مقالة منهجية

إطار تصوير متعدد الوسائط لتعزيز التنميط الظاهري لخلايا سرطان الثدي الحية الخالية من الملصقات

DOI:

10.3791/68498

⸱

أغسطس 22, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Mechanical Engineering, Massachusetts Institute of Technology, 2Laser Biomedical Research Center, G. R. Harrison Spectroscopy Laboratory, Massachusetts Institute of Technology, 3Department of Mechanical Engineering, Politecnico di Milano, 4Klarman Cell Observatory, Broad Institute of MIT and Harvard, 5Department of Molecular Biochemistry and Pharmacology, Istituto di Ricerche Farmacologiche Mario Negri IRCCS, 6Department of Biological Engineering, Massachusetts Institute of Technology

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يقدم هذا البروتوكول نهجا متعدد الوسائط يجمع بين التحليل الطيفي رامان والفحص المجهري للطور المقطعي للتنميط الظاهري الخالي من الملصقات وغير الغازية لخلايا سرطان الثدي البشرية الحية. يتضمن خط أنابيب تحليل سهل الاستخدام وخالي من التحيز البشري للتحليل الكيميائي المورفو الكمي السريع ، مما يوفر رؤى جزيئية وهيكلية مفصلة مع تطبيقات في أبحاث السرطان وبيولوجيا الخلية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نقدم التحليل الطيفي الدقيق متعدد البؤر رامان (RS) والفحص المجهري للطور المقطعي (TPM) للتنميط الظاهري الكيميائي المورفولوجي السريع لخلايا سرطان الثدي البشرية (MDA-MB-231). بالاستفادة من الطبيعة غير المضطربة لتقنيات الفحص المجهري المتقدمة هذه ، التقطنا بيانات مورفو جزيئية مفصلة من خلايا حية خالية من الملصقات في بيئتها الفسيولوجية الأصلية. تم تطوير خطوط أنابيب معالجة البيانات الخالية من التحيز البشري لتحليل صور رامان الفائقة الطيفية (التي تمتد على أوضاع رامان من 600 سم -1 إلى 1800 سم -1 ، والتي تميز بشكل فريد مجموعة واسعة من الروابط الجزيئية والهياكل تحت الخلوية) ، بالإضافة إلى البيانات المورفولوجية من التصوير المقطعي ثلاثي الأبعاد لمقطعي معامل الانكسار ثلاثي الأبعاد (توفير قياسات لحجم الخلية ، ومساحة السطح ، والبصمة ، والكروية بدقة نانومتر ، جنبا إلى جنب مع الكتلة الجافة والكثافة). من خلال التقسيم المنهجي للتفاصيل الغنية أحادية الخلية التي يقدمها RS و TPM ، نوضح ، بطريقة كمية ، ميزة طريقة الفحص المجهري متعددة الوسائط هذه للتنميط الظاهري لخلايا سرطان الثدي السرطانية. توفر أدواتنا أيضا مزيدا من التبصر حول المعلومات الخلوية دون استخدام أي ملصقات. أخيرا ، ندرس ونناقش أي معلومات فريدة أو مترابطة تتميز بها مجموعات البيانات المشتقة من RS و TPM. نعتقد أن أدواتنا وخطوط أنابيب تحليل البيانات الكمية يمكن أن تحدث ثورة في مهام التنميط الظاهري في البحوث الطبية الحيوية عندما نحتاج إلى طريقة سريعة وغير مضطربة على الخلايا الحية في الثقافة ، مع إمكانية الترجمة المستقبلية إلى التطبيقات السريرية والتشخيصية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعد توصيف الخلايا والتنميط الظاهري من الجوانب المحورية للبحوث الطبيةالحيوية 1. تعد القدرة على توصيف الخلايا على المستويين المورفولوجي والجزيئي أمرا بالغ الأهمية لفهم وظيفة الخلية والتمايز وعلم الأمراض1،2،3. إنه ذو أهمية خاصة في مجال الأورام ، حيث يكون التنميط الدقيق للخلايا ضروريا لتشخيص الورم ، وتحديد مرحلة المرض ، وتحديد الأهداف العلاجية في النهاية2. لا يمكن لطرق توصيف الخلايا التقليدية أن توفر ديناميكيات زمنية وعادة ما تستند إلى تقنيات غازية ، مثل التلوين أو وضع العلامات ، والتي قد تتداخل مع الحالة الأصلية للخلايا وتقدم تحيزات محتملة داخل البيانات4. لذلك ، يزداد الطلب على الاستراتيجيات غير الغازية لتوفير تنميط ظاهري دقيق وشامل للخلايا الحية ، في حالتها الأصلية غير المضطربة.

في هذا السياق ، أحدثت طرق التصوير متعدد الوسائط الخالية من الملصقات ثورة في أبحاث بيولوجيا الخلية من خلال الجمع بين الطرائق التكميلية لالتقاط كل من المعلومات المورفولوجية والجزيئية2،5. تسمح هذه الأساليب بالتوصيف المتكامل وغير الجراحي للخلايا التي قد لا تكون التقنيات التقليدية الفردية قادرة دائما علىتوفيرها 2،5،6. على سبيل المثال ، على الرغم من استخدام تقنيات الفحص المجهري مثل الفحص المجهري الفلوري على نطاق واسع في تصوير الخلايا المورفولوجية والوظيفية ، إلا أنها تمتلك قيودا متأصلة. غالبا ما تعاني طرق التألق من التبييض الضوئي ، والسمية الضوئية ، والكميات المنخفضة من الجزيئات القابلة للاستهداف ، مما يحد من الإمكاناتالتحليلية 4. بالإضافة إلى ذلك ، غالبا ما تتطلب هذه الأساليب استخدام ملصقات أو أصباغ خارجية ، والتي قد تعطل حالة الخلية الأصلية أو تؤدي إلى القطعالأثرية 7.

