراسل إشارة

  1. تصميم تسلسل اثنين من خيوط قليل النوكليوتيدات غير المعدلة للحمض النووي التي تشكل SLAS. استخدم جزءا يحتوي على النيوكليوتيدات (nts) 4،6-39 من DAP-10-42 (الجدول 1 ، الشكل 1 أ).
  2. قم بتحويل تسلسل الجذع 1 (nts 1-8 و 36-42) إلى الجذع 1 'عن طريق إزالة بقايا الثايمين المنتفخة في الموضع nt 5 ، وتقصير الجذع إلى 4 نقاط أساس (nts 4،6-8 و 36-39) ، وإضافة طرف CG bp (الشكل 1 أ ، الخطوة 1). بالإضافة إلى ذلك ، يحتوي أحد خيوط SLAS على nts 9-29 من التسلسل الأساسي DAP-10-42 ، بينما يحتوي خيط SLAS آخر على nts 30-35 من التسلسل.
  3. قم بتمديد التسلسل الطرفي 3 'للجزء الذي يحتوي على nts 9-29 مع d (GGTCAT) ، والتسلسل الطرفي 5 'لجزء nts 30-35 مع d (ATGACC) لتشكيل جذع 6 نقاط أساس 2 (الشكل 1 أ ، الخطوة 2).
    ملاحظة: الأزواج الأساسية T4-A39 و A6-T38 و C7-G37 و G8-C36 من الجذع 1 في DAP-10-42 مطلوبة لوظيفة الإضاءة الخاصة ب aptamer. لا يمكن تعديل تسلسل الجذع 1 'إلا في BP الطرفي ويمكن أن يكون زوجا أساسيا GC ، A-T ، T-A أو ممتددا مع 1-2 أزواج أساسية حسب الحاجة. تسلسل الجذع 2 تعسفي ويمكن تغييره. ومع ذلك ، يوصى بالحفاظ على الاستقرار الديناميكي الحراري للجذع 2 ما لم يتم رفع درجة حرارة الفحص فوق 28 درجة مئوية. يمنع تقصير الجذع 2 أو مزعزعة الاستقرار المبكر ارتباط الصبغة بدون هدف إذا لوحظت خلفية عالية لمقايسة الفلورسنت القائمة على SLAS. يسمح أيضا بتقسيم تسلسل النيوكليوتيدات DAP-10-42 بين nts 28-29 أو 27-28 أو 26-27 بدلا من nts 29-30 (الشكل 1 ب).
  4. لتخصيص SLAS المصمم لهدف أو اهتمام الحمض النووي ، قم بتمديد الجذع 1 'مع تسلسل الحمض النووي المكمل لشظايا ربط الهدف المستهدف (الأذرع) من خلال روابط d (TT) (الشكل 1 أ ، الخطوة 3). ينتج عن هذا تسلسل الخيوط SLAS-U و SLAS-S التي تشكل المسبار.
  5. اجعل ذراع ربط الهدف ل SLAS-S مكملا لجزء 7-10-nt من الهدف الذي يحتوي على موقع SNS ، وذراع ربط الهدف ل SLAS-U - مكملا لجزء 15-25 nt من الهدف المجاور لذراع ربط الهدف ل SLAS-S (الجدول 1).
    ملاحظة: من الاختياري توصيل ذراع ربط الهدف ل SLAS-S ب nt 4 أو nt 39 من تسلسل DAP-10-42 (الشكل 1 ، الذراع 1 أو الذراع 2 ، على التوالي).
  6. تقييم درجة حرارة الانصهار (Tm) للدوبلكس بين الهدف محل الاهتمام وأذرع ربط الهدف في SLAS-S و SLAS-U باستخدام خادم الويب UNAFold (unafold.org)19.
    1. انقر فوق علامة التبويب DINAMelt أعلى صفحة الويب ؛ انتقل إلى التطبيقات وحدد تهجين ذوبان حالتين (الشكل التكميلي 3 أ). في صفحة تهجين الذوبان ثنائي الحالة ، أدخل أحد التسلسلات المتفاعلة في المربع الأيسر والآخر في المربع الأيمن (الشكل التكميلي 3 ب). تأكد من أن كلا التسلسلين بترتيب من 5 إلى 3. يمكنك إدخال أكثر من زوج من التسلسلات المتفاعلة عن طريق فصلها بفواصل منقوطة.