تتجاوز منصات التصوير متعدد الوسائط ، التي تجمع بين نقاط القوة في طرائق التصوير المتعددة ، هذه القيود من خلال تمكين الحصول على أنواع مختلفة من البيانات من الخلايا الحية دون الحاجة إلى وضع العلامات. كان دمج التحليل الطيفي رامان (RS) مع طرق التصوير الأخرى مثل الفحص المجهري لتباين الطور أو الفحص المجهري للطور المقطعي (TPM) استراتيجية واعدة للتغلب على قيود التقنيات الفردية. في الواقع ، يوفر التصوير متعدد الوسائط فهما أعمق للأنماط الظاهرية الخلوية ، خاصة في الظروف البيولوجية المعقدة والأمراض مثل السرطان ، حيث تكون الخصائص الجزيئية والهيكلية ضرورية للتوصيف الدقيق2،5.

RS الخالي من الملصقات مناسب تماما للتصوير الكيميائي للخلايا8. من خلال الكشف عن أوضاع الاهتزاز الجزيئي ، يوفر RS بصمات كيميائية حيوية يمكن أن تكشف عن معلومات متعمقة حول التركيب الجزيئي للخلايا9،10،11. تحتوي أطياف رامان المكتسبة من العينات البيولوجية على معلومات حول مجموعة متنوعة من الجزيئات الحيوية مثل الدهون والبروتينات والأحماض النووية والمستقلبات ، والتي تلعب أدوارا أساسية في فهم الطبيعة الجزيئية للخلايا9،12. تتمثل إحدى نقاط القوة الرئيسية في RS في أنها غير جراحية ، مما يسمح بتوصيف الخلايا الحية في حالتها الطبيعية دون تغيير حالتها الفسيولوجية.

على الرغم من مزاياها العديدة ، إلا أن RS تقدم أيضا بعض القيود. في الواقع ، على الرغم من أن RS يوفر معلومات جزيئية مفصلة ، إلا أنه لا يسمح بمعلومات كمية عن مورفولوجيا أو هيكل الخلايا2. هذا هو المكان الذي تلعب فيه تقنيات التصوير التكميلية مثل TPM دورا حاسما.

TPM هو شكل من أشكال تصوير الطور الكمي (QPI) 13،14 ، ويتيح تصور معلومات كمية عالية الدقة وخالية من الملصقات حول مورفولوجيا الخلية15،16. يختلف TPM عن تقنيات الفحص المجهري التقليدية في أنه لا يتطلب عوامل تباين. بدلا من ذلك ، يعمل عن طريق قياس تحولات الطور الناتجة عن الاختلافات في معامل الانكسار (RI) للعينة17. توفر تحولات الطور معلومات حول الخصائص الهيكلية للخلية ، بما في ذلك حجمها ومساحة سطحها وشكلها وهيكلهاالداخلي 2،18. يمكن أن تحقق TPM دقة مكانية عالية ، إلى مستوى النانومتر ، وبالتالي فهي تقنية مثالية لتسجيل التفاصيل المورفولوجية عالية الدقة للخلايا الحية. علاوة على ذلك ، فإن القدرة على إعادة بناء التصوير المقطعي ثلاثي الأبعاد RI تجعل من الممكن تصور الهياكل الخلوية في بيئة الجسم الحي18 ، مما يوفر معلومات أكثر دقة مقارنة بالإسقاطات ثنائية الأبعاد. ومع ذلك ، فإن أحد القيود الرئيسية ل TPM هو افتقاره إلى الخصوصية الكيميائية ، لأنه يوفر في المقام الأول معلومات عن مورفولوجيا الخلية وتوزيع الطور ، دون القدرة على التمييز بين المكونات الكيميائية المتميزة أو تحديد السمات الكيميائية الحيوية.

يوفر الجمع بين RS و TPM في تقنية متعددة الوسائط مزايا في التنميط الظاهري للخلايا. بينما يسمح RS بمعلومات جزيئية غنية ، يضيف TPM جانبا هيكليا ، مما يسمح بتحليل التشكل الخلوي بتفصيل كبير. في الآونة الأخيرة ، تم إثبات الجمع بين RS و TPM بنجاح في العديد من الدراسات التي ركزت على أبحاث السرطان2،19،20. على سبيل المثال ، أفادت أعمال سابقة أن التسجيل المشترك للتحليل الطيفي رامان مع بيانات الفحص المجهري للطور الثلاثي الأبعاد يمكن أن يوفر معلومات جزيئية وصرفولوجية تكميلية ، مما يسمح بالتمييز بين أنواع الخلايا المختلفة ومراحل تطورالورم 2. سلطت هذه التحقيقات الضوء على قوة التصوير متعدد الوسائط لتعزيز دقة التنميط الظاهري للخلايا ، لا سيما في سياق السرطان ، حيث ترتبط الخصائص الجزيئية والهيكلية للخلايا ارتباطا وثيقا بأورامها الخبيثة وسلوكها2،20.

على الرغم من التقدم الأخير في التصوير متعدد الوسائط ، لا تزال هناك تحديات يتعين معالجتها ، لا سيما في معالجة البياناتوتحليلها 21. يمكن أن تكون الكميات الكبيرة من البيانات التي تنتجها تقنيات التصوير متعدد الوسائط مرهقة لتحليلها ، ويجب استخدام إجراءات مباشرة لاستخراج معلومات ذات مغزى. لمواجهة هذا التحدي ، يجب إنشاء خطوط أنابيب معالجة بيانات سهلة الاستخدام للتعامل مع تعقيد البيانات وتقليل التحيز البشري في التحليل. وتعتبر خطوط الأنابيب هذه حاسمة لتحقيق دقة النتائج وقابليتها للتكرار وإمكانية ترجمة هذه الأساليب إلى تطبيقات سريرية وتشخيصية.

الهدف من العمل الحالي هو توضيح إمكانية دمج RS مع TPM من أجل التنميط الظاهري الخالي من الملصقات وعالي السرعة وغير المضطرب للخلايا السرطانية المفردة الحية. من خلال دمج هذين النهجين القويين للتصوير ، نقدم توصيفا شاملا وكميا للخصائص الجزيئية والمورفولوجية لخلايا سرطان الثدي البشرية (MDA-MB-231). يؤكد العمل أيضا على أهمية إنشاء خطوط أنابيب لمعالجة البيانات خالية من التحيز البشري لضمان أن المعلومات المستخرجة من مجموعات البيانات متعددة الوسائط صحيحة وموثوقة. هنا ، نسعى إلى إنشاء منصة قوية للتنميط الظاهري للخلايا السرطانية التي يمكن تعميمها على أنواع أخرى من الخلايا. إن تعدد استخدامات وحساسية هذا النهج يجعله مرشحا محتملا لمجموعة واسعة من التطبيقات الطبية الحيوية ، من دراسات بيولوجيا الخلية الأساسية إلى التشخيص.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. تحضير العينة

  1. قم بزرع خلايا MDA-MB-231 على أطباق الكوارتز بتري.
    1. لوحة MDA-MB-231 خلايا سرطان الثدي البشرية على أطباق بتري زجاجية كوارتز 3.5 سم.
    2. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في بيئة 5٪ CO2 حتى تلتصق بالكامل بالسطح (بعد 12 ساعة على الأقل من البذر).
  2. اغسل الخلايا واستعد للقياس.
    1. قم بإزالة وسط الثقافة من الخلايا بمجرد التصاقها بطبق بتري.
    2. اغسل الخلايا برفق باستخدام محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) لإزالة الوسط المتبقي.
    3. أضف وسط زراعة الخلايا الطازج وحافظ على الخلايا مغطاة بالوسط طوال إجراء القياس بأكمله لضمان استمراريتها.
      ملاحظة: كوسيط للاستزراع ، استخدمت هذه الدراسة DMEM / F-12 الخالي من الفينول الأحمر المكمل بمصل الأبقار الجنيني بنسبة 5٪ (FBS) والبنسلين (100 وحدة دولية / مل) - ستربتومايسين (100 ميكروغرام / مل).

2. نظام مجهر رامان عالي الإنتاجية

ملاحظة: تم وصف التفاصيل الفنية لمجهر رامان المصنوع منزليا المستخدم في العمل الحالي المتعلق بتصوير الخلايا الحية لخلايا MDA-MB-231 سابقا22. باختصار ، يتميز نظام مجهر رامان عالي الإنتاجية المستخدم خصيصا بليزر Ti-Sapphire 785 نانومتر يتم ضخه بواسطة ليزر 532 نانومتر (الشكل 1 أ). يقترن ليزر الإثارة رامان 785 نانومتر بجسم مجهر مضان مقلوب IX83 ، مع توجيه الإثارة إلى العينة من خلال هدف غمر الماء UPLSAPO60× 1.2 NA باستخدام مرآة ثنائية اللون 749 نانومتر. يقوم المستقطب بضبط متوسط طاقة الليزر في المنفذ الخلفي للمجهر. يتم تمكين التصوير في المجال الساطع عن طريق اقتران الضوء الأبيض بطريقة مماثلة. يقوم النظام بالتبديل بين وضعي Raman والمجال الساطع عن طريق تغيير المرشحات ثنائية اللون تلقائيا. يجمع النظام بين المسح الضوئي القائم على المرآة والمسح الضوئي المرحلي للحصول على تصوير عالي الإنتاجية. يتفاعل برنامج MATLAB النصي المخصص مع برنامج التحكم في المجهر مفتوح المصدر ، ولوحة الحصول على البيانات (DAQ) ، وأنظمة الكشف عن الإشارات لأتمتة عملية الحصول على البيانات. يتم جمع ضوء رامان المتناثر من خلال نفس الهدف ، بينما يتم ترشيح الضوء المرئي بواسطة مرآة ثنائية اللون 785 نانومتر وتوجيهها إلى مطياف NIR وكاشف جهاز مقترن بالشحن (CCD). يتيح هذا الإعداد التصوير متعدد الأبعاد ، والتقاط إشارات المجال الساطع ، والتألق ، ورامان عبر مواضع مختلفة ومداخن z2،22.

  1. إجراء تصوير رامان
    1. تحضير العينة والحفاظ على الظروف الفسيولوجية
      1. قم بتثبيت العينة في الحاضنة الموجودة على خشبة المسرح للحفاظ على الظروف الفسيولوجية. تأكد من ضبط الحاضنة على 37 درجة مئوية ، مع تنظيم التغذية الراجعة في الوقت الفعلي للتحكم في درجة الحرارة.
      2. حافظ على مستويات الرطوبة داخل الغرفة عند >95٪ باستخدام وحدة الحمام المحيطية الداخلية المملوءة بالماء المقطر. قم بإعداد وحدة التحكم في غاز CO2 لخلط 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 مع 95٪ هواء وتزويده بغرفة الحاضنة.
    2. الإدارة الآلية للغمر في الماء
      1. قم بتشغيل وحدة التغذية الآلية للغمر في الماء المصنوعة منزليا لتوفير الماء للعدسة الشيئية بمعدل تدفق يبلغ 2 ميكرولتر / دقيقة باستخدام مضخات الحقنة وإبر الحقنة الملصقة على الطرف الهدفي.
      2. تحقق بانتظام من مستويات المياه لتجنب التبخر وضمان ظروف تصوير متسقة طوال القياسات.
    3. الحصول على بيانات التحليل الطيفي رامان
      1. قم بتشغيل ليزر المضخة واضبط قوته للحصول على طاقة ليزر عند مستوى العينة 75 ميجاوات.
      2. افتح برنامج التحكم في المجهر مفتوح المصدر Micro-manager. في إعدادات التكوين، حدد BF وانقر فوق مباشر على الجانب الأيسر من نافذة البرنامج لتصور صورة المجال الساطع. حدد الخلية المفردة المطلوبة التي سيتم الحصول على طيف رامان منها. ثم انقر فوق إيقاف لإنهاء مرئيات المجال الساطع.
      3. اضبط إحداثيات Z لمستوى تصوير رامان عن طريق تعظيم عدد الإشارات على كاميرا CCD.
      4. للقيام بذلك ، افتح برنامج التحكم في كاميرا CCD (LightField) ؛ في إعداد التجربة، اضبط وقت التعريض الضوئي على 1.5 ثانية. ثم انقر فوق تشغيل على شريط أدوات التجربة ، وقم بتشغيل شعاع الليزر.
      5. بعد ذلك ، اضبط الموضع Z لزيادة عدد الإشارات في منطقة بصمات الأصابع من 600 سم -1 إلى 1800 سم -1 لتحسين تصور قمم رامان المرتبطة بالتوقيعات البيولوجية. ثم قم بإيقاف تشغيل الليزر وانقر فوق إيقاف في شريط التجربة لبرنامج كاميرا CCD ، واخرج من البرنامج.
        ملاحظة: لوحظ أن عدد إشارات رامان الكبير على كاميرا CCD يتوافق مع الموضع على طول المحور Z الذي يتزامن مع +8 ميكرومتر فيما يتعلق بمستوى التصوير الذي لا يظهر أي أثر لقمم رامان المرتبطة بالخلية ، بسبب سقوط بقعة بؤرية إلى حد ما داخل الكوارتز. قد تختلف هذه القيمة وفقا لنوع الخلية وحالتها.
    4. ابدأ عملية الحصول على البيانات باستخدام البرنامج النصي MATLAB ، والذي سيتعامل تلقائيا مع قنوات Raman في قياسات متعددة الأبعاد ويحفظ بيانات Raman الفائقة الطيفية.
    5. اضبط مجال الرؤية على 50 × 50 ميكرومتر2 ، 40 × 40 بكسل ، مع كل مساحة بكسل تتوافق مع 1.25 × 1.25 ميكرومتر2. اضبط وقت التعرض لكل طيف رامان يساوي 1.5 ثانية.
      ملاحظة: قم بإجراء معايرة الرقم الموجي بانتظام باستخدام عينات أسيتاميدوفينول للتعليق على قمم رامان المعروفة. معايرة محور إزاحة رامان من خلال الاستيفاء التربيعي.
      تنبيه: تعامل مع الليزر بعناية. استخدم دائما نظارات واقية مناسبة مصنفة للطول الموجي لليزر أثناء الإعداد والتشغيل.