    2. في أسفل الصفحة ، حدد درجة حرارة الفحص (22 درجة مئوية) ، وتركيزات الكاتيون أحادي التكافؤ والتكافؤ (20 ملي مولار و 25 ملي مولار ، على التوالي) لتتناسب مع ظروف الفحص. حدد تركيز التسلسلات المتفاعلة.
    3. اضغط على إرسال (الشكل التكميلي 3 ب). لاحظ النتائج التي تتضمن تغير طاقة جيبس ، وتغير المحتوى الحراري ، وتغيير الانتروبيا للارتباط ، بالإضافة إلى قيم Tm للطباعة على الوجهين المقابلة (الشكل التكميلي 3 ب).
    4. تأكد من أن قيم Tm للإرسال على الوجهين بين الهدف المتطابق تماما (M) وأذرع ربط الهدف ل SLAS-S و SLAS-U أعلى من درجة حرارة الفحص ، وهي 22 درجة مئوية في البروتوكول الحالي. هنا ، كانت قيم Tm 32.2 درجة مئوية و 74.4 درجة مئوية ، على التوالي (الشكل التكميلي 3C).
    5. تأكد من أن الإرسال ثنائي الإتجاه بين SLAS-S والهدف غير المتطابق (MM) الذي يحتوي على SNS يحتوي على Tm أقل من درجة حرارة المقايسة. هذا يضمن انتقائية عالية للتعرف على هدف المسبار ، مما يمنع فلوروجين AO من الإشارة إلى وجود تحليل الحمض النووي المستهدف إذا كان يحتوي على SNS في جزء ربط SLAS (الشكل 2). هنا ، كانت درجة حرارة Tm 21.3 درجة مئوية (الشكل التكميلي 3C) ، وهو ما كان كافيا للتمييز بين عدم التطابق والمركب المتطابق.
    6. اضبط تسلسل الأذرع المربدة للهدف عن طريق تقصير أو تمديد الشظايا التكميلية للهدف ، إذا لزم الأمر ، لتلبية متطلبات الاستقرار المشار إليها.
  7. احصل على الخيوط المصممة SLAS-S و SLAS-U من أي بائع تجاري يزود قليل النوكليوتيدات الحمض النووي المصنوعة حسب الطلب أو قم بتصنيع خيوط الحمض النووي داخليا باستخدام مركب قليل النوكليوتيدات الآلي.

figure-protocol-1
الشكل 1: تحويل أبتامر مضيء الفلورسنت (FLAP) DAP-10-42 إلى مستشعر أبتامر مضيء منقسم (SLAS). (أ)يتم التنبؤ بالهيكل الثانوي ل DAP-10-4212 من خلال تطبيق طي الحمض النووي لخادم الويب UNAFold19 عند 22 درجة مئوية ، 20 ملي مولار Na + ، 25 ملي مولار ملغ2+. يتميز أبتامر بهيكل ثانوي دبوس شعر مع قلب يفترض أنه يطوى في شكل G-quadruplex مثبت بواسطة الجذع 1. لكي يتم تحويل DAP-10-42 إلى SLAS ، يتم تقصير (1) الجذع 1 من aptamer إلى 4 نقطة أساس ويحيط به G-C bp إضافي لصنع الجذع 1 '؛ (2) يتم تقسيم التسلسل الأساسي بين NTs 29 و 30 ، مع تمديد الجانبين 3 'و 5' من موقع الانقسام بتسلسلات تكميلية d (GGTCAT) و d (ATGACC) ، على التوالي ، لصنع الجذع 2 ؛ (3) يتم تمديد الجذع 1 بالتسلسلات التكميلية للأجزاء المجاورة لهدف ذي أهمية - أذرع ربط الهدف ، مع رابط d (TT) بين أذرع ربط الهدف ومجال الإبلاغ عن الإشارة للمسبار. (ب) يمكن أيضا تقسيم النواة بين nts 28-29 أو 27-28 أو 26-27 دون فقدان كبير للإشارة و / أو زيادة أضعاف التألق. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-protocol-2