3. تحليل بيانات RS

  1. خرائط رامان الفائقة الطيفية بعد العملية عبر أداة RamApp المستندة إلى الويب (https://ramapp.io/):
    1. قم بتسجيل الدخول إلى الأداة المستندة إلى الويب.
    2. استيراد البيانات الفائقة الطيفية. في علامة التبويب تحليلاتي ، انقر فوق جديد وقم بتحميل ملف .mat ، الذي يحتوي على متغير البيانات المكانية والطيفية ومتغير المحور x (أي قيم إزاحة رامان).
    3. لاقتطاع الطيف إلى المنطقة (المناطق) المحددة في إزاحة رامان ، في القائمة المنسدلة اقتصاص وتدويرها ، انقر فوق الاقتصاص الطيفي وحدد الحد السفلي والحد العلوي لمنطقة إزاحة رامان التي تساوي 600 سم -1 و 1800 سم -1 ، على التوالي.
      ملاحظة: من خلال إجراء اقتطاع الطيف هذا ، يتم استبعاد الذروة العريضة وعالية السعة المتعلقة بمادة الكوارتز لطبق بتري من التحليل.
    4. لتصحيح أطياف رامان للأشعة الكونية ، ضمن خيارات تقليل الضوضاء ، انقر فوق Despike ، وحدد Z-score كطريقة ، واضبط العتبة تساوي 8.
      ملاحظة: تساعد وظيفة المعالجة المسبقة Despike على معالجة مشكلة وحدات البكسل التي تحتوي على طفرات في إشارتها ، والتي تنتج عن الأشعة الكونية.
    5. حدد الخيار استخدم الفرق الأول للعثور على القيم المتطرفة باستخدام الفرق المنفصل الأول للشدة على طول الطيف ، وحدد الخيار تصحيح الارتفاعات. سيتم استبدال طيف كل بكسل تالف بمتوسط الطيف لوحدات البكسل المجاورة له.
    6. انقر فوق تشغيل لتصحيح الارتفاعات.
    7. لإزالة التشويش من الخرائط المقابلة لكل رقم موجي، ضمن خيارات تقليل الضوضاء ، انقر فوق Smooth Map (خريطة ناعمة)، وحدد مرشح Median، واضبط حجم جانب المربع الذي يتم أخذه في الاعتبار عند تطبيق الفلتر على كل بكسل من الخريطة يساوي 3 بكسل. ثم انقر فوق تشغيل.
    8. لتطبيق مرشح لتنعيم طيف كل بكسل ، انقر فوق سلس الطيف داخل تحديدات تقليل الضوائج . حدد مرشح Savitzky-Golay كطريقة واضبط طول نافذة المرشح يساوي 7 والترتيب متعدد الحدود للمرشح يساوي 2. ثم انقر فوق تشغيل.
      ملاحظة: يتطلب مرشح Savitzky-Golay تحديد طول نافذة المرشح (عدد صحيح فردي موجب) وترتيب كثيرة الحدود.
    9. لإزالة متوسط إشارة الخلفية من المقدمة، افتح لوحة إزالة الركيزة البصرية وانقر فوق تحديد الركيزة. قم بتعيين k-means كطريقة وعدد المجموعات يساوي 2.
      ملاحظة: تقوم هذه الوظيفة بتقسيم الخلايا ("المقدمة") والركيزة الخاصة بها باستخدام نهج التجميع. ستتمكن بعد ذلك من إزالة متوسط إشارة الخلفية من المقدمة أو تقييد بعض الخطوات للعمل فقط على وحدات البكسل الأمامية. قد يختلف عدد المجموعات التي سيتم اختيارها اعتمادا على العينة المحددة.
    10. في الخيارات المتقدمة ، تحقق من التنظيف المورفولوجي لإزالة بعض النقط الصغيرة من المقدمة (على سبيل المثال ، أجزاء الخلية الزائفة ، إلخ). ثم انقر فوق تشغيل.
    11. في لوحة إزالة الركيزة البصرية ، لطرح متوسط إشارة الخلفية، انقر فوق إزالة الركيزة، ثم حدد المتوسط العمومي (متوسط القيم المركزية البالغة 95٪) وانقر فوق تشغيل.
      ملاحظة: عادة ما تكون K-means أسرع ، على الرغم من أنها غير حتمية (ومع ذلك ، نظرا لأن البذور العشوائية ثابتة ، الحصول على نفس النتيجة في كل تشغيل ، وكل شيء آخر متساو). يمكن زيادة عدد المجموعات إلى ما بعد 2 إذا كانت أجزاء معينة من المقدمة لا تزال معروفة كخلفية. يتم تعريف المجموعة ذات أدنى متوسط إشارة على أنها الخلفية.
    12. لتصحيح التألق الأساسي، افتح لوحة Baseline وانقر فوق Correct baseline. حدد asPLS (النعومة التكيفية PLS) واضبط λ يساوي 5000000. ثم انقر فوق تشغيل.
      ملاحظة: هناك 7 طرق متاحة يمكن اختيارها ، 5 منها تستند إلى المربعات الصغرى المعاقبة (PLS). في طرق PLS هذه ، من الضروري وجود معلمة تنعيم (λ). ستؤدي القيمة الأعلى ل λ إلى خطوط أساس أكثر سلاسة.
    13. لتطبيع كل خريطة رامان الفائقة الطيفية عن طريق تقسيمها على معيار فروبينيوس الخاص بها ، انقر فوق متفرقات وحدد خيار التطبيع . ثم حدد Frobenius كطريقة ، وانقر فوق تشغيل.
      ملاحظة: يتم استخدام معيار Frobenius لتطبيع مصفوفة البيانات بأكملها.
    14. للحصول على صورة بلون زائف توضح التوزيع المكاني لمكون خلوي فرعي، في لوحة Images على الجانب الأيمن، على Intensity Image، انقر فوق رمز القائمة Open . ثم انقر فوق تحرير الصورة الخيار لفتح لوحة التحرير.
    15. في لوحة التحرير ، حدد نطاق واحد ، ثم حدد النطاق الطيفي (على سبيل المثال ، 715-725 سم -1 للسيتوبلازم). حدد اللون المزدوج على خريطة الألوان، وحدد اللون وعتبة الشدة والتعتيم، ثم انقر على تأكيد.
    16. لتنزيل طيف من نقطة واحدة ، انقر فوق البكسل محل الاهتمام على الصورة لتحديده. ثم في لوحة وسيلة الإيضاح الطيفية ، في قسم المؤشر ، انقر فوق تنزيل الطيف. كرر نفس الإجراء للمكونات الفرعية المختلفة.
    17. لتصدير أطياف رامان المقدمة والركيزة، على لوحة وسيلة الإيضاح الطيفية، في قسم تحديد الركيزة، انقر فوق تنزيل الطيف لكل من قسمي المقدمة والركيزة.
      ملاحظة: في البروتوكول الموصوف سابقا لتحليل بيانات RS ، تم وصف خطوات المعالجة المسبقة والتحليل أحادي المتغير لإنشاء صور ملونة زائفة توضح التوزيع المكاني للمكونات الخلوية الفرعية الرئيسية ، وأطياف شدة رامان من كل من المقدمة والركيزة ، وأطياف أحادية النقطة للهياكل تحت الخلوية. في حين أن التحليل النهائي غالبا ما يكون مصمما وفقا للسؤال البيولوجي المحدد ، فإن هذه الدراسة تسلط الضوء الآن على طرق التمثيل متعددة المتغيرات والتصنيف التي يمكن الوصول إليها عبر قسم تحليل الخرائط في الأداة المستندة إلى الويب المستخدمة. وتشمل هذه التحليل العنقودي ، وتحليل المكونات الرئيسية (PCA) ، ودقة المنحنى متعدد المتغيرات (MCR) ، و N-FINDR ، والتركيب الطيفي. يتيح التركيب الطيفي القياس الكمي والمقارنة للسمات الطيفية باستخدام الأساليب القائمة على المسافة مثل معامل ارتباط بيرسون أو مخطط الزاوية الطيفية. يمكن إجراء تحليل الكتلة باستخدام خوارزميات مثل k-means أو Mini-batch k-means أو التجميع التكتلي الهرمي ، مما يسهل تجزئة البيانات الفائقة الطيفية بناء على التشابه الطيفي. يمكن تطبيق PCA لتقليل أبعاد البيانات وتسليط الضوء على أنماط التباين ، بينما يسمح MCR بتحلل الإشارات المختلطة إلى أطياف مكونات نقية. تساعد خوارزمية N-FINDR في استخراج أطياف الأعضاء النهائيين عن طريق تطبيق PCA أولا لتقليل الأبعاد ، مما يجعلها مناسبة بشكل خاص لمجموعات البيانات الفائقة الطيفية. توفر هذه الأدوات إطارا قويا لاستكشاف المصب للأنماط البيولوجية المشفرة في بيانات رامان الطيفية.

4. بروتوكول قياس TPM

  1. قم بإعداد المجهر.
    1. ضع قطرة من الماء المقطر على العدسة الموضوعية للمجهر. ضع العينة على مرحلة ترجمة المجهر. اضبط موضع العينة لمحاذاته مع العدسة الموضوعية.
  2. قم بمحاذاة العدسات الموضوعية والمكثفة.
    1. قم بتشغيل المجهر وقم بتشغيل برنامج التصوير TomoStudio. انقر فوق رمز المجهر على شريط الأدوات. بعد التهيئة، انقر فوق التكوين. حدد LiveCell في لوحة Job و PBS كوسيط.
      ملاحظة: يتم ضبط قيمة RI في اللوحة Medium تلقائيا على 1.337 عند تحديد PBS كوسيط.
    2. قم بالوصول إلى علامة التبويب معايرة في لوحة التحكم الخاصة ببرنامج التصوير. اضبط المواضع المحورية للعدسات الموضوعية والعدسات المكثفة عن طريق تحديد التركيز البؤري والسطح، على التوالي.
    3. انقر فوق وضع المسح الضوئي لضبط العدسات يدويا، مما يضمن تركيز أنماط الإضاءة في وسط مجال الرؤية وظهورها ثابتة تقريبا.
  3. حدد موقع العينة.
    1. انقر فوق الوضع العادي واضبط مرحلة الترجمة لوضع الخلية في مجال العرض. ركز على العينة عن طريق ضبط الموضع المحوري للعدسة الشيئية حتى تصبح حدود العينة غير مرئية تقريبا على الشاشة.
    2. اضبط مرحلة الترجمة لتحديد موقع منطقة بدون خلايا، مما يضمن رؤية خالية من العوائق.
  4. معايرة النظام.
    1. حدد معايرة في برنامج التصوير لالتقاط صور ثلاثية الأبعاد ثنائية الأبعاد متعددة بزوايا إضاءة مختلفة.
  5. الحصول على التصوير المقطعي 3D RI.
    1. اضبط مرحلة الترجمة لتوسيط الخلية داخل مجال الرؤية. انتقل إلى علامة التبويب Acquisition وحدد 3D Snapshot لالتقاط المخطط المقطعي للخلية.
      ملاحظة: وقت الحصول على التصوير المقطعي ثلاثي الأبعاد لخلية واحدة أقصر بكثير (في ترتيب الثواني) ، مقارنة بوقت الاقتناء الذي تتطلبه بيانات RS ؛ وبالتالي ، فإن اعتماد حاضنة على خشبة المسرح ل TPM ليس مطلوبا عادة. ومع ذلك ، إذا كان سيتم إجراء قياسات على عدد كبير من الخلايا ، أو في ظروف محددة ، فإن غرف الحضانة التجارية المخصصة توفر الظروف الفسيولوجية متاحة ويمكن دمجها في نظام TPM.