الشكل 2: آلية توليد إشارة SLAS. يتكون SLAS من خيطين - SLAS-U و SLAS-S - وصبغة فلورية (على سبيل المثال ، Auramine O ؛ AO). في حالة عدم وجود هدف للحمض النووي ذي أهمية ، يكون كلا الخيوط في حالة منفصلة وغير قادرين على ربط الصبغة. لم يتم ملاحظة أي إشارة (في الوسط). في وجود هدف متطابق تماما M ، يتم تهجين كل من SLAS-U و SLAS-S إلى الجزء المجاور من M لإحضار الأجزاء الأساسية على مقربة. هذا يسمح بتكوين موقع ربط الصبغة. يعزز ربط AO تألقها ، والذي يتم قياسه كقراءة إشارة فلورية (على اليسار). في حالة وجود MM مستهدف غير متطابق يحتوي على استبدال أحادي النوكليوتيدات (SNS) في جزء يتفاعل مع SLAS-S، يمكن فقط SLAS-You التهجين إلى هدف MM ، بينما SLAS-S في حالة الفصل. هذا يمنع تكوين موقع ربط الصبغة ، ولا يتم ملاحظة أي إشارة (يمين). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

2. تضخيم التسلسل المستهدف

  1. تضخيم جزء من الجين المراد تحليله باستخدام مقايسة SLAS. لتضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل أو RPA ، استخدم الظروف غير المتماثلة (على سبيل المثال ، مع إضافة التمهيدي الأمامي بمقدار 10 أضعاف على التمهيدي العكسي) لإنشاء مضخم أحادي الشريطة. لتضخيم جزء 126 nt من الجين NANOGP8 باستخدام Linear After The Exponential (LATE) PCR20 ، استخدم التسلسلات التمهيدية المدرجة في الجدول 2. هنا ، تم استخدام قالب DNA أحادي الشريطة (القالب NANOGP8 أو القالب G1423C ، الجدول 2) المقابل لجزء 126 nt من الجين. تم تصنيع القالب خصيصا بواسطة Integrated DNA Technologies، Inc.
    1. قم بإعداد تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل 100 ميكرولتر عن طريق خلط 10 ميكرولتر من 10 أضعاف المخزن المؤقت لتفاعل Taq القياسي ، و 2 ميكرولتر من مزيج dNTP 10 ملي مولار (للحصول على تركيز نهائي يبلغ 0.2 مللي مولار) ، و 10 ميكرولتر من التمهيدي الأمامي 10 ميكرومتر و 10 ميكرولتر من التمهيدي العكسي 1 ميكرومتر (للتركيز النهائي 1 ميكرومتر و 0.1 ميكرومتر ، على التوالي) ، 0.5 ميكرولتر من 5U / μL Taq DNA polymerase ، قالب DNA وماء خال من النوكلياز. لعنصر تحكم بدون قالب، أضف الماء بدلا من القالب.
    2. استخدم ظروف التدوير الحراري التالية: التمسخ الأولي عند 95 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة ؛ 45 دورة من (1) تمسخ عند 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية ، (2) تلدين أولي عند 60 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، (3) تمديد التمهيدي عند 68 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ؛ والتمديد النهائي عند 68 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
      ملاحظة: يمكن استخدام تقنيات التضخيم القائمة على النسخ مثل NASBA18 بدلا من تفاعل البوليميراز المتسلسل أو RPA ، خاصة إذا كان قالب الحمض النووي الريبي متاحا للتضخيم. يولد NASBA أمبليكون الحمض النووي الريبي أحادي الشريطة بتركيز المنتج النهائي في نطاق الميكرومولار ، وهو مرتفع بما يكفي لاستخدامه في مقايسة SLAS النهائية دون تركيز المنتج.
  2. قم بترسيب العينات المضخمة بالإيثانول عن طريق إضافة حجم 0.1x من أسيتات الصوديوم 3 M (درجة الحموضة 5.5) و 3x حجم من الإيثانول. احتضان عند -20 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة ، وجهاز الطرد المركزي عند 12,000-18,000 × جم لمدة 5 دقائق ، وتخلص من المادة الطافية.
  3. اغسل الحبيبات بنسبة 70٪ من الإيثانول ، وأعد الطرد المركزي ، وتخلص من المادة الطافية مرة أخرى. جفف الحبيبات في الهواء وتذوب في 10 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكلياز لاستخدامها في مقايسة SLAS.