5. تحليل بيانات TPM

  1. خرائط TPM بعد المعالجة باستخدام برنامج TomoStudio.
    1. لتصور الصور المقطعية الثلاثية الأبعاد، حدد البيانات الموجودة في لوحة التنقل في البيانات ، وانقر بزر الماوس الأيمن فوق البيانات، ثم انقر فوق فتح. سيتم فتح علامة التبويب "بحث" تلقائيا لمزيد من التحليل. في لوحة Data Manager ، انقر فوق RI Tomogram.
    2. في لوحة Volume Visualization ، حدد RI وارسم أربعة مربعات ألوان مستطيلة داخل لوحة RI.
      ملاحظة: يسمح كل مربع ألوان بإقران لون معين بمكونات الخلية المميزة بنطاق RI المحدد بواسطة المربع الموجود في لوحة RI. بعد رسم كل مربع ألوان ، تظهر المعلومات ذات الصلة تلقائيا على الجدول أسفل لوحة RI.
    3. في اللوحة الموجودة أسفل لوحة RI ، قم بتعيين الحد الأدنى والأقصى لقيم نطاق RI لكل مربع ألوان (على سبيل المثال ، مربع الألوان الأول: MinRI = 1.3450 و MaxRI = 1.3499 ، مربع الألوان الثاني: MinRI = 1.3506 و MaxRI = 1.3571 ، مربع اللون الثالث: MinRI = 1.3586 و MaxRI = 1.3650 ، مربع الألوان الرابع: MinRI = 1.3688 و MaxRI = 1.3866). قم بإقران قيمة التعتيم واللون (بالنقر المزدوج على كل مربع وتحديد لون) مع كل مربع. هذا يسمح بتصور الصور المقطعية وفقا لتوزيعات 3D RI.
    4. انقر فوق حفظ لحفظ نطاقات RI ومربعات الألوان المحددة.
      ملاحظة: يجب ضبط نطاقات RI اعتمادا على العينات المحددة.
    5. للحصول على واصفات كمية لتشكل الخلية (أي الحجم [V] ، ومساحة السطح [S] ، والمساحة المتوقعة [A] ، ومتوسط RI ، والكثافة [D] ، والكتلة الجافة [DM] ، والكروية [Φ]) ، استخدم واجهة التحليل .
      ملاحظة: يمكن العثور على تفاصيل حول الحساب النظري للمعلمات الكمية هنا2،23.
      1. في شريط الأدوات، انقر فوق تحليل. في لوحة Analysis على اليسار، حدد يدوي في لوحة Segmentation وقم بتعيين 1.3450 كحد RI. ثم انقر فوق تطبيق.
        ملاحظة: تأكد من أن قيم RII (fl/pg) وخط الأساس RI هي على التوالي 0.19 (زيادة الانكسار ، والتي تم تحديدها على نطاق واسع من خلال التحقيقات السابقة24) و 1.3370 (RI من PBS المستخدمة في RI لمعايرة خلفية PBS). يقوم برنامج التصوير بإجراء تجزئة حجمية للخلية المستهدفة وفقا لعتبة RI المحددة ويحسب الفهارس المورفولوجية (V و S و A و متوسط RI و D و DM و Φ) ويبلغ عنها في جدول إخراج في لوحة القياس .
      2. انقر فوق حفظ لحفظ الفهارس المورفولوجية المحسوبة.
        ملاحظة: بالإضافة إلى البرنامج المستخدم ، يمكن استخدام العديد من الأدوات مفتوحة المصدر لقياس السمات المورفولوجية من بيانات TPM. يوفر CellProfiler (https://cellprofiler.org/) أدوات لتحليل الصور ، بما في ذلك التجزئة واستخراج الميزات ، والتي تتوافق مع صور تباين الطور. فيجي (https://fiji.sc/) هو برنامج مفتوح المصدر يحتوي على مكونات إضافية للتجزئة وحساب المعلماتالمورفولوجية 25. Napari (https://napari.org/) هو عارض صور متعدد الأبعاد مع دعم لدمج نماذج التعلم الآلي للتجزئة والتحليل. تقدم Ilastik (https://www.ilastik.org/) أدوات تجزئة قائمة على التعلم الآلي ، ويدمج DeepImageJ (https://deepimagej.github.io/) نماذج التعلم العميق مع ImageJ / Fiji للتحليل المتقدم. إلى جانب ذلك ، يوفر MorphoLibJ (https://imagej.net/plugins/morpholibj) أدوات للعمليات المورفولوجية ثنائية الأبعاد وثلاثية الأبعاد في فيجي. Cellpose326 هي أداة أخرى قائمة على التعلم العميق لتجزئة الخلايا يمكن تطبيقها على تصوير تباين الطور.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وصفنا سير عمل للتوصيف الكيميائي المورفو الخالي من الملصقات للخلايا الحية بناء على RS متحد البؤر و TPM. اختبرنا قدرة سير العمل المقترح على تحقيق التركيب الجزيئي والمعلمات المورفولوجية لخط خلايا سرطان الثدي البشري MDA-MB-231 (الشكل 1).

تم زرع خلايا MDA-MB-231 في أطباق بتري ذات قاع زجاجي من الكوارتز. تم استخدام مجهر رامان متحد البؤر المصمم خصيصا (الشكل 1 أ) ، الذي يعمل عند إثارة ليزر ذات موجة مستمرة 785 نانومتر ، للوصول إلى أطياف رامان ل...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

قدمنا نهجا متعدد الوسائط وخط أنابيب تحليل مباشر يدمج تقنيتين متقدمتين للتصوير خالية من الملصقات: RS و TPM. مكن سير العمل الموصوف من التنميط الظاهري الكيميائي المورفو السريع وغير الغازي للخلايا المفردة لسرطان الثدي البشري الحي (MDA-MB-231) دون الحاجة إلى وضع العلامات الخارجية.

RS هي تقنية غير مدمرة تسمح بتوصيف التركيب الكيميائي الحيوي للعينات البيولوجية من خلال الكشف عن الأنماط الاهتزازية للجزيئات9،27

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تمويل هذا البحث من قبل Progetto Rocca من مؤسسة معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا وإيطاليا ، ومنح المعاهد الوطنية للصحة (P41EB015871 ، UH3CA275687 ، R01DC021326) ، وأبولون (سيول ، كوريا الجنوبية) ، والمركز الوطني للسرطان ، كوريا (NCC-24H1170). يعترف ليوناردو بيانكي بمنح زمالة Progetto Rocca لما بعد الدكتوراه لإجراء بحث تعاوني في معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا وبوليتكنيكو دي ميلانو.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
كاميرا CCDآلات برينستونPIXIS 100BR eXcelonكاشف لإشارة تشتت رامان.
برنامج التحكم في كاميرا CCDآلات برينستونلايت فيلد
ليزر Ti-Sapphire ذو الموجة المستمرة (الطول الموجي: 785 نانومتر)فيزياء الأطياف3900 ثانيةيتم استخدامه لإثارة رامان المجهري.
مرآة ثنائية اللونThorLabsDMSP750Bمرآة ثنائية اللون 749 نانومتر ، تحرف إثارة رامان 785 نانومتر إلى العينة ، وتصفية إشارات التألق والمجال الساطع.
مصل الأبقار الجنينيةثيرمو فيشر العلميA5256701
جسم مجهر مضانأوليمبوستاسعة 83
الليزر (الطول الموجي: 532 نانومتر)فيزياء الأطيافآلاف السنين eVليزر المضخة لنظام ليزر Ti-Sapphire 785 نانومتر.
برنامج MATLABماث ووركس2023 أ
خط خلية MDA-MB-231ATCCإتش تي بي -26
مطياف NIRأندورورهولوسفير HS-HSG-785-LFيتم استخدامه للتحليل الطيفي للضوء المتناثر الخلفي.
عدسة موضوعية (60× 1.2 NA غمر في الماء)أوليمبوسUPLSAPO60×
غرفة الحضانة على خشبة المسرحتوكاي هيتمجموعة stxg-welsx
برنامج التحكم في المجهر مفتوح المصدرµ مديرمدير صغير 2.0
البنسلين الستربتومايسين (10,000 وحدة / مل)ثيرمو فيشر العلمي15140122
خالي من الفينول DMEM / F-12ثيرمو فيشر العلمي21041025
محلول ملحي من الفوسفاتجيبكو10-010-023
أطباق بتري كوارتز ذات قاع زجاجيويك بي تكSF-S-D12
برنامج تحليل بيانات رامانرام آبأداة قائمة على الويب لمعالجة بيانات رامان فائقة الطيف.
كاميرا sCMOSهاماماتسو فوتونكسOrca Flash 4.0 v2
مضخة حقنةكيميكسفيوجن 720
مجهر المرحلة المقطعيةشركة Tomocube، Inc.إتش تي-2 إتشالنظام التجاري للحصول على صور المرحلة الكمية.
برنامج تحليل بيانات TPMشركة Tomocube، Inc.تومو ستوديوبرنامج يستخدم لتحليل بيانات الفحص المجهري للطور المقطعي (TPM).