3. مقايسة التألق باستخدام SLAS

  1. قم بإعداد محاليل مخزون من AO (0.1 ملي مولار في DMSO ، 10x) ، SLAS-S (10 ميكرومتر في الماء الخالي من النوكلياز ، 10x) ، SLAS-U (10 ميكرومتر في الماء الخالي من النوكلياز ، 10x) ، و 4x مخزن مؤقت للفحص (80 ملي مولار Tris-HCl ، درجة الحموضة 7.4 ، 100 ملي ملي MgCl2 ، 80 ملي كلوريد العقد).
    ملاحظة: أيونات البوتاسيوم ضرورية لتثبيت شكل G-quadruplex المفترض للأبتامر ، والذي يعد جزءا من موقع ربط الصبغة. أقل من 1 ملي مولار KCl (عند 25 ملي مولار MgCl2) في المخزن المؤقت للفحص 1x يكفي لضمان تعزيز التألق ~ 14 ضعفا في وجود الهدف المحدد M فوق العينة الفارغة (عينة بدون هدف ؛ الشكل التكميلي 2 ب). تعمل أيونات المغنيسيوم على استقرار تفاعلات خيوط الحمض النووي (بين SLAS-S و SLAS-U والهدف). يجب أن يكون تركيز Mg2+ في 1x Assay Buffer لا يقل عن 5 ملي مولار (عند 20 ملي مولار KCl; الشكل التكميلي 2 ج ، د). يتم تحضير محلول مخزون AO (~ 1 مليمتر) في DMSO. تركيزات مخزون SLAS-S و SLAS-U تعسفية ويمكن تعديلها إذا لزم الأمر طالما تم الحفاظ على التركيزات النهائية للخيوط (انظر الأساس المنطقي لاختيار التركيز النهائي ل SLAS في المناقشة).
    تنبيه: AO ضار إذا ابتلع ، وسام عند ملامسته للجلد ، ويشتبه في أنه يسبب السرطان. ارتد دائما القفازات عند العمل مع حلول AO. يجب أن يتم وزن AO وإعداد محاليل المخزون الخاصة به تحت الغطاء الكيميائي.
  2. قم بإعداد المزيج الرئيسي الذي يحتوي على جميع مكونات الفحص باستثناء الهدف. احسب حجم المزيج الرئيسي (مزيج V) بضرب حجم العينة (60 ميكرولتر) في عدد العينات زائد واحدة (n + 1):
    figure-protocol-3
    يجب أن يتضمن عدد العينات n الضوابط السلبية والإيجابية اللازمة.
  3. اجمع بينمزيج 0.25x V μL من 4x Assay Buffer ، ومزيج 0.1x V μL من 0.1 ملي مولار AO ، ومزيج 0.1x V μL من 10 ميكرومتر SLAS-S ، ومزيج 0.1x V μL من 10 ميكرومتر SLAS-S. أضف الماء الخالي من النوكلياز إلى الحجم figure-protocol-4 النهائي بحيث يستوعب الحجم المستهدف المضاف في الخطوة 3.4. دوامة ولفترة وجيزة الطرد المركزي المزيج الرئيسي. Aliquot 50 ميكرولتر من المزيج الرئيسي في n أنابيب عينة.
    ملاحظة: يمكن ضبط حجم العينة اعتمادا على خصائص الجهاز المستخدم لاكتشاف إشارة الفلورسنت. يمكن ضبط حجم المزيج الرئيسي الذي يتم تقسيسه في أنابيب العينة بناء على الحجم المستهدف المضاف في الخطوة 3.4. يجب تعديل حجم الماء الخالي من النوكلياز المضاف لصنع المزيج الرئيسي في المقابل. على سبيل المثال ، إذا تمت إضافة العينة المحتوية على الهدف بنسبة 10٪ (V / V) من حجم العينة النهائي ، فيجب إضافة الماء إلى المزيج الرئيسي حتى0.9x V.
  4. استخدم عينة واحدة كعنصر تحكم بدون هدف (فارغ) ، وعينة واحدة كعنصر تحكم إيجابي. أضف 10 ميكرولتر من العينة المحتوية على الهدف إلى المزيج الرئيسي (50 ميكرولتر) لجعل حجم العينة النهائي 60 ميكرولتر يحتوي على هدف 10-1000 نانومتر. بالنسبة للفراغ ، استخدم الماء الخالي من النوكلياز (10 ميكرولتر) بدلا من الهدف. للتحكم الإيجابي ، استخدم قليل النوكليوتيد الاصطناعي للحمض النووي يحتوي على التسلسل المستهدف (على سبيل المثال ، الهدف M ، الجدول 1). أضف 10 ميكرولتر من التحكم 0.6-3 ميكرومتر لجعل التركيز النهائي 0.1-0.5 ميكرومتر.
    ملاحظة: يضمن التألق العالي في عنصر التحكم الإيجابي هذا أن الفحص يعمل كما هو متوقع ، حتى إذا لوحظت إشارة سلبية للعينات غير المعروفة التي تم اختبارها.
  5. امزج العينات وقم بتدويرها باستخدام جهاز طرد مركزي دقيق. احتضان العينات عند 22 درجة مئوية لمدة 10-60 دقيقة. تزداد الإشارة بنسبة <15٪ فقط بين 40 دقيقة و 60 دقيقة (الشكل 3).
  6. قم بقياس تألق العينات عند 540 نانومتر عند الإثارة عند 475 نانومتر باستخدام مقياس الطيف الضوئي الفلوري.
    ملاحظة: من الممكن استخدام مقياس فلوري محمول يقيس التألق في أنابيب PCR رقيقة الجدران. يحتاج مقياس الفلور إلى مرشحات إثارة وانبعاث مناسبة للكشف عن مضان AO. مثال على مرشح الإثارة المناسب هو التمريرة القصيرة 495 نانومتر. مثال على مرشح الانبعاث المناسب هو 510-580 نانومتر. بدلا من ذلك ، يمكن ملاحظة الإشارة بصريا عند إثارة مضان AO في العينة باستخدام مصدر ضوء للأشعة فوق البنفسجية أو الأزرق.
    تنبيه: إذا تم استخدام مصباح الأشعة فوق البنفسجية ، فارتد نظارات واقية من الأشعة فوق البنفسجية.

figure-protocol-5
الشكل 3: الاعتماد الزمني لتوليد الإشارة ل SLAS-29U / 30S. تم تحليل عينة تحتوي على AO و SLAS-29U و SLAS-30S باستخدام وضع الحركية لمقياس الطيف الضوئي الفلوري (الإثارة عند 475 نانومتر ، الانبعاث عند 540 نانومتر ، شقوق الإثارة / الانبعاث 5 نانومتر) على مدى 60 دقيقة. في وقت 5 دقائق (يشار إليه بسهم) ، تمت إضافة الهدف M إلى العينة. تم حساب متوسط البيانات من تجربتين مستقلتين. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم إثبات أداء SLAS باستخدام نواة DAP-10-42 كمراسل إشارة باستخدام مسبار مصمم لاستجواب جزء من الجين NANOGP8 المهم لتطور الورم الأرومي الدبقي متعدد الأشكال (GBM) ، وهو شكل عدواني من سرطان الدماغ21. تم الإبلاغ عن احتواء هذا الجزء على SNSs في شحنة الحمض النووي للإكسوسومات المشتقة من الخلاياالسرطانية 22. لذلك ، تم تصميم SLAS لموقع SNS للجين. تم استخدام أهداف الحمض النووي الاصطناعية M أو MM التي تحاكي تسلسل الجين NANOGP8 الذي يحتوي على G أو C في...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في البروتوكول المبلغ عنه ، تشمل الخطوات الحاسمة (1) تصميم SLAS. (ثانيا) درجة حرارة الفحص ؛ (3) وجود كاتيونات فلزية أحادية وثنائية التكافؤ (K + و Mg2+) ؛ (رابعا) تركيزات خيوط SLAS.

تصميم SLAS
عند تصميم خيوط SLAS ، من المهم مراعاة الاستقرار الديناميكي الحراري للمجمعات التي تشكلها خيوط SLAS-S و SLAS-U في حالة عدم وجود أهداف ، وفي وجود هدف محدد أو غير محدد (إذا كانت هناك حاجة إلى تمايز SNS). يمكن تعديل استقرار مركب SLAS-S ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تحظى الأموال من مكتب UCF للأبحاث الجامعية (OUR) ل AK بتقدير كبير. يتم دعم العمل على تحسين ظروف LATE-PCR للجين NANOGP8 من قبل صندوق فلوريدا للابتكار في السرطان (منحة MOABC).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
أورامين أوMP Biomedicals 195064صبغة فلوروجينية تستخدم للإبلاغ عن الإشارات
كاري كسوف فلورومترأجيلينت تكنولوجيزجي 9800 ألقياس إشارة الفلورسنت للعينات
ثنائي ميثي سلفوكسيدMP Biomedicals 196055مذيب لإعداد محاليل مخزون Auramine O
قليل النوكليوتيدات DNA (الاشعال ، خيوط SLAS ، قالب اصطناعي ل PCR)IDTغير متاححسب الطلب ومحلى من قبل البائع ، ويستخدم دون مزيد من التنقية
مزيج dNTP ، 10 مليثيرموفيشر العلميةر0191لتفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل المتأخر
كلوريد المغنيسيومإنفيتروجينAM9530Gمكون عازلة مطلوب للارتباط الصحيح لخيوط المسبار بالهدف الذي تم تحليله
أنابيب الطرد المركزي الدقيقة (1.5 مل)فيشربراند02-681-320بلاستيك لتحضير العينة
الماصة الدقيقة (0.1-2.5 µ L)إيبيندورفK56877Gتستخدم لإعداد العينة
الماصة الدقيقة (100-1000 µ L)إيبيندورفK13160Fتستخدم لإعداد العينة
الماصة الدقيقة (20-200 µ L)إيبيندورفJ05253Mتستخدم لإعداد العينة
ماصة دقيقة (2-20 µ L)إيبيندورفG24675Gتستخدم لإعداد العينة
جهاز طرد مركزي صغيركورنينج 6770تستخدم لتدوير العينات   ؛
مياه خالية من النوكلياز (غير معالجة ب DEPC)ثيرموفيشر العلميةطراز AM9932استخدم للعينات في فحص PCR و SLAS
أنابيب PCR (0.5 مل)إنفيتروجينطراز AM9932لقياس التألق باستخدام مقياس فلور Quantus
نصائح ماصة (20-200 & micro; L)VWR76322-150بلاستيك لتحضير العينة
أطراف الماصة (1-10 uL)VWR76322-528بلاستيك لتحضير العينة
كلوريد البوتاسيوم   ؛إنفيتروجينAM9640Gمكون عازلة مطلوب للطي الصحيح لمجال أبتامر الفلورسنت المضيء للمسبار
مقياس الفلورومتر الكميبروميجاE6150مقياس فلورومتر محمول منخفض التكلفة يمكن استخدامه لقياسات التألق
كوفيت الكوارتزستارنا16.50F-Q-10/Z15لاستخدامها لقياس التألق باستخدام مقياس الفلور Cary Eclipse
بوليميراز Taq DNA مع Taq Buffer القياسينيو إنجلاند بيولابسطراز M0273Sلتضخيم جزء الجين المراد تحليله باستخدام مقايسة SLAS   ؛
المخزن المؤقت Tris-HCl (الرقم الهيدروجيني 7.4)بوسطن بيو برودكتسآر -314مكون المخزن المؤقت
مصباح الأشعة فوق البنفسجيةالأشعة فوق البنفسجية95-0016-14لإثارة AO لمراقبة الإشارات المرئية
خلاط دوامةVWR10153-838تستخدم لخلط العينات

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wetmur, J. G. DNA Probes: Applications of the principles of nucleic acid hybridization. Crit Rev Biochem Mol Biol. 26 (3-4), 227-259 (1991).
  2. Tyagi, S., Kramer, F. Molecular Beacons: Probes that Fluoresce upon Hybridization. Nat Biotechnol. 14, 303-308 (1996).
  3. Kolpashchikov, D. M. An elegant biosensor molecular beacon probe: challenges and recent solutions. Scientifica. 2012, 928783(2012).
  4. Kolpashchikov, D. M. A binary DNA probe for highly specific nucleic acid recognition. J Am Chem Soc. 128 (32), 10625-10628 (2006).
  5. Kolpashchikov, D. M. Binary probes for nucleic acid analysis. Chem Rev. 110 (8), 4709-4723 (2010).
  6. Stancescu, M., Fedotova, T. A., Hooyberghs, J., Balaeff, A., Kolpashchikov, D. M. Nonequilibrium hybridization enables discrimination of a point mutation within 5-40 C. J Am Chem Soc. 138 (41), 13465-13468 (2016).
  7. Gerasimova, Y. V., Kolpashchikov, D. M. Detection of bacterial 16S rRNA using a molecular beacon-based X sensor. Biosens Bioelectron. 41, 386-390 (2013).
  8. Gerasimova, Y. V., Hayson, A., Ballantyne, J., Kolpashchikov, D. M. A single molecular beacon probe is sufficient for the analysis of multiple nucleic acid sequences. Chembiochem. 11 (12), 1762-1768 (2010).
  9. Gao, T., Luo, Y., Cao, Y., Pei, R. Progress in the isolation of aptamers to light-up the dyes and the applications. Analyst. 145, 701-718 (2020).
  10. Du, Y., Li, B., Wang, E. "Fitting" makes "sensing" simple: Label-free detection strategies based on nucleic acid aptamers. Acc Chem Res. 46 (2), 203-213 (2013).
  11. Kolpashchikov, D. M., Spelkov, A. A. Binary (split) light-up aptameric sensors. Angew Chem Int Ed Engl. 60 (10), 4988-4999 (2021).
  12. Kato, T., Shimada, I., Kimura, R., Hyuga, M. Light-up fluorophore--DNA aptamer pair for label-free turn-on aptamer sensors. Chem Commun. 52 (21), 4041-4044 (2016).
  13. Connelly, R. P., Madalozzo, P. F., Mordeson, J. E., Pratt, A. D., Gerasimova, Y. V. Promiscuous dye binding by a light-up aptamer: Application for label-free multi-wavelength biosensing. Chem Commun. 57 (30), 3672-3675 (2021).
  14. Kikuchi, N., Reed, A., Gerasimova, Y. V., Kolpashchikov, D. M. Split dapoxyl aptamer for sequence-selective analysis of nucleic acid sequence based amplification amplicons. Anal Chem. 91 (4), 2667-2671 (2019).
  15. Wang, L., et al. MicroRNA detection in biologically relevant media using a split aptamer platform. Bioorg Med Chem. 69, 116909(2022).
  16. Gerasimova, Y. V., Nedorezova, D. D., Kolpashchikov, D. M. Split light up aptamers as a probing tool for nucleic acids. Methods. 197, 82-88 (2021).
  17. Daher, R. K., Stewart, G., Boissinot, M., Bergeron, M. G. Recombinase polymerase amplification for diagnostic applications. Clin Chem. 62, 947-958 (2016).
  18. Compton, J. Nucleic acid sequence-based amplification. Nature. 350, 91-92 (1991).
  19. Zuker, M. Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction. Nucleic Acids Res. 31, 3406-3415 (2003).
  20. Pierce, K. E., Sanchez, J. A., Rice, J. E., Wangh, L. J. Linear-after-the-exponential (LATE)-PCR: primer design criteria for high yields of specific single-stranded DNA and improved real-time detection. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 8609-8614 (2005).
  21. Grochans, S., et al. Epidemiology of glioblastoma multiforme-Literature review. Cancers. 14, 2412(2022).
  22. Vaidya, M., Bacchus, M., Sugaya, K. Differential sequences of exosomal NANOG DNA as a potential diagnostic cancer marker. PLoS One. 13, e0197782(2018).
  23. Owczarzy, R., Moreira, B. G., You, Y., Behlke, M. A., Walder, J. A. Predicting stability of DNA duplexes in solutions containing magnesium and monovalent cations. Biochemistry. 47, 5336-5353 (2008).
  24. Bhattacharyya, D., Arachchilage, G. M., Basu, S. Metal cations in G-quadruplex folding and stability. Front Chem. 4, 2296-2646 (2016).
  25. Chen, R. F. Fluorescence of free and protein-bound auramine O. Arch Biochem Biophys. 179 (2), 672-681 (1977).
  26. Klymchenko, A. S. Solvatochromic and fluorogenic dyes as environment-sensitive probes: Design and biological applications. Acc Chem Res. 50 (2), 366-375 (2017).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Split Hybridization ProbeDNA Light Up AptamerSequence Specific DetectionNucleic Acid AnalysisLabel Free FluorescenceSingle Nucleotide SubstitutionFluorescent SpectrophotometerPortable FluorometerMelting Temperature AnalysisTarget Binding Duplex

مقالات ذات صلة