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gosnell, M. E., et al. Quantitative non-invasive cell characterisation and discrimination based on multispectral autofluorescence features. Sci Rep. 6 (1), 23453(2016).
  2. Bresci, A., et al. Label-free morpho-molecular phenotyping of living cancer cells by combined Raman spectroscopy and phase tomography. Commun Biol. 7 (1), 1-13 (2024).
  3. Rocha, R. A., Fox, J. M., Genever, P. G., Hancock, Y. Biomolecular phenotyping and heterogeneity assessment of mesenchymal stromal cells using label-free Raman spectroscopy. Sci Rep. 11 (1), 4385(2021).
  4. Vicar, T., et al. Cell segmentation methods for label-free contrast microscopy: review and comprehensive comparison. BMC Bioinform. 20 (1), 360(2019).
  5. Kang, J. W., et al. Combined confocal Raman and quantitative phase microscopy system for biomedical diagnosis. Biomed Opt Express. 2 (9), 2484-2492 (2011).
  6. Pandey, R., et al. Integration of diffraction phase microscopy and Raman imaging for label-free morpho-molecular assessment of live cells. J Biophotonics. 12 (4), e201800291(2019).
  7. Zhao, W., Sun, D., Yue, S. Label-free multimodal non-linear optical imaging of three-dimensional cell cultures. Front Phys. 10, 1100090(2023).
  8. Hanna, K., et al. Raman spectroscopy: current applications in breast cancer diagnosis, challenges and future prospects. Br J Cancer. 126 (8), 1125-1139 (2022).
  9. Dodo, K., Fujita, K., Sodeoka, M. Raman spectroscopy for chemical biology research. J Am Chem Soc. 144 (43), 19651-19667 (2022).
  10. Puppels, G. J., et al. Studying single living cells and chromosomes by confocal Raman microspectroscopy. Nature. 347 (6290), 301-303 (1990).
  11. Elumalai, S., Managó, S., De Luca, A. C. Raman microscopy: progress in research on cancer cell sensing. Sensors (Basel). 20 (19), 5525(2020).
  12. Chandra, A., et al. Unveiling the molecular secrets: a comprehensive review of Raman spectroscopy in biological research. ACS Omega. 9 (51), 50049-50063 (2024).
  13. Cacace, T., Bianco, V., Ferraro, P. Quantitative phase imaging trends in biomedical applications. Opt Laser Eng. 135, 106188(2020).
  14. Nguyen, T. L., Pradeep, S., Judson-Torres, R. L., Reed, J., Teitell, M. A., Zangle, T. A. Quantitative phase imaging: recent advances and expanding potential in biomedicine. ACS Nano. 16 (8), 11516-11544 (2022).
  15. Kuś, A., et al. Tomographic phase microscopy of living three-dimensional cell cultures. J Biomed Opt. 19 (4), 046009(2014).
  16. Memmolo, P., et al. Loss minimized data reduction in single-cell tomographic phase microscopy using 3D Zernike descriptors. Intell Comput. 2, 0010(2023).
  17. Jin, D., Zhou, R., Yaqoob, Z., So, P. T. C. Tomographic phase microscopy: principles and applications in bioimaging [Invited]. JOSA B. 34 (5), B64-B77 (2017).
  18. Pirone, D., et al. Stain-free identification of cell nuclei using tomographic phase microscopy in flow cytometry. Nat Photonics. 16 (12), 851-857 (2022).
  19. Bresci, A., et al. Non-invasive morpho-molecular imaging reveals early therapy-induced senescence in human cancer cells. Sci Adv. 9 (37), eadg6231(2023).
  20. Ghislanzoni, S., et al. Optical diffraction tomography and Raman confocal microscopy for the investigation of vacuoles associated with cancer senescent engulfing cells. Biosensors. 13 (11), 973(2023).
  21. Bischof, J., et al. Multimodal bioimaging across disciplines and scales: challenges, opportunities and breaking down barriers. npj Imageing. 2 (1), 1-6 (2024).
  22. Kobayashi-Kirschvink, K. J., et al. Prediction of single-cell RNA expression profiles in live cells by Raman microscopy with Raman2RNA. Nat Biotechnol. 42 (11), 1726-1732 (2024).
  23. Popescu, G., et al. Optical imaging of cell mass and growth dynamics. Am J Physiol Cell Physiol. 295 (2), C538-C544 (2008).
  24. Kim, K., Lee, S., Yoon, J., Heo, J., Choi, C., Park, Y. Three-dimensional label-free imaging and quantification of lipid droplets in live hepatocytes. Sci Rep. 6 (1), 36815(2016).
  25. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  26. Stringer, C., Pachitariu, M. Cellpose3: one-click image restoration for improved cellular segmentation. Nat Methods. 22 (3), 592-599 (2025).
  27. Talari, A. C. S., Movasaghi, Z., Rehman, S., Umapathy, S. Raman spectroscopy of biological tissues. Appl Spectrosc Rev. 50 (1), 46-111 (2015).
  28. Hobro, A. J., et al. Raman and Raman optical activity (ROA) analysis of RNA structural motifs in Domain I of the EMCV IRES. Nucleic Acids Res. 35 (4), 1169-1177 (2007).
  29. Samuel, A. Z., Sugiyama, K., Ando, M., Takeyama, H. Direct imaging of intracellular RNA, DNA, and liquid-liquid phase separated membraneless organelles with Raman microspectroscopy. Commun Biol. 5 (1), 1-9 (2022).
  30. Kuhar, N., Sil, S., Umapathy, S. Potential of Raman spectroscopic techniques to study proteins. Spectrochim Acta A Mol Biomol Spectrosc. 258, 119712(2021).
  31. Park, C., Shin, S., Park, Y. Generalized quantification of three-dimensional resolution in optical diffraction tomography using the projection of maximal spatial bandwidths. JOSA A. 35 (11), 1891-1898 (2018).
  32. Bresci, A., et al. Label-free monitoring of embryonic development in living colonies by combining Raman spectroscopy and tomographic phase microscopy. Multiscale Imaging Spectrosc VI. PC13327, PC1332703(2025).
  33. Baczewska, M., et al. Refractive index changes of cells and cellular compartments upon paraformaldehyde fixation acquired by tomographic phase microscopy. Cytometry A. 99 (4), 388-398 (2021).
  34. Movasaghi, Z., Rehman, S., Umapathy, S. Raman spectroscopy of biological tissues. Appl Spectrosc Rev. 42 (5), 493-541 (2007).
  35. Butler, H. J., et al. Using Raman spectroscopy to characterize biological materials. Nat Protoc. 11 (4), 664-687 (2016).
  36. Allakhverdiev, E. S., et al. Raman spectroscopy and its modifications applied to biological and medical research. Cells. 11 (3), 386(2022).
  37. Xu, J., et al. Unveiling cancer metabolism through spontaneous and coherent Raman spectroscopy and stable isotope probing. Cancers. 13 (7), 1718(2021).
  38. Swain, R. J., et al. Assessment of cell line models of primary human cells by Raman spectral phenotyping. Biophys J. 98 (8), 1703-1711 (2010).
  39. Smith, R., Wright, K., Ashton, L. Raman spectroscopy: an evolving technique for live cell studies. Analyst. 141 (12), 3590-3600 (2016).
  40. Du, J., et al. Raman-guided subcellular pharmaco-metabolomics for metastatic melanoma cells. Nat Commun. 11 (1), 4830(2020).
  41. Jones, R. R., et al. Raman techniques: fundamentals and frontiers. Nanoscale Res Lett. 14, 231(2019).
  42. Shirokova, O., et al. Possibilities of holotomographic microscopy for studying primary cell cultures of the brain. Proc IEEE CNN. 208 (211), 208-211 (2024).
  43. Choi, W., et al. Tomographic phase microscopy. Nat Methods. 4 (9), 717-719 (2007).
  44. Park, Y., Depeursinge, C., Popescu, G. Quantitative phase imaging in biomedicine. Nat Photonics. 12 (10), 578-589 (2018).
  45. Jung, J., et al. Label-free non-invasive quantitative measurement of lipid contents in individual microalgal cells using refractive index tomography. Sci Rep. 8 (1), 6524(2018).
  46. Debnath, S. K., Park, Y. Real-time quantitative phase imaging with a spatial phase-shifting algorithm. Opt Lett. 36 (23), 4677-4679 (2011).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة